NOD2 x TLR4

益生菌领域信息分享！请点击上方文字“益生菌科学与产业”一键关注。 前言 炎症性肠病（IBD）是一组具有重要临床意义的慢性胃肠道炎症性疾病，可对患者生活各方面产生重大影响。炎症性肠病的两种主要类型为克罗恩病（Crohn’s Disease, CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）。这两种亚型均属于复杂性疾病，其特征分别为胃肠道（克罗恩病）或结肠（溃疡性结肠炎）的进行性破坏性炎症。这些疾病的综合影响可能导致严重的身体和心理症状。目前全球患者人数已超过680 万，每年治疗费用通常高达1 万美元。 尽管克罗恩病和溃疡性结肠炎具有相似的发病机制，但二者仍表现出不同特征。克罗恩病可涉及消化系统的任何部位，而溃疡性结肠炎通常起始于直肠，并逐渐蔓延至整个结肠。炎症性肠病的确切发病机制尚不清楚，但普遍认为是由菌群失衡、免疫系统异常、遗传易感性和环境触发因素等多种因素复杂相互作用所致。尽管治疗方法不断发展，但炎症性肠病的管理仍具挑战性，往往需要终身用药，且这些药物可能存在潜在副作用。因此，开发新型有效的治疗策略显得尤为迫切。 2021 年，后生元被定义为 “对宿主具有健康益处的非活性微生物制剂和/ 或其成分”。这一全面定义涵盖了多种分子。需注意的是，类益生菌指的是灭活的益生菌细胞或粗制细胞提取物。虽然类益生菌可被视为后生元的一个子集，但后生元的范围更广，还包括益生菌产生的代谢产物。研究表明，益生菌和后生元在改善病理状态方面具有相似能力。然而，在后生元的安全性和肠道菌群调节方面，其相较于益生菌具有显著优势。后生元不存在存活风险，稳定性更高且易于储存，是益生菌的理想替代品。特别是，后生元作为下一代生物治疗剂，在治疗溃疡性结肠炎和其他多种炎症性疾病方面具有极高的适用性。 在治疗溃疡性结肠炎方面，与传统益生菌相比，后生元具有更高的稳定性、安全性和靶向生物活性，可通过多种作用机制缓解病情。研究表明，益生菌干预对克罗恩病患者效果不佳，但对溃疡性结肠炎患者显示出更良好的疗效。因此，本综述将重点关注可能有助于改善溃疡性结肠炎治疗的后生元生物活性成分，介绍后生元的主要来源和制备方法，并系统评估后生元在溃疡性结肠炎治疗中的疗效，着重分析其生物活性成分、通过屏障改善肠道健康的机制、免疫代谢重编程以及对菌群的调节作用。 1. 后生元的来源、制备与鉴定 本节将讨论后生元成分的来源和制备方法，并通过图1 和图2 进行展示 图 1. 后生元的主要来源。后生元来源于多种微生物，包括乳酸菌、下一代益生菌以及以酵母菌为代表的其他菌株。这些来源可产生丁酸、细菌素、免疫调节蛋白（如 Amuc_1100 蛋白、硫氧还蛋白）等多种生物活性化合物，这些化合物为后生元在溃疡性结肠炎（UC）治疗中发挥潜力提供了支持。 图 2. 用于保留生物活性成分的创新性制备技术及其特点。该图囊括了后生元生产中所采用的先进提取与灭活方法，包括传统溶剂提取法、超声辅助提取法、欧姆加热法，以及超临界二氧化碳（SC-CO₂）提取法。每种技术均会从提取效率、生物活性物质（如短链脂肪酸（SCFAs）、胞外多糖（EPS））的保留效果，以及对不同微生物来源的适用性三个维度进行评估。 乳酸菌是一类广泛存在于发酵食品中的微生物。这类革兰氏阳性菌具有出色的耐酸性和耐胆盐能力，使其能够在肠道环境中良好存活并发挥作用。乳酸菌涵盖多种细菌属，包括双歧杆菌属、乳杆菌属和链球菌属。 代谢组学技术的发展使得乳酸菌代谢产物的鉴定成为可能，这些代谢产物可产生胞外多糖、细菌素、短链脂肪酸和芳香族氨基酸等有益化合物。这些代谢产物对宿主生理的重要性已引起全球广泛关注。近年来，研究人员探究了益生菌（尤其是乳酸菌）在溃疡性结肠炎管理中的潜在益处。源自长双歧杆菌某个亚种和鼠李糖乳杆菌1.0320 的新型胞外多糖，已被证实能有效减轻葡聚糖硫酸钠诱导的肠道损伤，缓解结肠炎症状和氧化应激反应。这种作用具有浓度依赖性，且会影响肠道菌群组成。 机制研究表明，口服后生元制剂Probio-Eco（由热灭活的乳杆菌和双歧杆菌菌株组成）可通过同时调节肠道微生物组和代谢组来缓解结肠炎症。这一现象主要与粪便中丁酸盐水平的显著升高有关，丁酸盐作为一种重要的短链脂肪酸，在促进上皮细胞生长、增加黏膜黏液分泌和促进免疫耐受方面发挥着关键作用。这些后生元的健康益处极具前景，表明其在溃疡性结肠炎治疗中具有潜在价值。因此，乳酸菌被认为是目前应用最广泛的后生元原料之一。 近期研究表明，传统益生菌在溃疡性结肠炎治疗中存在定植效率低、个体反应差异大以及作用机制不明确等局限性。相比之下，下一代益生菌，如Akk 菌、普拉梭菌、脆弱拟杆菌和酪酸梭菌，通过后生元技术实现了基因工程改造和成分标准化，为溃疡性结肠炎治疗提供了新的解决方案。 在此背景下，通过基因工程和合成生物学技术，下一代益生菌被重新改造为“微生物工厂”。这种创新方法旨在提高抗炎分子的高浓度生产。通过灭活技术，这些进展能够保留免疫调节成分，从而摆脱了传统益生菌对定植能力的依赖以及个体反应差异的问题。大量研究表明，Akk 菌可通过改善肠屏障功能、上调与肠屏障完整性相关的基因表达以及促进抗菌肽的产生，来减轻炎症和氧化应激反应 。此外，Marion Lenoir 等人在小鼠研究中发现，普拉梭菌可通过产生丁酸盐发挥抗炎作用，丁酸盐能上调 Dact3 基因的表达。 酵母菌凭借其耐受强酸性胃环境和胆汁的能力，成为极具潜力的后生元来源。此外，酵母菌在加工和储存过程中稳定性极佳，受温度、pH 值等环境因素的影响较小。一项关于布拉氏酵母菌、热灭活布拉氏酵母菌以及布拉氏酵母菌来源的β- 葡聚糖在炎症性肠病管理中治疗效果的系统性比较研究显示，热灭活布拉氏酵母菌在调节肠道菌群组成和功能特征方面效果更优。源自布拉氏酵母菌的硫氧还蛋白被鉴定为新型后生元，其通过激活表皮生长因子受体通路，可减轻肠道炎症、增强上皮屏障完整性并缓解氧化应激反应，为炎症性肠病提供了一种靶向性强且安全的治疗策略。此外，研究发现某些酵母菌菌株还能产生共轭亚油酸异构体10-12tc 和丙酸。 研究表明，源自酵母菌的后生元可通过其抗炎特性显著缓解溃疡性结肠炎症状。这些发现凸显了酵母源益生菌在改善菌群失调以及与溃疡性结肠炎治疗相关的炎症病理生理方面的独特优势。 2.制备 2.1 传统溶剂提取法 后生元化合物的分离主要采用基于溶剂的提取方法。Han 等人提出了一种从植物乳植杆菌Z057 的无细胞上清液中提取细菌素的新型技术。该方法使用体积比为1:1 的乙酸乙酯（作为提取溶剂），后续通过真空蒸发处理得到浓缩提取物。此外，在70°C 条件下，采用氯化钠提取胶红酵母的胞外多糖，可获得多样性丰富的有机物。该方法可用于酵母菌菌株中胞外多糖的提取为解决短链脂肪酸在提取过程中易挥发的问题，Gu 等人率先提出了一种碱性调节提取法，该方法采用氢氧化钠浓度梯度。这种创新方法显著提高了乙酸和丙酸的回收率，同时有效抑制了其挥发。此外，通过使用N - 叔丁基二甲基硅基- N - 甲基三氟乙酰胺进行同步提取和衍生化，简化了短链脂肪酸的分析流程。该方法无需进行耗能的超声处理，从而将分析工作量和处理时间减少了30% 以上。相比之下，传统溶剂提取法仍是分离非挥发性后生元代谢产物的重要方法，Lee 等人的研究也证实了这一点。 2.2超声辅助提取法 传统提取方法存在能耗高、二氧化碳排放量大以及使用有害溶剂等局限性，因此迫切需要开发可持续的分离技术。超声辅助提取技术作为一种极具前景的绿色替代方法，在提高提取效率和调节微生物生理反应方面具有双重功能。通过可控的声空化作用，超声波可产生微机械力，在保持细胞结构完整性的同时，可逆地增加细胞膜通透性。这种物理机制能够精确控制微生物代谢产物的释放，这是后生元生产中的关键因素。 