IFITM1

今天小编给大家解读一篇2月发表在Journal of Hepatology杂志（IF：25.7/Q1）的文章“Single cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity”。在本文中作者结合单细胞数据、流式细胞术和免疫荧光，阐明与慢性乙型肝炎（CHB）和功能治愈（FC）患者相关的免疫病理细胞状态。背景慢性乙型肝炎(CHB)病毒感染影响2.57亿人，主要在亚太地区和非洲地区，每年估计有80万人死于肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎患者很难彻底治愈和清除病毒感染，在患者血清中出现或不出现抗HBs抗体的情况下，病毒表面抗原(HBsAg)的丧失，也叫功能治愈(FC)。病毒感染的清除在很大程度上取决于强大和持久的适应性免疫反应。病毒特异性CD8 T细胞参与急性乙肝病毒感染。然在慢性乙肝患者中，乙肝病毒特异的CD8 T细胞最终耗尽。最近的研究表明，适应性免疫反应的损害除了高抗原负荷外，还与暴露于病毒抗原的时间有关。先天免疫反应在慢性乙型病毒性肝炎中的具体作用仍存在争议，且相对知之甚少。先天免疫反应通常被认为是慢性乙肝患者的功能受损。最近一项研究发现了一种特定的Kupffer细胞(KC)亚群，该细胞在IL2的存在下重新激活了乙肝病毒特异性CD8 T细胞的抗病毒功能。此外，其他研究表明，NK细胞细胞毒活性的增强与肝脏炎症之间存在正相关关系，尤其是在核苷类似物(NA)治疗后清除乙肝表面抗原的患者中。这些研究暗示了先天免疫细胞在慢性乙肝的解决中的潜在功能。尽管最近的研究已经通过不同测序方法探索了CHB不同阶段的肝脏环境的动态情况，但FC患者的疾病相关细胞状态(DAC)仍然难以捉摸。在本文中，作者主要目的是探索持续控制乙肝表面抗原丢失的机制基础。同时用scRNA-seq和多参数流式细胞术检测了每例肝穿刺活检的核心细胞和匹配的PBMCs，并分离了CHB患者或已实现功能性治愈的患者。通过对转录组谱、推断的细胞间相互作用和基于流式细胞术的验证研究的系统分析，作者发现了不同的免疫和上皮细胞状态，如CD4-CTL、NK细胞、中性粒细胞和表达MHC-II类分子的肝细胞，这些细胞可能在FC患者实现和维持HBsAg持续丢失中发挥重要功能。此外，作者首次提供了FC患者中存在cccDNA的直接证据。结果CHB和FC患者肝脏和PBMCs的单细胞图谱作者将CHB患者分为治疗组(n=29)和未治疗组(n=29)，其中检测到病毒HBsAg, CHB患者达到FC (n=9)。FC患者在治疗后(n=7)或自发(n=2)显示病毒HBsAg清除，并在HBsAg消失后7 ~ 84个月进行分析。作者对肝脏活检和患者匹配的PBMCs中分离出的细胞进行了scRNA-seq，以及多参数流式细胞术。并利用多重免疫荧光(mIF)染色和图像分析对来自同一肝活检的组织切片进行了验证研究（图1A）。为了重点分析免疫细胞亚群和HBV特异性T细胞的表型，CHB患者根据其定量HBsAg (qHBsAg)进行分层，高(>10000 IU/ml)，中(1000-10000 IU/ml)，和低(0.05-1000 IU/ml)（表1）。 表1：样本的EASL指南图1 CHB和FC患者的肝脏单细胞转录组图谱和匹配的PBMCs肝脏中适应性和固有免疫细胞的组成有明显的变化CHB (n=15)和FC (n=8)患者的单细胞转录组分析在肝内捕获了47109个细胞，包括26种不同的主要细胞类型/状态，分别是上皮细胞(肝细胞和胆管细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞)、内皮细胞和星状细胞(图1B)。PBMCs主要由17种不同免疫细胞亚型(主要包括T、NK、单核细胞、DCs和B细胞以及干细胞和中性粒细胞)构成(图1E)。FC患者肝内环境中T细胞显著减少，同时NK细胞和中性粒细胞增加(图1D)。而这一现象在PBMCs种并未观察到(图1G)。流式细胞术(图1H)也证实FC患者肝活检中T细胞的减少和NK/NK T细胞群的增加，而外周血则没有这种类似的改变(图1-I)。