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近日，药融云团队王中健博士与朱凌峰数据分析专家在《药学进展》杂志上发表了题为《全球基因治疗药物研发现状》的论文。论文对1998年至2022年2月全球范围内获批上市的基因治疗药物进行数据监控与分析，并且对全球在研基因治疗药物的研发现状进行分析总结，以期为基因治疗药物的立项与研发提供参考。《药学进展》是由中国药科大学和中国药学会主办、国家教育部主管的国家级医药科技期刊，是一本提供新药研发动态、学科发展趋势、临床药学应用、药事法规政策等领域研究思路、方法和技术信息的专业媒体。此论文是药融云所开展的多次“药融咨询”中的一项研究成果。在论文以外，药融云也一直在依托药融云专业的医药全产业链数据库与丰富的外部专家资源，多角度、深层次地帮助业内人士快速获取医药情报，洞悉行业发展脉络，为药企决策提供有力参考。论文作者王中健：科技情报与数据分析专家，在业界首次建立了“化学-药学-医学”系统化数据情报体系，开发了生物医药行业专用数据标注与审核系统。作为主要项目骨干参与国家科技重大专项3项、中科院先导专项2项，主持并在研上海市科技创新行动计划1项。朱凌峰：中国药科大学药物化学硕士，在医药信息数据领域深耕多年，拥有丰富的行业及专业经验，对大数据、人工智能技术辅助生物医药领域的开发利用有深入研究。 论文中，大量药物的信息整合是依托了药融云数据的精度和广度而开展的。其中，全球药物研发数据库囊括了18w+各研发阶段的药物（创新药、改良型新药、生物类似药），包括药物研发代码、研发企业、治疗领域、靶点、研发阶段、工艺技术等信息，同时扩展了药物各适应症的研发状态以及药物的关键性临床、全球销售额数据，是企业立项调研、实时掌握全球药物研发动态的重要工具。https://www.pharnexcloud.com/以下为论文全文👇👇：全球基因治疗药物研发现状分析 PPS 朱凌峰，王中健*（药融云数字科技（成都）有限公司，四川成都610000）[摘要]随着DNA重组、基因克隆等技术的逐步成熟，基因治疗这一具有革命性的医疗技术不断发展，改变了单基因遗传病的治疗现状，为肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病等带来了新的选择。截至2022年2月，全球已有37款基因治疗药物获批上市。通过对1998年至2022年2月全球范围内获批上市的基因治疗药物进行数据监控与分析，包括药物分类、药物名称、适应证、批准日期、批准国家、研发公司等，并且对全球在研基因治疗药物的研发现状进行分析总结，以期为基因治疗药物的立项与研发提供参考。1基因治疗药物概述1968年，美国科学家迈克尔·布莱泽发表了《改变基因缺损：医疗美好前景》的文章，首次在医学界提出了基因治疗的概念[1]。基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的[2]。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）对基因治疗定义为：基因治疗是一种通过改变人的基因来治疗或治愈疾病的技术。基因治疗可以通过以下几种机制发挥作用：1）用一个正常基因来替换致病基因；2）使不能正常发挥作用的致病基因失活；3）将一种新的或经过修饰的基因导入体内以帮助治疗疾病。基因治疗药物，是指经过药物监管机构批准的用于治疗人体相关疾病的基因类产品[3]。从1998年全球首款基因治疗药物上市到2015年期间，断断续续有少量基因治疗药物获批；从2016年开始，每年都有多款基因治疗药物获批上市。截至2022年2月，全球共有37款基因治疗药物获批上市，从1998年到2022年2月，每年基因治疗药物获批上市的数量如图1所示。基因治疗药物按照结构可划分为核酸类药物、重组病毒类药物以及细胞治疗类药物。其中核酸药物按照种类又可划分为DNA药物（裸质粒等）、RNA药物[干扰RNA（RNAi）等]及反义寡核苷酸药物，其作用原理是借助一定载体将核酸药物传送进细胞内并进行复制转录继而从基因层面起到治疗效果；重组病毒类药物是利用人工修饰过的病毒选择性进攻人体病灶部位，以起到治疗疾病的目的，该类药物目前大多用于治疗癌症；细胞治疗类药物以细胞为主体通过基因工程技术对相关功能细胞进行改造，改造后的细胞直接输送回病人体内用以治疗相关疾病。已上市37款基因治疗药物中，核酸类药物共计15款，其中裸质粒2款，反义寡核苷酸9款，RNAi4款；重组病毒类药物9款；细胞治疗类药物13款（见图2）。从获批药物的疾病领域来看，近一半是罕见病，其次是肿瘤（见图3）。针对肿瘤的基因治疗主要是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy，CAR-T）药物和溶瘤病毒药物。从获批药物使用的载体来看，裸质粒/寡核苷酸最多，其次是慢病毒和逆转录病毒载体（见图4）。本文将分别按照核酸类药物、重组病毒类药物和细胞治疗类药物对目前已经上市的基因治疗药物以及全球研发现状进行介绍。2核酸类药物2.1裸质粒截至2022年2月，全球共有2个裸质粒药物获批上市，分别为2011年在俄罗斯上市的Neovasculgen（cambiogenplasmid）和2019年在日本上市的Collategene（beperminogene perplasmid）（见表1）。Neovasculgen是一个编码血管内皮生长因子基因的质粒，注射到人体内后，表达出的血管内皮生长因子能够促进血管的生成，从而改善患者的生活质量[4]。Collategene是一种编码肝细胞生长因子基因的质粒，注射到人体内后，表达出的肝细胞生长因子能够促进血管的生成，从而治疗缺血性疾病。相关研究表明[5-6]，病毒载体介导的促血管生成因子基因的传递诱导了小鼠心脏血管瘤的形成，将表达血管内皮生长因子的基因工程细胞注入到正常肌肉中，术后24d后也可以观察到血管瘤的形成。因此，为避免促血管生成因子的长期表达，裸质粒是一个很好的选择。目前裸质粒的主要开发方向就是编码促血管生成因子基因。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的裸质粒基因治疗药物共计39个（见图5）。目前处于Ⅲ期临床的2款药物的相关信息如表2所示。重组质粒-肝细胞生长因子注射液（pUDK-HGF）是由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所研发，人福医药合作开发的裸质粒药物。其治疗严重下肢缺血性疾病导致的肢体静息痛的Ⅲ期临床试验（CTR20181274）正在进行中，首次公示日期为2018年8月9日，主要临床机构为首都医科大学宣武医院。由Helixmith公司研发的重组人肝细胞生长因子裸质粒注射液（NL-003）目前正在全球范围内开展临床试验，其在中国的开发由北京诺思兰德生物技术股份有限公司进行，目前治疗下肢缺血性疾病的Ⅲ期临床试验（CTR20190746和CTR20190750）正在进行中，首次公示日期为2019年4月17日，主要临床机构为北京协和医院。2.2 反义寡核苷酸反义寡核苷酸是一种单链寡核苷酸分子，通常包含15~25个核苷酸残基。其进入细胞后在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则同与其互补的靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）结合，抑制靶基因的表达。截至2022年2月，全球共有9款反义寡核苷酸药物获批上市（见表3）。1998年，美国FDA批准了首款基因治疗药物Vitravene（fomivirsen），Vitravene是一种反义寡核苷酸，可用于治疗局部免疫缺陷患者（包括获得性免疫缺陷综合征患者）的巨细胞病毒视网膜炎，但是，由于更高效抗逆转录病毒治疗药物的开发，Vitravene于2002年退出欧洲市场，并于2006年退出美国市场[7]。2013年，美国FDA批准了一款包含载脂蛋白B-100的反义寡核苷酸药物Kynamro（mipomersen）用于治疗纯合子家族性高胆固醇血症[8]。2016年，有2个反义寡核苷酸药物获得美国FDA批准，分别为Spinraza（nusinersen）和Exondys51（eteplirsen）。Spinraza用于治疗脊髓性肌萎缩，Exondys51用于治疗杜氏肌营养不良症[9-10]。2018年7月，Tegsedi（inotersen）作为一款反义寡核苷酸药物获得欧盟药品管理局（European Medicines Agency，EMA）的批准，用于治疗遗传性甲状腺淀粉样变性[11]。2019年，Waylivra（volanesorsen）获得了EMA批准用于治疗成年人家族性乳糜微粒血症综合征[12]。Vyondys53（golodirsen）获得了FDA批准用于治疗杜氏肌营养不良症[13]。2020年，日本独立行政法人医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA）批准了Viltepso（viltolarsen），用于治疗杜氏肌营养不良症[14]。2021年，FDA批准了Amondys45（casimersen）用于治疗杜氏肌营养不良症[15]。从治疗领域来看，除了已经退市的Vitravene外，全部是罕见病治疗领域，其中有4个适应证为杜氏肌营养不良症。从开发公司来看，小核酸药物研发公司Ionis公司占5个，Sarepta公司占3个。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的反义寡核苷酸基因治疗药物共计345个，临床前180个，进入临床阶段的共计90个（见图6）。其中，目前处于Ⅲ期临床的13款药物如表4所示。Alicaforsen是细胞间黏附分子-1的反义抑制剂，最新的针对结肠袋炎的Ⅲ期临床效果不佳，未达到预期主要终点，经内窥镜评估缓解率，与安慰剂相比并无改善（4.6% vs. 4.9%）。Sepofarsen是一种旨在解决CEP290基因中p.Cys998X突变引起的莱伯先天性黑内障的反义寡核苷酸，p.Cys998X突变会导致mRNA的异常剪接和中心体蛋白290（centrosomal protein of 290 kDa，CEP290）失去功能，sepofarsen通过结合到pre-mRNA的突变位置，使得产生正常的CEP290[16]。Imetelstat是一种端粒酶抑制剂，在治疗骨髓增生异常综合征的Ⅱ/Ⅲ期临床试验IMerge中，imetelstat取得了积极的临床效果，持续8周输血不依赖率达到34.3%，而其中未接受过低甲基化药物或来那度胺治疗，且无染色体5q缺失的持续8周输血不依赖率达到53.8%[17]。AKCEA-APOCIII-LRx是由Ionis公司专有的配体共轭反义技术平台开发的反义寡核苷酸药物，能够抑制载脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein C-Ⅲ，ApoC Ⅲ）的产生。ApoC Ⅲ是一种在肝脏中产生的蛋白质，在血清三酰甘油的调节中发挥着核心作用。