RLR

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：先天免疫系统是抵御流感病毒的第一道防线，流感病毒会导致严重的呼吸道炎症，每年在全球造成超过65万人死亡。信使RNA（mRNA）疫苗是传统疫苗方法的有希望的替代品，因为它们具有安全剂量、低成本制造、快速开发能力和高效率。在这篇综述中，我们提供了我们对使用模式识别受体检测和响应mRNA疫苗的先天免疫反应的当前理解。我们还提供了mRNA疫苗的概述，并讨论了推进这一有前途的治疗方法的未来方向和挑战。 关键词：mRNA、疫苗、流感病毒、先天免疫、炎症体、细胞因子、炎症 1.引言 先天免疫系统是宿主对病原体的第一反应线，也是针对病毒疫苗（包括减毒或灭活病毒）的第一道防线，用于预防传染病。接种疫苗后，先天免疫系统识别并清除接种细胞，同时协调适应性免疫反应，以抗原特异性反应的形式，从而维持对病毒感染的长期保护。为了快速检测和防御各种病毒，免疫细胞已经进化出获得多种模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族蛋白（NLRs）。通过这些受体，先天免疫系统以严格调节的方式激活，同时保留适应性免疫反应，但不会引发过度的先天免疫反应，这些反应可能导致组织损伤和全身性炎症，对宿主有害。在本篇综述中，我们讨论了先天免疫识别、炎症体的激活以及对流感病毒感染及其mRNA疫苗的细胞因子分泌反应。我们还强调了mRNA疫苗作为预防和控制流感病毒疾病的有前途的工具。 2.迄今为止流感疫苗的简要历史 流感病毒是人类最严重的呼吸道传染病原之一。季节性流感病毒流行估计每年在全球导致29万至65万人死亡。流感病毒是包膜的、负义单链RNA（ssRNA）病毒，具有分节段的基因组。例如，流感A病毒（IAV）包含八个RNA片段，编码RNA聚合酶亚基[聚合酶酸性蛋白（PA）、聚合酶基础蛋白1（PB1）、聚合酶基础蛋白2（PB2）]、病毒糖蛋白[血凝素（HA），促进病毒进入；神经氨酸酶（NA），促进病毒释放]、病毒核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）和非结构蛋白1（NS1）（图1A）。IAV通过内质网摄取和释放感染细胞，病毒核糖核蛋白（vRNPs）进入细胞核进行mRNA转录和复制，通过正义互补核糖核蛋白（cRNP）中间体。病毒mRNA然后在细胞质中转化为病毒蛋白，这些蛋白被组装成新的病毒颗粒并从细胞中释放出来（图1B）。 图1 | 流感A病毒结构和复制。(A) 流感A病毒（IAV）基因组由八个分节段的单链负义RNA（vRNA）组成。每个节段都被核蛋白（NP）包裹，并通过RNA聚合酶介导，形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体（PB1、PB2、PA和NP），这是转录和复制的基本单位。(B) 感染的vRNP被运输到细胞核中，在那里发生病毒转录和复制，随后产生后代vRNP。后代vRNP被运输到细胞质后，病毒开始组装。HA，血凝素；M1，基质蛋白；M2，膜蛋白；NA，神经氨酸酶；NS1，非结构蛋白1；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶基础蛋白1；PB2，聚合酶基础蛋白2。 季节性流感病毒有四种不同类型：A型、B型、C型和D型。A型和B型流感病毒目前在人群中共同循环，并引起季节性流行：IAV的H1N1和H3N2亚型，以及流感B病毒（IBV）的两个不同谱系（山形谱系和维多利亚谱系）。通过世界卫生组织全球流感监测网络的协调，每年设计季节性流感病毒疫苗，配方包含两种IAV株和两种IBV株；然而，季节性流感病毒疫苗的有效性在每个流感季节都有很大差异。在季节性流感疫苗注射后，先天免疫细胞，包括存在于肌肉中的巨噬细胞和树突状细胞（DCs），会引起趋化因子释放的增加，这导致更多免疫细胞从血液中招募到疫苗接种部位。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞的激活，以产生抗体（图2）。然而，疫苗诱导的免疫反应狭窄且特定于株，需要不断更新（几乎每年），由于点突变的高频率，这最终是一个复杂、昂贵且耗时的过程。