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侃言诱导邻近，利用小分子诱导“蛋白质对”接近，是一种创新的药物发现模式。例如之前分享的Revolution Medicine开发的KRAS特异性和泛KRAS抑制剂RMC-6291、RMC-9805、RMC-6263等，作为一种分子胶而非双功能分子，通过诱导伴侣亲环蛋白和靶标蛋白形成三元复合物，降解靶标，进而干扰靶标上下游信号，详见👉 🔗。邻近诱导物，最常见的除了分子胶（MGs）以外，还有双功能分子（PROTACs）。本次分享，结合近几年来自学术界和CRO技术服务公司几篇前沿性研究文章，介绍一种高通量发现邻近诱导物（PROTACs & 分子胶）的高效、快速地方法——DNA编码化合物库筛（DEL）选技术。因此，本次主要分享以下3点：1、邻近诱导物：分子胶和PROTACs2、DEL与邻近诱导3、DEL应用于邻近诱导物发现的实例①ERα，by X-Chem, J Med Chem (2021)②BRD4, by HitGen, ACS Chem Biol (2023)③BRD9, by Broad Institute, J Am Chem Soc (2023)④BRDx, by Broad Institute, Nat Chem Bio (2024)⑤BRD4, by HK Univeristy & SIMM, ChemRxiv (2024)01邻近诱导化合物：MGs & PROTACs蛋白靶向降解剂（TPD）作为邻近诱导的实际应用备受关注，其中最常见的为分子胶（MGs）、和靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）。不同于靶标抑制剂，TPD不一定需要对蛋白有抑制活性，只需要对其有亲和力。因此，TPD可适用于更加广泛的靶标类别，甚至包括传统意义上被认为是“不可成药”的靶标，以及支架蛋白靶标、突变蛋白靶标等。分子胶（MGs）是一种邻近依赖性单价分子，通过粘合两个蛋白发挥作用。其作用的模式（MOA）可能为以下三种：1、MGs显著增强POI与E3的相互作用；2、MGs结合到POI，然后被E3识别；3、MGs结合到E3连接酶，然后识别新的底物POI。分子胶普遍存在，是一种理想的蛋白降解剂。然而关于其合理地发现和在药物治疗中的应用，非常具有挑战性。这些化合物大都是偶然发现的。通常是在表型分析中发现的化合物通过作用机制研究，发现的分子胶机理。关于其合理的设计、快速、高通量的筛查，将会非常具有吸引力！靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）是一种双特异性功能分子。一般，PROTACs由三部分组成：POI结合物、E3连接酶配体、以及连接两个分子的合适的连接子。PROTACs能招募目标蛋白（POI）和E3连接酶，诱导POI的多泛素化，使之随后被蛋白酶体介导降解。近些年最盛行的一种PROTACs开发方法是将抑制剂和已知的E3连接酶结合分子用适当的连接子连接起来。因此，一种快速、高效的筛查POI抑制剂的方法，发现潜在POI抑制剂，也非常具有吸引力。这里筛查出来的苗头化合物甚至不需要证明其抑制活性，仅仅具有亲和结合力就好。然后应用于PROTACs分子的形成和降解评估。以上两种邻近诱导物的合理设计和发现让人不禁想到了一种技术——基于亲和力筛选的DNA编码化合物库（DEL）筛选技术！02DEL与邻近诱导DNA编码化合物库（DEL）筛选技术本质上是一种亲和力结合实验。DEL筛选技术通过连接子连接DNA片段和潜在的POI结合物，构建多样性化合物文库，然后通过多轮生物淘选，从大量文库中分离出对POI具有亲和力的结合物，并通过对连接子连接的DNA片段测序鉴定、并解析结合物结构。因此，DEL筛选出来的苗头化合物对POI一般具有亲和力，但不一定具有抑制活性，需要后续进一步的体外/体内的活性鉴定。然而，TPD不一定需要像抑制剂那样的抑制功能效应，只需要亲和力！这不巧了嘛！一方面，DEL挑选的苗头化合物可以无缝地整合到嵌合分子中，应用于降解剂的降解能力评估。具体的操作，即，将DEL筛查出来的苗头化合物重合成，用反应性连接子一边连接苗头化合物，另一边用E3连接酶配体代替DNA片段，形成PROTACs分子。可以快速的探索数十、数百种由E3连接酶配体、连接子、POI结合物构成的组合，直接测定他们蛋白降解能力。快速、高效！接下来的实例中会谈到具体的应用。另一方面，也可以通过DEL技术，直接合成包含POI潜在结合物、连接子、E3连接酶配体的多样性文库，用于靶标和E3连接酶的筛选，直接筛查POI潜在结合物、以及连接子的多样性。或者，还可以对E3连接配体的多样性进行筛查。也有实际的应用报道在接下来的实例分享中具体说明。此外，分子胶是诱导邻近比较前沿的应用，它可能具有更加明显地优势，如更低地分子量、更少地可旋转键、更好地代谢稳定性等。然而，发现新型分子胶是比较具有挑战性的，而DEL广泛的化学空间，基于亲和力的生物淘选原理，为更加有潜力的分子胶的发现提供了无限可能。近两年，关于PROTACs和分子胶都有基于DEL的高质量、高档次文章报道，有来自企业界的技术服务公司，也有来自学术界的高等院校和研究所。接下来汇总了目前已报道的实例！03DEL应用于邻近诱导的实例鉴于邻近诱导物开辟了一种革新的药物治疗策略，合理的设计、和发现邻近诱导物就至关重要。学术界和企业界的CRO服务公司共同在此方面做出了不俗的贡献，开发出了两种靶向降解剂的发现策略：一是发现POI亲和力苗头化合物，用于PROTACs分子的生成；二是直接构建包含POI潜在结合物、连接子、E3连接酶配体的化合物文库，直接用于POI的筛查。Case / 01ERα : PROTACsby X-Chem2021年，X-Chem在J Med Chem上报道了其采用第一种方案，利用DNA编码化合物库筛选鉴定出了雌激素受体α（ERα）新型双特异性降解剂。ERα是雌激素受体的两种主要亚型之一，在约70%的乳腺癌中过度表达。如上图，是X-Chem研究人员从庞大的DEL文库筛选出苗头化合物，再到产生PROTACs组合的流程：首先，选择的文库是一个包含44个文库，约1,200亿个DEL分子（1.2x1012）的超级化合物库池子；POI（ERα）通过亲和tag固载，通过两轮生物淘选（洗涤和洗脱），富集到的DEL分子热洗脱后，对其DNA序列进行PCR扩增、测序。再通过“Click”偶联将富集的POI结合物与一些列E3连接酶配体连接起来，产生出PROTACs的组合。DEL筛选过后，从44个文库组成的池子中共产生了5.28亿次单端读取数据，每个文库每个筛选条件平均产生120万次读取。上表是从DEL中筛查出的苗头化合物，并对DNA片段的替代物进行了优化（2-7）筛查，以期寻找到合适的PROTACs连接子。研究人员首先以已知的POI结合物巴多昔酚作为模板，验证CRBN、VHL、IAP等作为E3配体的活性，最终确定VHL配体模型的降解潜力。