总体而言，这些观察结果提示，功能治愈的患者肝脏内的免疫细胞组成可能存在特定变化，而这些变化可能并不总是准确地反映在PBMCs中。FC患者表现为CD8 T细胞耗竭减少并出现CD4相关的适应性免疫应答接下来作者细分了主要的T细胞和NK细胞簇，然后对这些细胞类型进行重新聚类(图2A-A’)。确定了不同的细胞亚型，包括CD4辅助性T细胞、CD4细胞毒性T细胞或CD4-CTLs 、CD8效应T细胞、耗竭的CD8 T细胞、CD8记忆T细胞、Treg 细胞、肝脏常驻NK或LR-NK、常规NK或cNK 细胞以及NK T细胞。FC患者中，耗竭的PDCD1+CD8 T细胞显著减少，FOXP3+Treg几乎完全缺失(图2A-D)。耗竭标志物如TIGIT、LAG3和PDCD1在FC患者中显著降低(图2C-D)。而且这种图变化主要反映在肝脏而非PBMCs。与CHB患者相比，FC患者的FOXP3+ Treg频率下降，在肝脏中更明显(图2C)。对肝脏CD8 T细胞进行流式细胞术分析也显示，在FC患者中，PD1+和TIM3+耗竭CD8 T细胞的频率显著较低(图2E)。这不仅体现在CD69+组织驻留CD8 T细胞中，也体现在转运CD69- T细胞中。根据qHBsAg水平对CHB患者进行分层表明，耗竭CD8 T细胞的减少与qHBsAg的减少相关(图2E)。FC的患者中伴随着耗竭的CD8 T细胞和Treg细胞的丢失，CD4-CTL细胞数量增加（表达效应毒性淋巴细胞相关标志物PRF1、GZMA、GZMK、TNF、NCR3）(图2 F-F’)。此外，这些CD4-CTLs表达与终末分化、抗原敏感的CD4 T细胞(IL7R, KLRG1)相关的标记物，这些标记物显示出独特的炎症和细胞毒性效应细胞特征，包括肿瘤坏死因子(TNF)。同时它们也表达NCR3基因，类似于NK样细胞的特征（图2F, F）。流式细胞术分析显示，在组织驻留(CD69+)和转化(CD69-) T细胞中，KLRG1+ CD4 T细胞的频率均增加(图2F”)。低qHBsAg组CHB患者外周血中CD4+KLRG1+细胞比例显著高于高qHBsAg组。如图2G-G'所示，与高qHBsAg患者相比，低qHBsAg患者KLRG1+ CD4细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达增加约2-3倍，进一步证实了qHBsAg的丢失可能与CD4-CTL的出现有关。RNA velocity 分析表明，FC患者CD4-CTL的出现和增加很可能是由naïve CD4细胞分化而来(图2H)。轨迹分析也揭示了CD4-CTL和传统CD8 T细胞之间存在明确界限。作者鉴定了两种CD8 T细胞亚群：一种细胞主要在CHB中，也产生耗竭的CD8 T细胞，以PDCD1、LAG3和TIGIT的表达为标志(图2C, D)。FC的标志是耗竭的CD8 T细胞簇明显消失。剩余的CD8 T细胞亚群向NKT和cNK细胞转变。在CMV暴露的情况下也观察到类似的观察结果，CD8 T细胞表现出先天样特征，这归因于BCL11B表达缺失。cNK和NKT细胞簇在FC患者的LR-NK细胞中增加，这表明从CD8到NKT或cNK到LR-NK的转变可能促进固有免疫激活状态。总之，这些数据表明存在与CD4-CTL表达效应蛋白(PRF1, GZMA, IFNG, TNF)和通路(如IL2, STAT5)相关的适应性免疫应答改变。也强调了T细胞的可塑性以获得先天样特征功能。图2 FC患者表现出Tregs缺失、CD8 T细胞耗竭以及cd4相关适应性免疫反应的出现抗原特异性CD4 T细胞在FC患者中作为病毒清除的关键调节因子接下来，作者利用流式细胞术全面表征并比较了在CHB患者(n=17)和FC患者(n=6)肝脏和PBMCs中发现的CD8和CD4 T细胞群的表型。HBV DNA水平和qHBsAg水平之间有很强的正相关。组织驻留(CD69+) CD4和CD8 T细胞显示了记忆样T细胞(CD127+)频率的增加，以及衰老(CD57+)和终末分化(HLADR+)标志物的丧失。这些观察结果再次表明，不仅在免疫表型变化的稳健性方面，而且在两种组织类型(肝脏与PBMCs)之间观察到的模式方面存在显著差异。耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加（补充图1C-E）。这些观察结果表明，FC患者耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加。补充图1在HBV感染的自然史中，HBV特异性T细胞，尤其是CD8 T细胞与病毒控制相关。作者询问HBV特异性T细胞应答在CHB和FC患者之间是否有差异。利用酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay,  ELISpot）对HBV特异性T细胞进行去卷积，发现慢性乙型肝炎患者和FC患者的HBV特异性T细胞应答均具有肽-特异性（peptide-specific）。通过细胞内细胞因子染色进行的进一步分析表明，在出现FC的患者中，HBV特异性T细胞主要包含在CD4 T细胞群中，而HBs-特异性CD4 T细胞的出现频率高于相应的CD8 T细胞(图2I)。在所有CHB患者中均发现了核心和HBx-特异性CD8 T细胞，但频率较低(无论qHBsAg水平如何，图2I)。FC患者的pol和HBs特异性CD8 T细胞明显增加。HBV特异性CD4 T细胞(主要是pol和HBs特异性)只在出现FC的患者中观察到(图2I)，这提示在功能性治愈的长期维持中，某些肽-特异性（peptide-specific）T细胞的稳健效应功能具有重要意义。肝内NK细胞在FC患者中表现为启动状态除了CD4-CTLs的增加外，FC患者还表现出经典固有免疫应答的增加。肝脏scRNA-seq数据的分析显示，LR-NK细胞显著增加(图3A-A′)，这些细胞被认为通过分泌细胞因子和参与与各种类型细胞的信号相互作用(如招募DCs到炎症部位，促进抗原交叉呈递，从而重塑肝脏环境。FCGR3A+传统NK (cNK)细胞直接参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且可促进抗病毒T细胞应答，在FC患者中也显示出轻度增加(图3A-A′)。LR-NK细胞和cNK细胞的免疫效应功能均增加，并具有细胞因子-趋化因子分泌特异性（图3B-C）。此外，肝脏中流式细胞术分析显示，随着qHBsAg水平的下降，CXCR6+ CD69+ NK簇逐渐富集(图3D)。在FC患者中，这些细胞中激活性受体(NKp46、CD38、NKG2D和TRAIL)的表达升高和抑制性受体(如PD1和TIM3)表达降低(图3D’-D’’)。在早期的研究中已经报道过CXCR6+ CD69+ NK细胞是scRNA-seq分析中确定的LR-NK细胞的代表。也就是说，部分FC患者的LR-NK细胞还表现出其他抑制性受体的中高表达，如PD1和LAG3(图3D’-D’’)。基于这些标志物，作者确定了CD69+ CXCR6high CD16-(图3D' )和CD69+ CXCR6low CD16+(图3D' )细胞亚群，这些细胞随着HBsAg水平下降而出现，并在FC中富集。作者还发现了另一个由CD69+CXCR6- CD16-标记的细胞群，该细胞中qHBsAg水平较低(图3D'-3D'')。总之，多参数流式细胞术数据表明，组织驻留的NK细胞的效应细胞毒性功能必须被活化和抑制受体的平衡表达仔细调节。图3 FC患者表现出肝内NK细胞的预激状态FC患者肝内髓样环境重塑为免疫活跃状态以上数据表明FC患者的肝脏逐渐向免疫激活状态转变。为了了解患者的全身免疫反应，作者通过Luminex分析了血浆细胞因子、趋化因子和可溶性受体。血浆分析显示，促炎细胞因子和趋化因子如IL -1 β， ENA-78 (CXCL5)， BAFF和MCP-1 (CCL2)逐渐增加，而qHBsAg水平降低。其中，ENA-78是一种上皮中性粒细胞吸引蛋白，已知由内皮细胞产生，募集中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞到肝脏，这表明FC患者的低度炎症。中性粒细胞是构成抵御病原体第一道防线的肝内髓系细胞群的关键组成部分。越来越多的证据表明，中性粒细胞可作为固有免疫的长期调节剂，并在病毒感染和消退期间改变免疫环境中发挥作用。