MT-CO2

感谢关注转发，欢迎学术交流回复药渡Cyber，领取文献原文请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程Sigma 2受体（σ2R）在特定癌症中过度表达，视为肿瘤增殖的生物标志物。σ2R配体正在成为癌症和神经退行性疾病有前景的治疗诊断剂。密歇根大学设计和合成一系列新型喹啉基吡嗪酰胺类化合物作为高选择且有效的σ2R配体，在胰腺癌细胞系中显示出微摩尔效力。化合物14（JR1-157）和17（JR2-298）与σ2R结合亲和力Ki分别为47nM和10nM。化合物14的口服生物利用度为60%，在非同基因胰腺癌模型中具有显著的体内疗效，且没有明显的毒性。喹啉基吡嗪酰胺的细胞毒性在铜的存在下显著增强，而在铜螯合剂四硫代钼酸铜的存在下显著减弱。化合物14具有水溶性、代谢稳定的、可以口服并且增加自噬标记物LC3B的表达，值得进一步开发用于治疗胰腺癌。图1.化合物14和17发现和分子优化过程胰腺癌是一种侵袭性疾病，占美国第三大死亡原因，约占癌症的3%和死亡原因的7%。到2022年，大约62,210患者被诊断患有胰腺癌，约有49,830患者死于该疾病。由于胰腺癌早期发现困难、预后差、有效治疗方案有限、化疗耐药等，迫切需要开发有效治疗方式。近年来，σ受体（σR）已经成为治疗胰腺癌的潜在靶点。σ受体最初分为阿片受体（μ、κ和σ）的亚型，是定位于血浆中G蛋白偶联受体相关受体膜、内质网、细胞核、溶酶体和线粒体。σR分为两种亚型，σ1和σ2受体作为伴侣蛋白，干扰离子通道和GPCR受体活性，通过内质网应激和控制细胞内Ca2+稳态调节多种生理途径。σR与各种CNS疾病、神经涂星星疾病、创伤性脑损伤、药物滥用和癌症相关。σ1受体（σ1R）和σ2受体（σ2R）已被确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的潜在治疗方式。SIGMAR1基因编码σ1R，在中枢神经系统内外的多种组织中表达，其表达的蛋白除与酵母C8-C7甾醇异构酶有66.4%同源性外，与任何已知的蛋白序列均无相似性。已经有σ1R与选择性拮抗剂PD144418和选择性激动剂4-IBP共晶结构如Fig1所示。另一方面，σ2R分子结构长期以来一直不清楚。2017年，跨膜蛋白97（TMEM97）被鉴定为编码多功能四次跨膜σ2R的基因，也称为脑膜瘤相关蛋白（MAC30）。TMEM97与激素、钙和神经元信号传导相关，通过调节胆固醇的运输，在胆固醇稳态中发挥重要作用。调节胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1型（NPC1）。值得注意的是，σ2R可以作为黄体酮受体膜成分1（PGRMC1）与低密度脂蛋白受体（LDLR）三元复合物的结合位点。首批高分辨率晶体结构牛σ2R复合物如σ2R和5-HT2A拮抗剂roluperidone（PDB：7M94）和σ2R激动剂PB28（PDB：7M93）被解析出来（Fig1）。多种的化学结构具有碱性氨基和疏水片段以不同的亲和力与σR结合以及选择性公开报道出来。Siramesine是一种有效且具有选择性的σ2R激动剂。SW43在胰腺癌小鼠模型中表现出活性，PB221（PB28的阿哌嗪同系物）对脑肿瘤细胞具有抗增殖活性，在小鼠模型中显示出体内活性。直到现在，只有少数的σR配体能够进入临床阶段，包括神经退行性疾病、精神障碍、疼痛或诊断试剂。然而，目前尚没有治疗癌症临床试验的σR配体，这可能是由于对σR信号通路了解不足，以及关于σRs配体在临床前癌症模型中的活性的数据不一致。然而，越来越多的证据支持σR小分子配体作为药物治疗癌症的潜在用途。SIGMAR1转录物，σ1R蛋白水平的提升和特定的σ1R拮抗剂死亡诱导作用表明功能性σ1R是肿瘤发生和发展所必需的。另一方面，TMEM97似乎在肿瘤进展中发挥作用，并且σ2R在包括乳腺癌和胰腺癌在内的多种癌细胞系中过度表达。此外，σ2R已被用作增殖的生物标志物，并且σ2R放射性配体已用于肿瘤成像。几种σ2R配体在胰腺癌小鼠异种移植模型中显示出体内活性。虽然σ1R通过增强各种离子通道功能来控制癌细胞的电可塑性，但σ2R配体的细胞毒性可归因于ROS在内的多种致癌途径、p53和半胱天冬酶单独/依赖性细胞凋亡途径。因此，σR配体在癌症中的确切作用机制仍然不清楚。此前，已有研究发现氯喹与σ1R结合，Ki=109nM，但没有发现与σ2R结合的报道。密歇根大学假设氯喹中的5-(5-(二乙氨基)戊-2基)胺片段与σ1R结合。最近，鉴定出喹啉基吡嗪酰胺衍生物QN523作为有前途的先导化合物，在胰腺癌细胞中表现出显著的活性。因此，考虑将氯喹的片段结合到QN523上，以探索该分子结构1与σR亲和力。嫁接氯喹尾部部分可以形成盐，并可能提高整个分子的溶解度。密歇根大学提供了一类新的σ2R配体，其与σ1R相比具有纳摩尔效力和选择性，在胰腺癌异种移植模型中表现出显著的抗肿瘤活性。 确认杂交分子1与σR结合亲和力首先，将杂交分子1和氯喹对接到人σ1R与PD144418（PDB：5HK1）复合物的晶体结构中。σ1R晶体结构显示了每个聚合物中具有单个跨膜结构域的三聚体结构，其中羧基末端结构域显示出广泛的平坦、疏水性膜近端表面与内质网膜的胞质表面密切相关，在其中心有一个大的疏水性配体结合腔，使得配体具有较强的可塑性。这种结构使σ1R能够与多种蛋白相互作用，最广为人知的是其伴侣功能和与多种化学结构类型配体相结合，产生不同的σ1R配体结合模式。因此，σ1R配体的碱性氮原子与σ1R中的E172之间除了与形成结合口袋内部边缘的疏水残基形成多个疏水作用外，还会形成强的离子相互作用。密歇根大学的模型表明，与氯喹分子对接打分相比，分子1与σ1R的结合亲和力更高（化合物1为-10.69kcal/mol，氯喹为-8.74kcal/mol）（Fig3）。分子1和氯喹中带正电的碱性尾部均参与σ1R中的E172的阴离子相互作用，并且两个配体的喹啉环与L95和L182存在相互作用。分子1有较高的对接分数可能是由于与σ1R形成更多的疏水作用，尤其是与V84和F107有疏水作用。为了验证假设，合成了分子1并测试了其σR结合亲和力。与建模结果一致，与氯喹（Ki=741nM）相比，分子1对σ1R显示出更高的结合亲和力（Ki=196nM）。令人惊讶的是，分子1对σ2R表现出结合亲和力，Ki=22nM，而氯喹为5719nM。由于分子1对σ2R的高亲和力，接下来探索1的构效关系，旨在发现一类具有理想理化性质的新型选择性σ2R配体。 人类σ2R的同源模建和杂化结构1的分子对接首先用最近发布的牛σ2R与PB28（PDB：7M93）复合物的晶体结构作为模板，同源模建人σ2R模型。σ2R牛晶体结构揭示了深深嵌入膜中的配体结合位点，其中配体结合腔被溶剂阻挡。口袋横向开口进入脂质双分子层，而不是开口到内质网内腔。结合口袋的开口与疏水性和芳香族残基对齐。配体以中性、去质子化形式通过此开口进入腔穴，然后在结合位点质子化，从而与保守的D29形成盐桥。另一个保守的酸性氨基酸残基E73距D29约3Å，表明这些残基彼此通过氢键结合，E73可能被质子化。此外，位于细胞外loop环的D56参与氢键网络，该网络可能对受体的正确折叠很重要，但并不直接参与配体识别。人σ2R同源模型的结合位点与已发表的牛σ2R晶体结构几乎相同（对于22个口袋残基的主链α碳，RMSD=0.077）（Fig4）。与报道的晶体结构类似，该模型在与入口相对的结合腔内侧的一个结合子位点中包含有序分子。这种有序水分子是结合口袋的组成部分，与H21、Q77和Y103形成氢键桥接相互作用，并被认为参与了部分σ2R配体的高亲和力结合。与PB28相比，分子1对σ2R采用了不同的结合模式（Fig4）。分子1的喹啉环位置靠近由F66、L70、E73、T107、L111、I114和Y150包围的有序水分子（Fig4A）。分子1的吡嗪环面向结合腔中心的保守D29。带正电荷的末端N和分子1的吡嗪氮之间的分子内氢键正在形成假环，占据I24、M28、Y50、F54、L59、V146和Y147残基相互作用的结合腔的入口（结合模式A，Fig 4A）。因此，喹啉环取代可能会通过与σ2R残基相互作用而在很大程度上影响σ2R结合。或者，分子1以替代结合姿势翻转，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口。附加尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电荷的末端氮参与E73的阴离子相互作用（结合模式B，Fig4B）。根据这种结合模式，喹啉环上的取代可能通过与σ2R嵌入的膜成分相互作用而影响观察到的与σ2R的结合亲和力，但不与σ2R本身的残基相互作用。使用以PB28（PDB：7M93）作为模板的牛晶体结构的人σ2R同源模型的结合位点上σ2R上的分子1与PB28的对接模式比较。（A）分子1的喹啉环（橙色）靠近由F66、L70、E73、T107、T110、L111、I114和Y147相互作用的结合腔穴的入口。（B）分子1的替代对接模式，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口（结合模式B）。附件尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电的末端氮参与E73的离子相互作用。（C）质子化哌嗪PB28（绿色）通过多个离子和氢键与D29相互作用，而甲氧基取代的芳香环与M28相互作用。与对接模式A中类似，在分子动力学（MD）模拟中主要的相互作用如下：与D29形成水桥氢键作用，与E73形成疏水作用，与Y147和Y150形成多种相互作用。对接模式B，MD模拟结果如下：D29参与多种相互作用，Y50、Y147和Y150主要为疏水作用，而E73参与相互作用，但非常弱。通过MD模拟检测到两种对接模式但针对不同氨基酸的离子相互作用，即D56用于模式A，D29用于模式B。有趣的是，D29和D56都与PB28相互作用。在没有获得σ2R与喹啉基吡嗪酰胺1的晶体结构情况下，MD模拟的结果模拟了两个对接模式看起来较为合理。