之后，重点放在了以VHL作为E3配体，和DEL中筛查出来的苗头化合物组合在一起，生成了一系列PROTACs分子（化合物17-23，三个系列：酰胺连接、苯氧连接、酰胺连接的差向异构对照）。并对靶标、及包靶标的细胞进行了活性检测。酰胺连接的化合物都表现出了个位数nM级别的细胞降解潜力（ED50），单其结合力随着连接子的增长而减弱2-5倍（化合物17、18、19）。然而，对于苯氧连接子形成的PROTACs分子结合力的情况却相反，降解能力也不如酰胺键连接。这些化合物还与突变体D538G、S463P和Y537S进行了相应的结合实验，并显示出在野生型的20倍范围内的泛抑制作用。在细胞活力实验中，所有化合物都被证明是拮抗剂。从两个系列中选择出最具潜力的降解剂化合物18、21，进行后续MOA验证。生物化学上，这两种化合物在WT和突变体ERα FP结合试验中都非常有效！Case / 02BRD4: PROTACsby HitGen2023年，HitGen在ACS Chem Biol上报道了其采用第二种方案，利用DNA编码化合物库直接构建PROTACs文库，并针对BRD4，筛选出来新型PROTACs三元复合物。操作流程如下图：研究人员以三官能团支架分子作为连接子，一端连接DNA编码序列、一端连接E3连接酶配体、还有一端连接POI潜在配合物（通过两个循环构建潜在多样性配合物），并选择一端不连接E3连接酶配体的文库作为对照研究人员在筛选阶段对POI和E3连接酶与DEL文库孵育的方式进行控制，经过生物淘选、测序、数据分析，最终获得了具有针对BRD4有效降解的靶向降解剂。DEL文库：为了减少如方案1中大量繁琐的优化，HitGen研究人员通过构建包含E3连接酶配体的编码PROTACs文库，针对POI和E3 ligase直接进行筛选。如上图，PROTACs文库和对照组文库多样性相同，都包含628.6万个DEL分子。其中，选用了16个三官能团的支架分子作为连接子。筛选方案：如上图，研究人员设计了4个平行筛选方案，通过两轮筛选。方案一，用GST-tag标记BRD4，His-Tag标记CRBN/DDB1。将DEL文库、同POI、以及E3连接酶在溶液中共孵育；两轮筛选；第一轮孵育后通过亲和力GST-tag固载POI（BRD4），洗涤、热洗脱后的部分作为下一轮的input，与新鲜的亲和力tag标记的POI、E3连接酶进行第二轮共孵育，然后通过亲和力His-tag固载E3连接酶，洗涤、热洗脱，进入PCR扩增、NGS测序。目的是鉴定出同时结合POI、和E3连接酶的结合物。方案二，操作同方案一，但共孵育时不加入GST-tag标记的POI，而仅以GST-tag代替。目的是鉴定筛选背景。方案三，操作同方案一，但POI与E3连接酶不同时与文库共孵育。两轮筛选，第一轮仅GST-tag标记的POI与文库共孵育；二轮轮仅His-tag标记的E3连接酶与第一轮的热洗脱部分共孵育。目的是对照方案一，鉴定出具有协同作用的结合物。方案四，操作同方案一，但第一轮共孵育时不加入POI、E3连接酶，仅加入GST-Tag与文库共孵育。第二轮仅加入His-tag标记的DDB1进行共孵育。目的是鉴定筛选背景。筛选数据分析：如上图放大后的立方图。A代表PROTACs文库，B代表对照文库。筛选过后，对NGS数据进行去噪反褶积、形成可视化立方图。图中的点的大小与与序列读取数成正比。对比A中4个筛选条件下对PROTACs文库结合物富集的信息，可以看出，方案一的双靶标同时孵育获得明显的富集、方案三的协同孵育获得了中度的富集。因此，PROTACs的协同作用对信号富集具有加强的效应！对比方案一，A与B立方图表中PROTAC文库比对照组获得更明显的富集，也再次证明了PROTAC的协同作用对富集效应的加强。重合成验证：如下图，通过从DEL1323-1-13-311-348截获的三个线性特征中选择了9个具有代表性的PROTACs分子进行off-DNA重合成，以更好地了解结构、序列读数、和三元络合物形成的相关性。9个重合成的PROTACs分子分别代表着对连接子（R1)、POI结合物片段1（R2）、POI结合物片段2（R3）等不同位置的多样性选择。上表中，针对9个重合成的化合物，PROTACs文库在方案一与方案三中的序列读数的比值（S1/S3），反映了在E3连接酶在存在与不存在时，PROTACs分子结合POI的协同性。（备注：双功能分子结合两个蛋白的很大程度上不是非协同的吗？？？α~1 or < 1。只能说他们具有一定协同性，而非如分子胶的超强协同性，即分子胶只有在靶蛋白和呈递蛋白同时存在时才会对靶标有效结合，下面分子胶的筛选将会详细展开）在方案一中，DEL1323-1与DEL1323-3的序列读数的比值，反映了与CRBN通过沙利度胺片段促进的结合具有协同性。通过分析，两个最优的PROTACs分子cpd 1、cpd 5具有更高、更宽的曲线（上图曲线），以及通过比较另一种蛋白不存在和不存在时的抑制活性，也观察到α >1的正协同作用如下表。两个化合物针对BRD4的抑制活性IC50，在不添加CRBN/DDB1的情况下，IC50在次μM范围波动，添加CRBN/DDB1后，IC50均降至两位数nM范围，IC50比值在3左右。对于CRBN/DDB1，BRD4存在时IC50也降低2-4倍（上表）。综上所述，α值大于1，表明CRBN/DDB1和BRD4在三元配合物形成中具有积极的协同作用，这与CRBN/DDB1和BRD4同时存在时，信号比单独使用该蛋白筛选时强得多的选择结果相映衬。构效关系分析：通过对三个方向性片段的构效关系分析，也证明了DEL筛选序列的读数直接反映了DEL文库中PROTACs分子的相对三元复合物招募能力！这篇研究意义非凡！证明了利用DEL技术进行PROTACs文库设计、合成、和双蛋白亲和筛选，以直接发现针对BRD4的PROTACs分子的可行性。该方法解决了PROTAC发现和优化的基本操作：PROTAC与POI、E3连接酶的协同结合，以及连接子对协同结合的影响。通常这些都是最具挑战性的，因为有多种因素有助于降解过程。重要的是，这种筛选策略可以应用于需要关键正向协同性的分子胶的发现！非常巧合！同年来自MIT和哈弗Broad研究所的Stuart教授，在J Am Chem Soc上几乎用同样的策略，不过选用的是VHL配体作为E3连接酶结合物，针对BRD4同家族的BRD9进行DEL 分子胶文库的筛选。Case / 03BRD9 ：分子胶by Broad Institute of MIT and Harvard双功能分子与它们的两个蛋白质靶标在很大程度上是非协同的（协同因子α ~ 1，其中α = 解离常数(KD)二元/三元，下图）。因此，表现出钩效应——即高化合物浓度时，三元复合物消失，这是由于化合物与蛋白质1：1时，导致二元复合物失活。相比之下，分子胶表现出高协同性(α ≫ 1)，这有利于三元复合物的形成，尽管对蛋白质伴侣缺乏二元亲和力，从而减轻了钩效应。通常，化合物诱导的邻近促使两种蛋白联系起来：其中的靶蛋白用于调节信号，其中的呈递蛋白用于对靶蛋白附加功能效应。