Trabedersen是TGF-β2基因mRNA区域的反义互补物，通过下调TGF-β2mRNA发挥抑制作用。在Ⅱ期临床研究中，与标准化疗治疗相比，使用10mmol·L-1trabedersen治疗的复发/难治性晚期胶质瘤患者的2年生存率更高。亨廷顿舞蹈症的主要机制为患者4号染色体上的亨廷顿基因CAG三核苷酸重复扩增，从而导致亨廷顿蛋白质具有延伸的聚谷氨酰胺束，并在细胞内积聚成大分子团，影响神经元的正常功能[18]。Tominersen可以在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则与其互补的靶mRNA结合，抑制靶基因的表达。基于这一原理，tominersen可靶向相应的mRNA以防止蛋白质产生，基于非盲独立数据监测委员会对受试者的潜在风险/收益比提出了意见，罗氏于2021年3月宣布终止tominersen治疗显性亨廷顿舞蹈症的Ⅲ期GENERATION HD1临床的给药工作。携带肉瘤融合基因（fused in sarcoma，FUS）突变的患者会发展成罕见形式的肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），即FUS-ALS，FUS基因突变是青少年ALS最常见的病因。ION-363是一种靶向FUS mRNA的反义药物，以减少FUS蛋白质的产生。在FUS-ALS小鼠模型中，反义介导的突变FUS蛋白质减少可以防止运动神经元丢失。通过靶向FUS-ALS的根本病因，ION-363有潜力减少或防止患者的病情进展。Aganirsen可抑制胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）的表达，被研究用于角膜和视网膜新生血管的治疗。Tofersen是一种反义寡核苷酸药物，旨在降低超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）的mRNA，从而降低SOD1蛋白，在对SOD1-ALS的Ⅲ期临床试验VALOR中，与安慰剂相比，tofersen在其主要终点上并没有取得统计上显著的改善。Eplontersen是一种靶向转甲状腺素的反义寡核苷酸药物。Pelacarsen是首个靶向脂蛋白（a）[lipoprotein（a），Lp（a）]的反义寡核苷酸降脂药，pelacarsen的Ⅱb期临床试验研究显示，98%的患者Lp（a）水平降至50mg·dL-1以下的适宜水平。ION-373是一种靶向胶质纤维酸性蛋白mRNA的反义寡核苷酸药物，FDA已授予ION-373孤儿药资格认定。Donidalorsen是一种抑制前激肽释放酶产生的反义寡核苷酸药物，前激肽释放酶在遗传性血管性水肿急性发作相关的炎症介质激活中起关键作用，该药物治疗遗传性血管性水肿的Ⅲ期临床正在进行中，Ⅱ期临床试验研究显示，与安慰剂组相比，donidalorsen可减少遗传性血管性水肿的发作。2.3 RNA干扰药物截至2022年2月，全球共有4款RNAi药物获批上市（见表5），4款RNAi药物都是小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）药物，siRNA进入细胞后，与解旋酶和其他因子结合，形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC与mRNA结合，使得mRNA降解。2018年，Onpattro（patisiran）作为首个RNAi药物获得FDA和EMA的许可，用于治疗淀粉样变性[19]。2019年，Givlaari（givosiran）获得FDA批准用于治疗肝卟啉病。2020年，2款RNAi药物获批上市，Oxlumo（lumasiran）获得EMA和FDA批准用于治疗高草酸尿症[20]，Leqvio（inclisiran）获得EMA批准用于治疗高胆固醇血症。Leqvio的获批上市，也使得RNAi疗法的疾病领域不仅局限于罕见病[21]。载体上，除了Onpattro使用的纳米脂质体，后续3个药物都是使用靶向肝细胞的N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）修饰。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的RNAi基因治疗药物共计235项（见图7），其中临床前131项。已提交上市申请和Ⅲ期临床试验的7款药物如表6所示。RNAi疗法药物vutrisiran靶向和沉默特定的mRNA，从而阻止野生型和突变型甲状腺素转运蛋白（transthyretin，TTR）的产生，在Ⅲ期临床试验HELIOS-A中取得积极的临床结果，2021年6月，Alnylam宣布FDA已受理vutrisiran的新药申请[22]。Fitusiran使用siRNA来靶向并减少抗凝血酶，从而促进血友病A或B的患者有足够的凝血酶生成，以恢复止血功能和防止出血。然而于2020年11月，因发现新的不良反应事件，赛诺菲宣布fitusiran的研究暂时搁置。Tivanisiran是一种靶向香草酸受体（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）的小分子RNAi疗法药物，Sylentis公司发布的Ⅲ期临床试验HELIX显示，中央角膜染色的减少有改善（P=0.035）。Cosdosiran是一种靶向细胞凋亡相关基因caspase-2的mRNA的siRNA药物，拟用于治疗视网膜神经节细胞死亡相关的疾病。目前，cosdosiran用于非动脉性缺血性视神经病变治疗的Ⅱ/Ⅲ期临床试验已于2019年6月终止，原因是中期分析的结果不足以支持后续的患者入组。Teprasiran可通过暂时抑制P53介导的细胞死亡，减少急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）发生，41个临床试验中心共360例患者随机分为给药组（10mg·kg-1）和安慰剂组，给药方式为术后4h内单次静脉推注，术后7d内每日随访，第30、90和365d时再进行3次随访观察。结果显示，teprasiran可显著降低心脏术后患者AKI的发生率、严重程度及持续时间，90d内主要不良事件的发生率与安慰剂组无统计学差异[23]。Nedosiran是一种正在开发用于原发性高草酸尿症（primary hyperoxaluria，PH）1、PH2和PH3型的RNAi候选药物，旨在抑制肝乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的产生，该酶可催化乙醛酸代谢途径的最后一步，可以导致PH1、PH2或PH3患者草酸过量产生，在治疗PH患者中的关键临床试验PHYOX2中取得了积极顶线结果。ARO-APOC3是一种靶向ApoC Ⅲ的RNAi药物，其治疗家族性乳糜微粒血症的Ⅲ期临床试验正在进行中。3重组病毒类药物病毒因其良好的感染效率和在体内外靶细胞中持久表达的潜力被用于生物研究领域重组细胞的构建以及作为医药领域基因治疗技术的重要载体。而现在，病毒除了可以作为细胞和基因治疗药物的主要工具外，重组病毒也已经作为一类药物进入临床使用[24]。目前，主要应用的病毒包括腺病毒及腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒等。截至2022年2月，全球共有9款重组病毒类基因治疗药物获批上市（见表7）。2003年，我国批准一款重组腺病毒载体表达p53治疗头颈癌的基因治疗药物—今又生（重组人p53腺病毒注射液）。今又生被认为是首个商品化的基因治疗药物[25]。2004年，拉脱维亚批准了Rigvir（Virus ECHO-7）用于治疗黑色素瘤，所用的病毒载体为ECHO-7肠道病毒[26]。2005年，我国批准了用于治疗鼻咽癌的药物安柯瑞（重组人5型腺病毒注射液）[27]。2007年，菲律宾批准了Rexin-G（Mx-dnG1）用于治疗软组织肉瘤和骨肉瘤，所用的病毒载体为逆转录病毒[28]。2012年，EMA批准了Glybera（alipogene tiparvovec）用于治疗家族性脂蛋白脂酶缺乏症，Glybera所用的载体为重组腺相关病毒。Glybera的获批上市是整个基因治疗领域的里程碑，促进了基因治疗的发展。但是，由于高昂的价格以及市场需求有限，Glybera已经撤市[29]。2015年，Imlygic(talimogene laherparepvec)获得FDA批准用于治疗黑色素瘤，这是FDA批准的首个溶瘤病毒药物，使用的载体为单纯疱疹病毒[30]。2017年，腺相关病毒载体药物Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl)获得FDA批准上市用于治疗经证实的双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养障碍性疾病[31]。2019年，美国FDA批准Zolgensma(onasemnogene abeparvovec-xioi)用于治疗脊髓性肌萎缩症[32]。2021年6月，PMDA宣布授予Delytact(teserpaturev)许可，在一定的条件及时限内，允许被应用于治疗恶性胶质瘤患者。治疗领域来看，肿瘤治疗有6款，罕见病治疗有3款。使用最多的载体为腺相关病毒载体。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的病毒载体药物共计980项，其中临床前570项，药物发现147项，临床阶段共计250项（见图8）。目前提交上市申请的4款药物如表8所示。Lenadogene nolparvovec是一款重组腺相关病毒的基因治疗药物，病毒内包含编码人野生型线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4蛋白（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase4，ND4）的基因，该化合物专为治疗ND4基因突变相关的Leber遗传性视神经病变而开发。GenSight公司根据Ⅰ/Ⅱa期临床试验研究（CLIN-01）、2项关键性Ⅲ期的有效性研究（CLIN-03A：RESCUE和CLIN-03B：REVERSE）以及RESCUE和REVERSE的长期随访研究，同时结合统计学的间接比较方法，确立基因疗法与自然病史对比的药效和获益-风险比，并以此为基础提交上市申请[33]。Valoctocogene roxaparvovec是一种使用腺相关病毒来递送凝血因子Ⅷ功能基因，用以恢复凝血因子Ⅷ的产生，从而起到治疗A型血友病的基因治疗药物，Ⅲ期临床研究结果显示，年化出血率下降84%。Eladocagene exuparvovec是一种基于腺相关病毒提供芳香族L-氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase，AADC）基因的基因治疗药物[34]。Nadofaragene firadenovec是一款重组腺病毒的基因治疗药物，含有干扰素α-2b基因，每3个月1次通过导管灌注膀胱。