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“ 点击蓝字 关注我们 北京大学高宁课题组揭示真核DNA复制中冈崎片段引物去除过程的新分子机制 PPS  2024年11月22日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、核糖核酸北京研究中心高宁课题组在The EMBO Journal发表了题为Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2的研究论文，对含有PCNA的内源相关复合物进行结构研究，获得了两组PCNA复合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的结构，为理解冈崎片段成熟的后期步骤提供了一系列的结构快照。 真核生物DNA复制在复杂的染色质环境下进行，与多种分子生物学过程互相协调，例如DNA复制与修复的偶联以及DNA复制与新生核小体组装的偶联等。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作为DNA复制体不可缺少的辅助蛋白，在DNA复制中结合各种DNA聚合酶以赋予其持续合成的能力，也可以将多种因子募集到DNA复制、修复等DNA代谢事件发生的位点，并促进相应的生物学反应，是DNA代谢的中心枢纽之一。与PCNA相互作用的蛋白超过两百多种，包括DNA复制相关蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修复蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表观遗传因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及参与细胞周期调控、凋亡等过程的一些蛋白分子，它们都是通过自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like 基序结合PCNA。 真核生物PCNA是环绕双链DNA的同源三聚体，每个单体都包含一个PIP box结合位点，因此一个PCNA环可以至多结合三个含有PIP box的蛋白因子。领域内认为PCNA的协调功能是通过“工具带，toolbelt”的形式实现，即PCNA同时结合处于上下游过程的不同的酶，以提高DNA代谢相关事件的整体效率。一个具有代表性的例子是DNA复制过程中的滞后链冈崎片段的加工成熟，参与这一过程的所有具有催化活性的酶都与PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1。参与引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作为RNA核酸酶去除由Pol α与引物酶复合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滞后链上的新生DNA链的延伸之后，会进行链置换反应，继续向前合成将临近冈崎片段中的引物顶起，形成5'-flap DNA结构；FEN1作为结构特异性的DNA核酸内切酶结合并切割5'-flap DNA；通过这一系列步骤，保真度较差的DNA引物及RNA引物得以去除。领域前期通过体外重组的方式，已经获得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1复合物，对它们的结构和功能进行了表征，部分地验证了PCNA作为工具带的分子角色。然而很多重要的机制性的问题还未得到解答，例如PCNA如何特异性地选择并协调参与同一DNA代谢事件的不同蛋白因子；同时结合在PCNA上的蛋白因子之间是否进行相互的变构调节等。 课题组以PCNA作为诱饵蛋白，首先建立了一套从染色质中快速纯化PCNA内源复合物的方法，得到了一系列含有PCNA且参与DNA复制、核小体组装、DNA修复等过程的内源复合物。 结合冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了两套复合物PCNA-FEN1与PCNA-FEN1-RNaseH2不同状态的三维结构。其中PCNA-FEN1复合物中FEN1处于催化后状态，5'-flap DNA被切割但尚未离开FEN1的酶活中心，表明FEN1的5'-flap DNA产物释放在细胞内是限速步骤。 在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中，发现FEN1与RNaseH2分别结合PCNA的不同亚基，证实了PCNA工具带的功能。对不同状态的PCNA-FEN1-RNaseH2复合物进行结构分析，发现RNaseH2始终结合在FEN1催化位点上游固定的双链DNA区域，并且此区域不包含任何未去除的RNA残基，这表明同时结合PCNA的FEN1与RNaseH2存在一种未被认识到的功能上的耦合。因为5'-flap DNA是聚合酶Pol δ继续向前合成进行链置换的产物，其核苷酸序列与其上游双链DNA序列一致，所以在细胞中5'-flap DNA很可能侵入上游的双链DNA，产生3'-flap DNA，一旦3'-flap长度大于1 nt，FEN1将无法切割5'-flap DNA。