在后生元制造领域，我们近期的研究建立了一套优化的超声处理方案（24 kHz，10 μm 振幅，3 次 ×5 分钟脉冲），该方案可显著促进短乳杆菌的发酵过程。与传统方法相比，采用该方案后，活菌数量、比生长速率、膜通透性和酸化速率均有所提高。这种处理方法具有非热特性，能够保留热敏性成分，同时实现可控的微生物灭活，这对于维持后生元的生物活性至关重要。 Brandao 等人首次证实了超声灭活（20 kHz，40 分钟）用于制备类益生菌的可行性。灭活后的干酪乳杆菌虽然失去了活性，但仍保留了其细菌成分，并具有调节菌群的特性，可改善高脂饮食诱导的小鼠体内代谢紊乱和心血管功能障碍。这项研究证实，超声波是一种能够保留功能成分的非热灭活技术，为后生元生产提供了安全高效的方法。 2.3 欧姆加热辅助提取法 欧姆加热技术是一种利用电流通过食品自身电阻将电能转化为热能，从而实现食品快速均匀加热的技术。 与传统传热方法相比，这种高效的加热工艺可显著缩短总处理时间，并最大限度地减少热损伤。一项值得关注的研究发现，在对嗜酸乳杆菌LA-5、干酪乳杆菌01 和动物双歧杆菌乳亚种Bb-12 进行灭活处理时，采用欧姆加热（8 V/cm）比传统加热处理对细胞膜完整性的损伤更小，且能更好地保留类益生菌的功能结构。 与传统加热相比，欧姆加热可提高干酪乳杆菌对碳水化合物等营养物质的利用率，从而更有效地促进细菌生长。此外，一种由乳清和葡萄汁制成的饮料，添加经欧姆加热（8 V/cm，95°C，60 Hz 频率下处理7 分钟）灭活的干酪乳杆菌01 后，仍能保留细胞内酶和多糖等重要功能成分。这种特性可显著降低餐后血糖水平，并提高营养物质的生物利用度。这些结果表明，欧姆加热是一种可行的技术方法，可用于生产高效的类益生菌物质。 2.4超临界二氧化碳辅助提取法 超临界二氧化碳作为一种极具前景的非热技术，在后生元生产过程中可实现高效的微生物灭活。该方法可替代传统加热处理，有效保留有益的代谢产物和细胞成分。超临界二氧化碳的抗菌机制与其对微生物膜完整性的影响和对细胞内pH 值的调节作用有关。研究表明，超临界二氧化碳会增加细胞膜的流动性和通透性，破坏其结构完整性，并导致关键细胞成分发生不可逆损伤。 通过精确调节温度和压力参数，超临界二氧化碳在后生元的选择性提取方面展现出显著优势。这种方法可根据目标成分的理化性质实现针对性提取，同时最大限度地减少杂质的混入。然而，由于超临界二氧化碳本身极性较低，在处理极性或中等极性化合物时，需要添加共溶剂以优化提取效率。 目前，关于超临界二氧化碳辅助提取后生元的研究仍较为有限，但初步研究已揭示了其潜在的生物效应。一项对经超临界二氧化碳灭活的双歧杆菌的研究显示，其对雄性Wistar 大鼠具有显著的代谢影响，包括降低血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL - 胆固醇）水平，以及升高白蛋白和肌酐浓度。这些发现表明，超临界二氧化碳处理不仅能实现微生物灭活，还可能调节后生元的生物活性。未来需要开展更多系统性研究，以阐明超临界二氧化碳处理参数与功能代谢产物保留之间的关系。 3.鉴定 后生元的描述和鉴定可能因涉及多种物质（包括死亡细胞、细胞碎片和微生物代谢产物）而变得复杂。由于难以对后生元的所有成分进行清晰的表征和定量分析，详细说明后生元的制备过程可能就足够。尽管研究人员致力于开发具有更高准确性和更快检测速度的创新方法，但在实际基质中对这些方法进行验证至关重要。因此，需要结合多种技术才能充分表征后生元。 准确鉴定后生元成分对于质量控制和机制验证至关重要。流式细胞术主要用于评估细胞活性，具有速度快和高通量的显著优势。相反，要精确鉴定和表征特定后生元化学成分（如短链脂肪酸、细菌素和胞外多糖）及其物理结构，则需要采用一系列分析方法，包括色谱法、质谱法、分光光度法、傅里叶变换红外光谱法和核磁共振法。由于后生元成分高度复杂，建立通用且标准化的鉴定和表征方案面临着巨大挑战。然而，后生元的表征必须包含三个基本要素：准确鉴定前体菌株、验证灭活过程的有效性，以及定量分析最终产品中的非活性细胞。 4. 改善溃疡性结肠炎的后生元生物活性成分 后生元是指源自微生物的生物活性化合物，既可由活细菌产生，也可在细菌裂解时释放。这些化合物主要分为两类：（1）细菌固有的结构成分，包括细胞壁、细胞膜、胞外多糖、肽聚糖、S 层蛋白和脂磷壁酸；（2）位于细胞胞质中的生物活性分子，如短链脂肪酸、细胞内蛋白、氨基酸和肽。这些物质共同为宿主带来显著的生理益处。 4.1 胞外多糖 微生物胞外多糖是细菌、真菌、酵母菌和微藻在生长和代谢过程中分泌的重要生物分子。源自后生元菌株的胞外多糖会影响肠道菌群组成和代谢产物的产生，可能在免疫调节和代谢稳态维持方面发挥积极作用。然而，其通过抑制溃疡性结肠炎中促炎信号通路来发挥直接治疗作用的机制尚未完全阐明。 胞外多糖调节溃疡性结肠炎炎症的关键机制包括促进短链脂肪酸的产生、抑制Fas/FasL 和TLR4/NF-κB 信号通路、激活Nrf2 信号通路、抑制促炎性Th17 细胞分化，以及促进CD4+T 细胞向调节性T 细胞分化。此外，后生元研究已从最初对粗制细菌提取物的观察，深入到对特定活性成分的详细分析。近期研究表明，源自泡菜中特定细菌产生的多糖EPS-W-1，可显著增加结肠长度，并有效缓解溃疡性结肠炎症状。阿尔新蓝和过碘酸- 希夫染色实验证实了其屏障修复功能，结果显示杯状细胞数量和黏液分泌量显著恢复，结肠上皮结构完整性也得到大幅改善。胞外多糖减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的能力表明，这是一个值得深入研究的领域。未来的研究应重点开展全面研究，深入探究胞外多糖的结构、功能、相互关系及临床应用等方面。 4.2短链脂肪酸 短链脂肪酸是肠道微生物在发酵膳食纤维和其他不可消化碳水化合物过程中产生的有机酸。主要的短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。 溃疡性结肠炎的发生与短链脂肪酸产生不足密切相关。短链脂肪酸对于维持结肠稳态至关重要，具有抗炎特性，同时还能增强结肠功能。结肠细菌分解膳食纤维产生的短链脂肪酸，已被证实对炎症具有缓解作用。值得注意的是，丙酸和丁酸可通过增强缺氧诱导因子- 1α（HIF-1α）依赖性肠黏膜屏障功能，来维持肠道稳态 。乙酸、丙酸和丁酸均对肠道炎症具有抑制作用。其抗炎作用的主要机制包括抑制脂多糖- TLR4（LPS-TLR4）通路，以及减少M1 型巨噬细胞极化，从而改善肠道内的炎症微环境。丁酸钠在缓解溃疡性结肠炎方面的作用尤为突出，它可通过抑制铁死亡、调节Nrf2/GPX4 信号通路，以及影响肠道微生物组来发挥作用。尽管戊酸在研究中受到的关注相对较少，但有研究表明其与溃疡性结肠炎疾病严重程度降低相关。具体而言，戊酸与单核细胞计数和白细胞介素- 6 水平呈负相关。此外，研究还发现戊酸可通过上调GPR41 和GPR43，直接抑制脂多糖激活的单核细胞和巨噬细胞。 此外，施用短链脂肪酸（SCFAs）衍生物（如丁酸修饰脂质体），可通过减轻与结肠炎相关的 Gasdermin E介导的焦亡，显著促进上皮屏障的修复。针对丁酸诱导小鼠结肠高敏感性的机制研究发现，其浓度效应呈现出双相特征：低浓度丁酸通常表现出有益作用，包括抗炎、保护肠道屏障及调节免疫等；但当丁酸浓度超过3 mM 时，会抑制组蛋白去乙酰化酶，进而诱导结肠高敏感性，并可能产生毒性。短链脂肪酸（SCFAs）作为后生元的活性成分，在改善溃疡性结肠炎（UC）方面展现出多方面的作用机制。然而，仍需进一步研究以优化其递送方式，并评估其临床应用潜力。 4.3 细菌素 细菌素是一类由细菌产生的抗菌肽或蛋白质，在胃肠道区域尤为常见。