因此，分子的两端都可能影响其σ2R的结合亲和力。密歇根大学准备探索取代基对喹啉吡嗪酰胺骨架的影响以及附加的氯喹尾部的性质。测试了所有合成的化合物对σR的结合亲和力，并在MIA PaCa-2胰腺癌细胞中测定其细胞毒性。 除喹啉基吡嗪酰胺的C7位外，环取代耐受性良好通过在喹啉环的不同位置引入甲基、甲氧基或卤素基团来选择喹啉环中最合适的取代位置。喹啉环2-5中带有甲基的化合物与σ2R具有显著的结合亲和力，Ki为16nM至85nM。但化合物6除外（Ki=2664nM），7-Me取代对结合亲和力不利。与σ1R相比，甲氧基类似物7-9对σ2R表现出良好的结合亲和力，Ki为13至40nM，而7-甲氧基衍生物10对σ1R表现出较差的结合亲和力（Ki=1626nM）。化合物11-15中具有吸电子氯取代的衍生物表现出显著的结合亲和力，σ2R结合亲和力（Ki为12nM-51nM）。然而，对σ2R的结合选择性较低。5-氟衍生物16和6-氟衍生物17保留了对σ2R的高结合亲和力，并且化合物17最有效（Ki=10nM）和选择性（σ1/σ2=16.5）。另一方面，大体积的6-溴衍生物18分别对σ1R和σ2R表现出中等的结合亲和力，Ki分别为46nM和27nM，在这组衍生物中表现出最低的选择性。LLE对应于pIC50（pKi）和由clogP表达的亲脂性之间的差异，多数配体与靶蛋白结合具有合理的LLE≥3，这意味着良好的药物特性。密歇根大学认为空间位阻可能是σR亲和力丧失的主要原因，如C7取代的衍生物观察到的实验结果。化合物2-6的构象分析结果表明，除了7-甲基取代的化合物6外，喹啉基吡嗪酰胺骨架需要保留平面性。化合物6的吡嗪酰胺核心骨架不是平面性，可能是由于7-甲基和C8上的羰基之间的形成冲突，导致构象变化（Fig5）。这也合理解释与7-甲氧基衍生物10一样，可以扩展到C7位的任何取代基。然而，不能排除与两个σR的空间位阻。经SAR分析C6是最适合替换的位点。因此，进一步合成了化合物19-22（表2）。与化合物6相比，化合物19-21中的这些取代对两种受体亚型的效力均较弱。而环丙基衍生物22表现出显著的结合亲和力（Ki=27nM），但其选择性较低（σ1/σ2=2.6）。在探索单取代的喹啉衍生物之后，密歇根大学开始研究双取代类似物23-26，结合单取代化合物中最好的取代基，23-26的Ki值分别为36nM、70nM、79nM和28nM。然而，对σ2R的选择性较差。通过以上的结构修饰认为，除了C7位置的分子平面性破坏造成结合活性丧失外，喹啉环中的取代都具有良好的耐受性。 碱性尾部部分对于σ2R结合至关重要接下来进一步调节尾部的链长和碱性对σ2R结合亲和力的影响。选择6-甲基和6-F取代的喹啉作为尾部片段变异的模板，它们对σ2R具有高亲和力和/或选择性，以及与其他衍生物相比具有更高的LLE。首先合成了不同链结构的衍生物（表3）。没有末端碱基中心的衍生物27、30和34-36没有与σ2R的结合亲和力。与二甲基乙基氨衍生物28（Ki=471nM）或吡咯烷乙基氨基32（Ki=165nM）相比，二甲基丙氨衍生物29（Ki=105nM）对σR表现出更高的结合亲和力，这说明链长度影响σ2R结合。如果尾部中有吸电子基团大大降低对σ2R的结合亲和力，如二甲基氨基乙氧基衍生物31（Ki=1344nM）和砜衍生物33和37（Ki=3770nM和2147nM），说明尾部的碱性是σ2R结合所必需的。与哌嗪基乙基氨基化合物39相比，氨基乙基哌嗪基38表现出更高的结合亲和力（Ki=129nM vs. 400nM）。与5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链密切相似的羟基取代的尾部40表现出与σ2R的显着结合(Ki=71nM)，而化合物41中的哌啶氧基尾部具有较低的σ2R结合亲和力(Ki=134nM)。通过SAR分析，5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链非常适合与σ2R结合，并且结合亲和力取决于尾部片段的碱性和链长。 羰基和吡嗪环对于喹啉基吡嗪酰胺的σ2R结合不是必需的接下来，密歇根大学合成了化合物42和化合物43，分别考察去掉吡嗪基团和羰基的影响，这些化合物保持了显著的σ2R结合亲和力（Ki=52nM和65nM），说明结合亲和力主要来源于5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部与σ2R结合位点相互作用的贡献。用其它杂环替换吡嗪环合成了一些恶唑类似物，但由于稳定性较差没有进一步探索。用化合物44中的噻唑替换吡嗪保持了与化合物17相同的活性。作为酰胺的生物电子等排体，合成了磺酰胺连接子的化合物45，与化合物17相比，亲和力提高了3倍（表4）。化合物42-45维持了σ2R的选择性，并再次验证了5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部负责与σ2R结合。 吡嗪酰胺杂合体抑制胰腺癌细胞的生长筛选合成的化合物在MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中的细胞毒性（表1-4）。对带有氯喹尾部的单取代衍生物SAR分析表明，6-甲基类似物5是最有效的化合物（IC50=1.1±0.3μM），而7-甲基衍生物6则无活性（IC50>30μM）（表1）。同时观察到氯的类似趋势和甲氧基类似物。与2-Me或2-Cl同系物相比，化合物7中仅C2位的甲氧基取代保留了效力 (IC50=1.9±0.5μM)。5-Cl、6-Cl、6-F和6-Br衍生物14-18显示出显著的细胞毒性（表1）。显示出σ2R结合亲和力减弱的化合物（如化合物6和10）的细胞毒性明显低于具有良好结合亲和力的化合物。双取代化合物与单取代化合物相比，类似物23、25-26的细胞毒性降低了3-4倍（表2）。密歇根大学同时还研究了尾部片段的取代基的耐受性。然而，在细胞毒性方面，烷基氨基链（27-32）没有观察到太大的差别（表3）。另一方面，分别在33和34中带有尾部的二氧硫代吗啉和异羟肟酸没有细胞毒性。在探索了与吡嗪环直接C、N和O键合的化合物的活性之后，又检测了硫和磺酰基键合类似物的活性。尽管NH−SO2−基团导致35和36的效力完全丧失（IC50>30μM）；与之前合成的类似物相比，具有SO2−NH−基团的化合物37表现出更高的细胞毒性（IC50=0.6±0.3μM）。哌啶氧基类似物41中的醚键 (IC50=6.5±3.5μM) 并未改善细胞毒性。经过对不同尾部基团的探索，观察到细胞毒性与σ2R结合亲和力没有明显的相关性，后者似乎仅取决于尾部基团的链长和碱性。化合物42 和43的效力丧失表明吡嗪环和酰胺官能团对于细胞毒性至关重要（表4）。噻唑类似物44显示 IC50=1.5±1.6μM（表4）。磺酰胺衍生物45的细胞毒性低4-5倍（IC50=3.8±0.9μM），与17相比（IC50=0.9±0.3μM）（表4）。最具细胞毒性的类似物14和17对σ2R的Ki分别为47nM和10nM，尽管它们与化合物6相比选择性较低。从SAR分析结果，可以得出结论：5- ((5-(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链负责σ2R的结合亲和力，但不负责细胞毒性。两个类似物42和43尽管不具有细胞毒性，但仍显示纳摩尔范围内的σ2R结合。这与之前的研究一致，即几种σ2R配体发挥的细胞毒性与σ2R的调节无关。在TMEM97或PGRMC1敲除细胞系或 TMEM97/PGRMC1双敲除细胞系中，σ2R配体对细胞死亡的诱导不受阻碍，表明细胞毒性作用不是由TMEM97或PGRMC1直接介导的。 吡嗪酰胺类衍生物对σ2R的选择性由于σR与GPCR家族相关，密歇根大学针对一组45种GPCRs和相关跨膜靶标筛选了合成的化合物。化合物14和17相对于其他GPCRs（前20个）的选择性概况如表5所示。一般来说，大多数类似物合成的1-5、7-9、11-18和22-26表现出低纳摩尔结合，并且对σ2R的选择性比σ1R高5-10倍。 化合物14和17在人和小鼠肝微粒体中稳定在小鼠肝微粒体（MLM）和人肝微粒体（HLM）存在下，测试了对σ2R表现出高结合亲和力并在MIA PaCa-2细胞（约1μM）中为有效细胞毒性的化合物的微粒体稳定性。在MLM中，6-甲基类似物5的t1/2为21.0分钟，而相应的2-MeO类似物7, 5-氯类似物14和化合物17的t1/2分别为54.0、60.0和45.3min（表6）。6-甲基喹啉类似物5的微粒体稳定性低可能归因于苄基甲基的氧化。化合物44（MLM中t1/2=3.3min和HLM中t1/2=23.0min）和45（MLM中t1/2=15.0min和HLM中t1/2=39.2min），与化合物17（MLM中t1/2=45.3min 和HLM中t1/2>60分钟的比较，表明吡嗪具有更高的代谢稳定性。不幸的是，化合物37在MIA PaCa-2细胞中表现出所有测试化合物中最高的效力，但其微粒体稳定性较差（MLM中的t1/2=6.0min），这阻碍了进一步的探索。因此，选择化合物14和17进入体内研究。化合物14抑制多种胰腺癌细胞系的生长在人（MIA PaCa-2、PANC1和BxPC3）和鼠（PAN02和KPC-2）胰腺癌细胞中进一步评估了化合物14和17的细胞毒活性。化合物14和17在所有测试的细胞系中显示出低微摩尔细胞毒性，具有不同的效力，其中MIA PaCa-2细胞系最敏感（表7）。化合物14和17在其它五种胰腺细胞系中的MIA PaCa-2中活性更高，如集落形成测定中所示（Fig6）。化合物14对正常细胞的毒性低于吉西他滨为了评估化合物14对癌细胞的优先作用，密歇根大学在三种正常细胞系[人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人HPDE细胞系高于HFF-1细胞系(表8)。在HEK-293和HPDE细胞中，化合物14的毒性显著低于吉西他滨。