此外，包括禽类和猪类在内的各种流感病毒株已经获得了在人类中高效生长的能力，跨越物种障碍从动物宿主传播，并在人群中传播，对人类构成严重威胁。除了季节性流行，流感大流行每隔几十年发生一次，由猪源H1N1 IAVs引起，这些病毒以前从未循环过，并且可以迅速在人类中传播。1918年的H1N1流感大流行在全球造成约4000万人死亡。自那时以来，流感大流行由1957年的H2N2、1968年的H3N2和2009年的H1N1pdm09引起。考虑到季节性流感病毒疫苗诱导的株特异性免疫可能无法对大流行性流感病毒提供强大的保护，因此需要开发新型流感疫苗，以诱导不专注于相应疫苗株的广泛免疫。 图2 | 宿主对mRNA疫苗的免疫反应。自复制RNA（saRNA）疫苗可以以类病毒RNA颗粒、体外转录RNA和质粒DNA的形式传递。树突状细胞（DCs）在肌肉中识别saRNA并分化。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞激活以产生抗体。 在1980年代之前，已经建立了灭活疫苗和减毒活疫苗来保护人类免受致病微生物的侵害。灭活疫苗是通过化学或热处理制造的，而减毒活疫苗通常在动物或细胞系中开发。使用杀死的整个生物体疫苗或减毒活疫苗在减少包括麻疹、腮腺炎、风疹和脊髓灰质炎在内的病毒感染以及根除天花感染方面取得了巨大成功。尽管取得了成功，但传统疫苗策略仍然存在主要问题。流感病毒等传染性病原体能够逃避适应性免疫反应，而且通常很难开发减毒或杀死的整个生物体疫苗。在目前的流感病毒疫苗的情况下，主要挑战是其在老年人（65岁及以上）中的低效性，他们比儿童和成年人更容易感染流感病毒。灭活流感病毒疫苗的其他缺点通常归因于流感病毒表面抗原的突变。关于流感病毒减毒活疫苗的其他担忧包括可能引起全身性炎症和死亡，可能是由于回突变、获得补偿性突变或与循环传播的野生型株重组。 通常，流感病毒通过鼻腔或口腔腔感染宿主，首先与呼吸道上皮细胞接触，类似于通过鼻腔内给药的减毒活流感疫苗。感染呼吸道上皮细胞后，病毒或鼻腔内流感疫苗可以诱导全身和粘膜免疫反应。先天免疫细胞的防御机制，特别是DCs，是流感病毒的强大屏障。在不同的粘膜表面存在特定的免疫系统来抵抗流感病毒的入侵。存在于感染细胞内的病毒RNA被各种模式识别受体（PRRs）识别为非自身，导致促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素（IFNs）的释放。巨噬细胞、肺泡细胞、DCs和浆细胞样DCs产生I型IFNs，进而刺激邻近细胞中IFN刺激基因（ISGs）的表达，诱导抗病毒状态。 与流感病毒感染或鼻内流感疫苗不同，基于mRNA的疫苗包含编码病毒蛋白和免疫调节蛋白作为佐剂的mRNA，这些佐剂增强了免疫刺激性特性。当mRNA进入宿主细胞时，内质网（例如，TLR3、TLR7和TLR8）和细胞质先天免疫传感器（例如，RIG-I、PKR、NOD2、OAS和MDA5）识别mRNA，包括单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）。随后，免疫细胞被激活并产生I型IFN和多种炎症细胞因子。然而，疫苗中的单链mRNA通过体外转录过程适当纯化，以消除与先天免疫传感器的相互作用，这些相互作用会诱导过度分泌I型IFN及其细胞功能障碍。此外，佐剂刺激先天免疫反应，并在不引起可能引发严重副作用的全身性炎症的情况下，推动抗原特异性T细胞反应。此外，注射部位（例如，皮下、肌肉内、皮内和静脉内）和mRNA疫苗递送配方（例如脂质纳米颗粒）影响免疫反应的效力。例如，脂质纳米颗粒载体系统进一步保护mRNA免受核酸酶的侵害，并通过肌肉内注射靶向淋巴管并促进淋巴结中的蛋白质翻译。与鼻内mRNA介导的先天免疫反应相比，肌肉内mRNA主要被非免疫细胞摄取，包括局部肌细胞。一旦进入淋巴结，脂质纳米颗粒最终被DCs吞噬，从而产生并呈递抗原给T细胞以促进适应性免疫反应。mRNA疫苗诱导细胞内产生抗原蛋白以及先天免疫反应的能力必须促使CD8+和CD4+ T细胞分化为效应和记忆亚群，以保护免受感染。 体外转录的mRNA在哺乳动物中的有效使用首次报告于1990年，将报告基因mRNA注射到小鼠体内诱导了目标蛋白的产生。随后的研究表明，在下丘脑中施用编码血管加压素的mRNA可以在大鼠中诱导生理反应。