近期研究表明，细菌素具有强大的抗菌和抗炎特性，可通过选择性抑制致病菌、促进有益微生物定植，来维持肠道菌群稳态。例如，由肠杆菌科编码的抗菌肽微囊菌素J25，已被鉴定为一种强效抗革兰氏阴性菌肽。其作用机制可能涉及调节炎症反应和维持肠上皮屏障完整性。 口服从伴生乳杆菌MN047 中分离出的细菌素，可有效减少结肠炎小鼠杯状细胞的丢失，同时提高黏蛋白2和紧密连接蛋白的水平，在小鼠结肠炎模型中展现出抗炎特性。 此外，研究还揭示了乳酸链球菌A的抗炎特性及其潜在作用机制。研究证实，该细菌可通过激活腺苷来刺激鞘脂信号通路，同时抑制嘌呤代谢。这种作用方式可能有助于减少炎症引起的线粒体功能障碍和氧化应激。 尽管目前尚无将乳酸链球菌A 用于溃疡性结肠炎治疗的具体研究，但这些发现为改进该疾病的治疗方法提供了创新性思路和策略。 4.4 肽聚糖 肽聚糖是一种复杂的大分子，由交替连接的N - 乙酰葡糖胺和N - 乙酰胞壁酸组成，并通过短肽链交联，是细菌细胞壁的主要成分。在细菌生长和分裂过程中，肽聚糖会在特定酶的作用下不断降解和重塑，释放出肽片段。这些片段对于细菌信号传递、宿主间通讯以及免疫反应至关重要。 肽聚糖的关键受体包括胞质中的NOD 样受体NOD1 和NOD2。值得注意的是，NOD2 基因突变与包括克罗恩病在内的多种炎症性疾病相关。研究表明，NOD2 在减轻多种细菌产物诱导的炎症以及预防炎症性结肠炎方面发挥着关键作用。此外，研究发现受体相互作用丝氨酸/ 苏氨酸激酶2在NOD1 和NOD2 的炎症信号通路中具有调节作用。当受到细菌肽聚糖激活后，NOD2 会结合RIPK2 及其E3 连接酶XIAP，进而激活NF-κB 和MAPK 通路。这一信号级联反应会促进抗炎细胞因子的产生，并调节趋化因子的表达。近期一项研究探讨了源自乳杆菌的肽聚糖对增强Toll 样受体反应的影响。结果表明，肽聚糖的降解产物胞壁酰二肽可显著改善小鼠结肠上皮屏障功能，并上调紧密连接蛋白的表达。 尽管取得了这些进展，但肽聚糖及其衍生物在溃疡性结肠炎中发挥作用的机制仍未完全明确。为推动肽聚糖来源的后生元在溃疡性结肠炎及相关炎症性疾病中的广泛治疗应用，进一步深入研究这些机制至关重要。 4.5 脂磷壁酸 脂磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的重要两亲性成分，由磷酸甘油或磷酸核糖醇的重复单元构成，在肠道免疫调节中发挥着关键作用。研究发现，源自罗伊氏乳杆菌L1 的脂磷壁酸对炎症反应和肠道菌群稳态的维持具有浓度依赖性作用。在低浓度（如1 μg/mL）时，脂磷壁酸在体外和体内均可显著减轻脂多糖诱导的炎症反应，同时增加有益肠道细菌的丰度。相反，当浓度达到5 μg/mL 及以上时，脂磷壁酸则可能加剧肠道损伤并诱导菌群失调。 源自乳杆菌的脂磷壁酸具有显著的抗炎特性，在HT-29 细胞和小鼠结肠炎模型中，均可呈剂量依赖性地降低肿瘤坏死因子-α水平并升高白细胞介素- 10 水平。Apilactobacillus因其富含赖氨酸的脂磷壁酸结构，还能进一步促进免疫球蛋白A 的产生，从而促进肠黏膜免疫稳态。值得注意的是，野生型植物乳杆菌CRL1506 可通过脂磷壁酸抑制TLR3 介导的肠道炎症，具体表现为下调白细胞介素- 6 和单核细胞趋化蛋白- 1（MCP-1）等促炎因子的表达；而脂磷壁酸合成受损的dltD 突变体则无法产生这种效果，这凸显了脂磷壁酸在其中的关键作用。因此，脂磷壁酸已成为益生菌中一种极具前景的成分，在缓解炎症症状方面展现出潜力。然而，仍需通过进一步验证来评估脂磷壁酸在临床应用中的安全性和有效性，这有望为炎症性疾病的治疗提供一种新方法。 4.6 其他成分 结肠炎症相关的多种效应通常由微生物代谢产物介导，其中必需芳香族氨基酸色氨酸发挥着关键作用。作为一种后生元，色氨酸在溃疡性结肠炎的治疗管理中展现出显著潜力。其核心作用机制与肠道菌群代谢产物激活芳香烃受体通路密切相关。具体而言，色氨酸可通过其肠道菌群代谢产物激活AhR-IL-22 轴，从而促进肠屏障修复并抑制炎症反应。 此外，实验证据表明，在饮食中补充必需氨基酸L - 色氨酸的代谢产物，可激活肠上皮细胞中的多巴胺受体D2。这种激活会降低宿主肌动蛋白调节蛋白的表达，从而对肠道病原体起到防御作用。 胆汁酸是一类甾体类天然产物，与肠道菌群存在复杂的相互作用，共同调节肠道免疫和炎症反应。研究表明，胆汁酸通过激活关键信号分子，在肠道抗菌防御和炎症调节中发挥着关键作用。研究发现，激活FXR 可诱导抗菌靶基因（包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和白细胞介素- 18）的表达，从而增强肠屏障功能，减轻黏膜损伤和微生物易位。此外，激活TGR5 可刺激肠道干细胞，促进上皮再生，从而改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中的黏膜损伤。 胆汁酸可调节NF-κB 和NLRP3 炎症小体的活性，抑制炎症通路并促进抗炎细胞因子的分泌，有助于维持肠道稳态。值得注意的是，肠道菌群可将次级胆汁酸转化为3 - 氧代石胆酸（3-oxoLCA）和异石胆酸（isoLCA），这些代谢产物被证实可抑制Th17 细胞分化，进而进一步减轻炎症反应 。 综上所述，肠道中的色氨酸和胆汁酸均已成为极具潜力的治疗靶点。然而，由于菌群与宿主之间复杂的相互作用，以及疾病机制和实验模型的复杂性，仍需开展更深入的研究，以明确精确的治疗靶点并优化干预策略。 5. 后生元改善溃疡性结肠炎的作用机制 5.1 增强肠道屏障功能 肠道屏障由三个相互关联的部分组成：黏液层、上皮细胞层和固有层。黏液层是主要的物理屏障，由黏蛋白糖蛋白构成，同时还包含具有化学防御作用的抗菌蛋白和免疫球蛋白。黏液层下方是上皮细胞层，其通过紧密连接和黏附连接等特殊细胞间连接来调节物质的选择性通透性。固有层中含有负责监测和清除病原体的免疫细胞，共同构成了防御体系。这些分层结构共同形成了一个全面的防御网络，对维持肠道稳态至关重要。肠道屏障功能受损会导致肠道通透性增加，使得细菌代谢产物和内毒素能够进入全身循环。这一病理过程会触发先天免疫激活，并维持慢性低度炎症状态，而这些机制在肠道感染、炎症性肠病和乳糜泻的发生发展中起着关键作用（表1 和图3）。 图 3. 后生元介导的肠屏障强化作用。该图通过肠屏障的三部分结构进行阐释：1）黏液层，其包含黏蛋白 2（MUC2）、抗菌肽及免疫球蛋白 A（Immunoglobulin A，IgA）；2）上皮细胞层，该层的特征性标志是闭合小环蛋白 - 1（ZO-1）、闭合蛋白（Occludin）及 Claudin 家族蛋白等紧密连接蛋白；3）下方的固有层，该层分布有免疫细胞。图中的箭头指示了哪些后生元成分可对各层起到增强作用及其作用机制 新的证据表明，后生元可通过多种机制显著增强宿主上皮屏障功能。具体而言，短链脂肪酸可调节上皮细胞的转录谱，促进上皮细胞的增殖和修复。丁酸激活GPR109A 后，可增强结肠上皮细胞中白细胞介素- 18 的诱导表达和MUC2 黏蛋白的表达，从而保护结肠免受炎症和癌变的影响。此外，酪酸梭菌C1-6 产生的丁酸可作为肠上皮细胞的直接能量来源，通过代谢重编程促进上皮细胞的增殖和修复。 这些协同作用机制凸显了后生元在维持肠道屏障完整性和功能方面的治疗潜力。紧密连接蛋白是上皮细胞间的主要连接结构，在连接肠上皮细胞和控制肠屏障通透性方面发挥着关键作用。研究表明，热灭活的嗜热链球菌可通过上调紧密连接蛋白的表达水平，增强上皮屏障的结构完整性和功能恢复。此外，源自发酵乳杆菌HF06 的后生元可显著增强肠黏膜屏障功能。这一发现首次证实了发酵乳杆菌HF06 来源的后生元具有增强肠道屏障功能的作用。近期研究表明，肠道菌群对初级胆汁酸向次级胆汁酸转化的调节异常，可能会对溃疡性结肠炎的炎症发展产生显著影响。