因此，作者探索了中性粒细胞的性质和组成在CHB和FC患者的全血和肝室中的变化。如图4A和A'所示，FC患者的全血总体中性粒细胞频率较低。然而，cluster 4(图4A和A′′cl4)显示的成熟亚群似乎在FC患者中频率增加。在不同的全血中性粒细胞亚群中， FC患者的中性粒细胞募集标志物(如CXCR2、CXCL8、CEBPB、NCF和NAMPT)总体下降。然而，在FC患者中，全血cl4中性粒细胞显示出高水平的DUSP1、PTGS2、CEBPB、ISG15、IFIT3、IFITM1和IFITM3的表达(图4B)。与CHB患者相比，FC患者上调的通路显示了通过NFkB、干扰素应答、细胞因子产生的调节、对病毒和模式识别受体通路的应答增加(图4B'和B')。FC患者的肝室中中性粒细胞数量高于CHB患者(图4C-C”)。中性粒细胞的富集可能是由于在肺部疾病和其他组织中经常观察到的中性粒细胞浸润和边集现。此外， 中性粒细胞和内皮细胞的CXCR4-CXCL12相互作用增加，CXCR1/2-CXCL2相互作用减少(图4D)，这意味着在功能治愈的患者中，中性粒细胞运输增加，并且它们长期驻留在肝脏内。FC中性粒细胞中干扰素刺激基因(ISG)的减少表明，它们可能不再积极地参与诱导先天应答(图4E)。然而，这些细胞在病毒再激活过程中反复暴露的情况下，仍有能力分泌关键细胞因子给信号效应细胞(CD4/CD8 T细胞，NK细胞)以清除病毒。此外，作者还分析了MacParland等人整合的健康肝脏中的髓系细胞中炎症基因的表达，并将其与作者自己的scRNA-seq数据进行了比较。FC患者的髓系细胞显示出不同水平的促炎和免疫活性基因(IL1B, TNF, IFNG, TGFB1, NFKB1, IL6和CD80)，而抗炎基因，如IL10的表达似乎在FC患者中比CHB和健康肝脏低得多。此外，髓系细胞的单细胞谱也提示，FC患者的肝脏环境发生了明显的重塑，转变为免疫活动状态。流式细胞术分析证实，FC患者肝脏内的CD14+促炎单核细胞增加，表明存在低级别免疫应答的生态系统。CellPhoneDB分析显示，DC2和FOLR2/VSIG4 KC群体与CD4-CTLs和记忆样CD8细胞均显示出稳健的相互作用(补充图2E-E”)，因此提示它们在诱导主动免疫应答方面的假定功能。总之，这些数据强调了髓系细胞在调节从抗炎环境向免疫活性环境的转变方面的重要功能，其机制可能是通过FOLR2/VSIG4 KCs调节增加的病毒抗原呈递和效应细胞的再教育。重要的是，这些结果强调了中性粒细胞作为FC患者持续病毒清除的重要介质的重要作用，并进一步支持增强的固有免疫反应可能在实现功能性治愈中发挥重要作用的假设。补充图2图4 FC患者肝脏内存在边缘中性粒细胞图5 功能性治愈患者肝细胞中MHC II类分子表达增加FC患者肝细胞表达MHC-IIFC患者肝脏中的免疫细胞谱显示肝脏环境中存在促炎开关，通过LR-NK，cNK和中性粒细胞增加固有免疫应答；通过特异性KCs促进CD4和CD8 T细胞的抗原呈递；以及CD4-CTLs的出现，这些CTL可以被促炎刺激(IL2, TNF, IFNG)激活，并由KC培养。目前的关键问题是，在功能性治愈患者中，CD4-CTL或HBV特异性T细胞如何有效靶向呈递病毒抗原的肝细胞。在这项研究中，作者成功地从15例CHB和8例FC患者中提取了足够数量的肝细胞(n~1850)。肝细胞亚群(图5A-A′′)似乎与FC患者特异性相关。除了HLA-A、HLAB和HLA-C表达外，MHC Il类分子(包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74和CTSS)也高表达(图5B、C)。总体而言，与CHB患者相比，FC患者中MHC I/MHC ll值较低的肝细胞数量较多。据报道，干扰素治疗可在体外肝细胞(HepG2-NTCP和PHH)和体内小鼠模型中诱导MHC Il类分子表达。通路分析显示，在MHC ll高的肝细胞中，细胞质翻译、抗原呈递和处理、凋亡、白细胞分化信号和淋巴细胞活化等增加(图5D)。