然而，这些早期的有希望的结果并没有导致对mRNA疫苗开发的显著投资，因为人们担心mRNA的不稳定性、严重的先天免疫反应和体内递送无效。然而，在过去的十年中，重大的技术革新和研究投资使mRNA成为一种有前途的疫苗工具。与亚单位、灭活和减毒活病毒相比，mRNA疫苗的使用具有多种优势。由于mRNA是一种非传染性和非整合性平台，因此没有感染或插入突变的潜在风险。此外，mRNA通过正常的细胞过程降解，各种修饰和递送方法可以调节其在体内的半衰期。将mRNA配方成载体分子有助于在细胞质中快速摄取和表达，在那里它是稳定的并且高度可翻译的。此外，由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有快速、廉价且可堆叠的制造潜力。此外，已经使用非人灵长类动物模型进行了几项优雅的流感mRNA疫苗研究。在猴子中免疫修饰的非复制型mRNA编码流感H10包裹在脂质纳米颗粒中后，针对血凝素的抗体保护水平显著增加，与人类季节性流感疫苗接种后的观察结果类似。使用一种新的成像技术（正电子发射断层扫描-计算机断层扫描，PET-CT），标记有探针的mRNA疫苗被运送以评估猴子中的生物分布，提供了疫苗接种后先天和适应性免疫反应机制的见解，这些反应在接种部位和引流淋巴结转化为保护性免疫。 3.先天免疫对流感病毒的反应 IAV被包括TLRs、RLRs和NLRs在内的PRRs识别为外来物质，导致程序性细胞死亡、I型IFN的分泌和促炎细胞因子的分泌，从而引发过度炎症。 3.1.与流感病毒识别相关的TLR和RLR TLR和RLR介导的流感病毒信号诱导I型IFN的释放，并刺激感染细胞和附近细胞表达ISGs以诱导抗病毒状态。此外，TLR和RLR信号还诱导促炎细胞因子的释放，如白细胞介素（IL）-6和IL-8。TLR3在内质网中感应dsRNA。尽管感染流感病毒的细胞不产生dsRNA，但Tlr3−/−小鼠在致命流感病毒感染后比野生型小鼠寿命更长，这表明TLR3在病毒感染后识别了未知的RNA结构。此外，Tlr3−/−小鼠在流感病毒感染后产生正常的抗体，以及CD4+和CD8+ T细胞反应，表明TLR3对于产生T细胞免疫是可有可无的。在浆细胞样DCs中，TLR7识别流感病毒的ssRNA基因组。TLR7通过适配器髓系分化初级反应88（MYD88）信号传导，导致激活包括核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子7（IRF7）在内的转录因子，从而诱导产生I型IFN和促炎细胞因子。RIG-I是一种细胞质PRR，通常识别5'ppp双链RNA（dsRNA）。RIG-I还感应流感病毒复制后产生的5'ppp病毒ssRNA。在检测到流感病毒RNA后，RIG-I的解旋酶结构域与ATP相互作用，这有助于卡斯帕酶募集结构域（CARD）发生构象变化，与信号适配器线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用，以产生I型IFN。 3.2.炎症体介导的对流感病毒的反应 NLRs在抗病毒免疫反应、炎症反应和细胞因子诱导中发挥重要作用。促炎信号诱导免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的招募，以消除病原体和病原体衍生分子。IL-1β和IL-18是关键的促炎细胞因子，对抵御IAV感染很重要。IL-1β和IL-18的分泌需要分别通过炎症体介导的pro-IL-1β和pro-IL-18的蛋白水解成熟。炎症体是由caspase-1、ASC和PRRs（如NOD样受体家族蛋白3（NLRP3））组成的多蛋白复合体。在病毒配体感应后，PRRs诱导自聚合并结合到炎症体适配蛋白ASC，ASC由N末端pyrin结构域（PYD）和C末端CARD组成。ASC通过PYD结构域的同型相互作用寡聚化，然后通过CARD与caspase-1结合以形成炎症体，最终诱导炎症性细胞死亡。 在巨噬细胞中，流感病毒诱导的NLRP3炎症体激活需要Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）形成ZBP1-NLRP3炎症体。