值得注意的是，研究证实石胆酸及其酶促转化代谢产物3 - 氧代石胆酸和异石胆酸，可通过上调ZO-1 等紧密连接蛋白的表达，增强上皮通透性并保护肠道屏障。这一机制对于维持全身代谢稳态至关重要。此外，引入梭状芽孢杆菌可增加次级胆汁酸的产生。胆汁酸水平的升高有助于维持稳态，并激活TGR5 受体，从而促进黏膜再生。这些发现为溃疡性结肠炎的黏膜修复提供了一种潜在的生物治疗策略。 5.2 调节肠道菌群及其代谢产物 肠道菌群失调（主要由微生物间相互作用紊乱引起）是溃疡性结肠炎发病机制中的关键因素，可导致肠黏膜损伤和炎症级联反应。对比分析显示，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者体内有益菌的数量显著减少，而致病菌和活泼瘤胃球菌的水平则有所升高。 后生元通过抑制致病菌增殖、促进益生菌增殖以及恢复溃疡性结肠炎相关失调菌群的多样性，展现出治疗潜力（图4）。研究发现，长双歧杆菌NSP001 的胞外囊泡可增加拟杆菌门和 Adlercreutzia （一种与短链脂肪酸产生相关的菌属）的相对丰度，同时降低厚壁菌门、疣微菌门以及颤螺旋菌属等促炎菌属的相对丰度。此外，后生元还可酸化肠道环境，抑制氨和毒素的积累，同时为有益菌提供支持。 图 4. 通过补充后生元改善溃疡性结肠炎（UC）患者的肠道菌群失调。该图展示了后生元对溃疡性结肠炎患者肠道菌群组成及代谢的修复作用。肠道菌群组成的关键变化包括：（1）增加有益菌的丰度；（2）减少致病相关菌（如脆弱拟杆菌，Bacteroides fragilis）；（3）促进保护性代谢产物（如短链脂肪酸，SCFAs）及次级胆汁酸的产生。这些变化有助于提高肠屏障完整性并减轻炎症 溃疡性结肠炎相关的肠道菌群失调还会改变关键的微生物代谢产物，包括短链脂肪酸、胆汁酸和鞘脂类物质，这些物质作为代谢副产物和碳源，对微生物生态具有重要影响。研究发现，溃疡性结肠炎患者体内短链脂肪酸（尤其是丁酸）的含量显著降低，这与产丁酸菌的减少有关。这种缺乏会影响结肠细胞的能量供应，并促进大肠杆菌等需氧致病菌的增殖。通过灌肠或口服补充丁酸，在动物模型中已被证实可恢复上皮屏障功能、降低炎症标志物水平并缓解结肠炎症状。 5.3 免疫调节 肠道是人体最大的免疫器官，承担了人体近70% 的全身免疫功能。其防御体系通过先天免疫和适应性免疫系统的协同作用来构建。在复杂的肠道微环境中，高度异质的巨噬细胞群体动态调节着黏膜稳态。然而，新的证据表明，巨噬细胞表型和功能的失调是慢性炎症性疾病的核心病理特征。后生元可通过调节巨噬细胞极化来重塑肠道免疫微环境的稳态（图5），为包括炎症性肠病在内的慢性疾病提供了一种新的治疗选择。源自长双歧杆菌的新型胞外多糖BLEPS-1，已被证实可通过下调白细胞介素- 6、肿瘤坏死因子-α 和γ- 干扰素等促炎细胞因子的表达，以及抑制诱导型一氧化氮合酶的表达，显著抑制促炎性巨噬细胞的激活。值得注意的是，当该胞外多糖与嗜酸乳杆菌共同制成后生元制剂时，可协同增强巨噬细胞的修复性极化。与单一疗法相比，联合疗法在缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎方面效果更显著，这凸显了其作为炎症性肠病新型治疗策略的潜力。机制研究表明，吲哚- 3 - 丙酸可通过抑制糖酵解依赖性促炎性极化，同时增强巨噬细胞向修复表型的分化，来调节巨噬细胞的可塑性。这项研究结果为后生元通过重编程巨噬细胞极化相关的免疫代谢通路来治疗溃疡性结肠炎的潜在益处，提供了有力的实验证据。 图 5. 后生元在溃疡性结肠炎（UC）中的免疫调节机制。后生元影响的关键免疫机制包括：（1）巨噬细胞极化：促使促炎性 M1 型巨噬细胞向抗炎 / 修复性 M2 型巨噬细胞转化；（2）T 细胞平衡：抑制促炎性 Th1、Th2 及 Th17 细胞的分化，同时促进调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg 细胞）增殖；（3）上皮 - 免疫对话：激活肠上皮细胞中的芳香烃受体（AhR），进而增强肠屏障功能并促进抗菌肽（AMP）分泌。 近期研究强调了后生元在通过复杂免疫调节过程维持T 细胞亚群平衡方面的关键作用。开创性研究表明，生命早期的微生物定植具有长期的免疫调节作用，新生儿暴露于p40 等生物活性物质时，可诱导肠上皮细胞发生持续的表观遗传重编程。这一过程涉及Setd1β介导的组蛋白甲基化，可增强转化生长因子-β的分泌，从而促进固有层中调节性T 细胞的扩增，并为机体提供终身的结肠炎保护。值得注意的是，源自麦麸阿拉伯木聚糖的后生元具有独特的能力，可通过增加吲哚衍生物和胆汁酸的产生来激活芳香烃受体信号通路。芳香烃受体信号通路的激活可促进白细胞介素- 22 依赖性黏膜屏障增强，同时调节效应T 细胞的反应。 一项开创性研究采用源自人乳的后生元（具体为短双歧杆菌DSM 32583 和发酵乳杆菌 CECT5716），提出了一种创新的治疗方法。在溃疡性结肠炎模型中，这些后生元被证实可同时抑制致病性Th2/Th1/Th17 细胞的极化，同时促进富含白细胞介素- 10 的抗炎微环境的形成，从而实现对炎症级联反应的双重调节。 近期研究将这些发现扩展到老年人群体。例如，口服热灭活的加氏乳杆菌TMC0356 ，可通过上调CD8+T 细胞的丰度并维持CD28 共刺激分子的表达，显著改善老年人的细胞免疫反应。同样，热灭活的副干酪乳杆菌已被证实可预防与年龄或压力相关的免疫功能下降，并降低老年人感染风险，可能延长其健康寿命。这些发现为开发针对溃疡性结肠炎治疗的新型候选药物具有重要意义。 5.4 抗炎信号通路 近年来，后生元在溃疡性结肠炎中的免疫调节作用机制方面取得了重大进展。后生元的多靶点抗炎信号通路受到了越来越多的关注，这些通路可协同调节肠道炎症。大量研究表明，后生元可通过抑制促炎信号通路和激活免疫调节网络来重塑肠道微环境（图6）。例如，调节JAK/STAT3/FOXO3 通路是后生元促进单核细胞向抗炎性M2 表型激活的关键机制。研究发现，7-mix 和mix-sup 等特定制剂可抑制该通路，显著降低CD86+M1 巨噬细胞的比例，同时上调CD206+M2 标志物的表达，从而减轻肠道炎症。 图 6. 后生元在溃疡性结肠炎（UC）中靶向调控的关键抗炎信号通路。后生元通过协同调控一组信号通路网络发挥治疗作用，具体包括：（1）抑制核因子 -κB（NF-κB）信号通路，减少促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子 -α，TNF-α；白细胞介素 - 6，IL-6）的产生；（2）抑制 Janus 激酶 / 信号转导与转录激活因子 3 / 叉头框蛋白 O3（JAK/STAT3/FOXO3）信号轴，促进巨噬细胞向抗炎性 M2 表型极化；（3）调节组蛋白去乙酰化酶 3/ Toll 样受体 4（HDAC3/TLR4）通路，重新平衡辅助性 T 细胞 17 / 调节性 T 细胞（Th17/Treg）的稳态；（4）激活芳香烃受体（AHR），上调白细胞介素 - 22（IL-22）的表达，增强上皮屏障功能并诱导抗菌肽（AMPs）产生。这种多维度作用方式，凸显了后生元作为缓解肠道炎症综合策略的潜力。 此外，研究证实产短链脂肪酸细菌及其代谢产物可通过靶向组蛋白去乙酰化酶3和TLR4 通路，对白细胞介素- 6 和肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子以及Th17 细胞激活产生双重抑制作用，进而恢复Th17 细胞与调节性T 细胞之间的稳态。值得注意的是，抑制NF-κB 通路是后生元的核心抗炎策略。