组织特异性、或细胞特异性的呈递蛋白使分子胶具有高选择性。因为，只有靶蛋白和呈递蛋白同时存在时，分子胶才会产生有效的结合！双功能分子，如PROTACs，由于连接器连接两个结合体设计理念，更容易产生。相比而言，分子胶虽更具有治疗上的优势，但是关于其设计更具有挑战性！关于其诱导蛋白的作用机制，更是多来自于偶然的发现。因此，从外部结构特征上来看，PROTACs具有明显的“结合物-连接子-结合物”的结构模式，而分子胶的特点非在结构上，而是在其诱导蛋白-蛋白结合方面的高协调性！分子胶化合物库设计和筛选：如下图，Stuart教授设计了一个“DNA标签-VHL配体-POI结合物”模式的DNA编码VHL邻近诱导化合物库，VHL CIP-DEL。文库包含94万分子。这里的新颖的地方是，E3配体和POI结合物与DNA编码片段在一个线性上，而不再如PROTACs文库的支线结构。VHL可以看作是POI结合物组成的一部分；多样性POI结合物组成也可以看作是对VHL的改造！这也是基于对同类化合物共晶结构的了解，在VHL溶剂暴漏区进行的位点选择。筛选流程如下：研究人员设计了3个调节，筛选流程如同常规靶蛋白固载筛选流程。三个条件分别是双蛋白共孵育（仅靶蛋白固载）、不加呈递蛋白、不加靶蛋白和呈递蛋白。筛选后，数据展示出来的分别是三元复合物、和呈递比率的图示，如下。BRD9/VCB的富集化合物呈三组分布:(1)高富集和低呈现率，以连接器9(9系)和12(12系)的化合物为主;(2)中等三元富集和中等呈现比，以连接11(11系)的化合物为主;(3)低三元富集和高呈现物比，以连接13(13系)的化合物为主研究人员选择了16个化合物进行off-DNA重合成，如下表：研究发现，高呈递比率的化合物没有钩效应。如化合物9-1呈递比率较低（0.54），化合物13-7呈递比率高（34）。其中，化合物13-7针对BRD9和VCB具有最高的协同作用。而且，化合物13-7诱导更多的三元复合物，以及较少的二元复合物，在细胞中诱导的EC50 = 17 nM。这项研究对分子胶的合理设计和高通量发现具有非常重要的指导意义！此外，Stuart在2022年bioRxiv预刊上还发表了其针对PROTACs文库的高通量筛选，并于2024年正式刊载在顶级期刊Nature Chemical Biology上。方法类似，也是选择的VHL作为E3配体。接下来简要介绍 case 04.Case / 04BRDxby Broad Institute of MIT and HarvardPROTACs文库设计：也是基于已知的PROTAC分子与POI和E3连接酶共晶结构的了解，进行的DEL文库的设计，如下图。如下图是针对BRD4筛选后进行的数据分析和挑选出来的化合物进行重合成。这些化合物都具有个位数微摩尔级别和次微摩尔级别的三元结合能力和二元结合能力，并且两者之间比较接近。通过检测，邻近诱导物CIP1-4都有nM级别的抑制活性（19-38 nM）。此外，研究人员还对BRD2BD1 and BRDTBD1等靶点进行了筛选。因为是同家族靶标，研究人员观察到许多在BRD4BD1筛查中看到的相同趋势。例如，对于C15连接器和BB2-109/BB3-114，观察到同样强烈的偏好。Case / 05BRD4by HK University & SIMM今年2月份香港大学李笑宇教授联合上海药物所陆晓杰教授，在ChemRxiv预刊上也刊载了他们基于DEL发现可诱导蛋白降解的化合物的成果。研究人员采用的是基于POI泛素化的筛选方法，这是一种功能化的DEL筛选，而非POI结合或者形成三元复合物。因此鉴定的化合物在功能上更相关，更能预测活性蛋白质降解。DEL化合物文库的设计和筛选：如下图DEL化合物文库的构建设计：如上图A所示，研究人员这里将E3配体、POI配体、以及中间的连接子分别用DNA序列编码，三个组成部分类似于经典DEL文库合成中的分子砌块，这里通过双功能性连接子把三部分组合起来，并用DNA序列编码，包含950个组合成员。功能性筛选设计：在筛选中，文库与POI和E3连接酶复合物孵育，然后添加E1, E2, Ub和ATP(上图1B)。文库中潜在的PROTACs将使POI靠近蛋白复合物，也可能促进POI与E3连接酶之间的蛋白-蛋白相互作用，从而促进POI的多泛素化。接下来，串联泛素结合实体，将被用来捕获和分离含有富集化合物的泛素化三元配合物。富集的分子后续经过扩增、测序、分析鉴定等。研究人员同时设置了不加ATP，无法进行泛素化的对照组。DNA偶联嵌合体在细胞中的降解验证：研究人员首先验证了DNA偶联的嵌合体能否在细胞内诱导POI泛素化并降解，如下图。研究人员以BRD4、VHL为模型，合成了带有AOP-HP的嵌合体工具分子，转染进细胞内，进行降解验证。偶联物在2 μM时导致BRD4适度降解，还可以被蛋白酶体抑制剂carfilzomib所恢复，而与更多PEG单元(PTC-2、3和4)偶联物的活性很小。同时也发现连接体分支点的手性的对降解活性的影响至关重要。细胞实验的成果验证鼓舞着研究人员继续进行体外的泛素化实验测试，同样得到的证明。这表明，上面的筛选策略的设计是有效的！接下来，研究人员制备了一个模型库，继续进行验证，如下图。模型库包含活性降解剂PTC-5，三个非降解剂嵌合体PTC-2、PTC-3、和PTC-4（手性不同、链长不同），以及作为背景的DNA序列。通过这个模型库，针对BRD4-BD1进行体外验证，并设计了不添加ATP对照组。从上图B中的2D图中可以看出，潜在的苗头化合物具有较高的富集倍数、和筛选后序列数。从图C中也能清晰的看出，只有活性降解物PTC-5从筛选中被强烈富集！模型验证是成功的！理论得以验证，接下来，研究人员通过如下图的方案构建了一个950个分子的DEL文库。其中，选择了19个三官能团支架作为连接子、4个BRD4配体、以及10个VHL配体。通过筛选，分别在高浓度、低浓度环境下，富集出来比较明显的信号，并挑选了其中的分子进行重合成、验证，如下图。最终，通过这种方法，研究人员鉴定出了一种有效的BRD4-BD1降解剂（DC50: ~9.7 nM）和一种短型同源型选择性BRD4降解剂（DC50: 0.26 μM）。该报道从最初的设计理念、到一步步的概念验证、最终实现DEL文库的合成和高通量功能降解剂的筛选、鉴定，逻辑紧密，丝丝入扣，非常具有参考、指导意义！总结与展望：学术界和企业不懈的努力，推动技术的快速发展、和应用。以上介绍了DNA编码化合物库筛选技术，通过不同的方案，实现了对PROTACs、分子胶等蛋白靶向降解剂（TPD）的高通量、合理化设计、合成、筛选、鉴定。可以是高通量发现亲和力元件，再进行二度设计PROTACs分子，因为DEL分子本身和PROTACs分子的高度相似性；可以直接设计高通量PROTACs、分子胶文库，并针对靶标和E3连接酶进行筛选；也可以通过化合物库、筛选条件的设计，直接进行功能性设计、筛选，挑选出降解剂的；总有一款适合你。