腺病毒进入膀胱壁细胞后，释放出活性基因，经转录和翻译后，使膀胱壁细胞分泌大量的干扰素α-2b蛋白，从而增强抗肿瘤活性[35]。4细胞治疗4.1自体细胞治疗细胞治疗是利用患者自体或异体的成体细胞或干细胞对组织、器官进行修复的治疗方法。FDA对来自于患者自体的细胞基因治疗的定义是：从患者体内取出细胞、基因改造（通常使用病毒载体），然后回输到患者体内。细胞治疗给患有无法治愈的疾病的患者带来了希望。截至2022年2月，全球共有11款自体细胞基因治疗药物获批上市（见表9）。2016年，EMA批准Strimvelis用于治疗由于腺苷脱氨酶缺失导致的重症联合免疫缺陷。Strimvelis是一种表达人腺苷脱氨酶的CD34+自体细胞，是全球首个获批上市的细胞基因治疗药物[36]。2017年，FDA批准了全球首款及第2款CAR-T产品Kymriah（tisagenlecleucel）和Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。2款药物都是在体外将CD19基因导入到患者自体的T细胞中。Kymriah可用于治疗25岁以下的复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病；Yescarta被用来治疗成年患者复发或难治愈的大B细胞淋巴瘤[37-38]。2019年，EMA批准了Zynteglo用于治疗12岁及以上的输血依赖性β-地中海贫血症，Zynteglo是一种含有造血干细胞的用慢病毒载体转导了βA-T87Q球蛋白基因的CD34+自体细胞[39]。2020年，2款自体细胞治疗药物上市，分别为FDA批准的用于治疗套细胞淋巴瘤的CAR-T产品Tecartus（brexucabtagene autoleucel）以及EMA批准的用于治疗异染性脑白质营养不良的药品Libmedly。Libmedly是一种含有造血干细胞和祖细胞的用慢病毒载体转导了人芳基硫酸酯酶A基因的CD34+自体细胞[40]。2021年，3款CAR-T产品和1款自体细胞治疗药物获得批准上市，FDA批准了用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的Breyanzi（lisocabtagene maraleucel）和治疗多发性骨髓瘤的Abecma（idecabtagene vicleucel）[41-42]，我国批准了倍诺达（瑞基奥仑赛注射液）用于治疗经过二线或以上系统性治疗后复发或难治性大B细胞淋巴瘤的成人患者，倍诺达成为我国首个获批为1类生物制品的CAR-T产品。EMA批准了Skysona用于治疗携带ABCD1基因突变的、18岁以下的早期脑性肾上腺脑白质营养不良患者。2022年2月28日，FDA批准Carvykti（ciltacabtagene autoleucel）用于复发或难治性多发性骨髓瘤患者，Carvykti是一款靶向B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）的CAR-T产品，Carvykti是首款由我国自主研发获得FDA批准上市的CAR-T产品[43]。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的CAR-T药物共计797项，临床阶段共计376项（见图9），适应证以肿瘤为主。4.2 异体细胞治疗在异体细胞基因治疗中，提供基因修饰细胞的供体与接受基因修饰细胞的受体是不同的人。从生产制造的角度来看，异体细胞治疗产品可以形成商业化的现成品，相较于自体细胞治疗，这可以大大降低生产成本[44]。截至2022年2月，全球共有2款异体细胞基因治疗产品获批上市（见表10）。2016年，EMA批准Zalmoxis（nalotimagene carmaleucel）用于造血干细胞移植后辅助恢复患者的免疫系统。2017年，韩国批准Invossa（tissuegene-c）治疗中度骨性关节炎，这是韩国的首款基因治疗药物[45-46]。5结语与展望目前已上市基因治疗药物包括核酸类药物、重组病毒类药物和细胞治疗类药物，核酸类药物细分为裸质粒、反义寡核苷酸和RNAi。裸质粒药物目前的主要应用方向为编码促血管生成因子基因，进一步优化方向为提高其在体内的稳定性与利用度。反义寡核苷酸药物近年来取得了良好的市场表现，美国渤健公司年报披露，2021年Spinraza全球销售额达到20.52亿美元，2021年12月3日该品种正式纳入我国医保，进入医保后，Spinraza在我国的市场规模预计达到30亿元人民币。已上市反义寡核苷酸药物适应证主要是罕见病，我国因人口基数庞大，罕见病人数相对较多，市场需求较高，反义寡核苷酸药物在我国具有相当大的市场潜力。RNAi药物起步较晚，首个药物于2018年获批，RNAi药物对于载体的要求较高，因此构建载体技术平台是开发RNAi药物的关键。重组病毒药物已为肿瘤及罕见病带来突破性的疗效，诺华的Zolgensma只要注射1次就可治愈脊髓性肌萎缩症，展现出基因治疗药物巨大的优势，诺华年报披露2021年Zolgensma全球销售额达到13.51亿美金。细胞治疗药物中自体细胞治疗药物开发较多，异体细胞治疗药物开发较少，然而从生产成本的角度考虑，使用自体细胞生产流程较长，成本远远高于异体细胞，但是使用异体细胞目前效果不佳且副作用较大，仍需技术上的突破。从发展阶段来看，基因治疗正处迅速发展期，越来越多的基因治疗药物进入到临床试验阶段。相信在不久的将来，基因治疗会给更多的疾病带来颠覆的解决方案，给患者带来更多的用药选择。数据说明 本文中的上市药物数据和研发管线数据主要来源于：1）全球权威期刊所发表的与基因治疗相关学术文献，该部分已分别标注于文中；2）中国国家药品监督管理局网站（www.nmpa.gov.cn）、美国食品药品监督管理局网站（www.fda.gov）、欧洲药品管理局网站（www.ema.europa.eu）、英国药品与保健品监管局网站（http://www.mca.gov.uk/home.htm）、日本药品与医疗器械管理局网站（www.pmda.go.jp）等；3）中国临床试验登记与信息公开平台（www.chinadrugtrials.org.cn）、美国临床试验（clinicaltrials.gov）、澳大利亚临床试验（www.australianclinicaltrials.gov.au）等；4）国内外制药企业官网：辉瑞（www.pfizer.com）、诺华（www.novartis.com）、百济神州（www.beigene.com）、人福医药（www.humanwell.com.cn）等；5）各大综合类及医药类新闻网站，如美通社（www.prnasia.com）、商业资讯（services.businesswire.com）、世界医药新闻（www.worldpharmanews.com）、Drugs.com（www.drugs.com）、新浪医药新闻（med.sina.com）。 基于上述数据源，以医药知识为核心，结合药融云公司人工智能团队，利用 Python 语言的数据采集与数据分析功能建立了药融云数据库，实时监控了全球范围内已上市、临床、临床前、药物发现各阶段的基因治疗药物信息，同时通过医药专业人员对智能化监控的数据进行了标准化处理、统计、分析和校对。参考文献：[1]  邓洪新 , 魏于全 . 肿瘤基因治疗的研究现状和展望 [J]. 中国肿瘤 生物治疗杂志 , 2015, 22(2): 170-176.[2] Gruntman A M, Flotte T R. 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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注全球基因治疗药物研发现状分析 PPS 朱凌峰，王中健*（药融云数字科技（成都）有限公司，四川成都610000）[摘要]随着DNA重组、基因克隆等技术的逐步成熟，基因治疗这一具有革命性的医疗技术不断发展，改变了单基因遗传病的治疗现状，为肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病等带来了新的选择。截至2022年2月，全球已有37款基因治疗药物获批上市。通过对1998年至2022年2月全球范围内获批上市的基因治疗药物进行数据监控与分析，包括药物分类、药物名称、适应证、批准日期、批准国家、研发公司等，并且对全球在研基因治疗药物的研发现状进行分析总结，以期为基因治疗药物的立项与研发提供参考。1基因治疗药物概述1968年，美国科学家迈克尔·布莱泽发表了《改变基因缺损：医疗美好前景》的文章，首次在医学界提出了基因治疗的概念[1]。基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的[2]。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）对基因治疗定义为：基因治疗是一种通过改变人的基因来治疗或治愈疾病的技术。基因治疗可以通过以下几种机制发挥作用：1）用一个正常基因来替换致病基因；2）使不能正常发挥作用的致病基因失活；3）将一种新的或经过修饰的基因导入体内以帮助治疗疾病。基因治疗药物，是指经过药物监管机构批准的用于治疗人体相关疾病的基因类产品[3]。从1998年全球首款基因治疗药物上市到2015年期间，断断续续有少量基因治疗药物获批；从2016年开始，每年都有多款基因治疗药物获批上市。截至2022年2月，全球共有37款基因治疗药物获批上市，从1998年到2022年2月，每年基因治疗药物获批上市的数量如图1所示。基因治疗药物按照结构可划分为核酸类药物、重组病毒类药物以及细胞治疗类药物。其中核酸药物按照种类又可划分为DNA药物（裸质粒等）、RNA药物[干扰RNA（RNAi）等]及反义寡核苷酸药物，其作用原理是借助一定载体将核酸药物传送进细胞内并进行复制转录继而从基因层面起到治疗效果；重组病毒类药物是利用人工修饰过的病毒选择性进攻人体病灶部位，以起到治疗疾病的目的，该类药物目前大多用于治疗癌症；细胞治疗类药物以细胞为主体通过基因工程技术对相关功能细胞进行改造，改造后的细胞直接输送回病人体内用以治疗相关疾病。已上市37款基因治疗药物中，核酸类药物共计15款，其中裸质粒2款，反义寡核苷酸9款，RNAi4款；重组病毒类药物9款；细胞治疗类药物13款（见图2）。从获批药物的疾病领域来看，近一半是罕见病，其次是肿瘤（见图3）。针对肿瘤的基因治疗主要是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy，CAR-T）药物和溶瘤病毒药物。从获批药物使用的载体来看，裸质粒/寡核苷酸最多，其次是慢病毒和逆转录病毒载体（见图4）。本文将分别按照核酸类药物、重组病毒类药物和细胞治疗类药物对目前已经上市的基因治疗药物以及全球研发现状进行介绍。2核酸类药物2.1裸质粒截至2022年2月，全球共有2个裸质粒药物获批上市，分别为2011年在俄罗斯上市的Neovasculgen（cambiogenplasmid）和2019年在日本上市的Collategene（beperminogene perplasmid）（见表1）。