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高甘露糖型（High-Mannose，HM）是抗体的关键质量属性（CQA）之一，其水平过高可能会缩短抗体半衰期（血浆清除加速）并可能引发免疫原性。本文从细胞株筛选、培养模式优化、工艺参数调整及培养基添加剂四大工业常用策略切入，系统性解析降低HM的调控路径，助力提升抗体药物质量。01高甘露糖的形成路径高甘露糖型糖链主要在内质网完成初步加工，进入高尔基体后，若甘露糖苷转移酶对前体寡糖的修剪受阻或N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I （GnTI）活性异常，则无法进一步修饰为复杂糖型，导致HM残留（图1）。行业一般将甘露糖型Man5控制在≤10%，通常控制≤5%（依产品特性调整），Biosimilar需与原研品HM含量偏差≤±1.5%。图1：N-糖基化修饰途径02常见的降低HM的策略策略1：细胞株与克隆筛选细胞株工程改造过表达GnTI基因或者克隆筛选阶段选择蛋白表达量高且GnTI活性较高（即Man5水平低）的细胞株。文献分享如文献Scientific Reports，2024表明GnTI活性与HM水平呈负相关，当GnTI基因被敲除时（如CHO-gmt4细胞），细胞主要产生高甘露糖型链Man5（Man5GlcNAc2），如图2所示。这是因为GnTI负责将N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）添加到核心糖链的α-1,3-连接的甘露糖上，从而启动从高甘露糖型向复杂型糖链的转化。当GnTI缺失时，这一转化过程受阻，导致高甘露糖型糖链在细胞中积累。图2：CHO-K1和CHO-gmt4（GnTI KO）细胞株在曲妥珠单抗上的Man5水平对比策略2：强化培养工艺IPC/IFB模式：改变细胞培养模式，例如选用IPC（Intensified Perfusion Culture）或IFB（Intensified Fed Batch）工艺，通过高换液率维持营养稳态，减少代谢副产物（如NH4+）积累，有效降低HM水平。专利分享上海智享生物专利案例（CN116590371B）：本案例采用浓缩补料灌流培养工艺，并通过降低pH和排出细胞代谢副产物乳酸和NH4+，有利于高尔基体对抗体的翻译后修饰，从而降低抗体的高甘露糖基化。进一步添加糖型调节剂N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶、半乳糖，能够有效促进高甘露糖型抗体的进一步修饰，合成更加完善的双天线糖型结构。P-5结果中Man5的含量从FB-1的18.9%降低至4.4%，满足了抗体药物生产中Man5含量低于5%的要求，详细数据示例如下表1。FB代表Fed-batch补料批培养工艺，P代表浓缩补料灌流培养工艺。表1：专利CN116590371B降低Man5的方案汇总策略3：工艺参数调整工艺参数对HM的影响： 1 pH：低pH环境（如控制pH在6.7-6.8范围内），可增强高尔基体糖基转移酶活性，促进HM向复杂型糖链转化。 2 降温：在培养后期降温至31°C ± 0.5°C，可延缓细胞代谢副产物（如NH4⁺）积累，减少对糖基化酶的抑制。 3 培养周期：优化补料策略（如浓缩补料工艺）将周期缩短至10-12天，降低渗透压和NH4⁺浓度，减少对GnTI活性的抑制。 4 渗透压：高渗透压（> 400 mOsm/kg）会抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶（GnTI）活性，导致甘露糖残基无法被进一步加工为复杂型糖链。文献分享文献Efren Pacis , 2011等的研究表明，Man5和培养时间及渗透压成正相关，如图3。 1 Man5随着培养时间持续增加，Man5从D7 5%升高至D22 15-28%。 2 补料渗透压从750 mOsm/kg到1250 mOsm/kg，Man5水平从D12 15%大幅提升至23%-27%，可能是高渗透压导致代谢副产物如NH4+的积累，进而影响高尔基体内pH，抑制GnTI等酶的活性。