当前，也有报道基于DNA编码化合物库筛选为嵌合体核糖核酸酶（RiboTAC）的设计提供信息等，后续再聊（J Am Chem Soc， 2022, 144, 21096−21102）针对靶向降解剂的发现，欢迎留言交流！参考文献Selection of DNA-encoded Chemical Libraries for Compounds that can Induce Protein Ubiquitination.  ChemRxiv, 2024, preprint(By Lu Xiaojie & Li Xiaoyu Group)DOI: 10.26434/chemrxiv-2024-rmgtvDNA-encoded library-enabled discovery of proximity-inducing small molecules. Nature Chemical Biology, 2024, 20, 170-179.(By Broad Institute of MIT and Harvard)DOI: 10.1038/s41589-023-01458-4Rational Screening for Cooperativity in Small-Molecule Inducers of Protein–Protein Associations. Journal of the American Chemical Society, 2023, 145(42), 23281-23291.(By Broad Institute of MIT and Harvard)DOI: 10.1021/jacs.3c08307Optimization of PROTAC Ternary Complex Using DNA Encoded Library Approach. ACS Chemical Biology, 2023,18(1), 25-33.(By HitGen)DOI: 10.1021/acschembio.2c00797Bispecific Estrogen Receptor α Degraders Incorporating Novel Binders Identified Using DNA-Encoded Chemical Library Screening. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(8), 5049-5066. (By X-Chem)DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00127Molecular Glues & Bifunctional Compounds: Therapeutic Modalities Based on Induced Proximity. ChemRxiv, 2024, preprint(By Broad Institute of MIT and Harvard))DOI: 10.26434/chemrxiv-2024-q1n61-v2HitGen官网：DEL for 蛋白降解剂开发https://www.hitgen.com/cn/capabilities-details-120X-Chem官网：Targeted Protein Degradation & Molecular Glueshttps://www.x-chemrx.com/targeted-protein-degradation-molecular-glues/声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

12月21-22日，上海大咖带队，新秀集结！以创新利刃，破内卷之局前言Janus 激酶(JAK)-信号转导和转录激活因子 (STAT) 通路的发现源于对细胞如何响应干扰素(IFN)的研究，提供了一种细胞信号转导的范例。美国国立卫生研究院 (NIH)的John J. O’Shea及其团队是解析JAKs和STATs家族通路在免疫调节中作用的领先者，他们综述的JAK-STAT通路研究文章于2022年10月发表在CELL期刊上，概述了JAK-STAT通路的主要里程碑式事件，并讨论了目前的重大挑战和未来机遇。作者 | Ting01背景介绍Janus 激酶(JAK) 信号转导和转录激活因子 (STAT) 通路的分子成分在30 年前被确定。图1的简短历史说明了这一发现使我们了解细胞外多肽驱动生理和病理反应的机制，包括细胞和生物体的发育、增殖、代谢、感染、炎症和癌症。图1  JAK-STAT 时间线（自 1984 年以来JAK-STAT通路的各种里程碑）02信号转导的新范例干扰素（IFN）于1957年被发现，细胞如何响应IFN产生抗病毒机制的问题引出了JAK-STAT通路的发现。▲从IFN处理诱导的mRNA中产生cDNA文库的能力允许发现几个IFN诱导的基因，从而确定了控制IFN诱导基因表达的启动子和调控元件。▲Stark和Kerr实验室使用IFN诱导基因的启动子，经过诱变，分离出抗性细胞克隆，通过遗传互补，产生TYK2作为诱变剂灭活的必需基因。▲使用相对较新的简并聚合酶链式反应方法生成蛋白激酶文库，鉴定了新的 TYK 家族，包括TYK2、JAK1 和 JAK2。JAK这个名字起源于两面罗马神Janus，因为该激酶家族具有特征性的双面结构。▲Darnell实验室纯化出STAT(STAT1和STAT2，干扰素调节因子9（IRF9），其命名表示它们的双重性功能，并强调它们的功能执行速度快速。03全长JAK1结构随着人类和其他基因组的完成，根据结构确定JAK家族只有4个成员。JAK末端是一个羧基末端的催化或激酶结构域，前端是一个假激酶 (PK) 或激酶样结构域。JAK通过氨基末端ezrin radixin、moesin (FERM)结构域和Src Homology 2 (SH2)结构域与细胞因子受体的Box1和Box2结构域结合。直到最近才获得与细胞因子受体的细胞内结构域复合的全长JAK1结构（图2）。图2  Janus激酶的结构STAT3被鉴定为响应IL-6的DNA结合“急性期反应因子”。表皮生长因子和其他生长因子也被认为是STAT3激活剂。STAT4主要在淋巴组织中表达并被IL-12、IL-23和I型干扰素激活。由催乳素激活的“乳腺特异性核因子”被鉴定并命名为STAT5，可被IL-2、IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-5等因子激活。STAT6被鉴定并克隆为IL-4诱导因子。04JAK-STAT通路信号转导JAK-STAT通路信号转导：细胞因子受体结合JAK，导致JAK在受体尾部的酪氨酸残基的激活和磷酸化。受体磷酸化为细胞质STAT创建对接位点，STAT通过酪氨酸磷酸结合SH2结构域被招募到受体复合物中，并自身磷酸化。活化的磷酸化STAT（pSTAT）通过分子间SH2-磷酸酪氨酸相互作用形成同源或异源二聚化，易位到细胞核，结合DNA调控元件，改变染色质可及性，诱导基因转录（图3）。