源自费氏丙酸杆菌的胞外囊泡已被证实可通过抑制NF-κB 信号通路，减少肠上皮细胞中白细胞介素- 8 的释放。此外，研究发现阿拉伯木聚糖与发酵乳杆菌HFY06 的协同组合可抑制NF-κB 活性，从而增强抗氧化能力并减缓结肠炎的进展。 除此之外，后生元可通过色氨酸代谢- AhR/IL-22 轴增强肠道屏障完整性。在此过程中，吲哚衍生物等微生物代谢产物可作为芳香烃受体的配体，从而激活下游的白细胞介素- 22 信号通路。有趣的是，研究发现丁酸和活性维生素D3 可通过激活芳香烃受体协同上调抗菌肽和白细胞介素-22的表达，同时抑制白细胞介素- 6 和肿瘤坏死因子-α的表达。这一发现表明，后生元可能通过调节免疫反应相关的多种信号通路（如JAK/STAT3 通路和芳香烃受体通路），从而调节巨噬细胞极化、细胞因子平衡并恢复上皮屏障功能，为溃疡性结肠炎的治疗提供一种新方法。后生元的多方面治疗效果为溃疡性结肠炎的精准免疫治疗提供了广阔前景。 6 安全性评估 临床试验表明，含有后生元的产品对人体健康具有积极影响，且不会对宿主产生不良影响。在一项涉及443 名肠易激综合征患者的双盲、安慰剂对照试验中，参与者被分为两组：一组每天服用两粒含有热灭活的改善双歧杆菌MIMBb75 的胶囊，另一组则服用两粒外观相同的麦芽糊精胶囊。结果显示，热灭活的改善双歧杆菌MIMBb75 不仅保持了其与肠上皮细胞的强黏附能力，还表现出更强的疗效，这可能得益于肠道屏障功能的改善。另一项随机对照试验的数据表明，热灭活的副干酪乳杆菌CBA L74 可显著降低与腹泻相关的胃肠道感染风险。 近年来，专门针对后生元治疗溃疡性结肠炎的临床试验在已发表的文献中相对较少，大部分证据主要来自动物研究。例如，研究表明植物乳杆菌Q7 的胞外囊泡可通过调节肠道菌群，有效治疗葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎。同样，热灭活的两歧双歧杆菌B1628 细胞可通过调节肠道菌群，对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎产生治疗效果。此外，源自副干酪乳杆菌TK1501 的脂多糖和肽聚糖可增强黏蛋白- 2 的表达并改善巨噬细胞的吞噬活性，有效治疗葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎。 值得注意的是，由于后生元所含微生物已失去复制能力，因此其安全性应优于益生菌。尽管已有多种后生元作为免疫刺激剂上市或受到监管，但目前尚未明确规定具体的监管类别。然而，不能仅根据前体微生物的安全特性就推定后生元是安全的。根据所提出的定义，在使用任何后生元之前，都需要对其预期用途进行安全性评估。此外，食品或食品补充剂中的每种后生元都需要获得健康声称批准，并且必须始终符合适用监管类别的安全要求。 未来的研究应重点开展后生元的临床研究，以证实其在缓解溃疡性结肠炎方面的有益作用，并全面评估后生元的安全性，从而为溃疡性结肠炎的治疗提供新的策略和方法。 7 结论与未来展望 后生元已成为溃疡性结肠炎治疗领域的一个新型治疗方向。越来越多的证据表明，从传统益生菌转向精确定义的微生物衍生物，在调节微生物- 宿主相互作用和改善结肠炎发病机制方面具有治疗潜力。本综述系统概述了后生元的活性成分，强调了后生元在恢复肠道稳态中的多方面作用，包括增强屏障功能、调节菌群、免疫重编程以及调控抗炎信号通路。 后生元克服了传统益生菌的局限性（如定植效率低和个体差异大），为溃疡性结肠炎治疗提供了一种更稳定、效果更一致的治疗选择。尽管临床前研究取得了令人鼓舞的结果，为后生元干预提供了可能，但要将实验室发现转化为临床应用，仍面临诸多挑战。首先，由于后生元领域的定位不明确，其临床应用和商业化面临着重大的监管挑战，这限制了后生元制剂的广泛应用。其次，大多数研究过于关注菌群变化，而忽视了生物制剂的核心价值在于其健康益处。此外，研究表明后生元可降低活菌相关的感染和基因转移风险，但目前对其的全面安全性评估仍不充分。 因此，在改善溃疡性结肠炎方面，后生元几乎可以肯定具有积极作用，但其有效发挥作用的具体机制仍有待充分阐明。我们建议该领域应致力于通过精心设计的试验，验证具体且可靠的健康成果。例如，应考虑特定后生元与溃疡性结肠炎之间的剂量依赖性关联、活性成分的生物利用度和有效性，以及纳入的亚组人群的疾病严重程度。为了充分发挥后生元的健康益处，我们还需要明确的指南和标准，以确保后生元的安全性、质量和有效性。 文献来源： Postbiotics as an Innovative Intervention Strategy for Ulcerative Colitis: Insights into Bioactive Components and Mechanisms of Action. J Agric Food Chem. 2025 Oct 8;73(40):25150-25164. doi: 10.1021/acs.jafc.5c08885. Epub 2025 Sep 25. PMID: 40999678.(IF:6.2, 中科院1区).  ~ End ~ 责任编辑：陈萌鹤 审       核：任大勇 陈萌鹤 功能性微生物资源开发与食品安全控制团队 益生菌与食药资源协同研发创新团队 微信号：andyreee 声明：本文转载仅仅是出于学术交流和传播信息的需要，不代表本平台观点或证实其内容的真实性；本文版权归原作者所有，作者如果不希望被转载，请联系本平台删除。

摘要：疫苗佐剂是疫苗中不可或缺的成分，能够增强疫苗的免疫原性 。本文首先介绍了佐剂的作用机制，包括免疫刺激剂通过激活抗原呈递细胞（APCs）上的模式识别受体（PRRs）来增强免疫反应，以及递送系统通过延长抗原生物利用度、靶向 APCs 或淋巴结等方式促进抗原呈递 。接着阐述了经典佐剂平台（如铝佐剂、乳液佐剂等）和正在研究的佐剂平台（如合成双链 RNA、脂质纳米颗粒等）的特点和应用进展 。最后指出在开发新型疫苗时选择合适佐剂需要综合考虑多种因素，并且对未来佐剂的发展方向进行了展望，期望为佐剂的进一步研究、合理使用及设计开发提供参考。一、引言疫苗佐剂是与疫苗抗原联合使用时，能够增强疫苗免疫原性的各种成分。从 1926 年亚历山大・格伦尼发现铝盐可增强抗体产生，到如今多种佐剂的研发，佐剂的发展历程不断推进。尽管佐剂应用广泛，但其作用机制曾长期未被清晰阐释。随着对先天免疫反应控制抗原特异性反应机制的深入了解，佐剂的作用机制逐渐明晰。不过，由于佐剂定义宽泛、机制复杂，目前仍缺乏系统总结，这使得在为特定疫苗选择合适佐剂时面临困难。因此，本文旨在系统梳理佐剂的作用机制、各类佐剂平台的特点及应用进展，并探讨未来发展方向（原文 Fig. 1，展示佐剂增强疫苗免疫原性的原理，直观呈现无佐剂疫苗和有佐剂疫苗在诱导免疫反应上的差异）。二、佐剂的作用机制佐剂主要通过激活先天免疫细胞来增强疫苗的适应性免疫，其核心是促进抗原呈递信号（信号 1）和共刺激信号（信号 2）的产生 。免疫刺激剂和递送系统是佐剂的两大主要类型，它们通过不同方式发挥佐剂功效。免疫刺激剂的作用机制：免疫刺激剂作为危险信号分子，与 APCs 上的 PRRs 相互作用，引发先天免疫反应，促使 APCs 成熟和激活，进而启动和增强适应性免疫反应 。不同类型的免疫刺激剂通过靶向不同的 PRRs，诱导不同的细胞因子分泌，从而决定适应性免疫反应的类型 。比如，靶向 Toll 样受体（TLRs）通路的免疫刺激剂，能激活不同的 TLRs，引发不同的免疫反应；靶向 cGAS - STING 通路的免疫刺激剂，可促进 I 型干扰素的产生，极化初始 T 细胞为 Th1 型细胞并促进细胞毒性 T 淋巴细胞（CTLs）的生成；靶向 C 型凝集素受体（CLRs）通路的免疫刺激剂，能增强抗原的摄取、加工和呈递，调控初始 T 细胞的极化方向；此外，免疫刺激剂还能激活其他 PRRs，如 NOD1、NOD2 等，影响免疫反应（原文 Fig. 4，以简化图的形式展示免疫刺激剂通过激活 PRRs 调节适应性免疫反应的过程，清晰呈现不同免疫刺激剂的作用路径和结果）。