图3：Cell line A在各种基础渗透压（300、330、360和400 mOsm）和补料渗透压（750和1250 mOsm）组合下Titer和Man5的水平策略4：培养基组分和添加剂的调控从培养基组分添加剂上降低HM水平，常选择N-乙酰葡萄糖胺、尿嘧啶、半乳糖、2FP（岩藻糖类似物）、微量元素Mn2+，Cu+等物质。专利分享上海药明生物专利案例（CN116121170A）: 该专利是一种通过向培养基中添加 N-乙酰基-D-甘露糖胺（ManNAc）来降低哺乳动物细胞表达系统所产糖蛋白中高甘露糖型糖基化水平的方法。该方法包括在传代培养基或生产培养基中添加ManNAc，添加浓度20-100 mM, Man5水平可降低44%-65%，而且对蛋白产量、细胞生长代谢、蛋白纯度、酸碱峰等其他质量指标均无明显负面影响，作用机制可能是因为ManNAc其作为N‑乙酰神经氨酸/唾液酸(Neu5Ac)的前体，添加后，促进糖型往成熟方向合成，从而降低了Man5水平，详细数据示例，如下表2。表2：专利CN116121170A降低Man5的方案汇总文献分享文献Efren Pacis , 2011等的研究表明，通过在培养阶段添加一定量Mn2+，可以加速GnTI的周转率，从而降低高甘露糖型。如图4，向高渗透压的培养基中加不同浓度的MnCl2, Man5显著地从25%降到14%。相似的，向常规培养基中加1.0 uM的 MnCl2 , Man5从12%降低到5%。图4：摇瓶中添加MnCl2对Man5的影响03降低高甘露糖的方案汇总在实际的调控策略中，常通过培养基筛选和成分优化（如不同浓度UGM+GlacNAc的摸索），进一步优化培养条件（如温度，渗透压等工艺参数），达到控制HM的目的。常见的降低HM的参数、作用机制及推荐范围如下表3。表3：HM的参数、作用机制及推荐范围文末彩蛋定制化培养基开发服务2025年3月，Cytiva中国细胞培养基开发基地已在上海张江正式启用！该基地依托全球HyClone品牌资源，遵循统一的质量标准和生产工艺，整合全球资源及超6000种培养基原型库，为国内客户提供定制化培养基开发服务！无论是产品质量调控，还是细胞代谢优化，专注客户的开发需求，帮助客户实现从研究开发到生产应用，一站式解决抗体药开发痛点、难点。欢迎扫描下方二维码留下您的信息Cytiva专家团队将在近期与您联系参考文献：1.细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控，2019，江一帆等2.Haryadi, R. et al. Generating and characterizing a comprehensive panel of CHO cells glycosylation mutants for advancing glycobiology and biotechnology research. Sci Rep, 23068 (2024).3.Efren Pacis., et al.  Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation--what affects high mannose 5 glycoform. Biotechnology, 20114.CN116590371B, 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法, 20235.CN116121170A,一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用, 2023