图3  JAK-STAT信号转导05细胞因子信号通路的负调控● 生理性负调控STAT靶基因的细胞因子信号抑制因子（SOCS家族）的SOCS蛋白通过与细胞因子受体结合，与STATs竞争，干扰细胞因子信号转导。SOCS1和SOCS3的激酶抑制区（KIR）直接与JAK（JAK2、JAK1和TYK2）相互作用。其他关键的负反馈调节因子有泛素特异性肽酶18（USP18）和IFN刺激的基因15（ISG15）。激活STAT蛋白抑制剂（PIAS）家族由多个成员组成，它们作用于STATs和包括NF-kB在内的其他因子，并通过多种机制干扰信号转导。● 病毒相关的负调控直接或间接靶向STAT的病毒抗免疫策略突出了STAT介导的IFN信号通路作为抗病毒防御的重要性。STAT导向的IFN拮抗机制包括靶向STAT降解、隔离和细胞质滞留。黄病毒，包括登革热病毒和寨卡病毒，以STAT2为目标进行蛋白酶体依赖性降解。SARS-CoV-2 ORF6蛋白通过Nup98-Rae1核孔亚复合物干扰STAT的输入。SARS-CoV-2 N蛋白也可介导STAT胞质滞留。06STAT结构、复合物形成及对功能的影响● 所有的STAT都具有相似的N端、卷曲螺旋、DNA结合、接头、SH2和反转录激活域（ADs）（图4）。活化的JAK磷酸化一个STAT单体的保守酪氨酸残基，然后与另一个单体的SH2结构域结合，驱动构象变化，使STAT能够易位到细胞核中，启动靶基因的转录。使用P-STAT来表示“典型的”酪氨酸磷酸化，U-STAT来表示没有酪氨酸磷酸化的STAT。图4  STAT 结构域和结构● STAT可以形成多种异源或同源二聚体。STAT1、STAT3和STAT5a已被证明以平行或反平行的构象形成同源二聚体（图4；以STAT1为例）。STAT四聚体通过N端之间的相互作用协同招募同源二聚体成对形成。响应IFN I和III的基因表达由STAT1：STAT2异源二聚体驱动，并与IRF9一起组成干扰素刺激基因因子3（ISGF3）（图5）。● U-STAT1：U-STAT2二聚体不仅抑制多种P-STAT1同型二聚体的功能，还抑制ISGF3的形成。复合物形成也影响STAT的核质穿梭。图5  STAT1和STAT2复合物的构象变化07STAT和转录调控STAT复合物到达细胞核后就会完成与转录调控相关的任务：参与染色质化的靶基因、结合反应元件，以及招募和激活RNA聚合酶II的转录共激活因子的募集。●ISG的STAT调节考虑到对病毒感染的快速反应的必要性，ISG转录的诱导通常是快速的。这与转录速率的增加、快速mRNA加工和降解速率，并且没有转录后控制相对应。RNA Pol II重新招募到ISG是由IFN刺激的，ISGF3结合位点或附近的启动子和基因体的染色质可及性增加，并招募SWI/SNF核小体重塑复合体亚基。组蛋白乙酰化和去乙酰化都是ISG转录激活所必需的。●STAT和其他转录因子在生理条件下，细胞接收多个并发信号，激活多个信号通路。STAT和其他TF之间的相互作用包括TF合成的调控、TF活性的调节以及基因组内影响转录的直接或间接相互作用。●STAT之间的协同作用和拮抗作用无论信号异同，不同的STAT都可以相互协同或拮抗，从而影响转录。由于 STAT1和STAT3的丝氨酸磷酸化，IL-2和IL-12介导的协同作用，导致更高水平的IFN-γ 表达。STAT之间的拮抗通常在IFN和STAT3激活细胞因子的状态下，这一过程影响多种疾病的发生发展。08细胞因子作用的基因组学视图●STAT调节的增强子STAT与基因组的结合有多种影响。干扰素疾病与IFN表观基因组特征相关，因此STAT可以介导诱导和抑制表观基因组和转录组效应。活性增强剂可对STAT产生广泛影响（图6），它们可以影响近端组蛋白修饰，也可以参与潜在增强子的形成，还可以驱动缺乏LDTF结合基序区域的可及性。控制细胞类型特异性功能的关键基因往往受到被TFs、共激活因子、RNA Pol II和延伸因子密集占据的增强子簇的调控。●STAT可以通过多种机制来传递其作用：直接转录诱导/抑制、表观遗传调节或两者兼有，激活的STAT对表观遗传的调节有重要作用。图6  STAT和染色质组织09STAT的线粒体定位除了在细胞质和细胞核中发挥突出作用外，还有一小部分STAT1、STAT3和STAT5（占总数的5%-10%）位于线粒体中。线粒体STAT3研究最多，可通过调节呼吸、氧化还原稳态和线粒体转录直接促进Ras诱导的转化。10JAKs和STATs的体内功能●JAK突变1、JAK的关键作用首次在严重联合免疫缺陷（SCID）的人类中被证明。JAK3 常染色体隐性功能丧失（LOF）突变是导致SCID的重要原因。2、人类TYK2缺乏与细菌和病毒感染以及过敏性疾病有关。人类TYK2的LOF变异（P1104A）与自身免疫性疾病的发病率的降低和结核病风险的增加相关。3、JAK2对包括造血生长因子在内的多种细胞因子具有重要作用。在骨髓增生性肿瘤（MPNs）患者中发现了JAK2 GOF突变。4、人类的JAK1 LOF突变与复发性分枝杆菌感染、发育迟缓和早期转移性膀胱癌相关。JAK1 GOF突变导致自身炎症相关疾病和高免疫球蛋白E综合征（HIES）。●STAT突变1、STAT1-GOF患者易患自身免疫性疾病，对真菌和病毒感染的易感性增加；小鼠和人类的STAT2 LOF突变导致了对病毒的易感性增加。2、STAT3的LOF突变是高免疫球蛋白 E（乔布氏）综合征的分子基础。STAT3 GWAS变异与炎症性肠病 (IBD)、MS、2型糖尿病 (T2DM) 和心肌梗塞有关，具有STAT3 GOF突变的患者好发淋巴造血系统肿瘤和多发性自身免疫性疾病。3、人类的STAT4 LOF突变与真菌感染和病毒感染的易感性相关。STAT4变异与狼疮、类风湿性关节炎（RA）和干燥综合征相关。4、人类的STAT5B LOF突变会导致面部畸形和自身免疫。而且还可导致非克隆性高嗜酸性粒细胞增多、湿疹、荨麻疹和腹泻。5、STAT6 GOF突变与伴有嗜酸性粒细胞增多症的过敏性疾病相关，包括过敏、哮喘和嗜酸性粒细胞增多症。● 负反馈调节器的突变小鼠SOCS1缺乏对IFN-γ过敏是致命的，而SOCS1缺陷的人类表现出早发性自身免疫性和过敏性疾病。人类USP18和ISG15缺乏的主要后果是严重的系统性干扰素病。表1  JAK-STAT 通路体内功能11癌细胞中JAK和STAT的复杂角色Tel-JAK2融合蛋白和随后鉴定的其他JAK2融合蛋白（如PCM1、SEC1A和PAX5）都与白血病相关。此外，STAT3的SH2结构域二聚化、与DNA结合，转录激活，导致细胞癌变。肿瘤与GOF突变有关。所有JAK和STAT的突变都很常见，但主要见于造血/淋巴系统恶性肿瘤中。包括乳腺癌、肺癌和结肠癌的非造血系统肿瘤中，JAK和STAT的突变发生较少，但并不意味着该通路与实体肿瘤无关。在肿瘤微环境和间质癌相关成纤维细胞中，STAT3可以通过改变细胞外基质的产生、血管生成和代谢环境来驱动肿瘤的发展和进展。