然而，当RNaseH2结合在5'-flap DNA上游双链DNA时，由于空间位阻的存在，5'-flap DNA无法进行链入侵，大幅降低了5'-flap DNA转化形成3'-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通过维持DNA底物的特定构象以促进FEN1 5'-flap DNA的酶切效率。 此外，结构分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中RNaseH2蛋白通过RNaseH2A亚基结合PCNA，而不是之前报道的RNaseH2B PIP box结合PCNA，序列分析鉴定到RNaseH2A亚基中一个新的PIP box，通过体外生化实验验证了RNaseH2A及RNaseH2B亚基的PIP box都可以结合PCNA。结合免疫荧光电镜的成像实验，表明RNaseH2A PIP box与RNaseH2B PIP box在不同的生理学过程中发挥功能。 该研究表明PCNA在细胞内可以作为工具带同时结合多个蛋白因子。之前的模型认为同时结合PCNA的蛋白是按照顺序发挥功能，一个酶发挥完功能后与DNA解离，释放出DNA底物以供另一个酶结合；与之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物结构中，FEN1与RNaseH2稳定结合同一个DNA底物，RNaseH2可能通过对底物DNA的构象调控来促进FEN1的酶切效率。这表明细胞内同时结合PCNA的不同蛋白因子间可能会对它们酶促反应动力学进行互相调控。RNaseH2除了作为RNA核酸酶参与冈崎片段引物RNA的去除外，该研究发现了RNaseH2的另一个可能的新功能，即以不依赖于核酸酶活性的形式作为双链DNA结合蛋白来调节FEN1的5'-flap DNA酶切功能。 高宁教授为该论文的通讯作者。生命科学学院2020级博士研究生田宇辉为该论文第一作者。生命科学学院研究员李宁宁在实验方法探究及结构计算方面提供了帮助。生命科学学院李晴教授为该论文提供了支持与帮助。该研究得到了国家自然科学基金和昌平实验室的支持。北京大学冷冻电镜平台、昌平实验室冷冻电镜平台、北京大学高性能计算平台、生命科学学院仪器中心及国家蛋白质基础设施（北大分平台）对该项目提供了重要的技术支持。 参考文献: 1. Bellush, J. M. & Whitehouse, I. DNA replication through a chromatin environment.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci372(2017). 2. Li, N.et al.Parental histone transfer caught at the replication fork.Nature627, 890-897 (2024). 3. Slade, D. Maneuvers on PCNA Rings during DNA Replication and Repair.Genes9, 416 (2018). 4. Boehm, E. M., Gildenberg, M. S. & Washington, M. T. The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication.Enzymes39, 231-254 (2016). 5. Sun, H.et al.Okazaki fragment maturation: DNA flap dynamics for cell proliferation and survival.Trends in Cell Biology(2022). 6. Levikova, M. & Cejka, P. The Saccharomyces cerevisiae Dna2 can function as a sole nuclease in the processing of Okazaki fragments in DNA replication.Nucleic Acids Res43, 7888-7897 (2015). 7. Blair, K.et al.Mechanism of human Lig1 regulation by PCNA in Okazaki fragment sealing.Nat Commun13, 7833 (2022). 8. Lancey, C.et al.Structure of the processive human Pol δ holoenzyme.Nature Communications11(2020). 文章来源：北京大学生命科学学院 美编排版：朱玲欣 文章审核：周碧远 朱玲欣 罗琪 【免责声明】以上内容来源于互联网，不代表本平台立场或观点；如有侵犯作者著作权，请及时与我们联系（Tel：025-83271227，或直接在微信平台留言），我们将及时更正或删除。 《药学进展》杂志由国家教育部主管、中国药科大学和中国药学会共同主办，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.216，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 聚焦“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟

引言 DNA双链断裂（DSB）是细胞分裂过程中最严重的DNA损伤类型之一，如果不及时修复，会导致基因突变和癌症。同源重组（HR）是DSB修复的主要途径之一，HR依赖于同源染色体之间的序列匹配，以修复DSB【1】。HR的启动需要先对DSB末端进行DNA端重组，生成单链DNA模板，以便RAD51重组酶等蛋白组装并执行修复。BRCA1-BARD1复合体是重要的肿瘤抑制因子，在HR中发挥关键作用【2】。它参与多个HR阶段，包括DNA端重组，并已被证明与RAD51重组酶相互作用并增强其活性【3】。尽管BRCA1-BARD1在HR中至关重要，但其直接调节DNA端重组活性的机制尚不清楚。 近日，来自美国德克萨斯大学健康科学中心的Patrick Sung，Sandeep Burma研究团队和哥伦比亚大学的Eric C. Greene研究团队合作在Nature杂志上发表题为Promotion of DNA end resection by BRCA1-BARD1 in homologous recombination的研究论文，该研究发现BRCA1-BARD1通过增强关键重组酶的活性，以及与DNA端重组机器的协同作用，在DSB修复中发挥至关重要的作用。 首先研究人员利用体外酶促反应，将纯化的BRCA1-BARD1、BLM和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。结果发现BRCA1-BARD1显著增强BLM的解旋酶活性和DNA2的DNA端切割酶活性，并提高BLM-DNA2复合物的进程性和效率。接着通过亲和层析实验，研究人员验证BRCA1-BARD1与BLM和DNA2的相互作用。研究结果表明，BRCA1-BARD1与BLM和DNA2直接相互作用，这导致BLM-DNA2途径的DNA解旋和DNA端重组效率显著提高。BRCA1-BARD1的加入还促进了BLM-DNA2复合物的组装进程和效率，使其在DNA端重组过程中发挥更积极的作用。 与BRCA1-BARD1增强BLM-DNA2途径的实验类似，研究人员使用纯化的BRCA1-BARD1、WRN和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。通过亲和层析实验，验证BRCA1-BARD1与WRN的相互作用。结果发现BRCA1-BARD1显著增强WRN的解旋酶活性，并提高WRN-DNA2复合物的进程性和效率。与BLM-DNA2途径类似，BRCA1-BARD1的加入并没有改变WRN-DNA2复合物的组成，而是通过增强其活性来提高端重组的效率。 研究还发现，BRCA1-BARD1与EXO1直接相互作用，并显著增强EXO1的5’→3’外切酶活性。这意味着BRCA1-BARD1不仅作用于解旋酶和DNA切割酶，也作用于外切酶，进一步增强了DNA端重组的整体效率。机制解析发现BRCA1-BARD1通过与EXO1的特定结构域相互作用，提供辅助作用，促进DNA端的切割，并提高EXO1在DNA端重组过程中的稳定性和效率。例如，BRCA1-BARD1可能通过稳定EXO1的结构，或通过改变其活性位点的电荷状态，来增强其切割能力。 最后，研究发现，BRCA1和BLM1都含有独立的DNA结合模块，它们协同作用以增强DNA端重组的效率。此外，BARD1的DNA结合域对于BRCA1-BARD1促进DNA端重组的能力至关重要。这表明BRCA1-BARD1通过与DNA端的结合，更有效地引导和协调重组酶的活性。 同期在Nature杂志上，来自瑞士提契诺大学（USI）生物医学院的Petr Cejka研究团队发表题为Mechanism of BRCA1-BARD1 function in DNA end resection and DNA protection的研究论文，该研究也发现了BRCA1-BARD1在DNA端重组中的重要作用，并阐明了其保护DNA的功能。 总之，这两项工作都深入探讨了BRCA1-BARD1在DNA双链断裂修复中的关键作用，特别是它在同源重组过程中的DNA端重组阶段。这些研究不仅加深了我们对BRCA1-BARD1功能和癌症发生的理解，还可能为开发针对BRCA1-BARD1缺陷的癌症治疗方法提供新思路。 参考文献 1. Tarsounas, M. & Sung, P. The antitumorigenic roles of BRCA1-BARD1 in DNA repair and replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 284-299 (2020). 2. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W. & Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a016600 (2015). 