2024年，美国食品药品监督管理局（FDA）完美收官，全年共批准13款抗体新药，创下历史新高！至此，FDA批准的抗体药物累计达143款，标志着生物医药正式迈入“精准制导”的新纪元。13款抗体新药中，3款为双特异性抗体，10款为单抗，如同繁星点亮了多个疾病治疗的“无人区”。Biacore team将选取2024年度最具代表性的获批案例，看Biacore如何化身分子尺度的‘动态解码器’在药物发现的混沌中搭建起理性设计的桥梁，让更多抗体药物跨越研发鸿沟，加速抵达拯救生命的终点。抗癌战场：中国创新闪耀国际舞台抗肿瘤领域独占6席，印证抗体药物在癌症治疗中的核心地位。百济神州的PD-1单抗替雷利珠单抗（tislelizumab-jsgr，商品名百泽安，TEVIMBRA）斩获食管癌适应症，成为中国自主研发的又一里程碑。Tislelizumab是一种针对PD-1的人源化免疫球蛋白G4（IgG4）变体单克隆抗体，可与人类PD-1的细胞外结构域结合。它竞争性地阻断PD-L1和PD-L2的结合，抑制PD-1介导的负信号传导，并在体外细胞试验中增强T细胞的功能活性。2024年3月被FDA批准用于治疗既往接受过化疗的不可切除、复发、局部晚期或转移性食管鳞状细胞癌的成年患者。其在整个研发过程中大量使用到了Biacore的检测数据。通过Biacore 8K系统（CM5芯片固定PD-1 Fc融合蛋白），研究团队对比了替雷利珠单抗与已上市抗体Pembrolizumab、Nivolumab的结合参数（图1）。实验显示，替雷利珠单抗的KD较Pembrolizumab和Nivolumab低1-2个数量级。其核心机制在于极低的解离速率，较Pembrolizumab减缓80倍，结合半衰期延长30倍以上。这一特性预示了其在体内更持久的靶点占据能力。图1：Tislelizumab、Pembrolizumab和Nivolumab的表征数据通过PD-1/替雷利珠单抗Fab复合物的晶体结构解析，研究团队发现抗体通过重链CDR3（HCDR3）与轻链CDR1/2（LCDR1/2）形成广泛的结合界面，其中PD-1的CC'环成为关键结合区域。为验证这一发现，团队利用丙氨酸扫描突变结合Biacore分析，发现CC'环突变体（如Q75A、T76A、D77A）导致替雷利珠单抗的KD值显著上升（图2）。图2：CC'环突变体亲和力数据Biacore数据与结构分析的整合表明，替雷利珠单抗的结合表位与PD-L1的重叠面积达80%，而Pembrolizumab和Nivolumab的重叠面积仅为66%和44%。这一差异在细胞水平的P3Z实验中得到验证：替雷利珠单抗在3 μg/mL浓度下可完全阻断PD-L1信号（IL-2分泌抑制>99%），而Pembrolizumab和Nivolumab仅能达到80%和81%的阻断率。其机制源于替雷利珠单抗的轻链（VL）直接占据PD-L1的结合位点，形成空间位阻效应。结合结构生物学与功能实验，该研究为抗体药物的理性设计提供了范本。辉瑞新型血友病疗法：TFPI抑制HYMPAVZI美国FDA批准辉瑞（Pfizer）药品Hympavzi（marstacimab）用于常规预防或减少12岁及以上血友病A和血友病B成人和儿童患者的出血，这些患者体内不含凝血因子VIII与IX抑制剂（中和抗体）。Marstacimab是一种人源化IgG1单克隆抗体，通过特异性结合TFPI的Kunitz 2（K2）结构域，中和TFPI的K2活性，释放FXa和FVIIa的促凝功能，绕过内源性凝血途径缺陷（如FVIII/FIX缺乏），直接增强凝血酶生成。 在该药的研发与申报中，SPR实验显示，Marstacimab对人类TFPI K2结构域的解离常数（Kd）为2.63 ± 0.08 nM，对K1K2复合结构域的Kd为7.9 ± 0.33 nM，但不与TFPI的K1域结合。此外，Marstacimab对不同物种的TFPI K1K2域均表现出相似的抑制作用，具体数值如下：图3：Marstacimab对不同物种的TFPI K1K2域的亲和力数据Marstacimab不与TFPI的K1结构域结合，其促凝血活性完全依赖于对K2和K1K2结构域的结合与抑制。这种高选择性结合机制使其在增强凝血功能的同时，减少了潜在的副作用风险。此外，辉瑞研发人员还进行了Marstacimab与Concizumab（另一种抗TFPI单克隆抗体 ）的对比研究，见下表。基于结合亲和力，研发人员预测Marstacimab的临床有效剂量在100至300毫克之间。Marstacimab虽亲和力略低，但其平缓的药效动力学特性可能降低剂量依赖性毒性风险。图4：Marstacimab与Concizumab对人K1K2及小鼠K1K2的亲和力Marstacimab通过靶向TFPI的K2结构域，为血友病患者提供了一种“无需依赖凝血因子”的创新疗法。