递送系统的作用机制：递送系统作为载体材料，主要功能是促进抗原呈递，可通过多种方式实现。它能延长抗原的生物利用度，如通过持续释放抗原、形成免疫龛和保护抗原免受酶降解等；能靶向 APCs，通过模拟病原体的大小和结构或直接靶向 APCs 上的特定受体，增加抗原的摄取；还能促进抗原向淋巴结运输，通过被动扩散或白蛋白 - 搭便车的方式，增加抗原与 APCs 相遇的机会；此外，一些递送系统还能促进抗原的交叉呈递，使外源性抗原通过 MHC I 分子呈递给 CD8+ T 细胞，增强细胞免疫反应（原文 Fig. 5，展示递送系统的作用机制示意图，详细说明其在延长抗原生物利用度、靶向 APCs、向淋巴结运输和促进抗原交叉呈递等方面的作用方式）。三、经典佐剂平台经典的人类疫苗佐剂包括铝佐剂、MF59、AS01、AS03、AS04 和 CpG ODN 1018 等，它们在多种疫苗中广泛应用，可提高疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应 。铝佐剂：是首个被批准用于人类疫苗的佐剂，常用的有氢氧化铝和磷酸铝 。它既能作为递送系统，持续释放抗原，延长抗原生物利用度，又能作为免疫刺激剂，诱导损伤相关分子模式（DAMPs）的产生，激活先天免疫途径的 PRRs，引发细胞因子的产生和 Th2 型免疫反应 。不过，铝佐剂在诱导强烈细胞免疫反应方面存在困难，且可能引发不良反应，如红斑、过敏反应等 。尽管如此，因其安全性较高，目前仍被广泛应用于多种疫苗，如白喉、破伤风、脑膜炎和乙肝疫苗等（原文 Fig. 6，展示经典佐剂的主要信号通路简化图，帮助读者理解铝佐剂在免疫反应中的作用路径）。乳液佐剂：MF59 和 AS03 是经典的水包油乳液佐剂 。MF59 由角鲨烯、吐温 80 和司盘 85 组成，它具有抗原递送和免疫刺激的双重功能，可通过缓慢释放抗原，延长抗原与免疫系统的相互作用时间，增强抗原呈递，同时激活先天免疫细胞，招募更多免疫细胞到注射部位，促进免疫反应，但它主要诱导 Th2 型免疫反应 。AS03 由 α - 生育酚、角鲨烯和吐温 80 组成，作用机制与 MF59 相似，也主要诱导 Th2 型免疫反应 。这两种佐剂都已被广泛应用于多种人类疫苗，如流感疫苗，且在临床试验中表现出良好的安全性和有效性 。TLR 激动剂分子佐剂：AS04 是由铝吸附 TLR4 激动剂分子单磷酰脂质 A（MPLA）制备而成的佐剂，它比铝佐剂具有更强的免疫刺激功能，能特异性激活 APCs 上的 TLR4，引发更强的 Th1 细胞反应，诱导更高水平的抗体产生，目前主要用于人乳头瘤病毒（HPV）疫苗和乙肝疫苗 。CpG ODN 1018 是一种合成的单链 DNA 分子，作为 TLR9 激动剂，能激活 IRF7，产生强烈的 Th1 型细胞反应和细胞毒性 T 细胞，目前正在进行 COVID - 19 疫苗的临床试验评估 。颗粒佐剂系统：AS01 是一种经典的颗粒佐剂系统，由脂质体包裹免疫刺激剂 MPLA 和从皂树树皮中提取的 QS - 21 组成 。脂质体可保护抗原并促进其呈递，MPLA 和 QS - 21 协同作用，激活先天免疫系统，诱导 Th1 为主的免疫反应和 CTLs 的产生 。AS01 已被用于疟疾和带状疱疹疫苗，目前也在用于新型结核肽疫苗的研发，且在临床试验中显示出良好的安全性和有效性 。四、正在研究的佐剂平台近年来，随着佐剂研究的深入，一些正在研究的免疫刺激剂和递送系统展现出良好的佐剂效能。正在研究的免疫刺激剂平台：合成双链 RNA（dsRNAs），如 Poly - I:C 和 Poly - ICLC，可激活 TLR3 和 MDA5，诱导强烈的 Th1 型免疫反应和 CTLs 产生，在癌症疫苗的临床试验中显示出潜力，但可能存在剂量依赖性的全身发热和凝血异常等副作用 。GLA 及其衍生物，如 GLA - SE，可激活 TLR4，诱导 Th1 型免疫反应，在多种疫苗的临床前和临床试验中表现出良好的安全性和免疫原性，具有作为下一代疫苗佐剂的潜力 。咪唑喹啉类，如咪喹莫特（Imiquimod）、瑞喹莫德（Resiquimod）和 3M - 052，可激活 TLR 7/8，促进 Th1 细胞和 CTLs 的产生，但存在全身扩散导致疗效降低和副作用的问题，需要与其他递送材料结合使用 。CpG ODNs，如 CpG ODN 7909 和 IC31，可激活 TLR9，诱导 Th1 型反应和 CTLs 产生，在乙肝疫苗和疟疾疫苗等的研究中显示出良好效果 。环二核苷酸（CDNs），可激活 cGAS - STING 通路，诱导强烈的 Th1 型细胞反应和 CTLs 反应，在多种疫苗的临床前研究中表现出前景，部分已进入临床试验阶段 。代谢佐剂，如靶向甲羟戊酸途径和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）复合物等代谢通路的小分子调节剂，可通过调节免疫细胞的代谢来增强免疫反应，是一类新型的疫苗佐剂 。锰佐剂及其衍生物，可激活 cGAS - STING 通路，增强抗原呈递和交叉呈递，促进抗体产生和 CD8+ T 细胞免疫反应，相关的纳米佐剂在动物实验中展现出良好的效果，具有很大的开发潜力（原文 Table 1，展示正在研究的免疫刺激剂平台的临床试验情况，包括平台名称、作用机制、抗原、测试疾病和临床试验编号等信息，直观呈现这些免疫刺激剂在临床研究中的应用现状）。正在研究的递送系统平台：新型水包油纳米乳液，如 Montanide ISA 51 和 Montanide ISA 720，通过形成抗原储存库和缓慢释放抗原，增强血清抗体和 CTLs 的产生，目前正在进行多种疫苗的临床试验评估 。脂质纳米颗粒（LNPs），由可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰脂质组成，具有多种功能，可有效保护抗原、靶向 APCs 和促进抗原从内体逃逸，在 COVID - 19 疫苗、肿瘤疫苗和流感疫苗等的临床试验中表现出色，部分已获批紧急上市 。聚合物颗粒，分为天然聚合物和合成聚合物颗粒，如壳聚糖和聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（PLGA），主要通过缓慢释放抗原发挥作用，在核酸疫苗、黏膜疫苗和癌症疫苗等方面具有应用潜力，部分已进入临床试验阶段 。病毒样颗粒（VLPs），具有良好的颗粒大小和几何结构，可有效递送疫苗抗原，激发强烈的抗体反应，已成功应用于多种疫苗，如 HPV 疫苗、乙肝疫苗等，还有多种基于 VLPs 的疫苗正在进行临床试验 。笼状蛋白纳米颗粒，如铁蛋白，具有高度有序和重复的空间结构，可将抗原表位展示在表面，有效激活 B 细胞，在流感疫苗、COVID - 19 疫苗和肿瘤疫苗等的研究中展现出良好前景 。无机纳米材料，如金纳米颗粒和介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs），可通过保护抗原、促进抗原呈递和靶向淋巴结等方式增强免疫反应，目前相关的疫苗正在进行临床试验（原文 Table 2，展示正在研究的递送系统平台的临床试验情况，涵盖平台名称、作用机制、抗原、测试疾病和临床试验编号等，清晰呈现这些递送系统在临床研究中的进展）。五、结论与展望疫苗佐剂在疫苗开发中具有关键作用，其发展对于提升疫苗效果至关重要 。