化合物14与σ2R激动剂西拉美辛有轻微拮抗作用，与σ2R拮抗剂CYR-101有叠加作用为了进一步阐明细胞死亡机制，密歇根大学将14种信号抑制剂联合使用，包括铁死亡[铁他汀和去铁胺（DFO）]、细胞凋亡（Z-VAD）、坏死性凋亡（Necrostatin）、自噬（氯喹）、m-TOR（雷帕霉素）以及活性氧（ROS）、抑制剂 N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 和铁死亡诱导剂（erastin和FIN56）。化合14与铁死亡抑制剂ferrostatin和DFO具有相加或轻微协同作用。此外，化合物14还可以通过与铁死亡诱导剂erastin和FIN56表现出叠加/协同作用来诱导铁死亡。化合物14在 MIA PaCa-2 细胞中与氯喹（自噬抑制剂）具有协同作用。然而化合14与其他9种化疗药物没有表现出显著的协同作用。σ2激动剂西拉美辛和σ2R拮抗剂罗潘立酮 (CYR-101) 的联合研究表明，化合物14与roluperidone具有添加剂作用（Fig7）。化合物14提高ER应激标记GRP78的水平σ2受体存在于ER中，已知是引起未折叠蛋白反应（UPR）的ER应激诱导剂。在MIA PaCa-2细胞中评估了用化合物14（JR1-157）处理后的GRP78蛋白水平。蛋白质印迹分析显示，化合物14在24小时后增加了10μM的GRP78水平（Fig8A-C）。用σ2R配体西拉美辛和roluperidone治疗后，GRP78水平也增加（Fig8C）。化合物14增加LC3-B的蛋白质水平化合物14在结构上与氯喹相关，具有相似的氨基链，并且自噬已被证实是氯喹活性的主要作用机制。从SAR研究表明，氨基链对于该系列化合物的σ2R结合至关重要。σ2R配体可通过激活自噬途径促进细胞死亡。为了确定这一系列喹啉吡嗪酰胺的作用机制，密歇根大学进一步测试了14种自噬途径生物标志物LC3B水平的变化。观察到PANC1和MIA PaCa-2细胞中LC3-B水平呈剂量依赖性上调（Fig9）。化合物14诱导细胞凋亡据报道，σ2R配体可通过多种信号通路（包括细胞凋亡和自噬）促进细胞死亡。证实膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色分析。与对照相比，化合物14处理后凋亡群体增加（Fig10）。当MIA PaCa-2细胞用化合物14处理48小时时，观察到早期和晚期凋亡中膜联蛋白V阳性细胞的分布。这个实验结果与之前的报道一致，即σ2R配体通过两者促进细胞死亡凋亡和自噬途径。化合物14将细胞阻滞于G0/G1期为了评估对细胞周期的影响，用10μM浓度的14处理MIA PaCa-2和HCT116细胞24小时，并通过流式细胞仪分析细胞周期分布。与未处理的细胞相比，密歇根大学观察到停滞在G0/G1期的细胞呈剂量依赖性增加，而在S期则减少（Fig11）。化合物14是水溶性分子，可以与铜配位与QN523相关的N-喹啉-8-基吡嗪酰胺衍生物以其金属螯合特性而闻名。通过喹啉环中的氮原子、酰胺基团和吡嗪环的邻位氮原子与过渡金属发生配位，形成配体的两个分子与金属的一个分子的化学计量比的络合物。因此，测试了化合物5、14和17与各种金属（包括 Cu+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cr3+）形成配位络合物的能力，并使用LC-MS。化合物5、14和17与不同盐形式的铜形成配位络合物，如LC-MS光谱中化学计量比为1:1的变化所示。与7-甲基衍生物6的平面能量最小化结构不一致，没有观察到与Cu2+的金属配合物（Fig12）。尽管吡嗪和喹啉部分具有共平面性，但2-OMe类似物7并未显示出完全转化为Cu配合物，表明该位置的甲基破坏了金属配合物的形成推测是二体配体的原因。5-氯衍生物14和6-氟同系物17也仅与不同盐形式的铜形成络合物。然后测试了化合物14和17的铜配合物在MIA PaCa-2细胞中的细胞毒性。与相应的母体化合物相比，它们的效力提高了5-7倍（表9）。与正常细胞相比，铜是对铜有较高需求的癌细胞生长和增殖的限制性营养物质。铜螯合被认为可以通过减少线粒体中ATP的产生来杀死癌细胞。铜螯合似乎限制了铜结合MEK1/2酶的活性，这些酶通过KRAS或BRAF致癌突变驱动肿瘤发生。铜螯合剂四硫代钼酸铵（TTM）治疗乳腺癌患者的临床试验正在进行临床II期试验（NCT00195091）。与氯异喹啉相比，铜-氯异喹啉还显示出增强的抗癌活性。除此之外，补充有铜的双硫仑（DSF）[二乙基二硫代氨基甲酸铜复合物 (Cu(DDC)2)] 正在临床试验中进行测试，用于治疗不同的癌症，并已证明比单独使用DSF更有效。同样，密歇根大学的铜复合物比其母体具有更强的细胞毒性还测试了化合物14：CuCl2的各种化学计量比（4:1、2:1和1:1）；然而，观察到它们的细胞毒性是相当的，表明在所有情况下都形成相同的铜络合物。为了证实化合物14对MIA PaCa-2细胞的细胞毒性作用是Cu依赖性的，使用氯化铜和TTM与化合物14的组合进行集落形成测定（Fig13）。密歇根大学通过将化合物14与氯化铜组合（Fig13A）观察到强的叠加效应或协同作用，而TTM作为铜螯合剂显著挽救了化合物14的细胞毒性（Fig13B）。此外，QN523与氯化铜表现出协同作用，与TTM表现出显著的拮抗作用（Fig13C-D）。接下来，密歇根大学对化合物14与临床批准的铜螯合剂（如DSF或Andelesclomol）进行了类似的组合研究。化合物14与DSF或Orelesclomol没有表现出任何拮抗作用，这可能归因于以下事实：与TTM不同，DSF和elesclomol都是离子载体，能够螯合细胞外的铜，将形成的铜复合物在细胞内转运到不同的细胞区室，特别是线粒体，从而增加细胞内铜的浓度。另一方面，TTM预计会降低细胞内可用铜的浓度。用TTM降低Cu水平会影响MEK1/2激酶活性和BRAF驱动的肿瘤发生；而DSF通过影响ALDH活性和MEK-ERK途径来减少肿瘤生长。为了验证化合物14是选择性铜螯合剂，密歇根大学将14与醋酸金盐和醋酸银盐进行组合。另外，将化合物14、QN523和氯喹与TTM组合进行测试（Fig14）。通过用TTM预处理来挽救化合物14或QN523对MIA PaCa-2和HCT116细胞中集落形成的抑制作用。化合物14及其铜络合物（14-Cu）处理72小时后，分别在2.5和0.5μM下观察到LC3-B表达水平的剂量依赖性上调。 吡嗪酰胺杂合物的Cu配合物与σ2R结合密歇根大学进一步评估了 化合物14和17的Cu配合物的结合。结果表明，与其母体（Ki=47nM和Ki=10nM）相比，它们具有较低的σ2R结合亲和力（Ki=216nM和Ki=182nM）。然而，对于14-Cu和17-Cu配合物，观察到σ2R选择性高于σ1R的类似趋势（表9、Fig15）。 化合物14可口服密歇根大学测试了静脉内（i.v.）（10mg/kg）和口服（20mg/kg）给药后化合物14在CD-1小鼠中的药代动力学性质（表10）。静脉内给药后，化合物14表现出21L/kg的高分布体积，高分布体积。全身清除率为3730mL/h/kg，消除半衰期为4.7h。化合物14口服后也很容易吸收，AUC(0-inf)为3392h·ng/mL，口服生物利用度为60%。化合物14具有口服活性。基于其对σ2R的选择性（IC50<100nM）、良好的溶解度（>5mg/mL）和良好的微粒体稳定性（t1/2>30min），选择化合物14进行体内活性研究。MTD研究揭示化合物14和其与硫酸铜的组合可以分别以60mg/kg单独和30mg/kg（化合物14）+3mg/kg（硫酸铜）施用，而不影响小鼠的体重（Fig16A、B）。最初，每天通过腹膜内（i.p.）途径用化合物14以60mg/kg处理6至8周龄、携带Pan02细胞的雌性C57BL/6小鼠。经由腹膜内施用的化合物14显著延迟肿瘤生长（p＝0.017；Fig16C）。继续对相同剂量水平（60mg/kg/天）的化合物14的口服体内活性进行评估。类似地，化合物14具有口服活性（p=0.002；图16D）。在单独的研究中，小鼠同时接受化合物14（30mg/kg/天）和硫酸铜（3mg/kg/天）治疗32天。除了第4天和第7天外，没有观察到体重有任何显著变化。化合物14显著延迟肿瘤生长（p＜0.05 p.o. Fig16D）。这些结果表明化合物14是一种有前途的工具化合物，可以更好地阐明胰腺癌中的σ2R抑制和铜配位。 结论密歇根大学设计了一系列新型喹啉基吡嗪酰胺作为σ2R的有效配体。先导化合物14在多种胰腺癌细胞系中具有细胞毒性，并增加ER应激标记物GRP78和自噬标记物LC3-B的表达。化合物14的口服生物利用度为60%，t1/2为6h，在胰腺癌Pan02模型中显示出显著的肿瘤抑制作用。同时还证实此类化合物具有优异的铜配位特性并且是水溶性的。该系列喹啉基吡嗪酰胺的铜配合物也与σ2R结合。喹啉基吡嗪酰胺类化合物可以作为新型抗癌药物值得临床开发。文章来源https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01769请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色字体高亮的“数据挖掘”即为潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