在CellPhoneDB分析中，与CHB患者相比，FC患者中肝细胞与LR-NK或CD4-CTLs之间的HLA-C-FAM3C、EGFR-MIF、EGFR-COPA的相互作用减少，而XCR1-XCL1/2、HLA-DPA1-TNFSF9、CD74-COPA、CD74-MIF的相互作用增加(图5E-F)。即使在NUC+/-IFNa治疗后HBsAg仍然为阳性的患者(表1)，与FC (Sloss)患者相比，MHC Il基因(HLA-DRA、HLADRB1、HLA-DPB1)的表达显著减少(图5G)。与此同时，与FC患者相比，接受治疗的非sloss (NSLoss)患者还表现出功能障碍、耗竭的CD4-CTL其效应蛋白(如GZMA、PRF1和TNF)的表达水平较低(图5H)，同时检查点基因(包括PDCD1)的表达水平显著较高(图5H’)。总之，MHC ll高的肝细胞与LR-NKs细胞和活化的CD4-CTL之间的相互作用增强，可能触发靶向免疫应答，从而维持对CHB的长期控制。作者猜想是否有低水平的残留HBsAg由整合DNA合成，或极低水平的残留活性cccDNA可能被anti-HBs抗体掩盖，因此不容易被qHBsAg检测法检出。通过数字微流控PCR对FC患者进行的病毒学研究显示，与CHB相比，FC患者的肝活检中cccDNA水平低50倍，但持续存在(图6A)。此外，尽管FC患者的cccDNA、HBV DNA(图6B)和3.5kb HBV RNA水平较低，但FC患者的3.5kb HBV RNA与cccDNA的比值与CHB患者相似(图6 C-D)。此外，利用HBV-bait捕获富集的病毒序列的单细胞cDNA扩增(sccDNA)证实了数字微流控PCR的结果(图6E-H)。具体来说，在映射到与患者匹配的病毒基因型(图6E-H)后，病毒转录本在CHB(图6E, F)和FC(图6G,H)肝细胞中均有表达。正如预期的那样，从FC样本分离的肝细胞中病毒转录水平比CHB低100-1000倍。总之，这些数据表明，FC患者的残留cccDNA可被积极转录，以支持少量肝细胞内低水平的持续病毒复制。图6 FC患者肝细胞内存在低水平的cccDNA和病毒转录物总结在这项工作中，作者使用了多种方法包括单细胞测序、流式细胞术、ELISpot、细胞内细胞因子染色等等，主要研究了乙肝患者不同治疗结局中的免疫病理标志以及潜在的机制。文章的亮点之一就是数据，作者的患者数据非常丰富,不仅有不同乙肝患者而且测了肝脏组织以及样本匹配的PBMCs。通过单细胞分析肝组织和相匹配患者的PBMCs中疾病相关细胞状态研究，以此来为非功能性治愈患者的潜在机制提供新的见解。另外的一个亮点是，虽然文章以生物信息分析为主，但使用了非常多的湿实验手段，来证明生信分析的结果。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

MUC1是一种高度糖化的跨膜粘蛋白，位于上皮细胞的管腔表面，保护它们免受极端因素的影响。在癌细胞中，MUC1表达上调，蛋白质结构、糖基化水平和空间分布发生改变。上调的MUC1参与了多种信号通路的调节，并在肿瘤细胞代谢、细胞凋亡、上皮间质转化和转移中发挥重要作用。MUC1糖基化不足导致新的抗原表位的暴露，这些表位可作为治疗和诊断的特异性靶点。目前，基于MUC1的靶向药物包括单抗、ADC、适配子和肿瘤疫苗，其中一些已经进入临床试验。本文就MUC1结构、表达、在肿瘤生物学功能中的作用以及针对MUC1的治疗药物做一个简单介绍。MUC1结构与表达MUC1基因位于染色体1q22上，由7个外显子和6个内含子组成，编码MUCIN家族中的I型跨膜蛋白。通过选择性剪接，MUC1可以形成多种异构体，目前已鉴定出70多种，主要包括MUC1/A、MUC1/B、MUC1/C、MUC1/D、MUC1/X、MUC1/Y等 (图1)。在正常细胞中，MUC1以极性分布分布在上皮细胞的管腔表面，而在肿瘤细胞中，MUC1的分布失去了其极性。图1. MUC1异构体示意图MUC1合成后，由于空间应力作用，被水解成两个多肽片段：MUC1-C和MUC1-N，其通过共价键相连。MUC1-C包括胞外区(MUC1-C/ED)、跨膜区(MUC1-C/TMD)和胞内区(MUC1-C/CD)。MUC1-C/ED是EGFR和其他受体激酶的识别位点。MUC1-C/TMD帮助MUC1锚定在细胞膜上，并将信息从细胞外传递到细胞内。