在选择佐剂时，需要综合考虑多种因素，包括给药途径、所需免疫反应类型、病原体类型、抗原类型、疾病阶段以及疫苗接受者的生物学特征等，同时也要兼顾佐剂的安全性和经济性 。目前，将免疫刺激剂和递送系统结合使用是佐剂开发的趋势，但在此过程中，需要明确不同 PRRs 之间的信号相互作用，合理设计递送系统以兼容多种疫苗成分 。此外，虽然经典佐剂具有良好的生物安全性和成熟的研发基础，但因其免疫刺激能力有限，仍需开发新型佐剂来弥补不足。不过，新型佐剂的临床前开发和临床试验成本高、时间长，限制了其转化应用。因此，对经典佐剂进行性能优化和配方改进，如表面修饰、颗粒化处理或与其他佐剂联合使用，以提高其免疫功效，也是具有临床价值的研究方向。总体而言，本文系统地总结了佐剂的作用机制，详细介绍了不同类型佐剂的特点和应用场景。希望能为进一步研究佐剂机制、合理使用现有佐剂以及设计开发新型佐剂提供有价值的参考，推动疫苗佐剂领域的发展，从而助力更高效、更安全疫苗的研发，为全球公共卫生事业做出贡献。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

前言Toll样受体（TLRs）是一种先天免疫受体，直接或间接负责检测病原体相关分子模式（PAMP），并通过激活先天和适应性免疫途径对其作出反应。TLRs是抵御微生物病原体的第一道防线，TLR可以分为细胞表面和内体亚家族，识别不同的PAMP，并激活常见和特定的信号通路以形成免疫反应。尽管具有保护功能，TLR的异常反应仍会导致炎症和自身免疫性疾病。了解TLR激活和调节机制之间的微妙平衡对于破译它们在免疫防御和疾病发病机制中的双重作用至关重要。此外，天然存在和合成的TLR激动剂可以利用这些内源性免疫信号通路来增强和调节疫苗反应，从而使其成为优良的疫苗佐剂。这不仅对开发针对传染病的疫苗具有重要意义，而且对针对癌症、过敏、阿尔茨海默病和其他疾病的免疫疗法也具有重要意义。TLR的发现史1989年，Charles A. Janeway提出了一个突破性的假设，表示先天免疫系统具有通过主要在哨兵细胞上表达的受体检测微生物感染的显著能力，称之为“模式识别受体（PRRs）”。这些受体识别称为“病原体相关分子模式”的不同分子结构，这些结构在病原体中广泛表达，对其生存至关重要，但在宿主细胞中明显缺失。这使得PRRs能够有效地区分自我和非自我，并启动先天免疫反应。1996年，Hoffmann等人进行的一项研究证实了Janeway的假设。该研究表明，果蝇携带一种名为“Toll”的受体突变，由于抗真菌肽的诱导缺陷，对真菌感染表现出更高的易感性。随后，Janeway和Medzhitov的进一步探索鉴定出了Toll的人类同源物，最初称为hToll，后来被确认为Toll样受体4（TLR4）。TLR4的发现揭示了它通过激活转录因子核因子κB（NF-κB）诱导先天反应的能力，包括产生促炎细胞因子和表达共刺激分子。随后，在人类和小鼠中分别鉴定出10个和12个TLR，每个TLR都能识别多种PAMP。TLR1至TLR9在两个物种中都是保守的；由于逆转录病毒衍生的DNA插入，小鼠TLR10不起作用；TLR11、TLR12和TLR13不存在于人类基因组中。TLRs的发现推翻了人们最早的认识，即先天免疫系统识别病原体是非特异性的。TLR的结构和信号通路TLR属于I型跨膜蛋白，包括负责PAMP识别的富含亮氨酸重复序列（LRR）的外结构域、跨膜区和激活下游信号通路的细胞质Toll-IL-1受体（TIR）结构域。TLR分为细胞表面和内体亚家族：细胞表面TLR（TLR1、TLR2、TLR4和TLR5）识别脂质和蛋白质成分，而内体TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR13）专门用于核酸检测；即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2与TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、单链RNA（TLR7/8）、双链RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。TLRs激活的免疫反应类型由特定TLR及其衔接蛋白激活的信号通路决定。一般来说，大多数TLR途径导致Th1免疫反应，但TLR2除外，可能由于TLR2配体的多样性，TLR2可以诱导促炎和抗炎途径，导致Th1、Th0或Th2免疫反应。除TLR3外，大多数TLR通过MyD88发挥作用。TLR激活后，MyD88募集由IL1受体相关激酶（IRAK）1、IRAK2和IRAK 4组成的寡聚复合物，并激活MyD88 TNF受体相关因子6（TRAF6）。活化的TRAF6随后触发核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，从而诱导促炎细胞因子，如IL-12和TNF-α。TLR7和TLR9可以激活TRAF3磷酸化干扰素调节因子7（IRF7），从而产生IFN-α。此外，TLR3和TLR4已被证明通过其TRIF衔接蛋白募集TRAF3来诱导IFN-β的产生，从而激活IRF3。I型IFN应答可诱导强Th1细胞/细胞毒性T细胞（CTL）应答，该应答对鉴定和清除感染或癌细胞很重要。TLR2受体主要诱导以高IL-10产生和低IL-12为特征的强Th2免疫反应。TLR并不专门触发Th1或Th2途径，而是可以影响多种途径。正是信号事件的平衡决定了免疫偏向。例如，一项研究表明，TLR4和TLR2激动剂的激活可以通过p38 MAPK和ERK1/2-FOS途径刺激信号传导，分别导致IL-12或IL-10的产生；然而，TLR4在比TLR2更高的阈值下诱导p38 MAPK信号传导，而TLR2在比TLR4更高的阈下诱导ERK1/2信号传导，导致免疫极化。TLRs在适应性免疫中的作用TLRs协调了从免疫细胞迁移到增强抗体亲和力成熟的许多功能。TLRs作为危险信号传感器，增加了免疫细胞向疫苗给药部位的运输。TLR参与可增强I类和II类MHC分子的抗原捕获、处理和呈递。某些特定类型的TLR可以不同程度地影响抗原的交叉呈递，从而TLR3或TLR4，而不是TLR2或TLR7/8配体，减少CD8 +T细胞对抗原的摄取和交叉呈递。TLR激活也可导致共刺激分子（如CD80和CD86）的上调，这对APC启动幼稚T细胞至关重要。DC细胞的TLR在自我/非自我抗原识别以及是产生免疫反应还是免疫耐受中起着关键作用。不同类型的APC表达不同的TLR，例如髓系DC表达TLR2和TLR4，而浆细胞样DC（pDC）表达TRL7和TLR9。因此，TLR对不同DC谱系的优先激活可以影响随后的免疫偏向。与小鼠相比，TLR在B细胞上的表达在人类中更为有限，人类主要表达TLR 2、7、9、10，TLR2配体需要通过B细胞受体（BCR）和TLR7的交联进行额外增敏，TLR7需要1型干扰素（IFN）引发。这些TLR激动剂在体外诱导B细胞的增殖、活化和分化。最初，人们认为TLRs只促进B细胞的卵泡外反应，其特征是快速产生低亲和力抗体；然而，最近的研究表明，TLRs也可以增强生发中心反应，从而产生高亲和力抗体。TLR与BCR协同作用，诱导类转换重组和抗体反应的成熟。TLR4还增强了B细胞向引流淋巴结的迁移，并在此过程中加快了抗体类别的转换。不适宜的B细胞TLR信号传导与自身反应性B细胞和自身免疫性疾病的产生有关；因此，在疫苗配方中避免过度的TLR刺激非常重要。TLR也已被证明能增强各种不同的T细胞亚群。几项研究表明，TLRs可以作为CD8+T细胞的共刺激分子，促进细胞增殖/存活、效应器功能、细胞因子产生和记忆形成的增加。TLRs在Treg细胞中的作用仍然存在争议。