当复制时，IAV产生Z-RNAs，这是RNA双螺旋的转化版本，被ZBP1感应并与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）和caspase-8结合以激活ZBP1-NLRP3炎症体。最近，研究表明caspase-6促进RHIM依赖性RIPK3与ZBP1的结合，促进ZBP1介导的NLRP3炎症体激活。在呼吸道上皮细胞中，MxA充当炎症体传感器，识别流感病毒蛋白NP并以NLRP3独立的方式诱导IL-1β和IL-18的释放。 NLRP3和MxA炎症体激活已被证明是对抗流感病毒的重要先天免疫防御。在流感病毒株A/Puerto Rico/8/34（PR8）感染后，发现NLRP3对白细胞迁移到肺部和保护宿主免受感染很重要。在人类MxA转基因小鼠的流感病毒感染期间，呼吸道上皮中MxA炎症体的快速激活显示出抑制病毒从细支气管传播到远端肺泡区域。这些研究表明，最佳的炎症体激活对宿主有益；然而，异常激活可能导致有害结果。 4.适应性免疫对流感病毒 先天和适应性免疫反应显著保护宿主免受流感病毒侵害，并对产生强烈的抗体反应很重要。流感病毒感染后，先天免疫系统对于识别和清除接种细胞至关重要，同时也通过抗原特异性抗体反应协调适应性免疫，并提供长期保护。 在识别病毒抗原和与认知CD4+ T细胞相互作用后，幼稚B细胞被激活。一些激活的B细胞迅速分化为短寿命的浆细胞。尽管其他激活的B细胞迁移到二级淋巴组织的滤泡并经历生发中心反应，但浆细胞在人类中产生第一波病毒特异性抗体。如果浆细胞来自记忆B细胞，那么在感染后约7天，浆细胞的数量在外围达到峰值。然而，少数激活的B细胞只会分化为长寿命的浆细胞，它们迁移并居住在骨髓中产生抗体，提供长期血清抗体水平，并与抵御病原体感染和疾病的防御相关。另一部分主要激活的B细胞分化为记忆B细胞，它们不释放抗体并留在外围进行免疫监视，但它们是长寿命的，可以在感染期间重新激活成为浆细胞，以产生新的抗体和进一步的记忆B细胞。总体而言，适应性免疫衍生的抗体反应对流感病毒感染相对广泛且持久；然而，由于高突变率和抗原灵活性，流感病毒有时会偏离适应性免疫反应。需要进一步研究自然病毒感染如何诱导长期免疫反应，以开发下一代流感病毒疫苗。 5.传统的季节性流感病毒疫苗 季节性流感病毒疫苗是使用基于鸡蛋、细胞和蛋白质的技术生产的，整个过程通常需要6~8个月。针对IAVs和IBVs的流感疫苗在1940年代发明，这些全病毒灭活疫苗是在胚蛋中产生的，由甲醛和苯汞硝酸盐灭活的粗提纯全病毒组成。2012年，含有基于细胞的病毒的疫苗作为生产灭活和减毒活疫苗的替代方法出现。三价灭活和减毒活流感疫苗的有效性分别约为成人和儿童的65%和83%。通常使用的减毒活流感病毒疫苗通常是冷适应和温度敏感的，在上呼吸道而不是下呼吸道有效复制。总体而言，这些研究表明季节性流感病毒疫苗对流感病毒感染提供了良好的保护。 然而，也有关于这些疫苗的负面报告。成人75%的疫苗效力在老年人中突然下降，老年人更容易感染流感病毒。此外，疫苗和循环株之间的不匹配有时也会发生，通常与较低的疫苗效率有关。根据美国病毒学监测和美国流感疫苗效力（Flu VE）网络数据，2019-2020年流感季节所有年龄组对IAV或IBV的估计疫苗效力（VE）降至29%（2010-2018年平均VE为44.1%），由于抗原漂移的IAV（H3N2）的传播，这引发了对疫苗株选择的担忧（https://www.cdc.gov/flu/vaccines-work/past-seasons-estimates.html）。此外，保护的持续时间有时很短。为了在老年人中诱导更强、更持久的免疫反应，已经测试了高剂量疫苗或包括MF59和AS03在内的先进佐剂疫苗。高剂量疫苗的剂量是三价灭活疫苗的4倍，可以比标准剂量疫苗诱导更多的抗体。MF59佐剂季节性疫苗已在25多个国家获得许可并针对老年人群市场。AS03佐剂流感病毒疫苗也在考虑用于老年人群。 6.传统大流行流感病毒疫苗 IAV通常在一种动物种群内传播，但有时它们可以跨越并导致另一种物种生病。在后一种情况下，与在人类中循环的季节性IAV相比，表现出更显著的遗传变化。如果新型IAV具有传染性并在人类中容易传播，则被认为是流感病毒大流行。由于大多数人口对新型流感病毒株没有或只有有限的自然免疫力，因此已经使用多种生产平台开发了大流行IAV疫苗候选物。