MUC1-C/CD具有多个磷酸化位点和胞内蛋白结合位点，在细胞信号转导中发挥重要作用。MUC1-N包含多个可变数目的串联重复序列(PDTRPAPGSTAP PAHGVTSA)(VNTR)。VNTR形成的多肽骨架为糖基化提供了支架。肽骨架含有一个富含Pro(P)、Thr(T)和Ser(S)的PTS区域，糖链主要通过O-糖苷键与肽骨架上的Ser/Thr相连。在正常细胞中，糖基化隐藏了免疫优势多肽表位，而癌细胞中异常的MUC1糖基化导致免疫优势多肽表位暴露。此外，在肿瘤细胞中，MUC1-N/MUC1-C复合体的破坏导致MUC1-N的脱落和MUC1-C的激活。血液中的游离MUC1-N可以中和MUC1治疗性抗体，使它们无效。MUC1在多种肿瘤中高度表达，包括乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和卵巢癌，并与预后不良有关。MUC1在正常组织和肿瘤中扮演着完全不同的角色。在正常组织中，正常糖基化的MUC1在上皮细胞表面形成一种保护性屏障，保护它们免受极端环境的影响。在癌细胞中，MUC1异常高表达，异常糖基化改变了细胞内的定位，通过许多信号通路参与多种细胞活动的调节。MUC1在肿瘤细胞中的作用MUC1与癌细胞代谢新陈代谢的转化已成为癌细胞的特征之一。癌细胞对新陈代谢进行重新编程，以维持其能量需求并适应恶劣的肿瘤微环境，同时为强劲的增殖创造条件。MUC1在肿瘤代谢重编程中起重要作用，包括葡萄糖代谢、脂肪代谢、核苷酸代谢、嘧啶代谢和谷氨酰胺代谢(图2)。图2. MUC1在肿瘤代谢重编程中的作用MUC1通过调节HIF-1a的表达帮助肿瘤细胞在低氧条件下存活和增殖。研究发现，MUC1通过调节HIF-1a调节癌细胞的代谢重编程，增加癌细胞中葡萄糖的摄取和有氧糖酵解，导致肿瘤进展。在子宫内膜癌中，AGR2通过MUC1/HIF-1a途径诱导糖酵解关键基因(LDHA、PGK1、HK2和ENO1)的表达，增加细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的产生，从而促进肿瘤进展。此外，MUC1增强TIGAR的表达，从而促进糖酵解中间产物分流到戊糖磷酸途径。代谢旁路碳流的增加促进了肿瘤细胞的合成代谢。脂代谢紊乱也是癌症最显著的代谢变化之一。癌细胞利用脂类代谢获得能量，促进合成代谢，增加恶性表型。MUC-1通过上调胆固醇和脂肪代谢酶相关基因的转录使得tamoxifen耐药。MUC1介导的EMT与转移上皮肿瘤的癌细胞需要一系列过程才能实现远处转移。从上皮细胞到间充质细胞第一次转化的特征是上皮细胞标志物减少，间充质细胞特征增加。这一过程的完成使得细胞脱离邻近细胞的紧密连接，为进入循环做准备。MUC1通过多条途径促进EMT(图3)。图3. MUC1通过多条途径促进EMT癌细胞在趋化因子的诱导下接近血管或淋巴，并黏附于内皮细胞，然后通过内皮细胞间隙进入循环。在血液循环中，癌细胞需要克服氧化作用才能生存。在乳腺癌中，MUC1通过JAK/STAT信号与STAT1相互作用，刺激干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)转录，进而促进乳腺癌细胞中的EMT。在三阴性乳腺癌中，MUC1-C激活STAT3，与pSTAT3形成复合体，驱动Twist1基因的表达，进而与Twist1直接形成复合体，不仅促进MUC1-C的表达，还在EMT过程中促进EMT转化转录因子(EMT-TF)的表达和多基因表达。此外，MUC1-C通过与ZEB1启动子区域结合的NF-kB p65形成转录复合体来促进ZEB1的转录。反过来，ZEB1与MUC1-C形成ZEB1/MUC1-C复合体，抑制上皮分化诱导剂miR-200C的转录。ZEB1和MUC1-C的协同作用最终导致EMT。在肾癌中，SNAI2促进MUC1的表达，反过来，MUC1-C和b-catenin复合体通过与SNAI2启动子区域相互作用诱导细胞的EMT而增加SNAI2的转录活性。ALKBH2通过抑制E-catenin和通过MUC1增加vimentin的表达来促进膀胱癌细胞的EMT。MUC1与癌细胞凋亡细胞凋亡是一种受基因控制的正常细胞死亡，在细胞对环境的适应和维持动态平衡方面发挥着重要作用。