几项研究表明，TLR2激动剂可诱导Treg抑制活性的暂时丧失；而其他研究表明，尽管TLR2激动剂可增加抗原特异性增殖，但Treg细胞仍保留其抑制功能。TLR在疫苗佐剂中的应用天然存在和合成的TLR激动剂可以利用这些内源性免疫信号通路来增强和调节疫苗反应，从而使其成为优良的疫苗佐剂。疫苗配方中使用的TLR激动剂有多种形式，从脂肽到单链DNA和RNA。下面介绍TLR佐剂的主要类别。TLR2TLR2在多种细胞表面表达，包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、髓系抑制细胞、血小板和肥大细胞。TLR2识别的PAMP库是最广泛的，因为它能够与TLR1和TLR6（以及人类中的TLR10）形成异二聚体。TLR2佐剂的范围很广，包括合成脂肽（PAM3CSK4和PAM2CSK4）、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、GPI膜锚定物、酵母多糖和肽聚糖。近年来TLR2研究的主要趋势包括发现小型合成TLR2激动剂、改进传统TLR2激动物的特性以及TLR2与疫苗抗原的生物偶联。例如，XS15（PAM3CS-GDPKHPKSF）是一种新的基于PAM3CS的TLR-1/2激动剂，其中PAM3CSK4的四赖氨酸（K4）被九肽（GDPKHPKSF）取代，以改变偶联物的水溶性，不仅促进摄取，而且易于纯化。使用TLR2激动剂作为佐剂的局限性包括大多数配体的大小、复杂性和疏水性。TLR3TLR3是一种细胞内识别系统，对病毒核酸（dsRNA、ssRNA和ssDNA）以及内源性双链RNA作出反应。已经开发了许多TLR3激动剂，如RGC100和ARNAX，一种合成的DNA-RNA杂交化合物。然而，在过去两年中，研究人员又回到了使用传统的dsRNA模拟配体，如poly IC，重点是改进其递送模式和新的疾病应用。TLR4TLR4是TLR家族中研究最多的成员，它识别脂多糖（LPS）。TLR4位于质膜上，主要在髓系细胞上表达，而pDCs和幼稚B细胞不表达。TLR4通过其共受体骨髓分化因子-2（MD-2）和CD14识别LPS。最近关于TLR4激动剂的工作集中在修饰产物的开发和评估上，如单磷酸脂质A（MPLA）和吡喃葡萄糖脂质A（GLA），它们在结构上与LPS相关，但没有高致热原性并保持强免疫增强特性，从而增加了其临床应用的可行性。TLR5TLR5识别鞭毛蛋白，并在上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞和未成熟DC）上表达，通过MyD88依赖性信号通路产生免疫反应。最近关于TLR5激动剂的工作主要集中在提高耐受性上。不幸的是，鞭毛蛋白会诱导不必要的过度反应原性，作为一种蛋白质，它可以诱导针对自身的抗体，干扰其作为佐剂的功能。有研究通过从鞭毛蛋白中去除B细胞表位区域解决了这一问题，脱免疫的鞭毛蛋白保留了其TLR5佐剂活性。TLR7/8TLR7和TLR8位于免疫细胞的内涵体膜上。TLR7主要在pDC和B细胞中表达，而TLR8在髓系树突状细胞、单核细胞中表达，在pDC中表达程度较低。TLR7/8识别单链核糖核酸（ssRNA），并通过MyD88依赖性途径发出信号。在天然配体中，富含腺苷和尿苷的寡核苷酸（ORN）能够激活TLR8，而对TLR7没有任何影响，而富含鸟苷的ORN激活TLR7和TLR8依赖性信号传导。TLR7以单体形式存在，并在配体存在下二聚，而TLR8以天然存在的弱二聚体存在，在配体结合时发生构象变化。目前已发现15种以上的新型杂环分子，如咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡咯嘧啶和苯并咪唑，被鉴定为TLR7/8激动剂。TLR7/8激动剂的一个常见缺点是反应原性，近年来，有大量研究试图克服这些副作用。将TLR7/8激动剂封装在基于阳离子DOEPC的脂质体制剂纳米颗粒中，或将这些小分子共价连接到超支化聚合物上，可以避免其有害的系统反应，同时保持其对体液免疫的影响。TLR9TLR9在细胞内定位于内涵体膜中，识别细菌和病毒DNA的单链非甲基化CpG寡核苷酸。TLR9在免疫细胞上表达，如树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他APC。合成CpG序列可用作TLR9激动剂，以增强疫苗的免疫反应，并且每种独特的序列变异组合已被证明具有不同的结构和生物学特性。TLR9激动剂在过去两年中的最新发展主要集中在CpG向细胞的有效递送和摄取上。例如，一项研究介绍了一种将CpG-ODN偶联到新型阳离子脂质体上的新方法，该复合物能够在低抗原和佐剂剂量下诱导强烈的免疫反应。组合TLR佐剂将不同TLR的激动剂组合在单一疫苗中产生协同效应，可以驱动强大的疫苗免疫反应。例如，包含1V270（TLR7激动剂）和2B182C（TLR4激动剂）的脂质体佐剂诱导了针对流感的平衡的抗HA和抗NA IgG1和IgG2a反应，而没有Th1促炎反应常见的过度反应原性。类似地，一项研究评估了卵清蛋白（OVA）与两到三种TLR配体的十种独特组合的共包封，包括Pam3CSK4（TLR2激动剂）、MPLA（TLR4激动剂），咪喹莫特（TLR7/8激动剂）和CpG（TLR9激动剂），而三重组合以总体平衡的Th1/Th2应答促进抗原特异性抗体滴度。因此，TLR佐剂的组合可以提供广泛的定制免疫反应。TLR激动剂与其他PAMP如NOD2和巨噬细胞诱导型Ca²的组合⁺-依赖性凝集素受体（Mincle）配体也很有前景。共价连接CL239（TLR7激动剂）和胞壁酰二肽（NOD2激动剂），并将双激动剂作为纳米颗粒与NP-p24 HIV疫苗结合，协同作用增强了对小鼠的保护。小结TLR的发现大大增强了我们对先天免疫反应分子机制的理解，为创新的治疗方法和疫苗开发奠定了基础。靶向TLR的合成激动剂已被证明是非常有利的佐剂，相反，TLR拮抗剂对于减轻过度免疫反应具有重要价值，从而有助于治疗以TLR异常激活为特征的自身免疫性疾病。然而，关于单个TLR的特异性以及与其他PRR的潜在冗余问题仍然存在。微生物核酸被内体TLR和细胞质PRR识别，这确保了先天免疫系统能够通过不同细胞隔室中的多个PRR对各种病原体做出有效反应。TLR和PRR之间的相互作用是强有力地诱导免疫反应所必需的，这些PRR的激动剂的组合通过激活DC协同增强佐剂疗效。鉴于微生物病原体含有多种PAMP，这种协同作用可能在感染过程中自然发生，这可能解释了为什么与疫苗接种相比，自然感染通常会诱导更强的适应性免疫反应。然而，这种协同作用也可能与炎症性疾病的加重有关。因此，了解TLR和其他PRR之间的协同作用和相互作用机制对于开发先进的疫苗佐剂以及控制TLR相关疾病的药物至关重要。参考文献：1.Toll-like receptor (TLR) agonists as a driving force behind next-generation vaccine adjuvants and cancer therapeutics. Curr Opin Chem Biol.2022 Oct;70:1021722. Decoding Toll-like receptors: Recent insights and perspectives in innate immunity. Immunity.2024 Apr 9;57(4):649-673.推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）   综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标