抗体药物是一种重要的生物制剂，用于治疗多种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等。抗体药物的生产过程需要经过多个步骤，包括细胞株选择与构建、培养基与生物反应器的选择、细胞培养、抗体表达和纯化、抗体药物制剂等。本文主要详细描述抗体药物关键工艺步骤和流程。自1999年国内第一款抗体药物“抗人T细胞CD3鼠单抗”国内上市以来，后面上市几十款抗体主要以进口为主，国产抗体在近五年迎来爆发期，创新能力显著提高，但抗体药物产业链上游主要原材料、设备等长期以来高度依赖进口，国内产商寻找技术突破，在分析设备、耗材、培养设备、培养基等多领域实现国产替代，促进抗体药物研发创新。记得看完，文末有福利！抗体药物上下游产业链一、细胞株选择与构建细胞培养是抗体药物生产的第一步，主要是通过培养细胞系来产生目标抗体。哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要表达系统。对于治疗性抗体而言，为了满足其生物活性，需要进行正确的折叠和翻译后修饰，因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞，主要包括：Sp2/0骨髓瘤细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其中以CHO细胞用途最为广泛。与其他表达系统相比，CHO表达系统占有很大优势:(1)更适用于悬浮培养，可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；(2)产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；(3)所含人类病毒极少；(4)外源基因可以在CHO细胞中稳定地整合；(5)CHO细胞是成纤维细胞,几乎不分泌内源性蛋白, 因此对目标重组抗体的分离纯化工作十分有利。抗体药开发是一个非常复杂的过程，而构建适用于工业生产的高表达的细胞株是最关键的步骤之一，它直接影响了生产的效率和目标产品质量。因此，构建及优化稳定的表达不同外源基因的重组工程细胞株的实验研究至关重要。目前，治疗性重组蛋白在许多诊断和治疗中应用广泛。与合成药物不同，蛋白药物多来源于原核或真核表达系统。如大肠杆菌、哺乳或非哺乳动物细胞、昆虫细胞等细胞系表达系统，以及近几年热门研究的无细胞表达系统。生物药物常用的表达系统成功的构建工程化细胞株，即从分离高产的哺乳动物细胞株至得到未来用于临床和工程化生产的高产细胞株库，是一个步骤繁琐且漫长的过程，需要做大量的工作才能得到较高产的细胞株。以传统的筛选流程来说，从转染开始至minipool筛选，再到最后的单克隆筛选往往就要花费3-6个月的时间，而后还要进行稳定性传代实验以研究其稳定性，在得到高产单克隆后还要在上游细胞培养工艺开发阶段进行详细的优化与表征，综合起来其研发周期相对于同类药物来说显著延长，依各公司研发实力不同，其细胞株筛选至细胞培养工艺开发结束普遍需要6-12个月，甚至更长。而细胞株的构建在整个抗体产量的流程中占有较小的成本，但是在提高大批量表达的产量时却占有十分重要的地位。目前大部分的抗体药物大都是由CHO细胞进行表达的。CHO细胞能够进行正确的折叠、组装和进行类似于人抗体的翻译后修饰等能力，是生产重组蛋白类药物主要的宿主细胞。传统CHO工程细胞株的构建过程二、培养基与生物反应器的选择细胞株开发的过程中，一般需要在一定的培养工艺平台基础上进行克隆筛选。中试生产申报药品临床试验( investigational new drug，IND) 时，一般会选定2～3个来自不同系列的克隆，其中1～2个克隆作为备选。而培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有巨大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要，配制适合细胞生长和表达的培养基，包括基础培养基和补充物，常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640 等。在筛选培养基和补料培养基时，初期流加培养时基础培养基和同品牌的补料培养基应该配对进行筛选。初步筛选之后，将基础培养基和补料培养基进行分类，如促进生长类型、维持活率类型、促进表达类型等。将培养基进行混合优化时，尽量将不同类型的培养进行组合，并且应用实验设计( design of experiment，DOE) 优化。当前，以Amgen、Genentech公司为代表的生物制药巨头所使用的细胞株的蛋白表达量已达到5～10g/L，Pfizer、MedImmune 公司的个别细胞株甚至超过了10g/L。因此，细胞培养的生物反应器也从过去的大型化（20 kL）向小型化（1kL）、连续性、一次性转变。传统的不锈钢反应器在使用前需要进行彻底的清洁灭菌，而且有着更大的污染的风险，而一次性反应器可以大大节省准备的时间。带有搅拌器的袋式生物反应器，如 Hyclone 公司的 SUB、Sartorius公司的 BIOSTAT 和 Xcellerex 公司的 XDR-DSTB，正越来越多地被运用于治疗性抗体的生产。三、细胞复苏传代、扩增培养与大规模培养以典型的单抗药物的商业化生产流程为例，上游工艺（细胞培养）一般采用以下步骤：细胞复苏与传代→扩增培养→细胞大规模培养→细胞分离（可属于下游工艺）。01细胞复苏与传代将种子放置在恒温的水浴锅中，一般温度控制在如35℃左右，预热如30min，将工作细胞库细胞进行解冻复苏，根据工艺要求控制解冻时间，然后将解冻细胞加入至培养基中，离心分离后转入摇瓶中（如250 mL），进行摇瓶传代。注意控制CO 2 浓度、培养温度、培养时间等因素，同时也要根据工艺的要求控制接种的密度，控制细胞活率等要求。将上述的复苏种子细胞按照一定的密度稀释至新摇瓶中（如500 mL/2000mL），控制温度、CO 2 浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、摇床摇摆速度、pH等因素，逐渐扩增细胞数量至满足一级种子罐的接种要求。02扩增培养（亦称种子培养）一级种子培养将摇瓶种子细胞按照一定的密度接种到一级种子罐内（如20 L），控制温度、CO 2 浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足二级种子罐的要求。二级种子培养将一级种子按照一定的密度接种到二级种子罐内（如50 L），控制温度、CO 2 浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足三级种子罐的接种要求。三级种子培养将二级种子按照一定的密度接种到三级种子罐内（如100 L），控制温度、CO 2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足细胞发酵培养的接种要求。03细胞大规模培养（亦称生物反应器细胞培养）种子扩增后要进入细胞大规模培养阶段，注意控制温度、CO 2 浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素。细胞培养结束后，可采用离心分离或澄清过滤等方法进行抗体蛋白的分离纯化。04基于QbD理念的细胞培养工艺开发质量源于设计（QbD) 核心理念在于“质量是通过科学合理的设计得以实现的，而不是仅仅依靠最终检验出来的”。自2013年起，美国 FDA 对于新的药品批准申请，监管部门均要求采用QbD方法。近年来，QbD的理念已逐渐成为国内企业大多数药品生产和研发企业共识，在单抗制品的细胞培养工艺开发中应用的报道越来越多， 基于QbD理念的药品开发基本流程，ICH Q8中提到的质量源于设计QbD的方法如下图所示：基于QbD理念的细胞培养工艺开发：首先要界定目标产品的质量概况（QTPP），即以预先设定的目标产品质量概括（QTPP）为研发的起点，在了解关键物质属性（CMA）的基础上，通过试验设计（DOE），理解产品的关键质量属性（CQA），确立关键工艺参数（CPP），在原料特性、工艺条件、环境等多个影响因素下，建立能满足产品性能的且工艺稳健的设计空间（DS），并根据设计空间，建立质量风险管理，确立质量控制策略和药品质量体系，整个过程强调对产品和生产的认识。 QbD可以帮助我们更好地理解产品和工艺，增强单抗制品的稳定性，降低GMP生产的复杂性和成本等。四、抗体表达在细胞培养的基础上，进行抗体表达是抗体药物生产的关键步骤。抗体表达包括转染、筛选和扩增等步骤。01转染将目标抗体的基因导入到宿主细胞中，实现目标蛋白质的表达。转染类型一般有稳定转染和瞬时转染两种。在单抗细胞株筛选稳定转染前通常通过瞬时转染得到一些抗体，进行质量分析，以初步判断抗体是否满足需要，或者进行一些前期的启动子、密码子等组件的优化。稳定转染中外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。在CHO细胞中进行稳定转染时，外源DNA整合到CHO染色体上，未整合的游离态的DNA会随传代而丢失。常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，使用最多的是阳离子脂质体法和电穿孔法。02筛选筛选高表达单克隆细胞株是细胞株构建的关键步骤，衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞稳定性等。当目的基因被转染到宿主细胞内，并按照一定的细胞密度在合适的筛选压力下进行传代培养后便得到了细胞池。细胞池的表达量取决于转染的方式、筛选压力的作用以及目的基因整合情况。由于目的基因整合具有很大的随机性，即使用相同的方法进行转染和筛选，表达量依然会体现出极大的差异性，接下来就要从细胞池中筛选出高产稳定的细胞株。CHO细胞转染之后，通常会做一个克隆池(pool)，然后进行筛选。筛选策略主要涉及抗生素或药物的代谢途径，常见的筛选试剂包括puromycin、G418、MTX和MSX等。Puromycin为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除嘌呤霉素(puromycin)毒性的作用，在筛选的时候，puromycin浓度一般在10～50ug/ml；G418也是一种氨基糖苷类抗生素，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂之一，G418在筛选的时候一般浓度范围为200～1000ug/ml；MTX为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。Schimke等的研究显示，随着MTX浓度的增加，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因得以扩增，目的基因拷贝数随之增加，提高了表达量。