MUC1可抑制由凋亡物质、化疗药物和雌激素诱导的细胞凋亡(图4)。图4. MUC1抑制由凋亡物质、化疗药物和雌激素诱导的细胞凋亡死亡受体超家族的激活诱导了caspase-8的激活，从而引发了一种凋亡反应。MUC1-CD通过直接与caspase-8 p18片段结合并阻止caspase-8募集到死亡诱导信号复合体来抑制细胞凋亡。在化疗药物应激条件下，miR-551b通过抑制过氧化氢酶的表达导致细胞内ROS积聚。累积的ROS促进MUC1的过度表达，而MUC1促进EGFR介导的涉及Akt/c-Flip/COX-2的细胞生存级联的激活并抑制细胞凋亡。此外，MUC1通过激活HCT116中的JNK1抑制顺铂诱导的细胞凋亡。MUC1和STAT1之间的相互作用通过JAK/STAT信号通路驱动IFITM1在芳香酶抑制剂耐药的乳腺癌细胞中过表达，并抑制雌激素诱导的细胞凋亡。MUC1与肿瘤干细胞肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞中具有自我更新能力的一组细胞，被认为是致癌、促进肿瘤进展、肿瘤转移和癌症复发的原因。MUC1-C直接与MYC结合并驱动BRN2、Yamanaka OSKM(OCT4、SOX2、KLF4和MYC)多能因子的激活和神经内分泌(NE)去分化(图5)。图5. MUC1与肿瘤干细胞MUC1-C直接与E2F1结合，激活esBAF复合体(BRG1、ARID1A、BAF60a、BAF155和BAF170)，驱动NOTCH1、NANOG和CSC自我更新。MUC1-C整合了神经内分泌前列腺癌(NEPC)中的MYC和E2F1信号通路。MUC1-C/E2F1/esBAF/ARID1A通路可诱导EMT及NOTCH1、NANOG和MYC的表达。MUC1-C/E2F1/PBAF/PBRM1途径诱导NRF2介导的氧化还原平衡以及OSKM和NANOG的表达。MUC1-C还在PBRM1激活、氧化还原动态平衡、活性氧水平和CSC状态的相互作用中起着关键作用。MUC1与DNA甲基化MUC1和DNA甲基化过程之间有错综复杂的联系。一方面，MUC1可以调节基因甲基化。研究发现发现MUC1-C通过与DNMT1和DNMT3b启动子区域结合来调节DNA甲基化。此外，研究也发现MUC1降低了胃癌细胞中TFF2的甲基化，进而增加了TFF2的表达，并与预后相关。MUC1与肿瘤耐药研究发现，MUC1-CD不仅参与了多药耐药的形成，而且促进了多药耐药(MDR)基因的表达。沉默MUC1的癌细胞可使其对曲妥珠单抗、顺铂和tamoxifen敏感。长期使用曲妥珠单抗会导致对曲妥珠单抗敏感的乳腺细胞中FN、EGF和IL-6上调，促进STAT3的过度激活，从而促进MUC1和MUC4的表达，并通过维持HER2的持续激活最终导致对曲妥珠单抗的抗药性。沉默MUC1-C通过下调HER2激活逆转乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性。Namba等人使用KL-6/MUC1的单抗隔离MUC1，逆转了乳腺癌细胞对曲妥珠单抗介导的耐药性。Keisuke Shigeta等人的研究发现，在顺铂耐药的尿路上皮细胞系中，MUC1-C高表达，并伴有PI3K-AKT-mTOR信号通路和MDR1表达上调。MUC1下调后，PI3K-AKT mTOR信号通路和MDR1水平均降低，对顺铂的敏感性显著提高。这表明MUC1-C通过PI3K-AKTmTOR信号通路激活MDR1，导致尿路上皮癌细胞耐药。MUC1-C在Rab31的启动子上与ERa形成复合体，从而减少了tamoxifen对ERa的占据，最终导致对tamoxifen的耐药性。沉默MUC1-C导致pHER2下调，并恢复tamoxifen的敏感活性。以MUC1为基础的抗肿瘤治疗基于MUC1的治疗主要包括单抗、ADC、肿瘤疫苗、适配子，其中一些已经进入临床实验（图6）。图6. 基于MUC1药物的临床试验单抗以往针对MUC1的单抗治疗主要针对MUC1-N，但在治疗肿瘤方面效果不佳。研究人员目前正在开发针对MUC1-C和MUC1糖基的下一代单抗。Kim等人通过噬菌体展示技术分离出针对MUC1-C的抗体。