Neovasculgen是一个编码血管内皮生长因子基因的质粒，注射到人体内后，表达出的血管内皮生长因子能够促进血管的生成，从而改善患者的生活质量[4]。Collategene是一种编码肝细胞生长因子基因的质粒，注射到人体内后，表达出的肝细胞生长因子能够促进血管的生成，从而治疗缺血性疾病。相关研究表明[5-6]，病毒载体介导的促血管生成因子基因的传递诱导了小鼠心脏血管瘤的形成，将表达血管内皮生长因子的基因工程细胞注入到正常肌肉中，术后24d后也可以观察到血管瘤的形成。因此，为避免促血管生成因子的长期表达，裸质粒是一个很好的选择。目前裸质粒的主要开发方向就是编码促血管生成因子基因。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的裸质粒基因治疗药物共计39个（见图5）。目前处于Ⅲ期临床的2款药物的相关信息如表2所示。重组质粒-肝细胞生长因子注射液（pUDK-HGF）是由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所研发，人福医药合作开发的裸质粒药物。其治疗严重下肢缺血性疾病导致的肢体静息痛的Ⅲ期临床试验（CTR20181274）正在进行中，首次公示日期为2018年8月9日，主要临床机构为首都医科大学宣武医院。由Helixmith公司研发的重组人肝细胞生长因子裸质粒注射液（NL-003）目前正在全球范围内开展临床试验，其在中国的开发由北京诺思兰德生物技术股份有限公司进行，目前治疗下肢缺血性疾病的Ⅲ期临床试验（CTR20190746和CTR20190750）正在进行中，首次公示日期为2019年4月17日，主要临床机构为北京协和医院。2.2 反义寡核苷酸反义寡核苷酸是一种单链寡核苷酸分子，通常包含15~25个核苷酸残基。其进入细胞后在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则同与其互补的靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）结合，抑制靶基因的表达。截至2022年2月，全球共有9款反义寡核苷酸药物获批上市（见表3）。1998年，美国FDA批准了首款基因治疗药物Vitravene（fomivirsen），Vitravene是一种反义寡核苷酸，可用于治疗局部免疫缺陷患者（包括获得性免疫缺陷综合征患者）的巨细胞病毒视网膜炎，但是，由于更高效抗逆转录病毒治疗药物的开发，Vitravene于2002年退出欧洲市场，并于2006年退出美国市场[7]。2013年，美国FDA批准了一款包含载脂蛋白B-100的反义寡核苷酸药物Kynamro（mipomersen）用于治疗纯合子家族性高胆固醇血症[8]。2016年，有2个反义寡核苷酸药物获得美国FDA批准，分别为Spinraza（nusinersen）和Exondys51（eteplirsen）。Spinraza用于治疗脊髓性肌萎缩，Exondys51用于治疗杜氏肌营养不良症[9-10]。2018年7月，Tegsedi（inotersen）作为一款反义寡核苷酸药物获得欧盟药品管理局（European Medicines Agency，EMA）的批准，用于治疗遗传性甲状腺淀粉样变性[11]。2019年，Waylivra（volanesorsen）获得了EMA批准用于治疗成年人家族性乳糜微粒血症综合征[12]。Vyondys53（golodirsen）获得了FDA批准用于治疗杜氏肌营养不良症[13]。2020年，日本独立行政法人医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA）批准了Viltepso（viltolarsen），用于治疗杜氏肌营养不良症[14]。2021年，FDA批准了Amondys45（casimersen）用于治疗杜氏肌营养不良症[15]。从治疗领域来看，除了已经退市的Vitravene外，全部是罕见病治疗领域，其中有4个适应证为杜氏肌营养不良症。从开发公司来看，小核酸药物研发公司Ionis公司占5个，Sarepta公司占3个。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的反义寡核苷酸基因治疗药物共计345个，临床前180个，进入临床阶段的共计90个（见图6）。其中，目前处于Ⅲ期临床的13款药物如表4所示。Alicaforsen是细胞间黏附分子-1的反义抑制剂，最新的针对结肠袋炎的Ⅲ期临床效果不佳，未达到预期主要终点，经内窥镜评估缓解率，与安慰剂相比并无改善（4.6% vs. 4.9%）。Sepofarsen是一种旨在解决CEP290基因中p.Cys998X突变引起的莱伯先天性黑内障的反义寡核苷酸，p.Cys998X突变会导致mRNA的异常剪接和中心体蛋白290（centrosomal protein of 290 kDa，CEP290）失去功能，sepofarsen通过结合到pre-mRNA的突变位置，使得产生正常的CEP290[16]。Imetelstat是一种端粒酶抑制剂，在治疗骨髓增生异常综合征的Ⅱ/Ⅲ期临床试验IMerge中，imetelstat取得了积极的临床效果，持续8周输血不依赖率达到34.3%，而其中未接受过低甲基化药物或来那度胺治疗，且无染色体5q缺失的持续8周输血不依赖率达到53.8%[17]。AKCEA-APOCIII-LRx是由Ionis公司专有的配体共轭反义技术平台开发的反义寡核苷酸药物，能够抑制载脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein C-Ⅲ，ApoC Ⅲ）的产生。ApoC Ⅲ是一种在肝脏中产生的蛋白质，在血清三酰甘油的调节中发挥着核心作用。Trabedersen是TGF-β2基因mRNA区域的反义互补物，通过下调TGF-β2mRNA发挥抑制作用。在Ⅱ期临床研究中，与标准化疗治疗相比，使用10mmol·L-1trabedersen治疗的复发/难治性晚期胶质瘤患者的2年生存率更高。亨廷顿舞蹈症的主要机制为患者4号染色体上的亨廷顿基因CAG三核苷酸重复扩增，从而导致亨廷顿蛋白质具有延伸的聚谷氨酰胺束，并在细胞内积聚成大分子团，影响神经元的正常功能[18]。Tominersen可以在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则与其互补的靶mRNA结合，抑制靶基因的表达。基于这一原理，tominersen可靶向相应的mRNA以防止蛋白质产生，基于非盲独立数据监测委员会对受试者的潜在风险/收益比提出了意见，罗氏于2021年3月宣布终止tominersen治疗显性亨廷顿舞蹈症的Ⅲ期GENERATION HD1临床的给药工作。携带肉瘤融合基因（fused in sarcoma，FUS）突变的患者会发展成罕见形式的肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），即FUS-ALS，FUS基因突变是青少年ALS最常见的病因。ION-363是一种靶向FUS mRNA的反义药物，以减少FUS蛋白质的产生。在FUS-ALS小鼠模型中，反义介导的突变FUS蛋白质减少可以防止运动神经元丢失。通过靶向FUS-ALS的根本病因，ION-363有潜力减少或防止患者的病情进展。Aganirsen可抑制胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）的表达，被研究用于角膜和视网膜新生血管的治疗。Tofersen是一种反义寡核苷酸药物，旨在降低超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）的mRNA，从而降低SOD1蛋白，在对SOD1-ALS的Ⅲ期临床试验VALOR中，与安慰剂相比，tofersen在其主要终点上并没有取得统计上显著的改善。Eplontersen是一种靶向转甲状腺素的反义寡核苷酸药物。Pelacarsen是首个靶向脂蛋白（a）[lipoprotein（a），Lp（a）]的反义寡核苷酸降脂药，pelacarsen的Ⅱb期临床试验研究显示，98%的患者Lp（a）水平降至50mg·dL-1以下的适宜水平。ION-373是一种靶向胶质纤维酸性蛋白mRNA的反义寡核苷酸药物，FDA已授予ION-373孤儿药资格认定。Donidalorsen是一种抑制前激肽释放酶产生的反义寡核苷酸药物，前激肽释放酶在遗传性血管性水肿急性发作相关的炎症介质激活中起关键作用，该药物治疗遗传性血管性水肿的Ⅲ期临床正在进行中，Ⅱ期临床试验研究显示，与安慰剂组相比，donidalorsen可减少遗传性血管性水肿的发作。2.3 RNA干扰药物截至2022年2月，全球共有4款RNAi药物获批上市（见表5），4款RNAi药物都是小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）药物，siRNA进入细胞后，与解旋酶和其他因子结合，形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC与mRNA结合，使得mRNA降解。2018年，Onpattro（patisiran）作为首个RNAi药物获得FDA和EMA的许可，用于治疗淀粉样变性[19]。2019年，Givlaari（givosiran）获得FDA批准用于治疗肝卟啉病。2020年，2款RNAi药物获批上市，Oxlumo（lumasiran）获得EMA和FDA批准用于治疗高草酸尿症[20]，Leqvio（inclisiran）获得EMA批准用于治疗高胆固醇血症。Leqvio的获批上市，也使得RNAi疗法的疾病领域不仅局限于罕见病[21]。载体上，除了Onpattro使用的纳米脂质体，后续3个药物都是使用靶向肝细胞的N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）修饰。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的RNAi基因治疗药物共计235项（见图7），其中临床前131项。已提交上市申请和Ⅲ期临床试验的7款药物如表6所示。RNAi疗法药物vutrisiran靶向和沉默特定的mRNA，从而阻止野生型和突变型甲状腺素转运蛋白（transthyretin，TTR）的产生，在Ⅲ期临床试验HELIOS-A中取得积极的临床结果，2021年6月，Alnylam宣布FDA已受理vutrisiran的新药申请[22]。Fitusiran使用siRNA来靶向并减少抗凝血酶，从而促进血友病A或B的患者有足够的凝血酶生成，以恢复止血功能和防止出血。然而于2020年11月，因发现新的不良反应事件，赛诺菲宣布fitusiran的研究暂时搁置。Tivanisiran是一种靶向香草酸受体（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）的小分子RNAi疗法药物，Sylentis公司发布的Ⅲ期临床试验HELIX显示，中央角膜染色的减少有改善（P=0.035）。