MTX筛选时，一般浓度范围为25～1000 nmol/L；MSX筛选采用的是谷氨酰胺合成酶基因GS系统压力，谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效应。MSX筛选时，一般浓度范围为25～500umol/L。常用的筛选克隆的方法包括：有限稀释法（limiting dilution cloning，LDC）、流式细胞仪分选法（fluorescence activated cell sorter，FACS）、半固体培养基筛选法等。其中有限稀释法因为其低成本和易于操作，曾广泛运用于克隆的筛选。该法是将细胞稀释到极低的细胞密度，并将稀释好的细胞置于96孔板中培养，使孔板中每个孔的理论细胞数小于1个，稀释后使用显微镜对96孔板整板拍照，以确保单克隆。经过一段时间的培养后使用酶联免疫吸附反应选取表达量高的细胞扩大培养。有限稀释法往往需要重复两次，以确保单克隆细胞株的纯度。另一种开始广泛使用的方法是流式细胞仪分选法。将带有荧光标记的二抗和分泌抗体的CHO细胞混合孵育，分泌到细胞表面的抗体就能够被流式细胞仪检测到，从而利用其分选功能筛选出分泌多的细胞。为了使分泌到胞外的抗体能够维持在细胞膜表面，还可以使用微囊将细胞以及分泌的抗体包裹起来。目前，又有新的方法运用于流式细胞仪分选，即将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的两个基因片段作为报告基因分别构建到抗体重链和轻链的表达载体上进行共转染，当这两个片段都整合到细胞内进行表达时，能够产生绿色荧光蛋白而发出绿色荧光，利用FACS进行分选得到高表达的细胞。使用该方法在转染完成后48h就能够进行检测，可以有效缩短克隆筛选的时间，提高实验效率。03扩增抗体作为临床应用最广泛的治疗性蛋白药物,主要是通过CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞培养来表达生产。与前一代的生物技术产品如细胞因子类药物相比,抗体类生物药的主要特点是临床用药剂量大,因此需要大规模工业化生产来满足市场需求,而CHO细胞培养的工艺优化和规模放大具有较大挑战性。提高细胞培养工艺表达量,扩大细胞培养生产规模,保证表达抗体质量稳定成为目前国内抗体产业界在抗体类蛋白药物规模生产过程中亟待解决的问题。五、抗体纯化抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。抗体纯化工艺流程01细胞破碎与离心、过滤将表达高表达目标抗体的细胞进行破碎，释放出内含的目标抗体。抗体为胞外分泌型表达，纯化的第一步是将培养液上清与细胞及细胞碎片分离开来。在实验室规模，分离可通过简单批次离心完成，但大规模抗体生产主要采用连续分离的方法，主要包括深层过滤、切向流过滤和连续流离心。深层过滤的优点是简单易用，前期投入低。深层过滤介质的孔径分布较广，内表面积大，可依靠孔径截留和内表面吸附双重作用去除固体颗粒，比单一孔径滤器能处理更大量的固体杂质，且流速更快。深层过滤系统由一系列的滤器组成，介质的孔径从上游到下游递减（见下图）。深层过滤本身不能达到无菌过滤，所以过滤系统的最后一级通常需要一个无菌滤器。深层过滤介质中含有硅藻土，硅藻土在抗体纯化条件下带正电荷，在去除细胞和细胞碎片的情况下，还可以去除部分带负电荷的宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质，起到初步纯化的作用。深层过滤的缺陷是一次性滤芯使用费用高和处理量有限，在处理大体积培养液时需并联多个滤器，费用和占地面积显著增加，所以深层过滤的试用范围限于100-2000L的中试规模的抗体纯化。深层过滤系统切面图切向流滤器在灌流反应器部分较为常用（见下图），其高切向的流速可减少细胞在膜表面的沉积，从而可以处理大体积细胞培养液而不造成膜的堵塞。切向流的流速越高，细胞沉积越少，但同时带来的剪切力越高，细胞破碎风险越大。细胞破碎形成的细胞碎片更容易阻塞滤芯，并且细胞破碎释放的胞内蛋白和核酸将大大增加后续纯化步骤的压力。切向流滤器的使用以中空纤维最为普遍，其表面积大，又可以在孔腔内形成高剪切力。中空纤维滤器的工艺放大可通过增加纤维数目完成，简单易行。在切向流过滤工艺开发和优化方面，需要考虑的包括滤芯化学成分、滤芯表面积、孔径、切向流流速、跨膜压力。切向流过滤存在死体积，可在过滤后期加人少量缓冲液，降低死体积中的抗体含量，减少抗体损失。切向流过滤处理量大，可用于超过10000L细胞培养的分离，达到每小时近5000L的液体处理量。其局限在于滤器费用较高，过滤时间较长，并且过滤速度的可控性低。切向流滤器切面图连续流离心，尤其是采用碟片式离心机进行的连续流离心，是大规模抗体生产中主要采用的分离模式。碟片式离心机腔体为锥形，细胞培养收获液在靠近轴部加入，离心后上清液从轴部附近排出，细胞在离心力作用下，在锥形的底部边线附近聚集结块。腔体定期在细胞聚集处轻微开启，利用腔体内的压力将细胞排出。细胞排出夹带的液体损失可通过离心力（转速）、腔体开启频率和开启时间的优化，控制在5%以下。连续流离心能够去除绝大部分细胞和细胞碎片。残留的少量细胞碎片可用深层过滤去除。碟片式离心机的优点是体积小，多层碟片形成的沉降面积大，液体处理量大，操作简单、可靠，使用费用低。其缺点是前期设备投资髙，清洗较复杂，并缺少合适的小试模型。连续流离心机与沉降器一样利用细胞与培养基的密度差实现固液分离。下图显示的是一个商业化的碟片式连续流离心机。细胞培养液自离心机底部进料，在离心力的作用下，细胞在腔体的最外围富集。上下腔体周期性地短暂打开，释放清除腔体内积累的细胞，这部分细胞返回反应器。细胞培养液上清自离心机顶端收获。连续流离心分离速度快，液体处理量大，可实现高达3600L/d的灌流速度，细胞分离效果高于90%，有很好的应用前景。连续流离心机的弱点是设备和操作相对复杂，机械和操作故障风险相对较高。同时离心时形成的细胞团有可能造成局部营养缺失或副产物积累，其程度和影响需进一步考察。连续流离心机在操作时还需考虑细胞的剪切力耐受性，避免细胞损伤。连续流离心机切面图02亲和层析亲和层析是利用待分离组分和其特异性配体间具有特异性亲和力，从而达到分离的目的。利用亲和层析等方法将目标抗体与其他杂质分离。常用的亲和层析介质包括蛋白A、蛋白G等。原理：亲和层析是基于生物分子与其它配基分子之间（如抗原与抗体，酶和底物，激素与受体，核酸中的互补链，多糖与蛋白复合体等）的亲和吸附原理建立起来的。蛋白质与层析载体上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物，共价链接在载体表面的功能团配体上。蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点，纯化效率高。ProteinA是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白，具有与抗体特异性结合的能力，ProteinA亲和层析柱已成为应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。天然ProteinA由5个IgG结合域和其他未知功能的非Fc结合域组成，分子量42KD，天然ProteinA对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量IgG（见下图）。但同时，天然ProteinA的其他非结合域和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白纯度不够，会影响到后续的试验。运用基因工程技术，克隆出ProteinA的基因，并对其结构改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组RroteinA的琼脂糖凝胶柱在蛋白纯化中，的确提高了产物的纯度。一般使用具备较少B结构域的ProteinA柱能获得高纯度的IgG，洁洗脱条件温和，从而防止蛋白质集聚，保护蛋白活性。ProteinA的结构示意图抗体纯化的一个显著特点是ProteinA亲和层析的广泛应用，超过2/3上市抗体品种的生产使用ProteinA进行抗体捕获。ProteinA对抗体重链稳定区Fc有很高的特异性和亲和力，对抗体纯化有很好的通用性。ProteinA对IgG的高亲和能一步去除培养上清中大部分杂质，包括核酸、宿主细胞蛋白和可能存在的病毒，抗体纯度达到95%或更高，收率近100%。ProteinA层析操作简便，离心过滤后的细胞培养液可直接加载，不需经过任何处理。抗体加载后，先用缓冲液淋洗，去除与介质或抗体弱结合的杂质，然后利用强酸性缓冲液（pH3.0-3.5）洗脱ProteinA上结合的抗体，再利用酸性更强的缓冲液（PH约2.0）去除强结合杂质，进行介质再生。ProteinA的清洗可以使用盐酸胍、尿素或低浓度碱液。ProteinA亲和层析还是一个有效的抗体浓缩步骤，洗脱液中的抗体浓度可达10g/L以上，大大缩小后续精纯的液体处理量。ProteinA亲和层析工艺开发和优化的重点是抗体载量、停留时间（流速）、淋洗和洗脱条件。Shukla等考察了14个IgG抗体的ProteinA纯化，发现不同抗体间存在很大的差异，抗体的动态载量相差3倍（10-40g/L），洗脱需要的氢离子浓度相差一个数量级（pH3.0-4.1）。利用相同的工艺，洗脱峰中宿主细胞蛋白浓度可以从接近完全清除到残留21OOOppm，聚集体浓度可以从1%-20%，说明即使使用类似的平台技术，也需对特定的抗体进行特定的工艺开发和优化。ProteinA在使用过程中会发生脱落，脱落的主要原因是细胞培养液上清中含有蛋白水解酶，在上样过程中会对ProteinA进行水解。部分脱落的ProteinA与抗体结合，残留在洗脱液中。由于ProteinA具有免疫原性，需在下游精纯步骤中加以清除。ProteinA虽然在抗体纯化中被普遍接受，但改进和寻找ProteinA替代物仍是抗体纯化研究的一个重点。