带有佐剂的灭活分裂流感病毒疫苗平台进展最远，其他平台，包括核酸（DNA和mRNA）、载体、重组蛋白（VLP；类病毒颗粒）、活病毒仍在开发中。H5N1禽流感病毒疫苗是第一个获得美国FDA批准用于人类人口的疫苗，因为对高致病性H5N1病毒可能引起流感大流行的潜力提出了关注。 流感大流行管理面临的挑战之一是在全球疫苗生产能力在爆发后的几个月内。在针对H5N1株的疫苗的情况下，使用反向遗传学生成了种子株，以去除HA的多基本裂解位点，并将背景更改为高生长PR8 H1N1株，后者表现出相对较少的致病性。这些修改有助于生产更安全的疫苗株，并大量生产，因为高致病性IAV经常杀死胚蛋，导致产量低。已经对H5N1和H7N9疫苗在人类中进行了测试，需要高抗原剂量或使用佐剂以诱导可靠的血凝抑制滴度。一项H7N9疫苗的临床试验尽管使用了佐剂，但产生了大约60%的效力，这表明为了实现足够的疫苗效力，需要佐剂和多次接种。 7.针对流感病毒的信使RNA疫苗策略 mRNA疫苗通过实验方法进行了广泛表征，这些方法改善了mRNA的稳定性和传递以及蛋白质生产。这些方法涉及开发纳米颗粒运输技术，这些技术可以稳定mRNA，增强细胞摄取，并在mRNA进入细胞时提高生物可用性。mRNA疫苗的一个明显优势是它不需要进入细胞核来促进抗原表达。 7.1.针对流感病毒的自复制mRNA疫苗 自复制RNA（saRNA）疫苗可以以质粒DNA、类病毒RNA颗粒和体外转录RNA的形式携带（图3）。基于DNA质粒的saRNA疫苗结合了更稳定的DNA核酸产品和更高水平的抗原表达的优势。saRNA疫苗在临床前模型中引起了强烈的免疫反应。saRNA疫苗源自阿尔法病毒的基因组骨架，其中编码病毒RNA复制机制的基因是完整的。 图3 | 通过自复制RNA疫苗获得抗原表达。展示了自复制RNA（saRNA）传递的三条途径。这些包括：1） 类病毒RNA颗粒通过受体介导的内吞作用将saRNA传递到细胞质；2） 直接将体外转录的复制子saRNA以生理盐水或合成配方的形式传递给细胞；3） 携带复制酶基因和转基因的质粒DNA进入细胞核，在那里转录生成复制子saRNA，然后运输到细胞质。三条saRNA疫苗途径最终产生信使RNA（mRNA），通过核糖体翻译产生疫苗抗原。 有几份报告使用了针对流感病毒的saRNA疫苗。用编码PR8 H1N1 IAV HA的10 mg saRNA疫苗免疫，在小鼠中产生了抗体反应，并在致命的同源病毒挑战中提供了保护。另一项研究表明，开发了saRNA疫苗，其中A/California/07/2009（H1N1）或A/Shanghai/2/2013（H7N9）IAV HA编码的saRNA被配制在脂质纳米颗粒中，小剂量在小鼠中两次肌肉注射后诱导了保护水平的血凝抑制滴度。与这一发现一致，另一组表明，肌肉注射0.1或0.2 mg PR8 H1N1 IAV NP、M1或联合NP+M1自复制RNA-脂质纳米颗粒疫苗在小鼠中引起了强烈的抗原特异性T细胞反应和对同源病毒感染的保护。IAV HA和NP复制子RNA与含壳聚糖的脂质纳米颗粒或聚乙烯亚胺（PEI）复合后，在小鼠皮下给药后引起了T细胞和B细胞免疫反应。最近的一项研究揭示了一种由化学修饰的阳离子树状分子复合成的脂质纳米颗粒组成的递送平台。使用这个平台，肌肉注射编码A/WSN/33（H1N1）IAV HA的RNA复制子成功地保护了小鼠免受致命同源病毒挑战。最近的一项研究显示了自复制mRNA和非复制mRNA免疫后在小鼠中免疫反应和保护效力的直接比较。动物在首次疫苗接种后八周内两次肌肉注射不同剂量的PR8 H1N1 IAV HA编码未配方自复制mRNA或未修改非复制mRNA，并进行了挑战。两个平台都引起了对同源流感病毒感染的保护。 7.2.非复制型流感病毒mRNA疫苗 非复制型mRNA疫苗可以通过结合各种修饰的核苷酸来制造，并且在开发直接可注射的非复制型mRNA疫苗方面投入了大量的努力。有几项针对流感病毒的非复制型mRNA疫苗的研究。在脂质体中复合的IAV NP编码mRNA的给药在小鼠中诱导了细胞毒性T细胞反应。用各种IAV HA、NP和NA编码的RNActive疫苗在小鼠、雪貂和猪中进行皮内免疫，单次免疫后产生了保护性免疫反应。使用PR8 H1N1 IAV HA编码未修改mRNA-脂质复合物的小鼠静脉内免疫显示单剂量给药后T细胞激活增加。