3. Zhao, W. et al. BRCA1-BARD1 promotes RAD51-mediated homologous DNA pairing. Nature 550, 360-365 (2017). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07910-2 https://doi.org/10.1038/s41586-024-07909-9 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Rainbow 导读： DNA损伤在疾病的肿瘤发生和进展中起着重要作用。DNA修复异常会影响癌症的治疗和预后。 5月27日，同济大学医学院袁健、李昀辉共同通讯在期刊《ADVANCED SCIENCE》上在线发表题为“USP25 Elevates SHLD2-Mediated DNA Double-Strand Break Repair and Regulates Chemoresponse in Cancer”的研究论文， 研究提出了一个机制模型，即USP25在K64位点用K63连接的多泛素链去泛素化和修饰SHLD2，从而促进NHEJ修复，从而降低癌细胞的化学敏感性。然后，研究人员开发了基于破坏USP25-SHLD2结合的策略的肽，并证明肽与化疗药物的组合提高了结肠癌细胞和PDX模型的杀伤效率，这意味着一种潜在的治疗策略，以提高化疗敏感性并实现更好的结果。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202403485 研究背景 01 DNA损伤反应（DDR）系统对于维持基因组完整性和防止DNA损伤至关重要。DDR通路功能障碍导致基因组不稳定，这是肿瘤发生开始和进展的关键驱动力。 DNA 双链断裂（DSB）是最致命的病变，可引发一系列细胞DNA损伤反应。DSBs通过两种主要途径进行修复，即同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。NHEJ通路修复增殖细胞中75%的DSB，并在整个细胞周期中发生。屏蔽DNA末端是启动DSB NHEJ修复的核心过程。最近的报道已将shieldin复合物确定为53BP1相关活性的新效应子，可促进NHEJ修复并限制DNA末端切除。shieldin复合物由C20orf196（SHLD1）、FAM35A（SHLD2）、CTC-534A2.2（SHLD3）和REV7组成，SHLD2是该复合体中的关键调节因子。SHLD2的N端与REV7结合，促进SHLD2募集到DSB。SHLD2的C末端与ssDNA末端结合，通过与EXO1和DNA2竞争来防止DNA末端的切除。SHLD2对于促进NHEJ和抗体类别开关重组（CSR）至关重要。SHLD2的高表达与乳腺癌患者的不良预后相关。然而，对控制SHLD2活性的调控机制知之甚少。 翻译后修饰（PTM）在调节蛋白质功能中起着至关重要的作用。NHEJ通路中关键调节因子的许多PTM已被证明与肿瘤发生和癌症治疗有关。具体来说，ATM对53BP1 N末端的S/T-Q位点进行磷酸化是DNA末端保护和免疫球蛋白类转换重组（CSR）所必需的，促进其与RIF1的相互作用，激活NHEJ修复和癌细胞存活。此外，RNF168对K1268的53BP1泛素化对NHEJ修复、维持基因组稳定性和放射敏感性至关重要。然而，调节SHLD2的PTM尚未得到广泛的表征。 研究发现 02 在这项研究中，证明去泛素化酶USP25促进非同源末端连接（NHEJ），从而促进癌症的化疗耐药性。结果表明，USP25在K64位点使SHLD2去泛素化，从而增强其与REV7的结合并促进NHEJ。此外，USP25缺陷会损害NHEJ介导的DNA修复并降低 USP25 缺陷小鼠的类别转换重组（CSR）。USP25在结肠癌的一个亚群中过表达。USP25的耗竭使结肠癌细胞对IR、5-Fu和顺铂敏感。TRIM25也被鉴定为一种E3连接酶，负责降解USP25 。TRIM25的下调导致USP25水平升高，进而诱导结肠癌细胞的化疗耐药性。最后，在PDX模型中，成功鉴定了一种破坏USP25-SHLD2相互作用的肽，损害了NHEJ并增加了对化疗的敏感性。 总体而言，这些发现揭示了USP25是SHLD2调节NHEJ修复途径的关键效应因子，并表明其作为癌症治疗靶点的潜力。 研究结论 03 综上所述， 研究提出了一个机制模型，即USP25在K64位点用K63连接的多泛素链去泛素化和修饰SHLD2，从而促进NHEJ修复，从而降低癌细胞的化学敏感性。然后，研究人员开发了基于破坏USP25-SHLD2结合的策略的肽，并证明肽与化疗药物的组合提高了结肠癌细胞和PDX模型的杀伤效率，这意味着一种潜在的治疗策略，以提高化疗敏感性并实现更好的结果。 参考资料： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202403485 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情