ProteinA在拥有高特异性、高亲和力和高通用性等优点的同时，也具有若干显著缺点，包括费用高、载量低、线性流速有限、需低pH洗脱、ProteinA脱落等。ProteinA亲和介质比普通纯化介质贵大约10倍，在抗体生产成本中所占的比重高于其他任何一个原材料。抗体在ProteinA上的载量较低，动态载量通常在20-30g/L，造成介质用量高，进一步提高了使用成本。为控制生产成本，ProteinA通常会重复使用。实验证明，利用较温和的清洗步骤，ProteinA介质可以重复使用高达300次。为了降低介质成本，大规模抗体纯化通常采用较小的ProteinA层析柱，将单批收获液分成多批进行ProteinA纯化，减小了纯化通量。ProteinA上样是亲和纯化的速度限制步骤。Ghose等建议，可利用双重上样流速缩短上样时间。在上样初期，当抗体容易到达的结合位点为空时，采用高流速，等到抗体容易到达的位点被占领，抗体必须通过扩散达到孔内结合位点时，再采用低流速，给抗体更多的扩散时间，达到较高载量。天然结构ProteinA在强碱清洗时会降解，所有只能使用低浓度碱液（约0.lmol/LNaOH），尿素或盐酸胍进行清洗，但尿素和盐酸胍废液处理困难，不适于大规模生产，而低浓度碱液在内毒素清除方面的能力有限。MabSelectSuRe（GE）是一个改构的ProteinA，替换了ProteinA中易在碱性条件下降解（脱酰胺化）的天冬酰胺，从而使得重组ProteinA可以耐受强碱的清洗。在改进ProteinA的同时，寻找和设计可以替代ProteinA的配体也是一个重要的研究方面。具备替代ProteinA潜力的配体包括多肽、适配子、化学合成配体等，但目前这些配体在结合力、特异性和通用性等方面还不能全方位达到ProteinA水平，离商业化应用尚有距离。在今后的5-10年里，ProteinA还将是占主导位置的抗体捕获介质。03离子交换层析离子交换层析应用最为广泛，利用离子交换层析将目标抗体与其他带电杂质分离。通过调整pH值和盐浓度等条件来实现分离。特别要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷，然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用，另外离子交换介质吸附的一类物质，如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质，所以在纯化过程中，需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程，才能达到预期的结果（原理见下图）。离子交换层析原理示意图阳离子交换是另一个较常用的抗体捕获方法。至少有4个（Humira、Synagis、Soliris、Zenapax）在欧美上市的治疗性抗体药物采用了这种捕获方法，另外多个处于临床阶段的抗体品种也采用了阳离子交换捕获方法。阳离子交换与ProteinA相比的最大优势是成本。离子交换介质价格仅为ProteinA的1/10，可重复使用百次以上，并耐受强碱清洗。另外，阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L，是ProteinA的2-5倍，可降低介质使用量。Arunakumari等开发了一个基于阳离子交换抗体捕获、阴离子交换精纯的两步抗体分离方法。在大大降低纯化成本，缩短纯化时间的同时，阳离子交换层析捕获收率达到82%，捕获后抗体纯度超过97%，显示此工艺可成功放大1000倍。阳离子交换与ProteinA相比有两个劣势，一个是特异性差，另一个是通用性差，需针对不同抗体和抗体表达工艺进行优化，如不同抗体的等电点不同。即使是同一抗体，不同的翻译后修饰也造成不同的等电点，这些都影响到阳离子交换缓冲液pH的选择。捕获后的抗体需进一步去除宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、抗体聚集体、抗体片段和脱落ProteinA，以达到对患者安全的纯度。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余，但采用一步精纯的工艺也越来越多。精纯步骤常用的方法包括阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和分子筛，其中阴离子交换和疏水作用采用流穿模式，阳离子交换和羟基憐灰石采用结合-洗脱模式。各个层析步骤的主要杂质去除能力见下表。两步精纯工艺一般会选择一个流穿模式，一个结合-洗脱模式，而单一步骤精纯一般会选择流穿模式（因为捕获步骤为结合-洗脱模式）。精纯介质通常采用高效介质（直径10-30um）以提髙分离的分辨率，同时提髙抗体的回收率。但采用小粒径介质同时也限制了流速，延长了纯化时间。层析步骤对杂质的清除作用离子交换是最常见的精纯步骤。经典的抗体纯化步骤采用流穿的阴离子交换和结合-洗脱的阳离子交换两步精纯。阴离子交换对宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白有很好的清除作用，而阳离子交换是去除多聚体和抗体片段的有效步骤。离子交换依靠抗体和杂质表面所带电荷差异将其分离。抗体的电荷来自多个组成部分。赖氨酸、精氨酸、组氨酸可带负电荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可带正电荷，N-端的氨基可带正电荷，C-端的竣基可带负电荷，糖基化上唾液酸可带负电荷。抗体上的净电荷取决于抗体的等电点和缓冲液的pH，当缓冲液pH低于等电点时，抗体带正电荷；当pH高于等电点时，抗体带负电荷。所以，通过调整缓冲液的pH，可以改变其在离子交换介质上的结合和流穿。需要指出的是，虽然一半以上氨基酸本身不带电荷，但它们会通过结构影响抗体的表面电荷，也会影响邻近酸性或碱性氨基酸的电荷。阴离子和阳离子交换的区分在于介质上的活性基团，阴离子交换介质上的活性基团为阳性（带正电荷），可吸附流动相中的阴性离子，阳离子交换介质上的活性基团为阴性（带负电荷），可吸附流动相中的阳性离子。活性基团还可进一步分为强活性基团和弱活性基团，区分的标准是活性基团上所带电荷是恒定的还是随pH改变的。抗体纯化使用的一般为强活性介质。离子交换层析首先要平衡介质在介质上加载相反电荷离子，主要是钠离子或氯离子。平衡液选择的标准是抗体（结合-洗脱模式）或杂质（流穿模式）易于取代平衡时加载的反荷离子吸附在介质上，但吸附又不能太强或不可逆，从而易于洗脱。第二步是样品的加载样品加载时的缓冲液为低盐溶液，以促进抗体（结合-洗脱模式）或杂质（流穿模式）与反荷离子交换，在介质上的吸附。第三步是淋洗对于流穿模式，淋洗可采用平衡液，对于结合-流穿模式，淋洗可采用平衡液或可洗脱弱结合杂质的缓冲液，提高洗脱抗体纯化。结合-洗脱模式的第三步是洗脱，洗脱依靠的是增加流动相中的盐浓度，增强反荷离子与抗体在介质上的竞争，从而洗脱介质上吸附的抗体和其他物质，洗脱下物质的顺序是从弱结合组分到强结合组分。通过优化洗脱条件，可增加抗体与杂质在洗脱峰中分离的分辨率，从而有效去除杂蛋白、聚集体、抗体片段等杂质。离子交换的最后一步是再生，利用高盐缓冲液清除结合在介质上的所有物质，并在介质上重新加载反荷离子，准备下一个循环。离子交换缓冲液中的缓冲体系应该在设定pH范围提供足够的缓冲能力，没有毒性，并且与抗体和介质没有相互作用。通常缓冲组分与介质应带相同电荷，所以不会在介质上吸附。线性洗脱可提高洗脱的分辨率，但在大规模生产中，为保证操作的稳定性，一般采取阶梯洗脱。越来越多的公司开始使用一步精纯来提高收率和纯化速度，降低成本。Kelley等开发了一种一步精纯的弱分离阴离子交换层析（WPC）方法。弱分离阴离子交换层析操作条件介于流穿与结合-洗脱之间，采用比流穿操作更低的离子浓度，以提高流动相中的杂质与介质的结合能力，提高了本步骤的杂质去除能力。低离子浓度同时也增加了抗体在介质上的吸附，造成部分抗体吸附在介质上（大部分抗体流穿）。这部分弱吸附上抗体可以通过一个短暂的淋洗洗脱，保证抗体收率。Kelley等显示，ProteinA捕获和弱分离阴离子交换组成的两步抗体纯化工艺可满足抗体在宿主细胞蛋白、ProteinA、内毒素和宿主核酸的清除要求。聚集体的清除较为复杂一些。对于部分抗体品种，聚集体比单体的吸附能力强，聚集体可以采取WPC方法去除，但对另外一些抗体品种，单体比聚集体与阴离子交换介质的吸附能力更强，这样品种就只能通过筛选阴离子交换介质或采用结合-洗脱阴离子交换方式去除聚集体。抗体纯化技术的另一个进展是膜层析技术日益广泛的应用，尤其是在阴离子膜层析方面。阴离子交换层析膜与填料层析介质使用的是同样的活性基团，但膜层析具有如下几个显著优势。一是速度快，膜层析通过对流方式，使杂质能够直接接触到膜上所有的结合位点，开放式模孔结构利用分子扩散，可同时保证高流速和高载量。二是载量高，膜层析动态载量可高达l-10kg/L膜体积是填料层析的10-100倍。三是体积小，缓冲液用量降低。膜层析回收率可达95%-100%，在宿主细胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也与填料层析类似，具备替代传统填料层析的优势。膜层析为一次性使用，在成本上比循环使用的填料高。04凝胶过滤层析凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤，利用凝胶过滤层析将目标抗体与分子量较大的杂质分离，通过选择合适的孔径大小的凝胶来实现分离。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②  去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。05最终纯化通过以上步骤，得到初步纯化的目标抗体后，可以进行最终纯化。常用的方法包括逆流层析、高效液相层析等。高效液相色谱法（HPLC）可对抗体药物以及重组蛋白药物中的不均一性进行有效地分析。比如，尺寸排阻色谱法（SEC）利用了分子空间结构的不同，可对抗体多聚体、片段、PEG化蛋白等样品进行有效分析。