其每周一次的皮下注射方案、明确的疗效数据（III期研究ABR降低>65%）及Fc沉默化设计，标志着血友病治疗从“替代缺陷”到“调控内源”的范式转变。2019年FDA授予的快速通道资格（FTD）进一步凸显其临床价值，未来有望成为全球血友病标准治疗的重要组成。礼来新型特应性皮炎疗法：IL-13抑制剂Ebglyss特应性皮炎（AD）是一种以慢性炎症、剧烈瘙痒和皮肤屏障功能受损为特征的免疫介导性疾病。传统治疗方法主要依赖于糖皮质激素和免疫抑制剂，但长期使用这些药物可能引发皮肤萎缩及全身性副作用。尽管新型生物制剂（如IL-4/IL-13抑制剂Dupixent）在治疗中表现出一定疗效，但仍有部分患者对其应答不足。礼来公司开发的Ebglyss（Lebrikizumab）作为一种高选择性的IL-13单克隆抗体，为患者提供了更为精准的靶向治疗选择。Lebrikizumab是一种人源化IgG4单克隆抗体，通过特异性结合游离的IL-13蛋白，阻断其与IL-13受体（IL-13Rα1/IL-4Rα复合物）的相互作用，从而抑制下游JAK-STAT信号通路的激活，减少炎症细胞的浸润和瘙痒信号的传递，同时部分恢复皮肤屏障功能。2023年，礼来公司的研究人员发表了一项研究，该研究利用Biacore T200技术对Lebrikizumab、Cendakimab和Tralokinumab三种单克隆抗体与糖基化及非糖基化IL-13的结合能力进行了测试。研究结果显示，这三种单克隆抗体均能够与糖基化和非糖基化的IL-13结合。尽管它们的结合速率相近，但Lebrikizumab对糖基化和非糖基化人IL-13的解离速率最慢，因此其整体亲和力显著高于Cendakimab和Tralokinumab。图5：Lebrikizumab、Cendakimab和Tralokinumab对糖基化和非糖基化IL-13的结合能力此外，研究人员又进一步利用Biacore来评估抗体是否结合在IL-13的相同表位。当IL-13预先结合Cendakimab或Tralokinumab时，Lebrikizumab仍能结合IL-13；而Cendakimab和Tralokinumab无法结合已与自身或其他抗体结合的IL-13。这一结果表明：Tralokinumab与Cendakimab结合IL-13的重叠表位；Lebrikizumab结合IL-13的不同表位，且其表位空间不与其他两种抗体冲突。综上所述，Lebrikizumab凭借其高亲和力和独特的表位结合特性，在IL-13抑制剂中展现出核心优势。这些发现对于理解不同IL-13单克隆抗体在AD治疗中的潜在差异具有重要意义，并可能为个体化治疗提供新的见解。礼来阿尔茨海默新药Donanemab美国食品药品监督管理局（FDA）批准Kisunla（通用名：Donanemab）用于治疗早期有症状的阿尔茨海默病（AD）成人患者，包括轻度认知障碍患者和处于神经退行性疾病轻度痴呆阶段的患者。Donanemab是一种人源化(IgG1)单克隆抗体，可以减少淀粉样β斑块，用于治疗针对患有轻度认知障碍或轻度痴呆症的患者。在Kisunla的申报材料中， Biacore被用于药靶的亲和力检测，以及结合表位的鉴定。首先利用Biacore测定了Donanemab与人源AβN3pE-42肽结合的亲和力（KD）最高达到了0.82±0.05 nM；与非焦谷氨酸人Aβe3-16 (KD = 420 nM)相比，对c端截断形式Aβ N3pE-16的亲和力仍然相对较高(KD = 3±2 nM)。未检测到与人源Aβ1-40或小鼠AβN3pE-16的结合。同时，结合了Biacore的实验结果鉴定得到Donanemab与人源AβN3pE-16结合的表位定位在n端（AβN3pE-7）的5个氨基酸上。图6：Donanemab申报材料全球首款HER2双抗Zanidatamab11月20日，Jazz Pharmaceuticals宣布Zanidatamab（商品名：Ziihera）获FDA加速批准上市，用于治疗既往接受过治疗的不可切除或转移性HER2阳性（HER2+，标准为IHC 3+）胆道癌（BTC）成人患者。