12JAK/STAT通路的治疗靶向性●JAK抑制剂目前11种JAK抑制剂已被批准用于治疗包括RA、银屑病和特应性皮炎等自身免疫系统疾病，移植物抗宿主病，骨髓纤维化，肿瘤，斑秃等各类疾病（表2）。小编之前也整理了截止到今年10月份的药物信息，详见推文：能取代修美乐成为未来药王吗？神奇JAK抑制剂最新汇总到目前为止，JAK抑制剂的大多数不良事件都可以用已知的特定细胞因子对感染、贫血和癌症的作用机制来解释，其安全性在很大程度上可以与生物制剂相媲美。其他的不良相互作用包括血栓栓塞事件的风险增加，脂质的改变，和心血管并发症。选择性JAK抑制剂的开发干扰较少细胞因子的功能，能够增加特异性，减少不良反应。靶向蛋白降解现在也是生成包括JAK1在内的激酶抑制剂的一种选择。表2  获批的 JAK 抑制剂●STAT抑制剂各种策略已被用于开发STAT抑制剂，包括干扰SH2介导的二聚体、DNA结合、或反转录激活和诱导STAT降解。多种抑制剂正在临床试验中，目前进展最快的药物处于临床II期，包括IONIS公司的靶向STAT3反义寡核苷酸Danvatirsen（国内开展，三阴性乳腺癌），Hanlim公司的STAT抑制剂HL-237（韩国开展，类风湿性关节炎），Otsuka公司的STAT抑制剂OPB-111077（新加坡开展，实体瘤）。●SOCS模拟物SOCS拟肽药物已在免疫和肿瘤临床前模型中显示出疗效。13未来的挑战和机遇●结构和细胞生物学关于细胞因子受体和STAT复合物的结构信息仍然缺乏。随着成像方式的进步，可以使用更复杂的工具来分析细胞因子信号转导的早期事件。●更全面地理解STAT介导的染色质修饰和转录调控尽管STAT是信号依赖性TF，但非磷酸化STAT1的作用说明了仍需探究U-STAT1如何修饰染色质和三维基因组。利用体细胞GOF STAT突变，详细了解STAT对相分离的生物物理方面的结构和功能贡献将对解释增强子在染色质环之外的功能，以及增强子和启动子接近很重要。●实现细胞、组织和刺激特异性程序也许最大的挑战是理解细胞如何使用有限的JAK和STAT传递由大量细胞因子产生的信号。JAK-STAT通路可能有许多属性帮助解决这一生物学难题。首先是信号成分表达的特异性和调控。第二，不同STAT激活幅度、磷酸化和去磷酸化速率、核易位和DNA结合不同。STAT异源二聚体的形成被认为是特异性的一种因素。但在没有同源DNA结合基序的情况下，STAT如何被招募仍有待阐明。第三，许多刺激特异性STAT翻译后修饰状态影响细胞内运输、DNA结合和转录潜力，但这些修饰通常不能全面和动态地测量。但几乎没有关于JAK对不同刺激的翻译后修饰的信息，这需要进一步研究。最后，多组学工具的产生便于全面测量随着时间变化，在体内单细胞响应生理和相关病理的变化。对JAK和STAT的更复杂的知识无疑将为具有更大特异性的新药提供许多机会。参考文献：1．Philips RL, Wang Y, Cheon H, Kanno Y, Gadina M, Sartorelli V, Horvath CM, Darnell JE Jr, Stark GR, O'Shea JJ. The JAK-STAT pathway at 30: Much learned, much more to do. Cell. 2022 Oct 13;185(21):3857-3876. doi: 10.1016/j.cell.2022.09.023.2. 智慧芽https://synapse.zhihuiya.comBiG近期活动11月18-19日，苏州BiG New Modality闭门会，创新正当时！扫码加入BiG生物创新社读者交流群，分享、交流纯粹的行业知识，非诚勿扰！BiGScientific Driven, Making Impact!创新生态丨医药论坛丨行业分析媒体公关丨BiG Webinar联系我们商务：Max   18662346610媒体：Kathy 17621909690

摘要:真核生物转录的早期阶段包括两个主要事件：新合成mRNA的加帽，以及RNA聚合酶II从启动前复合物到生产性延伸状态的转变。加帽检查点模型意味着这些事件是紧密耦合的，这对于确保新合成mRNA的正确加帽是必要的。最近的发现还表明，加帽机制对转录和整个基因表达过程具有更广泛的影响。这些现象的分子基础将在本文中被讨论。1.引文真核生物mRNA的一个特征是5’端存在帽状结构。该结构由倒置的7-甲基鸟苷组成，其与新合成的转录子的第一个转录核苷酸相连，随后被帽结合蛋白复合物（CBC）结合。帽状结构的主要功能是通过保护mRNA免于5’核酸外切酶降解，以此来稳定新生的转录子。此外，帽状结构有助于聚集用于拼接、3’端加工、导出和翻译所需的因子。mRNA 加帽机制具有三种基本活性：RNA 5’三磷酸酶（RT）、鸟苷酸转移酶（GT）和RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）。在酵母中，有3种独立的酶负责这些活动。RNA 5’三磷酸酶（RT）和鸟苷酸转移酶（GT）在酿酒酵母中结合在一个功能复合物起作用，但在粟酒裂殖酵母中分别发挥作用。在后生动物中，前两种活性由相同的加帽酶（CE）进行，而甲基转移酶（RNMT）活性存在于 RNMT-RAM 复合物中，其中RNMT是催化亚基，RAM 是激活RNMT活性的活化亚基。此外，加帽机制包括帽子特异性mRNA-甲基转移酶 CMTR1和CMTR2（CMTr），以及最近描述的腺苷N6-甲基转移酶（CAPAM）。真核生物的mRNA加帽过程并不总是进行至完成。在哺乳动物中，DXO/Dom3Z和XRN家族蛋白在5’端加帽质量控制中用作监测蛋白质。特别是，脱帽外切核糖核酸酶DXO会降解加帽但未甲基化的早期mRNA。在酿酒酵母中，RNA加帽质量控制存在部分冗余机制：Rai1-Rat1和Ydr370C/Dxo1。当加帽和转录机制紧密耦合时，加帽发生。下面，我们描述了关于加帽过程和转录事件之间联系的观点。表1显示了在不同物种中参与建立这种联系的因素列表。2.加帽检查点模型RNA聚合酶II（Pol II）依赖型转录是一个由多种因素和信号调节的复杂过程，其中涉及多个检查点，以确保正确的mRNA合成和mRNA-蛋白质复合物的组装。主要检查点包括正确的mRNA加帽、剪接和3’端形成。真核生物转录发生在以下基本阶段：起始前复合物的组装、起始、延伸和终止。起始到延伸的转变进一步分为“早期延伸”和“生产性延伸”。这两个子阶段由RNA聚合酶II的暂停进行区分：在大约20-60个核苷酸转录后，RNA聚合酶II停止合成，直到特定信号出现。对hsp模型基因这一现象的早期研究表明，停顿与mRNA帽状结构的形成有关。加帽检查点模型表明RNA聚合酶II在启动子近端区域暂停，以确保在生产性延伸开始之前mRNA加帽。早期延伸的停止确保了加帽酶的聚集，这反过来又吸引了其他因素来取消早期延伸的停止。随着RNA聚合酶II穿过暂停区域，加帽逐渐发生：最近的暂停RNA大部分没有加帽，而更远端的完全加帽。