离子交换色谱（IEC）、疏水色谱（HIC）、反相（RPC）以及亲水色谱法（NPC/HILIC）可对抗体中的带电异构体、结构异构体，或者由于糖基化、脱酰胺化和氧化等作用引起的杂质进行高分辨率分析。六、抗体药物制剂最后一步是将纯化得到的目标抗体制备成抗体药物。这包括药物配方设计、稳定性研究和灭菌等步骤。01药物配方设计根据目标抗体的特性和需求，设计合适的药物配方，包括缓冲剂、保护剂等。抗体药物的经典配方组成为：抗体、用于调节溶液渗透性的赋形剂或是用于冻干粉的冻干保护剂、缓冲液和表面活性剂，其中离子强度调节赋形剂主要由氯化钠和非离子强度调节剂（如蔗糖、海藻糖、甘露醇、麦芽糖和山梨糖醇）组成，冻干保护剂为海藻糖和蔗糖。抗体药物溶液pH范围在4.0-8.0之间，所使用的pH调节剂包括组氨酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸、磷酸盐、谷氨酸、己二酸、天冬氨酸、乳酸、氨丁三醇和2-(N-吗啉)-乙磺酸。表面活性剂主要为聚山梨酯20或聚山梨酯80。02抗体稳定性研究对制备好的抗体药物进行稳定性研究，评估其在不同条件下(如温度、光照等)的稳定性。研究发现，某些单克隆抗体药物虽然在体外实验中表现出良好的药物活性，但在进入临床试验阶段却会遭遇到体内活性降低的问题。因此在药物研发的初期就要兼顾其药效动力学的问题。抗体药物的稳定性是影响抗体药效动力学的关键因素之一，首先抗体的高亲和力与高特异性都需要以稳定的结构为基础，这是其正确行使生物学功能的保障。其次，抗体的稳定性越高，则其新生肽链在细胞内装配时产生错误折叠（mis-folding）的概率越低，可溶性表达量也越高。良好的热稳定性所带来的紧凑结构使抗体的蛋白酶切位点更不易暴露，并其影响药品保质期及存放条件，关系到药物成本。目前，提高蛋白质热稳定性的方法主要有非共价修饰、化学修饰、添加蛋白质稳定剂、蛋白质工程，以及在液体状态利用矿化技术直接在蛋白表面形成磷酸钙矿化外壳以提高蛋白质的稳定性。由此可见，在保证抗体亲和力及表达量等性质不受太大影响的情况下，最大程度上提高其稳定性，对抗体药物的研发具有重要的现实意义。影响抗体稳定性的因素抗体分子自身性质：抗体分子一级结构（蛋白序列）对其聚集性有着重要影响，例如当抗体分子的等电点（pI）过高或过低时决定簇互补区（com‐plementarity-determining region，CDR）都 会 促 进 聚集，不同的是较低pI的分子所产生的分子间静电相互作用形成了可溶的聚集物，而较高pI的分子，尤其是当和带有负电荷的容器表面接触时，则会形成沉淀性聚集。例如有研究比较了英夫利昔单抗（infliximab）及其仿制药在强制性降解试验中的表现，发现二者尽管在生产工艺和制造过程上有些许不同，但在该试验中并未表现出明显差异，说明一级结构仍然在很大程度上决定了抗体分子的稳定性。还有研究比较了IgG分子的3 个亚型（IgG1、IgG2、IgG4）在分别经过酸性处理（pH=3. 3）之后的表现，结果IgG1保持了单体形式，而另外两个亚型均表现出二聚化倾向，且当恢复到正常pH时导致IgG4形成聚集体。环境应力因素温度：高温能够破坏单抗结构，且通常不可逆，进而导致聚集；同时伴随温度增高，脱酰胺和氧化反应发生的概率也增加。当环境温度下有50%左右的蛋白天然结构展开时，将该温度定义为熔解温度（melting temperature，Tm），每种蛋白都有其Tm，一般该温度范围为40℃~80℃ 之间，而通常生物药品储存运输的温度在2℃~8℃ 之间，远低于该温度。此外过低温也会引起蛋白变性，尤其是在反复冻融的情况下。随着冻融次数增加，会出现缓冲液pH值下降、溶质分子浓缩、水冰界面形成等因素的影响。当0. 5 mg /ml贝伐珠单抗（bevacizumab）溶液经受1~30次冻融循环时，其单体峰通过（size exclusion chromatography，SEC）分析，发现随着循环次数的增加而降低。在类似的研究中，对于固定数量的循环冻融（10个循环），单体峰值随着贝伐珠单抗浓度的增加而降低，这表明在较高浓度下冻融循环的稳定性有所提高。光照：蛋白质的芳香族残基（以色氨酸残基为主）对光照非常敏感，易发生光氧化形成氧化自由基，随后发生断裂和交联，尤其是紫外光相较于白光影响更大。有研究证实光照对蛋白质二级和三级结构的影响取决于其存在形式，通常冻干粉比液体制剂更能耐受光照。LUIS等通过采用 ICHQ1B（International Council for Harmonisation，ICH Q1Bconditions）推荐值（132万勒克斯小时）和环境光照强度（24万勒克斯小时）评估了两种单克隆抗体的光稳定性，结果显示出巨大的差异，表明单抗药物的光稳定性取决于总的曝光量而不是光强度。SHAH等发现了在ICH光照条件下虽然总体上未观察到明显的抗体结构变化，但CH2结构域仍然存在降解。蛋白质药物主要的光暴露发生在储存运输和给静脉输液患者用药期间，因此在药品应用阶段规避这一因素的影响就显得尤为重要。机械应力：在单抗药物生产使用过程中还会受到机械应力（如搅拌或剪切力）的影响。研究证实由于疏水性基团（主要是巯基）暴露，在该过程中形成了大量规格在1. 5~80 μm不等的聚集体，且聚集水平与气-液界面积呈指数关系。药物制剂在通过输液管或注射器时会产生剪切力作用，已有研究报道了高浓度单抗溶液的剪切稀化现象（剪切力下黏度的降低），这可能与自身聚集的单抗分子解离有关，但目前尚不清楚过滤过程中的剪切力是否会引起其他改变。储存方式因素浓度：高浓度下的单抗制剂由于黏度增加，分子间相互作用增强也会促进聚集。HAUPTMANN 等发现高浓度仅仅会增加制剂中小颗粒的数量，而分子量大的聚集物反而减少了；NICOUD等则观察到聚集物随浓度增加而增加的现象。有研究指出，虽然降低抗体浓度可以使结合性较弱的聚集体解离，但若不同时改变抗体分子与辅料的比例，则会稀释药物制剂中的辅料（具有保护性的糖类、表面活性剂或精氨酸），影响了溶液本身的pH值和离子强度，导致抗体分子化学稳定性降低。此外，蛋白质分子自身具备聚合倾向，是由分子间的电荷相互作用所主导，且受溶液的离子强度影响。包装：除对单抗药物固有属性及结构的优化外，也不能忽略在现有生产条件下包装存储方式的影响。蛋白质作为表面活性分子，有吸附到疏水界面的倾向从而导致产品损失、效力降低和潜在的剂量不足。KUMRU等的研究结果表明聚氯乙烯（PVC）材质的输液袋（Ⅳ-bags）相较于聚烯烃材质对1 mg / ml的IgG4溶液吸附效果更明显，且颗粒物和浑浊度明显增加，而在加入聚山梨酯20后两种输液袋中的颗粒数降低至接近阴性对照。影响抗体不稳定的机制造成抗体不稳定性的因素大致划分为化学不稳定性因素和物理不稳定性因素。它们各自对抗体性质产生影响，且彼此相互作用：相关化学反应可导致物理不稳定性，物理不稳定性又可使某些活跃的化学基团产生变化，或将有可能相互作用的基团间距离拉近。化学不稳定作用机制氧化作用：化学降解不仅不利于抗体药物的储存，在应用中还会使药物有效性发生损耗。氧化反应（包括二硫键的形成）是最常见的引起化学降解的因素，这种氧化可以发生于氧化剂（例如：光照、过氧化物或者活泼金属）存在的情况下，也可以自发氧化的形式产生。抗体分子中相当一部分氨基酸基团易被氧化，例如甲硫氨酸、组氨酸和半胱氨酸。二硫键的形成即发生在两个半胱氨酸的巯基之间，且类似的氧化不仅可发生在单个分子内部，也可在分子间产生。脱酰胺作用：另一个引起降解的因素便是脱酰胺化，涉及含天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）残基的位点。脱酰胺化类似于酸碱反应，是在临近反应位点的质子供体（通常为丝氨酸或者苏氨酸）参与下形成环酰亚胺中间物，从而破坏抗体本身的结构。例如Asn经脱酰胺化往往生成琥珀酰亚胺，之后很快自发水解为天冬氨酸或异天冬氨酸（Asp）。水解作用：在抗体分子中另一大化学性质不稳定因素便是二硫键或肽键的断裂。其中在单抗药物正常使用过程中“单价抗体”的形成就是由二硫键断裂导致。而肽键断裂则形成大量性质和大小不一的小分子量片段，且尚不能确定该现象是由酶解导致。同样的，抗体分子中铰链区的水解机制亦不明确，例如在研究木瓜蛋白酶对单抗裂解的过程中加入蛋白酶抑制剂并不能改变抗体分子的断裂，因此推测可能是由某种非酶解机制导致的该现象。尽管具体机制尚不明确，但抗体分子这一降解途径通常发生在强酸或者高温环境中。辅料作用：除了上述可能由环境影响发生的降解外，糖类作为常用的辅料亦会对抗体分子产生影响。研究发现蛋白质在还原糖作用下可发生糖基化（glycosylation），最终形成酮胺而导致褐变，且从抗体在胞内克隆直至静脉注射，该反应都有可能发生。虽然现在大多厂商以非还原糖作为辅料，但其依然可以降解为还原糖从而影响单抗药物结构和功能。化学修饰对于单抗药物性质的影响程度取决于其修饰位点。例如，脱酰胺化在Fc段发生所造成的影响很小，但若发生在CDR上则会降低单抗的亲和力及效价；同样的，氧化反应若是发生在Fc段则不仅会降低结合亲和力，更会增加单抗在人体内的清除率从而降低血药浓度。一些研究表明，化学不稳定性还会导致蛋白构象的改变和分子聚集，例如甲硫氨酸氧化易引起二级结构稳定性改变。物理不稳定性相关机制蛋白质变性往往意味着高级结构的展开，上述化学不稳定性改变、环境因素（温度及pH）等都有可能导致这一结果，并随之降低抗体铰链区的活动性，增加聚集性。聚集性增加是最主要的物理不稳定性改变，聚集体由多个蛋白质分子通过非共价键（范德华力、氢键、疏水和静电相互作用）相链接，而不涉及一级结构和蛋白序列的变化。此外还有部分聚集体是通过二硫键等共价键相缔合，称为共价聚集。这两种聚集最终都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物。抗体的聚集大多都是不可逆的，尤其是在后期当形成的聚集物是由大量非天然结构的抗体分子组成的时候。有学者提出了抗体聚集物有可能通过两种途径使正在接受单抗类药物治疗的患者产生免疫原性：T细胞依赖途径以及细胞因子激活途径。而且分子量越大的聚集物其免疫原性越强，且 糖 基 化 程 度 、聚 集 产 物 来 源 等 亦 对 其 有 影响。