该药物是第一款获批上市的HER2双抗。该药物获批前小编已经对该抗体进行了详细报道。回顾点击：新型双特异性抗体Zanidatamab结构设计及活性验证思路Biacore用于定量分析双特异性抗体zanidatamab及其前体与HER2胞外域（ECD）的结合动力学参数。通过单循环动力学实验（single-cycle kinetics），作者验证了zanidatamab对HER2的亚纳摩尔级高亲和力，并比较了其与亲本抗体的差异（如抗ECD2 Fab经工程优化后亲和力提升8.8倍）。作者进一步运用Biacore进行了结合模式验证，通过调节芯片表面抗体捕获密度，Biacore实验揭示了zanidatamab的反式结合特性：在高密度条件下，抗体通过同时结合两个HER2分子（分别靶向ECD2和ECD4）形成交联复合物，导致kd显著降低（密度依赖性）。而对照抗体trastuzumab（仅靶向ECD4）的kd无密度依赖性，证实其为顺式结合。这一结果为后续观察的HER2簇状聚集和补体依赖的细胞毒性（CDC）提供了机制基础。随后在抗体工程过程中，Biacore被用于筛选亲和力优化的抗ECD2 Fab突变体。通过对比野生型与突变体的结合参数（KD从15 nM提升至1.7 nM），作者确认了结构导向的亲和力提升策略的有效性，确保双特异性抗体能够高效交联HER2受体。结合分析型超速离心（AUC）和冷冻电镜（cryo-EM）数据，Biacore结果进一步支持了zanidatamab诱导的HER2多聚体形成，为其独特的生物学功能（如CDC）提供了分子层面的解释。在这些药物成功申报的背后，Biacore始终无声护航。目前，Biacore基于表面等离子共振技术已经被中国、美国和日本药典收录。2024年也荣幸地被国家药品监督管理局组织制定的《抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则》列为推荐的结合活性检测方法。Biacore技术符合GxP和21 CFR Part 11法规的要求，其准确稳定的数据质量已经得到了药企和监管机构的广泛应用和认可，能够为企业加快抗体药物上市保驾护航。据不完全统计，超过80%的抗体药物在其早期研发及申报过程中都会用到Biacore，通过动力学参数为药物优化提供“黄金标尺”。从双抗的精准协同到单抗的靶向锁定，从亲和力微调到脱靶风险预测，Biacore以数据为语言，书写着抗体药物从实验室到病床的“通关密码”。资料获取报价获取扫描下方二维码立即获取8K SOP资料及报价参考文献：Hong, Yuan, et al. "Tislelizumab uniquely binds to the CC′ loop of PD‐1 with slow‐dissociated rate and complete PD‐L1 blockage." FEBS Open Bio 11.3 (2021): 782-792.Okragly, Angela J., et al. "Binding, neutralization and internalization of the interleukin-13 antibody, lebrikizumab." Dermatology and Therapy 13.7 (2023): 1535-1547.Weisser, Nina E., et al. "An anti-HER2 biparatopic antibody that induces unique HER2 clustering and complement-dependent cytotoxicity." Nature Communications 14.1 (2023): 1394.FDA Integrated Review for BLA 761369