Cosdosiran是一种靶向细胞凋亡相关基因caspase-2的mRNA的siRNA药物，拟用于治疗视网膜神经节细胞死亡相关的疾病。目前，cosdosiran用于非动脉性缺血性视神经病变治疗的Ⅱ/Ⅲ期临床试验已于2019年6月终止，原因是中期分析的结果不足以支持后续的患者入组。Teprasiran可通过暂时抑制P53介导的细胞死亡，减少急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）发生，41个临床试验中心共360例患者随机分为给药组（10mg·kg-1）和安慰剂组，给药方式为术后4h内单次静脉推注，术后7d内每日随访，第30、90和365d时再进行3次随访观察。结果显示，teprasiran可显著降低心脏术后患者AKI的发生率、严重程度及持续时间，90d内主要不良事件的发生率与安慰剂组无统计学差异[23]。Nedosiran是一种正在开发用于原发性高草酸尿症（primary hyperoxaluria，PH）1、PH2和PH3型的RNAi候选药物，旨在抑制肝乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的产生，该酶可催化乙醛酸代谢途径的最后一步，可以导致PH1、PH2或PH3患者草酸过量产生，在治疗PH患者中的关键临床试验PHYOX2中取得了积极顶线结果。ARO-APOC3是一种靶向ApoC Ⅲ的RNAi药物，其治疗家族性乳糜微粒血症的Ⅲ期临床试验正在进行中。3重组病毒类药物病毒因其良好的感染效率和在体内外靶细胞中持久表达的潜力被用于生物研究领域重组细胞的构建以及作为医药领域基因治疗技术的重要载体。而现在，病毒除了可以作为细胞和基因治疗药物的主要工具外，重组病毒也已经作为一类药物进入临床使用[24]。目前，主要应用的病毒包括腺病毒及腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒等。截至2022年2月，全球共有9款重组病毒类基因治疗药物获批上市（见表7）。2003年，我国批准一款重组腺病毒载体表达p53治疗头颈癌的基因治疗药物——今又生（重组人p53腺病毒注射液）。今又生被认为是我国首个商品化的基因治疗药物[25]。2005年，我国批准了用于治疗鼻咽癌的世界首个溶瘤病毒药物安柯瑞（重组人5型腺病毒注射液）[26]。2007年，菲律宾批准了Rexin-G（Mx-dnG1）用于治疗软组织肉瘤和骨肉瘤，Rexin-G也是一种溶瘤病毒药物，所用的病毒载体为逆转录病毒[27]。2009年，拉脱维亚批准了Rigvir（VirusECHO-7）用于治疗黑色素瘤，Rigvir也是一款溶瘤病毒药物，所用的病毒载体为ECHO-7肠道病毒[28]。2012年，EMA批准了Glybera（alipogene tiparvovec）用于治疗家族性脂蛋白脂酶缺乏症，Glybera所用的载体为重组腺相关病毒。Glybera的获批上市是整个基因治疗领域的里程碑，促进了基因治疗的发展。但是，由于高昂的价格以及市场需求有限，Glybera已经撤市[29]。2015年，Imlygic（talimogene laherparepvec）获得FDA批准用于治疗黑色素瘤，这是FDA批准的首个溶瘤病毒药物，使用的载体为单纯疱疹病毒[30]。2017年，腺相关病毒载体药物Luxturna（voretigene neparvovec-rzyl）获得FDA批准上市用于治疗经证实的双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养障碍性疾病[31]。2019年，美国FDA批准Zolgensma（onasemnogene abeparvovec-xioi）用于治疗脊髓性肌萎缩症[32]。2021年6月，PMDA宣布授予Delytact（teserpaturev）许可，在一定的条件及时限内，允许被应用于治疗恶性胶质瘤患者。目前已上市的9款重组病毒类药物中，5款为溶瘤病毒，说明这种借由病毒的“以毒攻毒”的溶瘤病毒疗法已经逐渐取得成功。治疗领域来看，肿瘤治疗有6款，罕见病治疗有3款。使用最多的载体为腺相关病毒载体。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的病毒载体药物共计980项，其中临床前570项，药物发现147项，临床阶段共计250项（见图8）。溶瘤病毒疗法已上市及在研状态共计212项（占全部重组病毒的21.6%），其中临床前101项（占临床前重组病毒的17.8%），药物发现38项（占比25.9%），临床阶段68项（占临床阶段重组病毒的27.2%）。目前提交上市申请的4款药物如表8所示。Lenadogene nolparvovec是一款重组腺相关病毒的基因治疗药物，病毒内包含编码人野生型线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4蛋白（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase4，ND4）的基因，该化合物专为治疗ND4基因突变相关的Leber遗传性视神经病变而开发。GenSight公司根据Ⅰ/Ⅱa期临床试验研究（CLIN-01）、2项关键性Ⅲ期的有效性研究（CLIN-03A：RESCUE和CLIN-03B：REVERSE）以及RESCUE和REVERSE的长期随访研究，同时结合统计学的间接比较方法，确立基因疗法与自然病史对比的药效和获益-风险比，并以此为基础提交上市申请[33]。Valoctocogene roxaparvovec是一种使用腺相关病毒来递送凝血因子Ⅷ功能基因，用以恢复凝血因子Ⅷ的产生，从而起到治疗A型血友病的基因治疗药物，Ⅲ期临床研究结果显示，年化出血率下降84%。Eladocagene exuparvovec是一种基于腺相关病毒提供芳香族L-氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase，AADC）基因的基因治疗药物[34]。Nadofaragene firadenovec是一款重组腺病毒的基因治疗药物，含有干扰素α-2b基因，每3个月1次通过导管灌注膀胱。腺病毒进入膀胱壁细胞后，释放出活性基因，经转录和翻译后，使膀胱壁细胞分泌大量的干扰素α-2b蛋白，从而增强抗肿瘤活性[35]。4细胞治疗4.1自体细胞治疗细胞治疗是利用患者自体或异体的成体细胞或干细胞对组织、器官进行修复的治疗方法。FDA对来自于患者自体的细胞基因治疗的定义是：从患者体内取出细胞、基因改造（通常使用病毒载体），然后回输到患者体内。细胞治疗给患有无法治愈的疾病的患者带来了希望。截至2022年2月，全球共有11款自体细胞基因治疗药物获批上市（见表9）。2016年，EMA批准Strimvelis用于治疗由于腺苷脱氨酶缺失导致的重症联合免疫缺陷。Strimvelis是一种表达人腺苷脱氨酶的CD34+自体细胞，是全球首个获批上市的细胞基因治疗药物[36]。2017年，FDA批准了全球首款及第2款CAR-T产品Kymriah（tisagenlecleucel）和Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。2款药物都是在体外将CD19基因导入到患者自体的T细胞中。Kymriah可用于治疗25岁以下的复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病；Yescarta被用来治疗成年患者复发或难治愈的大B细胞淋巴瘤[37-38]。2019年，EMA批准了Zynteglo用于治疗12岁及以上的输血依赖性β-地中海贫血症，Zynteglo是一种含有造血干细胞的用慢病毒载体转导了βA-T87Q球蛋白基因的CD34+自体细胞[39]。2020年，2款自体细胞治疗药物上市，分别为FDA批准的用于治疗套细胞淋巴瘤的CAR-T产品Tecartus（brexucabtagene autoleucel）以及EMA批准的用于治疗异染性脑白质营养不良的药品Libmedly。Libmedly是一种含有造血干细胞和祖细胞的用慢病毒载体转导了人芳基硫酸酯酶A基因的CD34+自体细胞[40]。2021年，3款CAR-T产品和1款自体细胞治疗药物获得批准上市，FDA批准了用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的Breyanzi（lisocabtagene maraleucel）和治疗多发性骨髓瘤的Abecma（idecabtagene vicleucel）[41-42]，我国批准了倍诺达（瑞基奥仑赛注射液）用于治疗经过二线或以上系统性治疗后复发或难治性大B细胞淋巴瘤的成人患者，倍诺达成为我国首个获批为1类生物制品的CAR-T产品。EMA批准了Skysona用于治疗携带ABCD1基因突变的、18岁以下的早期脑性肾上腺脑白质营养不良患者。2022年2月28日，FDA批准Carvykti（ciltacabtagene autoleucel）用于复发或难治性多发性骨髓瘤患者，Carvykti是一款靶向B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）的CAR-T产品，Carvykti是首款由我国自主研发获得FDA批准上市的CAR-T产品[43]。截至2022年2月，全球处于已上市及在研状态的CAR-T药物共计797项，临床阶段共计376项（见图9），适应证以肿瘤为主。4.2 异体细胞治疗在异体细胞基因治疗中，提供基因修饰细胞的供体与接受基因修饰细胞的受体是不同的人。从生产制造的角度来看，异体细胞治疗产品可以形成商业化的现成品，相较于自体细胞治疗，这可以大大降低生产成本[44]。截至2022年2月，全球共有2款异体细胞基因治疗产品获批上市（见表10）。2016年，EMA批准Zalmoxis（nalotimagene carmaleucel）用于造血干细胞移植后辅助恢复患者的免疫系统。2017年，韩国批准Invossa（tissuegene-c）治疗中度骨性关节炎，这是韩国的首款基因治疗药物[45-46]。5结语与展望目前已上市基因治疗药物包括核酸类药物、重组病毒类药物和细胞治疗类药物，核酸类药物细分为裸质粒、反义寡核苷酸和RNAi。裸质粒药物目前的主要应用方向为编码促血管生成因子基因，进一步优化方向为提高其在体内的稳定性与利用度。反义寡核苷酸药物近年来取得了良好的市场表现，美国渤健公司年报披露，2021年Spinraza全球销售额达到20.52亿美元，2021年12月3日该品种正式纳入我国医保，进入医保后，Spinraza在我国的市场规模预计达到30亿元人民币。已上市反义寡核苷酸药物适应证主要是罕见病，我国因人口基数庞大，罕见病人数相对较多，市场需求较高，反义寡核苷酸药物在我国具有相当大的市场潜力。RNAi药物起步较晚，首个药物于2018年获批，RNAi药物对于载体的要求较高，因此构建载体技术平台是开发RNAi药物的关键。