最终，免疫原性反应不仅大幅降低了药物的体内疗效，而且易引发Ⅰ型超敏反应。当然，上述现象仅在体外实验及动物模型中观察到，并预测了聚集物在人体内的风险效应，其具体的机制仍然有待探究。03抗体稳定性评估方法生物技术产品稳定性评估通常包括生物活性分析、分子结构和纯度分析（含降解产物的定量检测）以及相关参数的监测（如外观、pH值等），综合以上数据来对样品的热稳定性、聚集性和分子间作用力大小做出评估。在对抗体效价和稳定性进行评估的方法中，除了最常用的间接ELISA法外，还常应用差示扫描量热仪（DSC）测量蛋白质热稳定性，其不仅可以得到熔化温度，还可以得到与熔化有关的焓、熵和自由能。进一步发展而来的差示扫描荧光法（DSF）、圆二色（CD）光谱法、动态光散射（DLS）检测技术都朝着高通量、高精度或者对蛋白质水动力学监测等方向改进。此外在蛋白质溶解性预测方面，研究者们相继提出了交叉作用色谱法（CIC）、亲和捕获自身相互作用-纳米粒子光谱法（AC-SINS）或克隆自身相互作用-生物层干涉法（CSI-BLI）等技术，取得了一定的进展，这些方法评估单克隆抗体在低蛋白浓度下的交叉或自身相互作用的可能性，从而预测单克隆抗体在高浓度下的特性。随着计算机辅助设计在生物大分子开发中的应用，对不确定晶体结构的分子，可以利用大量的建模和仿真软件来预测抗体-抗原复合物的三维结构；也可使用不同的力场进行分子动力学（molec‐ular dynamics，MD）模拟，获得更多有关结合相互作用、稳定性的详细信息，并使非共价键能（疏水能、静电能、非极性能和结合能）的计算变得更容易。七、小结以上就是抗体药物工艺流程中各个步骤和流程的详细描述。从细胞培养到抗体表达，再到抗体纯化和制剂，每个步骤都是抗体药物生产过程中不可或缺的环节。通过严格的控制和优化每个步骤，可以获得高质量、高纯度的抗体药物，为疾病治疗提供有效的工具。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

据世界卫生组织（WHO）估计，截止2016年，全球范围内有13亿成年人超重，6.5亿人肥胖（约占全球成年人总数的13%）。肥胖不仅会影响颜值和日常生活，还会引发代谢综合征，带来种种健康问题。肥胖与机体的新陈代谢和免疫功能密切相关。肥胖会引起慢性炎症反应，增加代谢综合征发生的几率。良好的代谢是指在未服用药物的情况下，血糖、甘油三酯、有益胆固醇（高密度脂蛋白）和血压等四项指标及腰围都在一定范围内。不良代谢会增加患2型糖尿病和心脏病等重疾的风险。以色列公司Lumen针对市场需求，开发了一种通过呼吸测量新陈代谢的便携式设备， 根据呼吸中二氧化碳（CO₂）的浓度来确定用户的代谢率。该公司在12月1日宣布获得了6200万美元的B轮融资，本轮融资由Pitango Venture Capital 领投，韩华控股、Resolute Ventures、RiverPark Ventures、Unorthodox Ventures、Almeda Capital和Disruptive VC跟投。Lumen计划利用此次融资扩大其在全球的影响力，丰富Lumen应用程序的功能，加强与学术机构的研究合作。 站在巨人的肩膀上，让代谢检测成为常规Lumen成立于2014年，位于以色列特拉维夫，是一家数字健康与保健公司。该公司首创可以准确测量新陈代谢的手持式便携设备。Lumen的联合创始人兼产品科学主管Michal Mor从本古里安大学获得医学实验室科学学士学位、生理学硕士学位和心脏科学生理学博士学位。第一排从左到右Merav Mor、Michal Mor  图源：Amit Sha'alMichal Mor和她的双胞胎姐姐Merav Mor是多年的Irorman铁人三项运动员。在进行铁人三项的训练时，她们发现很难确认身体是否需要更多碳水化合物以补充能量。在攻读本古里安大学的博士学位期间，她们意识到学术知识与实际应用之间的巨大差距，于是萌生了通过呼吸测量新陈代谢的想法。常见的测量新陈代谢方法主要有两种：一种是测量RQ值（呼吸商数），这是一种通过采集血样进行的测量，通常在医院或诊所进行昂贵且耗时的测试；另一种是测量RER值（呼吸交换率），这种方法通过间接测量CO₂的产生量和氧气（O₂）的摄取量，计算碳水化合物和脂类提供能量时的消耗量。“科学已经存在，”Merav Mor说，“测量新陈代谢的技术并不新鲜。自60年代以来，就已经有医院和检测机构提供新陈代谢测量服务。只是这种测量方式有几个缺点，Lumen使这项检测变得容易得多。”于是，2014年，Michal Mor 与她的3位老友以及几位企业家联合创立了Lumen。2016年，Lumen 设备开始公测。2018年，Lumen在众筹平台IndieGoGo上线，40天筹集了230万美元，超目标金额27%。2020年5月，Lumen正式面向大众发售。如今，Lumen让每个人都可以实时了解身体能量的来源和状况。人们可以通过Lumen提供的科学方法来管理他们的营养摄入量和生活方式，以达到减肥、提高运动成绩或远高糖尿病的目的。Michal Mor表示：“希望有一天，测量新陈代谢可以像刷牙一样成为常规。每个人都可以根据自己的新陈代谢状况来管理生活方式。”代谢“黑客”，破解健康密码Lumen 的目标是帮助用户“破解”并重新训练新陈代谢，使用户保持“代谢的灵活性”。“代谢灵活”意味着身体能够在燃烧碳水化合物和脂肪之间更有效地转换。通过限时进食（如间歇性禁食）、锻炼、控制常量营养素，或均衡蛋白质、碳水化合物和脂肪摄入量的方式可以达到“代谢灵活”。Lumen团队认为这种灵活性可以提高胰岛素敏感性，帮助身体更有效地燃烧脂肪。它还可以使身体的血糖水平更加稳定，从而产生更多的能量和更少的食欲。RER指标可以说明身体要以脂肪还是碳水供能。低碳水化合物饮食可以使身体使用已储存的脂肪作为其主要代谢燃料来源，呈现低RER值；高碳水化合物饮食使身体倾向于消耗消化系统中可用的碳水化合物和少量脂肪来作为代谢燃料，呈现高RER值。Lumen相当于RER的手持设备。Lumen使用RER作为核心数据点，通过CO₂传感器和流量计来确定用户单次呼吸中的CO₂浓度。测量CO₂浓度需要用户通过Lumen装置吸入固定体积的空气，保持 10 秒，然后完全呼气。用户需要在一天中的不同时间点重复此过程，以获得准确的数据。Lumen根据测得的CO₂浓度来评估用户的代谢率。与代谢脂肪时相比，人体细胞代谢碳水化合物时，会产生更多的CO₂。因此，高CO₂读数表示身体正在消耗碳水化合物，低CO₂读数表示身体正在消耗脂肪。用户通过设备呼吸2到3次，Lumen应用程序就会给出1到5的分数，用简单的方式告诉用户身体燃烧的主要是脂肪（1-2）还是主要是碳水化合物（4-5）。分数为3表示混合使用脂肪和碳水化合物来获取能量。经过4周的测量后，用户会获得Lumen Flex分数，这是对用户新陈代谢灵活性的评级。Lumen会根据用户的分数，制定一天的计划，并建议用户吃低碳水化合物、中碳水化合物或高碳水化合物的食物。旧金山州立大学运动生理学实验室研究人员使用Lumen和黄金标准代谢车方法(RER测量)来测量代谢燃料的使用情况，并将两者进行对照验证。研究显示，两者测量结果高度相关，这表明Lumen装置能够准确评估身体代谢燃料的使用和变化状况。精准营销，制胜市场2021年8月，Lumen转为订阅模式，用户订阅后可以获得Lumen的便携式检测设备和6至12个月的应用程序访问权限。用户只需向设备呼气，Lumen便会分析身体是在燃烧脂肪还是在消耗碳水化合物。Lumen根据用户的食物偏好、锻炼细节、睡眠习惯，为用户制定持续的解决方案，包括分析代谢灵活程度、介绍新陈代谢的相关知识、提供饮食与运动建议等。使用Lumen来改善新陈代谢的人数仅在过去一年就增加了500%，该公司表示其年收入已达到数千万美元。联合创始人Michal Mor表示：“大多数使用Lumen的用户以减重为目的，但我们希望将受众范围扩大至旨在保持健康的人群。”多方合作，持续提供高水平服务2020年11月，Lumen获得可穿戴设备巨头Garmin的认可，首次整合了他们的产品。两家公司的数据显示，整合后的三个月里，Garmin用户在锻炼后测量他们的新陈代谢超过1万次。2021年5月， Garmin宣布将与Lumen的设备和应用程序的代谢数据进行第二阶段的整合。最新阶段会允许Garmin用户直接将他们的新陈代谢与身体能量监测功能相关联。2021年6月，Lumen与世界第一综合武术组织UFC合作，Lumen被用作UFC性能研究所的官方代谢跟踪器。2021年9月，Lumen推出Lumen iOS应用程序，成为Apple Watch商店中唯一可以测量和跟踪用户新陈代谢的应用程序。该应用将允许用户使用Lumen设备分析他们的呼吸，并直接在Apple Watch上查看结果。但Lumen iOS应用程序中缺少食物日志功能，需要使用 MyFitness Pal或Calory等不同的应用程序来跟踪Lumen 提供的个性化营养建议。2022年3月，Lumen iOS应用程序更新，新增食物日志功能（可从MyFitness Pal等应用程序导入数据）。到目前为止，Lumen应用程序已与Apple Health Kit、Google Fit和Garmin建立合作关系。Lumen一直致力于健康问题的临床研究。该公司在过去一年里，已与普渡大学惠斯勒碳水化合物研究中心、多伦多大学运动学与体育学院和ARU Cambridge等研究机构合作。“了解营养、运动、睡眠和压力对新陈代谢的影响对维持健康的身心状态有重要意义，”Lumen首席执行官兼联合创始人Daniel Tal说，“我们团队很乐意看到人们能够照顾好自己的‘身体引擎’（新陈代谢）。在过去的一年里，Lumen 的用户意识到了他们应该吃什么样的食物，应该改变或保持什么样的习惯。”目前，Michal Mor正在研发Lumen的新功能——月经周期功能。这项功能会显示女性的新陈代谢在月经期间的阶段性变化。Michal Mor希望利用Lumen团队拥有的技术来满足女性及其身体的特定需求。近期推荐声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。动脉网，未来医疗服务平台