总之，确定这些发现是否以及如何转化为临床试验和疫苗接种将是重要的。 7.3.先天免疫对mRNA疫苗的反应 先天免疫系统作为宿主对mRNA疫苗接种的第一反应线。在mRNA疫苗接种期间，mRNA可被各种PRRs识别，包括TLRs、RLRs和NLRs，以产生IFNs和促炎细胞因子。典型地，IFNs和促炎细胞因子对宿主大有裨益，触发IFN诱导基因的诱导和免疫细胞的浸润，以清除接种细胞。然而，失调的IFNs和促炎细胞因子会抑制mRNA疫苗的效力，导致有害的全身性超炎症和组织损伤。因此，体外转录mRNA的适当纯化对于最大化免疫原产生和避免不必要的先天免疫激活至关重要。 TLR3感应超过45个碱基对的dsRNA和来自ssRNA形成二级结构或来自病毒复制中间体的dsRNA。TLR7可以识别dsRNA和ssRNA，而TLR8只感应ssRNA。TLR7的激活可以刺激抗原呈递、细胞因子释放并诱导B细胞反应。特别是，RIG-I感应带有5'-三磷酸的ssRNA和dsRNA并刺激IFN产生。 mRNA疫苗通过RNA传感器产生的IFN产生依赖于体外转录mRNA的质量、传递载体和给药途径。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN诱导，这上调了蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这导致翻译抑制和细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解（图4）。通过包括反向相快速蛋白液相色谱或高性能液相色谱在内的色谱方法，可以有效地从体外转录mRNA中去除污染的dsRNA。这些方法的纯化已被证明可以增加人类DCs中体外转录mRNA的抗原蛋白产生高达约1000倍。除了dsRNA污染物外，单链mRNA分子被识别为PAMP并被TLR7和TLR8检测，导致I型IFN产生和体外转录mRNA的抗原蛋白产生减少。 图4 | 失调的先天免疫阻止mRNA疫苗的效力 在mRNA疫苗接种时，进入的自复制RNA（saRNA）被Toll样受体（TLR）3、TLR7和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别，这促进了它们的下游信号传导和随之而来的产生I型干扰素（IFN）。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN产生，这会诱导蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这将抑制翻译并诱导细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解。EIF2a，真核生物启动因子2a；IFNAR，干扰素α受体。 鉴于减少I型IFN信号传导对mRNA疫苗策略至关重要，几项研究揭示了减少I型IFN信号传导的修饰mRNA的开发。包括天然存在的化学修饰核苷，包括假尿苷和1-甲基假尿苷，防止TLR7、TLR8和其他先天免疫传感器的激活，从而减少I型IFN信号传导。另一项研究还表明，与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA在体外和体内（特别是在小鼠中）在原代DCs中的翻译更好。总之，mRNA疫苗与先天免疫反应之间的平衡对于潜在的疫苗方法至关重要；这种平衡必须精细控制，以减少过度的先天免疫反应，同时在DCs中保持最大的免疫原产生。 注意，虽然依赖炎症体的IL-1β和IL-18的释放触发了DCs中进一步的产生，以诱导流感病毒特异性CD8+ T细胞启动，体外转录mRNA是否可以被炎症体传感器识别在很大程度上仍然未知。未来的研究需要全面检查驱动炎症体适应性免疫反应所需的因素。 7.4.基于mRNA的流感病毒疫苗开发 mRNA疫苗最近吸引了大量关注，涉及大规模的学术和工业投资，生物技术公司已成功筹集资金用于开发创新的RNA疫苗。Moderna Therapeutics（美国）的科学家开发了第一种直接可注射的针对H10N8和H7N9的流感RNA疫苗，证明了用可接受的耐受性概况诱导保护性免疫原性的可能性。对于第一种人类季节性流感病毒RNA疫苗试验，CureVac AG公司（德国）开发了一种序列工程化的mRNA-脂质纳米颗粒策略，该策略在不使用修饰核苷酸的情况下实现了非凡的体内蛋白质翻译水平。