在此上下文中，加帽意味着添加鸟苷，而其在转录过程中甲基化的时间点尚未确定。这就是为什么“加帽”在下文中指的是添加鸟苷的事件，并特别指出了其甲基化的情况。即使在暂停阶段，有几个因素可以确保进行适当的转变。转录起始后，DRB敏感型诱导因子（DSIF）结合RNA聚合酶II，并将负延伸因子（NELF）聚集到染色质。后者导致转录暂停，在此期间加帽机器聚集。在早期延伸过程中，RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）在第5个丝氨酸残基处被细胞周期蛋白依赖型激酶7（Cdk7）磷酸化，其是TFIIH的一个亚基。磷酸化的RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和DRB敏感型诱导因子（DSIF）的Spt5亚基聚集加帽机器。加帽酶的聚集可以缓解负延伸因子（NELF）的作用，并为正转录延伸因子（P-TEFb）加载提供平台。后者使RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）、DRB敏感型诱导因子（DSIF）和负延伸因子（NELF）的第2个丝氨酸残基磷酸化。结果，磷酸化的负延伸因子解离，暂停的RNA聚合酶II被释放到生产性延伸中（图1）。3.加帽机器的功能取决于转录mRNA加帽装置和早期伸长因子在细胞核中显示出紧密的联系。连接这些机器的核心参与者是RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和Spt5。事实上，带有截断CTD的RNA聚合酶II显示了加帽缺陷。RNA聚合酶II C末端结构域具有特定的磷酸化模式，这取决于转录过程的阶段，而加帽酶（CE）的聚集和功能取决于该模式。正是磷酸化的CTD将转录与加帽耦合。更准确地说，它在第5个丝氨酸残基处的磷酸化（而不是在Ser2处）激活了加帽活性。启动子上的第5个丝氨酸残基磷酸化提供了正确的早期mRNA加工。第5个丝氨酸残基磷酸化的RNA聚合酶II已被证明可与加帽机器和TFIIH激酶共纯化。最近的研究表明，Ser7磷酸化对于加帽也很重要：鸟苷酸转移酶 Ceg1与酵母中的RNA聚合酶II相关联是必要的。裂变酵母中的Ser5磷酸化RNA聚合酶II C末端结构域和Spt5与鸟苷酸转移酶 Pce1和三磷酸酶Pct1相互作用。在芽殖酵母中，RNA鸟苷酸转移酶 Ceg1与Ser5磷酸化CTD结合，并将Cet1三磷酸酶聚集到RNA聚合酶II，并且还表明Ceg1和Abd1直接独立地与磷酸CTD结合。Ser5磷酸化对于RNGTT结合及其在哺乳动物中的活性也很重要。人类RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）募集还依赖于Ser5磷酸化[46]，RNMT与加帽酶和RNA聚合酶II的伸长形式形成三元复合物。小鼠加帽酶Mce1的鸟苷酸转移酶结构域与磷酸化的CTD结合。此外，哺乳动物鸟苷酸转移酶通过与Ser5磷酸化CTD结合以变构方式激活。因此，加帽机器与Ser5磷酸化Pol II CTD的连接是一个保守的特征。然而，哺乳动物加帽酶中CTD结合位点的位置和组成与酵母加帽酶中的位置和组成不同，后者识别相同的CTD一级结构。在芽殖酵母中，所有3个加帽酶被聚集到转录基因的5’端需要Kin28。这是负责Ser5磷酸化的主要激酶（后生动物中TFIIH的Cdk7亚基的同源物）。抑制人Cdk7活性导致加帽酶聚集减少，从而减少mRNA加帽，并增加RNA聚合酶II启动子-近端暂停。正如预期的那样，在生产性延伸期间，起作用的Pol II CTD磷酸酶拮抗CE结合。因此，磷酸酶FCP1对于哺乳动物中CE与Pol II CTD的解离是必要的。然而，单独磷酸化的Pol II CTD不足以实现高效加帽。有一种CTD独立但Pol II介导的机制，与CTD依赖性过程并行工作，以确保最佳的加帽。酵母中的mRNA加帽酶需要两个界面才能与Pol II相互作用：Ser5磷酸化CTD和Rpb1的多螺旋足域。后者有助于CE与Pol II相互作用的特异性。足部结构域或其相关因子的突变导致Ser5磷酸化增加。在酿酒酵母中，Cet1和Ceg1以异四聚体Cet12Ceg12形式与Pol II相互作用。Ceg1与磷酸化的Pol II CTD之间的相互作用已得到充分研究，但Cet1也与CTD外部转录的Pol II复合物形成广泛的相互作用。Ceg1似乎是可移动的，并且在转录复合体中采用多种构象。还观察到Ceg1与Pol II亚基Rpb7的接触。因此，CTD非依赖性和CTD依赖性网络共享机制的组合在激活共转录加帽。另一个有助于加帽机器募集的转录因子是Spt5蛋白，它是早期Pol II伸长因子DSIF的亚基。Spt5携带CTD，其作用类似于Pol II CTD。Spt5和Pol IICTD对于CE的招募很重要。在裂变酵母中，三磷酸酶Pct1和GT Pce1独立地与伸长因子Spt5结合。在芽殖酵母中，Spt5有助于mRNA加帽酶 Cet1、Ceg1和Abd1的稳定募集。有实验证据表明“Spt5 CTD代码”的概念，类似于Pol II CTD的概念。根据这一概念，Spt5 CTD在结构上是灵活的，可以采用由特定细胞Spt5CT受体蛋白模板化的不同构象；此外，Spt5CTD 重复的苏氨酸磷酸化刻有一个二元开关，由不同的CTD受体读取，每个受体都有自己独特的方式。与Pol II CTD不同，P-TEFb磷酸化Spt5 CTD阻断了Spt5-Pce1相互作用。值得注意的是，CE招募的方式可能是物种特异性的。在芽殖酵母中，帽甲基转移酶Abd1直接与磷酸化的丝氨酸5 CTD Pol II相互作用，而裂变酵母中的帽甲基转移酶Pcm1在与Cdk9/Pch1（P-TEFb）的复合物中募集，Cdk9/Pch1显然将加帽装置靶向转录复合物。一个以上的一般转录因子参与适当的加帽。这是TFIIB尖端区域，这是丝氨酸5 CTD Pol II磷酸化和mRNA加帽的适当水平所必需的。在哺乳动物中，第一和第二转录的核苷酸也可以被CMTR1和CMTR2酶O-2甲基化。这种修饰在翻译启始和转录本识别为先天免疫中的“自我”方面具有作用。在转录早期将CMTR1招募到Ser5磷酸化的Pol II CTD中。最近，发现了一种新的甲基转移酶CAPAM。它催化第一个转录的腺苷N6-甲基化。CAPAM被鉴定为Ser5磷酸化CTD相互作用因子1（PCIF1）。虽然最初发现CAPAM对模型基因的RNA聚合酶II依赖性转录有负面影响[68]，但后来的全转录组分析显示其对转录有基因特异性影响。因此，CE与Pol II和Spt5之间存在许多相互作用。这些互动对于CE的招募和功能至关重要。加帽机器与转录装置之间的连接是双峰的。一方面，Pol II CTD可以作为将mRNA 5’端和CE结合在一起的支架，从而提高加帽效率；另一方面，转录因子可以变构地增强加帽机器的活性。4.加帽装置对转录的影响加帽酶（CEs）与转录机制之间的关系是相互的。