重组病毒药物已为肿瘤及罕见病带来突破性的疗效，诺华的Zolgensma只要注射1次就可治愈脊髓性肌萎缩症，展现出基因治疗药物巨大的优势，诺华年报披露2021年Zolgensma全球销售额达到13.51亿美金。细胞治疗药物中自体细胞治疗药物开发较多，异体细胞治疗药物开发较少，然而从生产成本的角度考虑，使用自体细胞生产流程较长，成本远远高于异体细胞，但是使用异体细胞目前效果不佳且副作用较大，仍需技术上的突破。从发展阶段来看，基因治疗正处迅速发展期，越来越多的基因治疗药物进入到临床试验阶段。相信在不久的将来，基因治疗会给更多的疾病带来颠覆的解决方案，给患者带来更多的用药选择。数据说明 本文中的上市药物数据和研发管线数据主要来源于：1）全球权威期刊所发表的与基因治疗相关学术文献，该部分已分别标注于文中；2）中国国家药品监督管理局网站（www.nmpa.gov.cn）、美国食品药品监督管理局网站（www.fda.gov）、欧洲药品管理局网站（www.ema.europa.eu）、英国药品与保健品监管局网站（http://www.mca.gov.uk/home.htm）、日本药品与医疗器械管理局网站（www.pmda.go.jp）等；3）中国临床试验登记与信息公开平台（www.chinadrugtrials.org.cn）、美国临床试验（clinicaltrials.gov）、澳大利亚临床试验（www.australianclinicaltrials.gov.au）等；4）国内外制药企业官网：辉瑞（www.pfizer.com）、诺华（www.novartis.com）、百济神州（www.beigene.com）、人福医药（www.humanwell.com.cn）等；5）各大综合类及医药类新闻网站，如美通社（www.prnasia.com）、商业资讯（services.businesswire.com）、世界医药新闻（www.worldpharmanews.com）、Drugs.com（www.drugs.com）、新浪医药新闻（med.sina.com）。 基于上述数据源，以医药知识为核心，结合药融云公司人工智能团队，利用 Python 语言的数据采集与数据分析功能建立了药融云数据库，实时监控了全球范围内已上市、临床、临床前、药物发现各阶段的基因治疗药物信息，同时通过医药专业人员对智能化监控的数据进行了标准化处理、统计、分析和校对。参考文献：[1]  邓洪新 , 魏于全 . 肿瘤基因治疗的研究现状和展望 [J]. 中国肿瘤 生物治疗杂志 , 2015, 22(2): 170-176.[2] Gruntman A M, Flotte T R. 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1前言大肠杆菌是最常用的基因工程菌之一，能将目的基因在体内表达，产生需要蛋白。实验室一般的大肠杆菌拥有 4288 条基因，每条基因的长度约为 950bp，基因间的平均间隔为 118bp（基因Ⅷ）。E.coli 基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。本文按 Demerec 等 1966 年提出的命名原则，总结了大肠杆菌的命名原则。表现型利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)。基因型引起这种变化的基因构成叫做大肠菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按 Demerec 等 1966 年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。2大肠杆菌基因型的表示方法01一般规则① 根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成 3 个小写斜体字母来表示。例如：DNA Adenine Methylase→dam。② 不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在 3 个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。例如：Recombination→recA、recB、recC。 ③ 突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如 supE44（sup 基因座 E 的 44 位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如 trp-31。 ④ 细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。 ⑤ 对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以 F 因子为例，F-t F 因子缺失；F+：自主性 F 因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F’：携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性 F 因子；Hfr：整合到染色体上的 F 因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（ ）”或“/”等以区别。例如：IF' [traD36、proAB、lac I q、lacZ M15] ⑥ 某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“ ”表示。例如：lac-proAB 基因缺失时它的基因型表示为 (lac-proAB)。 ⑦ 由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin 抗性→Str+或 Strr，Ampicillin 敏感性→Amp-。(第一个字母要大写,“+”或“r”表示有抗性,“-”表示无抗性或敏感)。⑧ 根据某些特异性蛋白的变异及其导致的结果变化进行表示。例如：TH2 菌株上有一种基因型表示如下：hsdS20 (rB-、mB-)，其中 S20 代表特异性识别蛋白发生变异，()中的 rB-、mB-表示由于 S20 的变异而导致 B 株来源的 hsdR 和 hsdM 的功能缺失。⑨ 蛋白质的名称与对应的基因或等位基因相同，但不用斜体，且首字母大写，如，UvrA、UvrB。3基因符号和意义表1 部分基因符号和意义4主要的基因型说明01基因重组相关的基因型1recA (Recombination)功能：recA 基因表达 ATP 依赖型 DNA 重组酶，它在λ-噬菌体与基因组 DNA 的溶原重组时起作用，同时具有对 DNA 放射性损伤的修复功能。由 recA 基因的变异所产生的基因型使同源或异源 DNA 的重组不能进行，保持插入 DNA 的稳定性，对 DNA 的转化有利。一个菌株的基因型如果是 recA，则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。2recB (Recombination)功能：recB 基因表达 ATP 依赖型 DNase 和核酸外切酶 V 的一个亚基，对 recA 的 DNA 重组酶起辅助和促进作用。DNase 催化双链 DNA 的解旋和解链，核酸外切酶 V 催化单链 DNA的裂解，在 DNA 的重组和损伤修复中发挥重要作用。recB 基因的变异导致其 DNA 重组和修复功能丧失，保证了外源 DNA 的稳定，有利于 DNA 转化。3recC (Recombination)功能：recC 基因表达四种酶，即核酸外切酶 V，ATP 依赖型的核酸内切酶，解旋酶及 ATP酶，它们和 recA, recB 所表达的酶相互协调作用，在 DNA 的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。recC 基因的变异导致 DNA 重组功能缺失，保证外源 DNA 的稳定性。02甲基化相关的基因型1dam (DNA adenine methylase)功能：dam 基因表达 DNA 腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列 GATC 中 A 的甲基化，保证 DNA 免受限制性核酸内切酶 Mbo I 的切断，同时在 DNA 复制时也起一定的辅助作用。dam 基因的变异导致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤 (A) 不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。2dcm (DNA cytosine methylase)功能：dcm 基因表达 DNA 胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别 DNA 双链上的 CCWGG 序列，并使第二个 C 甲基化，即 CmCWGG，避免 DNA 受到相关限制酶的切断。dcm 基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源 DNA 上的 C 不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。3mcrA (Modified cytosine restriction protein a)功能：mcrA 基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的 mcrA 酶，这种酶能特异性地作用于外来 DNA 上的被甲基化的胞嘧啶序列，即 C5mCGG 特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA 基因的变异，导致上述功能缺失，对外来 DNA 中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。4mcrB, C (Methyl cytosine-specific restriction)功能：mcrB, C 基因表达两种特异性蛋白，即 mcrB 蛋白和 mcrC 蛋白，它们在大肠杆菌的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，mcrC 具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源 DNA 上被甲基化的胞嘧啶（C）的特异序列G5mC 上，然后由 mcrB 蛋白切断（mcrB 蛋白是特异性切断外来 DNA 中 G5mC 序列的限制性核酸内切酶），防御外来 DNA 的侵入。mcrB, C 基因的变异，使上述的对外来 DNA的防御作用缺失，对质粒的转化有利。5mrr (Methylation requiring restriction)功能：mrr 基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA 的介入。