使用这种策略，最近的一项研究表明，单次肌肉注射10 mg A/Netherlands/602/2009（H1N1）HA编码mRNA-脂质纳米颗粒在非人灵长类动物中诱导了保护范围内的血凝抑制滴度（≥1:40）。此外，第二次剂量接种有效地增强了免疫反应，并在所有接种动物中使血凝抑制滴度≥1:160超过1年。CureVac AG科学家提供的证据表明，两次免疫接种mRNA-脂质纳米颗粒编码的HA来自A/Hong Kong/4801/2014（H3N2）比许可的MF59佐剂三价灭活IAV疫苗诱导更强的T细胞和B细胞免疫反应。 7.5.mRNA疫苗的局限性 通常不常观察到与mRNA疫苗相关的超敏反应。同样，严重的急性发作，假定为免疫球蛋白E（IgE）或免疫球蛋白G（IgG）介导的，以及补体介导的过敏性或严重的迟发性T细胞介导的全身反应被认为是非常罕见的。疫苗的活性抗原也可以发展超敏性。疫苗接种后的急性超敏反应包括自限性的局部副作用，系统反应可以从荨麻疹/血管性水肿到全系统多系统涉及的全身性过敏性反应。过敏性反应是一种罕见的危及生命的过敏反应，通常在接种后几分钟到几小时内发生。疫苗诱导的过敏性反应通常很少见。2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行突显了通过脂质纳米颗粒中的mRNA疫苗进行强大疫苗生产的需求。出乎意料的是，由于公共疫苗引起的严重过敏反应较少，因此，围绕特应性个体的相当大的公众关注。以前的疫苗相关过敏性反应的免疫机制研究集中在明胶、乳胶和鸡蛋蛋白的存在上，最近更多地关注聚山梨酯80，这是一种广泛存在于许多疫苗中的表面活性剂。然而，上述所有辅料都没有包含在辉瑞-BioNTech COVID-19 mRNA疫苗中，而且在大规模2/3期临床试验中没有观察到过敏性反应病例；因此，这些事件是出乎意料的。因此，初次接触COVID-19疫苗时发生的过敏性反应是指预先存在的抗体介导的免疫（过敏）或与以前暴露无关的假过敏反应。已知过敏原引起的过敏性反应最好通过与肥大细胞和嗜碱细胞的结晶片段（Fc）ϵ受体交联的IgE的经典范式来理解，但包括抗体依赖性补体激活或IgG相关肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞介导的肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞激活通过Fcg受体的非经典途径已在动物模型和人类对药物的过敏反应中描述。不幸的是，关于疫苗潜在用途的信息用于测试以确认病理病因或预测反应风险仍然很少。在公共卫生危机期间，需要对经历过敏性疫苗反应的患者进行快速彻底的基于研究的评估，并在处于风险中的个体中进行前瞻性临床试验，以解决这些问题。 8.结论和未来研究方向 我们已经强调了IAV mRNA疫苗接种期间先天免疫系统的反应。最佳的先天免疫感应和炎症细胞因子释放对于T细胞和B细胞免疫反应至关重要。然而，过度的宿主先天免疫反应可能导致细胞因子风暴和/或组织损伤，抑制流感病毒mRNA疫苗的效力。因此，必须控制mRNA诱导的先天免疫，以减少过度炎症，同时保持抗体产生。 在过去的十年中，流感病毒mRNA疫苗领域取得了明显的突破，证明了在临床前和临床环境中的概念验证。然而，减少mRNA的先天免疫感应和将有希望的动物数据最大化转化为人类仍然是一个挑战。需要进一步的临床试验来检查长期安全性和免疫原性，以评估RNA疫苗对流感病毒疫苗领域的影响。 目前，COVID-19大流行继续在全球蔓延，迫切需要有效的疫苗来对抗它。FDA批准的mRNA疫苗在工作年龄成人中预防SARS-CoV-2感染方面非常有效，疫苗减轻了突破性感染者的病毒RNA负荷、发热症状风险和病程，尽管接种了疫苗。mRNA疫苗领域的未来是潜力无限的，相关公司和其他学术机构提供的临床数据和资源可能会显著地建立和加强基于mRNA的疫苗的基础研究。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言 天然免疫是人类抵御病毒和微生物感染的主要防御机制【1】。哺乳动物天然免疫系统主要通过模式识别受体（PRR）识别各种病原体，包括病毒、细菌以及真菌等。