抗体药物一直在癌症、自身免疫疾病、传染病等重大疾病的治疗中发挥重要作用。然而，抗体药物有一个致命性弱点就是免疫原性。我们知道，免疫原性是指外源性蛋白（如抗体药物）引发机体免疫应答的能力。人体将治疗性抗体误判为“入侵者”并发动攻击，轻则降低药效，重则引发致命风险。即使是高度人源化的抗体，仍可能被人体免疫系统识别为“外来入侵者”，从而触发免疫反应，导致药物中和、疗效下降，甚至产生严重的不良反应。 那么，抗体药物的免疫原性究竟源自何处？它如何影响药效？目前有哪些办法？今天，我们就来探讨一下抗体药物的免疫原性。 图1 免疫原性反应的发生机制   01   免疫原性：出师未捷身先死 1. 免疫原性难在哪？ 在人体免疫系统看来，任何非己的分子都有可能被视为威胁并引发机体免疫反应。抗体药物虽然设计成类似人体自身的抗体，但其来源、修饰、结构等因素可能仍然暴露出“外来者”的特征。当患者体内产生抗药抗体（Anti-Drug Antibodies, ADAs）时，这些抗体可能会直接中和抗体药物，从而直接降低其疗效；也可能会加速抗体清除，缩短半衰期，使抗体药效不稳定；更严重的会引发免疫过敏反应，如过敏性休克或细胞因子风暴，威胁患者生命。这里面比较有名的就是TGN1412事件----2006年英国伦敦6名健康志愿者在注射实验性CD28超级激动剂抗体TGN1412后，短短90分钟内就出现全身器官衰竭，最终靠重症监护才捡回性命。 免疫原性问题不仅影响药效和安全性，还可能导致药物审批受阻，增加研发成本。因此，它是抗体药物研发过程中必须解决的核心难题之一。 2. 免疫原性是谁暴露了“破绽”？ 其实免疫原性的形成是多因素作用的结果，主要包括： （1）抗体结构因素：①非人源性序列：鼠源或嵌合抗体更容易被免疫系统识别。②异常糖基化：糖基修饰的改变可能引发免疫应答。③聚集体形成：抗体聚集会增强抗原呈递，引发免疫反应。 （2）药物生产因素：①细胞表达系统：不同宿主细胞可能带来不同的翻译后修饰，影响免疫原性。②制剂稳定性：抗体在制剂中可能发生降解或修饰，暴露免疫表位。 （3）患者相关因素：①个体基因差异：不同患者的HLA（人类白细胞抗原）基因型影响抗体的免疫原性。②基础免疫状态：免疫系统活跃的患者更易产生ADAs。 那么，有了问题，目前是如何解决这个问题的呢？   02   目前降低免疫原性的策略 1. 人源化改造：让抗体更像自己的抗体 最开始的抗体药物多为鼠源的，免疫原性极高，为了解决这个问题于是开发了人源化策略，改造的方法主要有： ①嵌合抗体（Chimeric Antibody）：将鼠源抗体的可变区（VH、VL）移植到人IgG框架上，如英夫利昔单抗。 ②CDR移植（Complementarity-Determining Region Grafting）：仅保留鼠源抗体的CDR区域，其他部分换成人抗体，如曲妥珠单抗。 ③全人抗体（Fully Human Antibody）：通过转基因小鼠或噬菌体展示技术，直接筛选全人抗体，如阿达木单抗。 2. 免疫原性预测与优化 （1）计算模拟技术：主要包括T细胞表位预测和结构建模：使用计算工具（如NetMHCIIpan）分析抗体是否包含可被HLA呈递的T细胞表位。预测抗体的表面结构，改造易被免疫系统识别的区域。 （2）体外实验验证：可以用HLA-T细胞共培养实验来检测抗体是否能诱导T细胞活化。 3. 工程修饰：比如去除T细胞表位来减少免疫原性表位；或者优化糖基化修饰：使用CHO-K1等特定细胞系生产更接近人体抗体的糖型。也有优化抗体稳定性，减少聚集体形成，从而减少免疫系统激活。 4. 免疫耐受诱导：先使用低剂量抗体，使免疫系统逐渐耐受，再逐步增加剂量。   03   未来展望：聚焦AI+合成生物学 正如昨天的推文中说到，拥抱AI就是拥抱生物医药的未来，随着新技术AI和合成生物学的发展，抗体免疫原性也会有进一步的技术突破，比如： ① AI驱动的免疫原性预测：深度学习算法可以分析大规模HLA数据，提高免疫原性预测的精准度。 ② 智能抗体设计：AI辅助蛋白工程优化抗体序列，规避高免疫原性表位。 ③ 合成生物学打造“免疫隐形”抗体：通过精准基因编辑，设计更接近人体自身抗体的药物。 随着新技术的不断涌现，免疫原性问题将不再成为抗体药物研发的主要瓶颈！！！ 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。 ©2021 医药速览 保留所有权利 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。