另外，它对限制酶 Acc I，CviR I，Hinf I (Hha II)，Nla II，Pst I 以及 N6-腺嘌呤甲基化酶和 C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。mrr 欠损株（基因型）可用于含有 N6-mA 和 C5-mC 的 DNA 的转化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。6hsdM (Host specificitive defective)Map position: 99 min功能：hsdM 基因所表达的 DNA 甲基化酶是 I 型限制酶复合体（具有对 DNA 切断和修补的双重功能）的一部分，它能使 DNA 双链上的 AA (双腺嘌呤) 甲基化，保护宿主 DNA 不被分解。hsdM 的变异使细胞内的 DNA 不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。03点突变相关的基因型1mutS (Mutator)功能：mutS 基因表达的蛋白具有识别 DNA 上错配序列的功能，并能修复其错配序列（GC→AT），防止基因突变。mutS基因的变异导致 DNA 的错配序列不能得到修复，容易发生基因突变，这对于利用点突变进行基因改造是有利的。2mutT（Mutator）功能：野生大肠杆菌在进行 DNA 复制时，细胞中的 8-OXO-dGTP 插入模板 DNA 中的 DA位点的效率几乎与插入 DC 位点的效率相同，导致 A-T 转换成 G-C，使 DNA 产生变异。而mutT 蛋白就是特异性地降解 8-OXO-dGTP 成为单磷酸盐（8-OXO-dGMP），这种单磷酸盐状态的 G (鸟嘌呤) 不能作为底物进行 DNA 合成，从而防止了上述的基因突变。mutT 基因的变异使细胞中 8-OXO-dGTP 浓度增高，A→C 的突变几率增大，有利于利用点突变进行基因改造。3dut (dUTPase)功能：dut 基因表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase），它能水解 dUTP 成为dUMP，使细胞体内 dUTP 的浓度维持在较低的水平，尿嘧啶（U）就不易掺入到 DNA 中，避免了基因发生 A→U 的突变。dut 基因发生突变使 dUTPase 活性缺失，导致 dUTP 浓度升高，碱基 U（尿嘧啶）极易掺入到 DNA 中，使其发生 A→U 的基因突变，有利于利用点突变进行基因改造。4ung (Uracil DNA glycosylase)功能：ung 基因表达尿嘧啶-N-糖苷酶，这种酶能特异性识别 DNA 单链或双链上发生突变的尿嘧啶残基，并从 DNA 上水解去除尿嘧啶残基，防止 DNA 发生突变。ung 基因的变异导致上述功能缺失， 有利用点突变。5uvrB (Ultraviolet)功能：uvrB 基因表达核酸外切酶中的 b 亚基，这种核酸外切酶具有 DNA 的切补功能，对紫外线损伤的 DNA 有修补作用。uvrB 基因的变异使细胞中核酸外切酶切除变异碱基的活性缺失，有利于点突变。04核酸内切酶相关的基因型1hsdR (Host specificity defective)功能：hsdR 基因表达 I 型限制酶 EcoK (K12 株) 或 EcoB (B 株)，在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的各种 DNA 有严格的限制。HsdR 基因的变异导致菌株细胞内的 I 型限制酶 EcoK 或 EcoB 活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。2hsdS (Host specificitive defective)功能：hsdS 所表达的特异性蛋白是 I 型限制酶 EcoK 或 EcoB 复合体中的一部分，它专门负责 hsdR 酶和 hsdM 酶对 DNA 序列的特异识别。hsdS 基因的变异使hsdR 和 hsdM不能正确识别其作用的特异 DNA 序列，可以保持插入 DNA 的稳定性。3endA (Endonuclease)功能：endA 基因表达非特异性核酸内切酶 I，它能使所有 DNA 双链解开，在 DNA 的复制和重组中起重要作用。endA 基因的变异将使插入的外源 DNA 更加稳定，提取的质粒纯度更高。 05停止密码子相关的基因型1supE (Suppressor)功能：supE 基因表达的阻遏蛋白与停止密码子 UAG 结合，使蛋白质合成停止。supE 基因发生变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子 UAG，蛋白质合成仍能继续，并使 UAG 作为一个密码子来编码谷氨酰胺（Glutamine），从而使发生了琥珀突变（AAG→UAG）的基因对蛋白质表达得以延续，因此称 supE 为琥珀突变抑制因子。2supF (Suppressor)功能：supF 基因表达的阻遏蛋白与停止密码子 UAG 结合，使蛋白质合成停止。supF 基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子 UAG，蛋白质合成仍能继续，并使 UAG 作为一个密码子编码酪氨酸 (Tyrosine)。 06抗药性相关的基因型1gyrA（Gyrase） 功能：gyrA 基因表达 DNA 促旋酶 A 亚基。DNA 促旋酶在 DNA 复制时具有使 DNA 解旋和回旋的作用。萘啶酮酸 (Nalidixic acid)、4-喹啉（4-Quinoline）等抗生素抑制 DNA 促旋酶的活性是通过与促旋酶复合体 (A2B2)中的 A 亚基的结合实现的。gyrA 基因的变异使 DNA促旋酶 A 亚基不能正常表达，萘啶酮酸和荧光喹啉等失去结合目标，从而使该基因型的菌株具有了对萘啶酮酸（Nalr）和荧光喹啉的抗性。2rpsL（Ribosomal protein small subunit） 功能：细胞中的核糖体是蛋白质生物合成的场所，大肠杆菌细胞中的核糖体包含两个亚基，即 50S 亚基（23SrRNA、5SrRNA、34 种蛋白质）和 30S 亚基 [16SrRNA、21 种蛋白质（S1～S21）]。rpsL 基因就是表达核糖体 30S 亚基中的 S12 蛋白质，S12 蛋白作用于翻译的开始阶段。链霉素（Streptomycin）等抗生素的作用位点就是核糖体 30S 亚基上的 S12蛋白质，正常情况下链霉素与 S12 蛋白结合使蛋白质的生物合成不能进行，细胞停止生长。rpsL 基因的变异使链霉素失去结合位点，从而使该基因型的菌株具有了对链霉素的抗性（Str r）。3Tn5（Transposon）功能：在原核生物和真核生物基因组中都存在有可移动的 DNA 序列，一般称这段序列为转座子或转位基因，转座子上通常带有抗药性基因。Tn5 是载有卡那霉素（Kanamycine）抗性基因的转座子，当Tn5转位到大肠杆菌基因组时，能使此菌株获得卡那霉素的抗性（Kmr）。4Tn10（Transposon）功能：Tn10是载有四环素（tetracycline）抗性基因的转座子。当 Tn10 转位至大肠杆菌基因组时，能使此菌株获得四环素的抗性 (Tet r)。07能量代谢相关的基因型1lacZ（Lactose）功能：lacZ 基因是大肠杆菌中 lac 操纵子的结构基因，表达β-半乳糖苷酶，分解乳糖为半乳糖苷。β-半乳糖苷酶是由四个相同的亚基组成的，每个亚基又包含两个片断，即α片断和ω片断，只有这两种片断同时存在时，β-半乳糖苷酶才表现出活性。lacZ 基因的变异或缺失将直接导致β-半乳糖苷酶活性缺失，细胞在只有乳糖作为碳源的培养基中不能生长，由此可以进行菌株的筛选和纯化。2lacZ M15（Lactose）功能：lacZM15 是表达β-半乳糖苷酶α片断的一段基因，当 M15 缺失（△M15）时，lacZ基因虽然能表达ω片断，但不能表达α片断，β-半乳糖苷酶没有活性。当带有 lacZ（α片断）基因的 lac 操纵子通过载体 DNA（如 pUC19 DNA）转化到 lacZ△M15 基因型的细胞 (如E.coli JM109)时，在有 IPTG (异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 存在的情况下, β-半乳糖苷酶表现出活性,它能分解 X-gal (半乳糖类似物)，使其呈现蓝色。因此可以通过平板上的蓝白菌落进行克隆体的鉴定。3lacIq（Lactose）功能：lacI 是大肠杆菌中 lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是 lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使 lac 操纵子上的结构基因 lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移梅）得以正常表达。IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与 lacI 阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此 IPTG 经常作为 lac 操纵子的诱导剂而使用。基因型 lacIq是 lacI 基因发生变异而使其大量（quantity）的表达阻遏蛋白，从而使 lac 操纵基因几乎完全被抑制。利用这种基因型的菌株进行基因表达时，可以使目的基因的表达得到更有效的人为控制。4ara（Arabinose）功能：ara 基因表达阿拉伯糖代谢所需的各种酶，包括：araA 表达阿拉伯糖异构酶、araB表达核酮糖激酶、araC 表达阻遏蛋白（起调节作用），araD 表达 L-核酮糖-4-磷酸差向异构酶、araE 表达低亲和型 L-阿拉伯糖转运蛋白、araF 表达 L-阿拉伯糖结合蛋白、araG 表达高亲和性的 L-阿拉伯糖转运蛋白。ara 基因的变异，使细胞不能利用阿拉伯糖进行能量代谢，可以利用此特性进行菌株筛选。5mtl（Mannitol）功能：mtl 基因包括 mtlA、mtlC、mtlD 三种基因。mtlA 表达磷酸转移酶、mtlC 表达阻遏蛋白（起调节作用）、mtlD 表达甘露醇-1-磷酸脱氢酶。mtl 基因的变异使甘露醇代谢不能进行，细胞在以甘露醇作为唯一碳源的培养基中不能生长。6xyl（Xylose）功能：xyl 基因包含 xylA、xylB、xylR 三种基因。xylA 表达 D-木糖异构酶、xylB 表达木酮糖激酶、xylR 作为调节基因表达阻遏蛋白。xyl 基因的变异使细胞不能以木糖作为碳源进行能量代谢。