PRR识别保守的病原体相关分子模式（PAMP），激活宿主的天然免疫应答，随后进一步激活宿主获得性免疫应答，最终清除病原体。PRR也可以识别损伤相关分子模式（DAMP）。RIG-I样受体（RLR）是分布于胞浆内的一类模式识别受体，在病毒感染时触发天然免疫反应【2,3】。然而细胞代谢产物，特别是脂肪酸，对RLR介导的抗病毒天然免疫调节的确切影响在很大程度上仍然是未知的。 2024年9月9日，中山大学郭剑平，程超及卜浪共同通讯在Molecular Cell在线发表题为Targeting APT2 improves MAVS palmitoylation and antiviral innate immunity的研究论文【4】。该研究通过代谢小分子库筛选，发现棕榈酸（PA）在抗病毒免疫反应中发挥着重要的作用。揭示PA通过诱导MAVS发生棕榈酰化修饰，引起MAVS的聚集，激活天然免疫，增强对病毒的抵抗的新机制。提出利用小分子增强该通路活性以提高抗病毒天然免疫的新策略。 该研究通过体内外实验发现棕榈酰转移酶ZDHHC24可以棕榈酰化修饰MAVS的C46和C79位点，从而促进RLR介导的TBK1-IRF3-IFN天然免疫信号通路的激活，发挥抗病毒作用。在基因敲除小鼠中发现，Zdhhc24敲除可以显著抑制MAVS的棕榈酰化修饰以及病毒对小鼠的天然免疫信号通路的激活。同时发现高脂饮食可以通过该通路促进MAVS激活，达到抑制病毒感染的作用。此外，发现去棕榈酰化修饰酶APT2可以去除MAVS的棕榈酰化修饰，抑制抗病毒天然免疫反应。证实使用APT2的小分子抑制剂ML349可以抑制APT2对MAVS的去棕榈酰化修饰反应，来激活天然免疫，对抗病毒感染。 模式图（Credit: Molecular Cell） 综上，该研究发现小分子代谢产物PA和棕榈酰化修饰酶ZDHHC24通过促进MAVS棕榈酰化修饰，调节抗病毒先天免疫中的关键作用，并提出了利用去棕榈酰化修饰酶APT2的小分子抑制剂ML349来对抗病毒感染的潜在治疗策略。 虽然我们发现高脂饮食，尤其是棕榈酸，可以增强对病毒感染的先天免疫反应，但高脂饮食中其它成分的作用，以及这些成分如何协同调节代谢稳态和先天免疫反应还缺乏探索。鉴于高体重指数（BMI）与各种疾病的广泛关联及其对免疫反应的显著影响，基于全面的流行病学分析来评估如何通过控制高脂饮食或PA摄入量以保持其增强抗病毒感染的有益“副作用”变得尤为重要。 参考文献 1. Seth, R., Sun, L., Che, Z. (2006). Antiviral innate immunity pathways, Cell Research 16, 141–147. 2. Honda, K., Takaoka, A., and Taniguchi, T. (2006). Type I interferon gene induction by the interferon regulatory factor family of transcription factors. Immunity 25, 349-360. 3. Hou, F., Sun, L., Zheng, H., Skaug, B., Jiang, Q.X., and Chen, Z.J. (2011). MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell 146, 448-461. 4. Bu, L., Wang, H., Zhang, S., Zhang, Y., Liu, M., Zhang, Z., Wu, X., Jiang, Q., Wang, L., Xie, W., He, M., Zhou, Z., Cheng, C., Guo, J. (2024). Targeting APT2 improves MAVS palmitoylation and antiviral innate immunity. Mol Cell, 2024 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.08.014 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述