后续实验证实，SKM1-02、-13和-20抗体显著抑制TNBC细胞的侵袭，SKM1-02显著抑制细胞生长。Naito等人以MUC1糖肽库为基础，设计合成了两种新型的MUC1单抗(1B2和12D10)。1B2和12D10都识别MUC1肽的PDT*R基序上的糖链。1B2识别GalNAc上O6位的O-糖链，而12D10识别相同位置的Neu5Ac。ADC基于MUC1的ADC的靶点包括MUC1蛋白骨架(MUC1-C、MUC1-N)和MUC1糖基相关蛋白。Wu等人开发了一种人源化MUC1抗体(HzMUC1)，它只识别肿瘤细胞表面的MUC1。ADC由HzMUC1与MMAE偶联而成。HzMUC1 MMAE通过诱导G2/M细胞周期停滞和促进细胞凋亡来抑制曲妥珠单抗耐药和HER2阳性乳腺癌细胞生长。Panchamoorthy等人研制了基于MUC1-C的3D1-MMAE ADC药物，并在体外实验中验证了其对MUC1-C阳性肿瘤细胞的杀伤作用。除了在MUC1蛋白骨架上发挥作用的ADC外，MUC1糖基化相关蛋白也是ADC的靶标。例如，SAR566658通过识别MUC1相关的唾液酸糖蛋白CA6来诱导肿瘤细胞死亡，并且在动物肿瘤模型中观察到SAR566658的有效剂量与CA6的表达相关。GSTA是一种特异性糖基化新抗原肽，位于MUC1异常糖基化的串联重复序列区域。MUC1 ADC的通过将GSTA新抗原特异性16A抗体与MMAE偶联来诱导细胞杀伤。研究发现16A-MMAE以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长，并且在表达人MUC1的转基因小鼠中不会产生显著的毒性。适配子适配子是具有高度特异性和亲和力的单链DNA、RNA寡核苷酸或具有三维结构的多肽。适配子可以与多种分子结合，包括纳米粒子、两亲性物质、药物等。Hanafi-Bojd开发了一种与二氧化硅纳米颗粒相结合的MUC1适配子，以有效地靶向乳腺癌细胞。Vivo-Llorca等人进一步表明，MUC1适配子包裹的二氧化硅纳米颗粒可以靶向Navitoclax耐药的TNBC细胞并诱导凋亡。Tan L等人的研究以MUC1适配子(APT)为载体，将阿霉素(DOX)导入表达MUC1的乳腺癌细胞(MCF7)。研究发现与游离DOX相比，APT-DOX复合体在不降低对靶细胞的细胞毒性的情况下，将巨噬细胞的存活率提高了近6倍。Khanet等人开发并验证了一种DNA适配子，它能特异性识别剪接变异体MUC1/Y，该剪接变异体在体内抑制乳腺癌细胞的生长。肿瘤疫苗与正常表型相比，恶性表型癌细胞的MUC1糖基化显著改变，肿瘤相关的O-糖链可作为肿瘤疫苗设计的靶点。Bilusic等人研制的基于多靶点的Ad5PSA/MUC-1/Brachyury重组免疫治疗疫苗。对于转移性去势抵抗前列腺癌(MCRPC)的患者，已经完成了I期临床试验，该疫苗耐受性良好。Wu等人开发了一种基于MUC1保护性抗原决定簇的Qβ-MUC1偶联疫苗，对乳腺癌细胞具有显著的选择性，克服了免疫耐受的缺陷。Liu等人构建的纳米颗粒能够将MUC1 mRNA疫苗运送到淋巴结中的树突状细胞(DC)，以激活和放大肿瘤特异性T细胞。mRNA疫苗联合CTLA-4单抗可显著增强机体免疫应答，有效抑制TNBC细胞生长。小编小结MUC1是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，在上皮细胞的管腔表面形成一种保护性屏障。MUC1在肿瘤细胞中高表达，其可通过调节肿瘤细胞代谢、EMT、抑制肿瘤细胞凋亡等方面促进肿瘤进展、增强肿瘤耐药性。因此，MUC1可能成为未来肿瘤靶向治疗的新靶点。目前针对MUC1的疫苗、抗体、ADC适配子正在开发中，一些处于I/II期临床试验，并已经显示出显著的治疗效果。尽管取得了这些进展，MUC1的具体作用机制仍然有待进一步探索。参考文献1.MUC1: An emerging target in cancer treatment and diagnosis.2.MUC1: structure, function, and clinic application in epithelial cancers.