加帽酶与CTD Pol II的相互作用增强了加帽，但加帽酶也会影响转录。如初始所示，Cet1抑制转录再启动，并降低RNA聚合酶II在启动子-近端区域的积累，该区域独立于mRNA加帽活性。Ceg1刺激早期伸长，其突变体在此过程中存在缺陷。最新发现表明，Cet1-Ceg1复合物和DSIF刺激Pol II启动子逃逸并转移到伸长。酵母甲基转移酶Abd1对启动子的Pol II募集具有基因特异性刺激作用。Abd1对转录的刺激发生在甲基化缺陷突变体中，因此与加帽本身无关。Abd1中的条件突变体在某些基因上与启动子结合的Pol II以及在其他基因的启动子清除或早期伸长方面存在缺陷。Abd1 耗竭导致 CTD Ser5的高磷酸化。裂变酵母加帽-甲基转移酶Pcm1将P-TEFb招募到染色质中。当这种连接被破坏时，Cdk9没有被正确招募，Pol II延伸受到严重影响。Cdk9与RNA三磷酸酶Pct1的相互作用也在粟酒裂殖酵母中进行了描述。加帽酶沿基因的分布意味着它们会影响转录的后期阶段。在酵母中，Cet1和Ceg1的全基因组占用仅限于转录起始位点，而Abd1的占用率在下游110 bp处达到峰值，CBC的占用率随后升高。据推测，Ceg1-Cet1加帽装置与转录复合物解离，因为Ser5磷酸化在延伸过程中减少，而酵母Abd1帽甲基转移酶延长了与Pol II CTD的相互作用。人类加帽酶存在于5‘末端和整个基因中，甚至包括poly（A）位点下游超过千碱基的3侧翼区域。因此，加帽因子会影响转录延伸、终止、和mRNA 3’端加工。酿酒酵母Cet1 N端结构域（NTD）促进染色质转录（FACT）的募集或促进染色质转录（FACT），从而增强在Pol II参与活性基因的转录延伸，独立与mRNA加帽活性。Cet1 N端结构域的缺失会损害染色质转录的靶向，从而降低Pol II在转录伸长中的参与度，从而导致Pol II的启动子近端积累。在哺乳动物中，CE在NELF的帮助下抵消转录抑制[28，82]。哺乳动物RNMT-RAM也促进Pol II依赖性转录。RNMT-RAM对转录的影响是直接的并且独立于mRNA加帽、稳定性和翻译。RNMT-RAM结合早期mRNA的整个长度并招募与转录相关的蛋白质。因此，已经发现加帽酶调控转录，并且该调控独立于其酶活性。这种效应的机制似乎是基因和物种特异性的。加帽-转录相互作用的另一个重要参与者是CBC。它与早期转录活动也具有互惠关系。CBC参与转录因子的招募和转录的调节过程。CBC与酵母中的CTD激酶相互作用，其消耗影响CTD Ser2和Ser5的磷酸化水平。在哺乳动物中，CBC通过NELF和P-TEFb的募集刺激转录延伸，并且对CTD Ser2磷酸化很重要。在酿酒酵母中，CBC招募Ctk2或Bur2（P-TEFb的直系对照）。Abd1和CBC对于激酶Ctk1和Bur1的募集很重要，这两者促进了延伸和CE释放。mRNA CBC还通过其与酿酒酵母体内Mot1p的相互作用刺激启动子处的预启动复合物的形成。Mot1p是一种转录调控子，可积极或消极地以一种基因特异性方式调节Pol II转录基因表达。CBC通过阻碍终止因子Pcf11p和Rna15p（裂解因子CFIA的亚基）的募集来抑制弱终止子。因此，CBC在转录过程中具有多重功能。最近，聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2被描述为CBC的一种新型伴侣。这些蛋白在转录的早期延伸共同作用，它们的消耗会影响果蝇中的Ser5 CTD Pol II磷酸化。5.加帽作为基因表达的调控步骤近年来，已经出现了一些例子说明mRNA帽状结构形成受到不同信号的调节。这些信号调节mRNA帽状结构形成的速率和程度，导致基因表达的变化。第一个被描述的调节加帽的例子是c-myc依赖性活化。c-Myc调节许多转录子的帽状结构形成。c-Myc增加了催化活性CE向Pol II及其靶基因的募集。此外，c-myc导致帽状结构甲基化增加，这对c-myc依赖性基因调控做出了重大贡献，并且增加的帽状结构甲基化与TFIIH和P-TEFb活性的c-myc依赖性增强有关。由于7-甲基鸟苷帽状结构是有效翻译所必需的，因此增强的甲基化帽状结构形成也将蛋白质产量从c-myc响应基因水平的提高到超过转录诱导的水平。因此，无论转录增强本身如何，加帽的调节都是增强蛋白质合成的一种方式。另一个例子是E2F1转录因子，它通过依赖于Pol II磷酸化的机制促进帽状结构的形成。加帽由信号通路调节。例如，RNMT在细胞周期中被CDK1-细胞周期蛋白B1磷酸化并激活。这导致帽状结构甲基转移酶活性升高，同时转录在有丝分裂后G1期开始时重新开始。这是协调mRNA加帽与转录爆发的方法。在酵母中，营养饥饿导致帽状结构甲基化普遍减少。据报道，输入蛋白α刺激一般帽状结构甲基化。相反，CE mRNA-cap通过调节果蝇中的PKA活性来正向调节Hh信号活性。因此，mRNA加帽的调控因子，加上加帽质量控制机制，也许提供了另一层基因表达的调控。6.结论和前景上述加帽检查点模型已在许多研究中得到证实。然而，目前的加帽/转录相互作用模型尚未完成。有一些问题需要进一步调查。未来一个重要的挑战是澄清将加帽与转录暂停和延伸联系起来的因果关系。加帽蛋白和转录机器之间的广泛相互作用网络尚不清楚。因此，对新生mRNA进行CBC募集的机制知之甚少，监测去帽机器的募集也是如此。物种和基因特异性相互作用特别令人感兴趣。加帽和转录机器具有一些物种特异性特征，例如存在相当数量的后生动物特异性因子和种内副群（表1）。此外，高等真核生物CE的非催化调控域具有高度的多样性，即使在密切相关的物种中。这些事实可能意味着，在与转录装置的特定相互作用中，这些因子和结构域都有参与。上面一些例子提到了物种特异性连接，包括哺乳动物/酵母CE与磷酸-CTD Pol II相互作用的不同位点，芽殖/裂变酵母中GT-RT与Pol II相互作用的不同方式，哺乳动物中存在NELF-CE相互作用，以及转录机制中Abd1 / Pcm1的不同靶标。加帽机制功能中的基因特异性已经在一些例子中进行了描述，例如前面提到的c-myc和E2F1依赖性加帽调节。其他基因特异性转录因子也可以以类似的方式起作用并调节局部加帽。加帽因子也可能是基因特异性信号通路的靶标，例如RNMT的NTD，其携带多个修饰位点。加帽步骤并不总是进行至完成。一个重要的尚未解决的问题是，这是否仅仅是加帽过程固有的低效率的结果，还是调节早期mRNA加工的调控活动。如果后者是正确的，那么所涉及的成分是什么，以及如何做出决策：哪些早期mRNA应该加帽？先前的加帽模型表明，加帽通过阻止mRNA降解，在调控因表达方面起着“被动”作用。现在很明显，加帽可以被修改为“主动”调节mRNA或选定的子集的命运。目前尚不清楚哪组基因和转录因子参与调节加帽。需要更多的研究来更深入地了解信号通路对加帽的影响以及加帽调控在整个基因表达中的作用。原文来源：Interplay of mRNA capping and transcription machineries.