7gal（Galactose）功能：gal 基因表达半乳糖代谢所需的各种酶类及调节蛋白，包括：galE（17 min）表达尿苷二磷酸（UDG）半乳糖-4-差向异构酶、galK（17 min）表达半乳糖激酶、galP（64 min）表达半乳糖透性酶、galR（62 min）表达半乳糖操纵子的阻遏蛋白、galT（17 min）表达半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、galU（27 min）表达葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。大肠杆菌 K12 株中通常出现的基因型是 galK 和 galT，由于这两种基因的变异使细胞不能直接利用半乳糖作为碳源。因此通过在最小培养基中添加半乳糖与否，进行菌株筛选和基因型确认。8srl（Sorbitol） 功能：srl 基因包含 srlA、srlC、srlD、srlR 等基因。srlA 表达磷酸转移系统相关的酶（葡萄糖醇-山梨醇透性酶、磷酸转移酶 II 等)、srlD 表达山梨醇-6-磷酸-2-脱氢酶、srlC、R 都是调控基因，表达葡萄糖醇操纵子的阻遏蛋白。Srl 基因的变异使细胞对山梨醇的吸收和利用受到阻害，在以山梨醇作为唯一碳源的培养基中，此基因型的菌株不能生长。08氨基酸代谢相关的基因型①gpt(Guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase)功能：gpt 基因表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，参与鸟嘌呤代谢。gpt 基因的变异使鸟嘌呤不能生物合成，对菌株筛选有利。2thyA (Thymine)功能：thyA 基因表达胸苷酸合成酶，参与胸腺嘧啶的代谢。thyA 基因的变异可以利用胸腺嘧啶进行菌株筛选。3asd (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase)功能：asd 基因表达天门冬氨酸半醛脱氢酶，催化如下反应：L 天门冬氨酸-4-半醛 + 磷酸盐 + NADP+ = L-4-磷酸天门冬氨酸 +NADPH，此反应是氨基酸共同合成路径的第二步。asd 基因的变异使天门冬氨酸合成受阻，用最小培养基进行细胞培养时，需特别添加天门冬氨酸。4leuB (Leucine)功能：leuB 基因表达 3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶，作用于亮氨酸生物合成的第二步，催化反应如下：3-羧基-2-羟基-4-甲基戊烯 + NAD+→3-羧基-4-甲基-2-氧戊烯 + NADH。leuB 基因的变异导致亮氨酸生物合成受阻，在用最小培养基进行细胞培养时，需特别添加亮氨酸。5proA (Proline)功能：proA 基因表达γ-谷氨酸磷酸还原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步，反应如下：L-谷氨酸-5-半醛 + 磷酸 + NADP+→L-γ-谷氨酸-5-磷酸盐 + NADPH 。proA 基因的变异或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培养基培养细胞时需要特别添加脯氨酸。6proB (Proline)功能：proB 基因表达谷氨酸岩-5-磷酸激酶，它能催化三磷酸盐与谷氨酸盐结合形成谷氨酸-5-磷酸盐，是脯氨酸合成的第一步，反应如下：ATP +L-谷氨酸盐→ADP + L-谷氨酸-5-磷酸。proB 基因的变异或缺失，使脯氨酸合成受阻，在用最小培养基培养时需特别添加脯氨酸。7trpR（Tryptophan） 功能：trpR 基因表达“trp 操纵子”的阻遏蛋白，但这种阻遏蛋白不能单独与操纵子上的操纵基因结合，只有在 L-色氨酸存在的情况下，首先与 L-色氨酸结合成复合体，然后这个复合体才能与操纵基因相结合，对 trp 操纵子起抑制作用。吲哚丙酸盐（IPA）作为 L-色氨酸的类似物也能与这种阻遏蛋白结合，但其形成的复合体没有活性，不能与操纵基因结合，因此可以把吲哚丙酸盐（IPA）作为 trp 操纵子表达的诱导剂。trpR 基因的变异，使 trp 操纵子的阻遏蛋白不能表达，有利于 trp 操纵子的蛋白表达。8lys (Lysine)功能：lys 基因分布于大肠杆菌基因组图的 17 ~ 191 min 的 5 个位置上,包括 lysA (61 min)、lysC (91 min)、lysP (46 min)、lysT (17 min)、lysX (60 min)，它们的功能如下：lysA 表达二氨基庚二酸脱羧酶、lysC 表达天冬氨酸激酶、lysP 是调节赖氨酸转运的基因、转录赖氨酸 tRNA、lysX 负责赖氨酸排泄。lys 基因的变异使赖氨酸的生物合成不能进行，用最小培养基培养时需额外添加赖氨酸。9metB（Methionine）功能：metB 基因表达胱硫醚γ-合成酶，催化反应如下：0-琥珀酰-L-高丝氨酸 + L-半胱氨酸→胱硫醚 + 琥珀酸盐，是甲硫氨酸生物合成的第二步。metB 基因的变异使甲硫氨酸的生物合成受阻，用最小培养基培养时需特别添加甲硫氨酸。10cysB (Cysteine)功能：cysB 基因表达一种阻遏蛋白，对半胱氨酸生物合成所需的各种酶的表达起调节作用。cysB 基因的变异有利于半胱氨酸的生物合成。11thr（Thronine） 功能：thr 包含三种基因，即 thrA、thrB 和 thrC。thrA 表达天冬氨酸激酶及 I-高丝氨酸脱氢酶，thrB 表达高丝氨酸激酶，thrC 表述苏氨酸合成酶。thr 基因的变异使细胞不能合成苏氨酸，用最小培养基培养时需添加苏氨酸。09维生素代谢相关的基因型1bioH（Biotin）功能：bioH 基因所表达的蛋白有两种功能：①催化前生物素到生物素的转化；②对庚二酰CoA（辅酶 A）有优先的阻害作用。bioH 基因的变异使细胞不能自身合成生物素，在最小培养基中必须添加生物素，细胞才能正常生长。2thi（Thiamin） 功能：thi 基因包含有 thiA、thiB、thiC、thiD、thiK、thiL 等。thiA 表达硫氨素噻唑转运蛋白、thiB 表达硫氨素磷酸盐焦磷酸化酶、thiC 表达硫氨素嘧啶转运蛋白、thiD 表达磷酸甲基化嘧啶激酶、thiK 表达硫氨素激酶、thiL 表达硫氨素甲磷酸激酶。thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长。10蛋白酶相关的基因型1lon（long form） 功能：lon 基因表达 ATP 依赖型蛋白分解酶（La），它对外源的异型蛋白质具有特异性的分解作用。lon 基因的变异或缺失，使细胞中的这种异型蛋白质分解酶不能得到表达，这对于保持克隆体目的蛋白的稳定是非常有利的。2ompT（Outer membrane protein）功能：ompT 基因表达特异性的外膜蛋白分解酶，它特异性地分解与细胞膜结合的含铁肠菌素受体蛋白。ompT 基因的变异使膜结合性蛋白分解酶活性缺失，有利于融合蛋白的表达。11物质转运结合相关的基因型1tonA（Transport）=fhuA（Ferric hydroxamateuptake） 功能：tonA 和 fhuA 基因处于基因组图同一位点，它们的作用也相同，都是表达外膜受体蛋白。这种受体蛋白与铁络合物结合，并与 tonB 蛋白相互协调作用，把铁化合物运至细胞质中。另外 tonA、B 受体蛋白还能与大肠杆菌素 M、噬菌体 T1、T5、φ80 等进行不可逆结合，而使细胞具有一定的抗菌作用。tonA 和 fhuA 基因的变异使细胞对铁离子的吸收受到阻害，同时使细胞对某些抗菌素及噬菌体更敏感，有利于质粒转化和菌体筛选。2tsx（T-six） 功能：tsx 基因表达 T6 噬菌体和大肠杆菌素 K 的受体蛋白，它结合于细胞膜的外表面，对T6 噬菌体和大肠杆菌素 K 进入细胞起关键作用。另外 tsx 受体蛋白还有与核苷酸特异性结合的功能，是核苷酸特异性运输通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。tsx 基因的变异使外界某些噬菌体及大肠杆菌素等对细胞的侵噬变得困难，有利于细胞基因组的稳定。3cysA (Cysteine） 功能：cysA 基因表达硫酸盐/硫代硫酸盐转移蛋白，参与细胞对硫酸盐的吸收与转运，通过cysA 蛋白转运的硫酸盐将参与半胱氨酸的生物合成。cysA 基因的变异使半胱氨酸的生物合成受到影响，在培养此基因型的菌株时要注意添加半胱氨酸。12其他1deoR (Deoxyribose)功能：deoR 是大肠杆菌中 deo 操纵子的调节基因，它表达的阻遏蛋白对 deo 操纵子具有重要的调控作用。deo 操纵子位于大肠杆菌基因图谱 100 min 的位置，它含有 deoA、deoB、deoC 和 deoD 等结构基因，分别表达 DNA 代谢所需的酶类，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸转位酶、脱氧核糖磷酸醛缩酶和嘌呤核苷磷酸化酶。deoR 基因的变异，使 deo 操纵子的阻遏蛋白不能表达，宿主细胞合成大量的 dCTP，可以选择性地改善大分子 DNA 的转化。2traD（Transmissibility） 功能：traD 基因不属于大肠杆菌基因组 DNA 范围，它是存在于 F 因子上的一段基因。traD基因在大肠杆菌的结合及 F 因子的传递方面发挥作用。traD 基因的变异使大肠杆菌细胞虽然能够结合，但 F 因子不能在细胞间发生转移，从而保证了宿主细胞和导入质粒的稳定性。3hflC（High frequence of lysogenization）功能：hflC基因表达一种高效溶原蛋白，它能使λ-噬菌体侵入大肠杆菌细胞后与基因组DNA发生溶原反应，导致噬菌体 DNA 插入到细胞基因组 DNA 中。hflC 基因的变异能避免上述的溶原反应，可以保持宿主基因组及插入质粒的稳定。4minA、B (Minicell)功能：minA、B 基因是促进微细胞 (不含 DNA) 形成的相关基因。minA、B 基因的变异阻害了微细胞的形成，可以提高克隆体的表达效率。5relA（Relaxed） 功能：relA 是松弛调节基因，对 RNA 的合成具有调节抑制作用。同时 relA 基因还表达 ATP：GTP3'-焦磷酸转移酶，负责在氨基酸饥饿状态下鸟苷 3'，5'-二磷酸 (ppGpp) 的合成，以适应饥饿环境。 relA 基因的变异对目的基因的转录有利。6glnV（Glutamine） 功能：glnV 基因专门负责转录谷氨酸 tRNA（转运 RNA），glnV 基因的变异使以谷氨酸为主的蛋白质的合成受到阻害。7tyrT（Tyrosine） 功能：tyrT 基因专门负责转录酪氨酸 tRNA（转运 RNA)，tyrT 基因的变异使以酪氨酸为主的蛋白质的合成受阻。使用时注意：基因工程中，经常使用的大肠杆菌几乎都来自于 K-12 菌株，最近也经常使用由 B 株及 C株来源的大肠杆菌。● 大肠杆菌 B 株原来就为 lon-，另外 MV1184 株不具有琥珀抑制基因 (Amber supperssor free)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。