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PROTACs are revolutionizing small molecule drug development 研究人员正在探索蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）治疗癌症、神经退行性疾病和其他疑难杂症的可能方法。PROTAC是一种异双功能小分子，可利用泛素-蛋白酶体系统进行蛋白质降解，被认为是靶蛋白降解剂（TDP）的一个子集。它们由靶蛋白质配体-连接子-E3连接酶配体部分组成，将需要降解的蛋白质与E3连接酶结合在一起，最终导致该蛋白质降解，而PROTAC则被回收，与另一个蛋白质分子重复该过程。 PROTAC的变体包括： 蛋白水解靶向抗体（PROTAB） 分子胶 溶酶体靶向嵌合体（LYTAC） 巨噬细胞降解靶向嵌合体（MADTAC） 为了更好地了解近年来研究格局的变化情况，我们分析了权威的人工标引科学信息数据合集——CAS Content CollectionTM，发现在过去几年中，与PROTAC相关的期刊和专利出版物均显著增加（见图1）。我们的分析还揭示了目前哪些PROTAC正引起研究人员的关注，以及它们最常被用于针对哪些疾病。 图1：过去十年内与PROTAC相关的出版物。截至2024年6月的部分数据。来源：CAS Content Collection   PROTAC是如何靶向蛋白质的 蛋白质降解是消除受损或错误折叠蛋白质的正常生理过程。PROTAC通过充当目标蛋白质靶标（即在癌症和其他疾病中发挥作用的靶标）和E3连接酶之间的桥梁以促进这一降解过程。这些连接酶用泛素标记目标蛋白；泛素标记作为向泛素-蛋白酶体系统发出的信号，表明该蛋白质分子需被降解。PROTAC将连接酶与蛋白靶标紧密连接，从而使蛋白质被泛素化，然后被降解（见图2）。 图2：PROTAC诱导目标蛋白降解机制示意图。Oza, Harsh；Tokarz, Victoria（2024）摘自：“PROTAC: Proteolytic Targeting Chimera”。源自：https://app.biorender.com/biorender-templates。 PROTAC分子本身是由靶蛋白质配体-连接子-E3连接酶配体部分组成，其中配体是靶向目标蛋白的一种手段，连接体可使蛋白质与E3连接酶之间保持最佳间距，E3连接酶配体部分则可让适当的E3连接酶参与其中。 最初，PROTAC由靶蛋白质配体-连接子-E3连接酶配体部分组成，靶向目标蛋白。然而，新的发展产生了不同的PROTAC设计，可以通过多种方式靶向蛋白质： 双靶标和多靶标PROTACs：与传统的PROTAC不同，它们可被设计用于靶向不止一种类型的蛋白质。 基于肽的PROTACs：它们利用肽基部分代替传统PROTAC中的小分子作为靶向配体。因此，它们可用于靶向还没有小分子抑制剂的蛋白质。 bioPROTACs：它们由带有附着蛋白的工程化E3连接酶组成，其附着蛋白的功能类似于传统PROTAC中的靶向配体，与目标蛋白相互作用。 细胞内点击形成的靶向嵌合体的蛋白水解酶（CLIPTACs）：CLIPTAC被用于尝试克服PROTAC口服给药的问题。它们通过依次施用靶向蛋白质配体和E3连接酶配体部分，在细胞内形成PROTAC，细胞内偶联则是利用附着在E3连接酶配体部分上的四嗪和附着在靶向配体上的反式环辛烯之间的逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）环加成反应。 点击释放蛋白水解靶向嵌合体（crPROTACs）：它们采用与CLIPTAC相似的逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应。其原理是给予PROTAC的前体药物，仅在需要的部位/位点释放具有活性的药物。 光化学靶向嵌合体（PHOTACs）：它们在光激活时实现最大程度的蛋白质降解，赋予选择性并可能减少脱靶效应。 E3连接酶引起研究人员的兴趣 由于E3连接酶是由PROTAC中E3连接酶配体连接的部分，我们分析了CAS Content Collection中近2,000篇与PROTAC相关的文章，发现了有四种E3连接酶特别引起研究人员的兴趣（见图3）。 Cereblon：这是一种由大约440个氨基酸残基组成的蛋白质，可与众多蛋白质相互作用，形成E3泛素连接酶复合物。Cereblon被认为是与PROTAC相关研究最多的E3连接酶。 VHL：它与elongin B、elongin C、cullin 2和环框蛋白1（Rbx1）一起，作为CRL2（一种Cullin-RING-E3连接酶（CRL）复合物）的底物识别受体/亚基。 IAP：IAP是一个蛋白质家族，包括细胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）、细胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）。依赖于IAP的E3连接酶配体的PROTAC通常被称为特异性和非遗传性IAP依赖性蛋白消除剂（SNIPER）。 MDM2：这是一种由大约480个氨基酸残基组成的蛋白质，其过度表达与化疗的耐药性有关。 图3：PROTAC数据集中E3连接酶的发文频率。来源：CAS Content Collection，2003-2024年间的数据。 我们在文献中确定了E3连接酶、底物识别受体和蛋白靶标之间的共现关系（见图4）。Cereblon和VHL最常与含溴结构域的蛋白共现。其他经常与Cereblon共现的蛋白包括B细胞白血病/淋巴瘤蛋白，雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）。MDM2和IAP在所有蛋白靶标中分布较为均匀： 图4. 在PROTAC相关出版物中，E3连接酶（左列）与其底物识别受体（中间列）和主要蛋白靶标（右列）的共现情况桑基图。来源：CAS Content Collection，2003-2024年间的数据。 针对癌症、传染病和神经退行性疾病的PROTAC 我们的分析表明，PROTAC研究针对的主要目标疾病仍然是癌症，其次是传染病和神经退行性疾病（见图5）。 乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤是与PROTAC共现的最常见的实体癌。最近针对前列腺癌中雄激素受体（AR）和乳腺癌中雌激素受体（ER）的研究取得的突破解释了这些疾病在文献中的普遍性情况。 图5：2003-2024年间CAS Content Collection中的PROTAC相关出版物中，PROTAC（第1列）、疾病大类（第2列）、具体疾病（第3列）和主要蛋白靶标（第4列）之间的共现情况桑基图。 阿尔茨海默症和帕金森病等神经退行性疾病涉及错误折叠的蛋白质，这些蛋白质也可能成为降解蛋白质的PROTAC的靶向目标。如果这些小分子药物能够成功地破坏导致上述疾病的缺陷蛋白，可能预示着治疗上的重要突破，从而解决病因，而不仅仅是病症。例如，Tau蛋白在PROTAC领域的发文数量不断增加（见图6），这表明人们对于开发此类神经退行性疾病治疗药物的兴趣日益增加。 其他常见的蛋白靶标包括雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）和含溴结构域的蛋白，也包括迄今为止对小分子药物治疗有抵抗性的蛋白，如KRAS和BCL2。这些研究尚未产生临床候选药物，因其大多是针对雄激素受体和雌激素受体，但它们为靶向在各种癌症中发挥重要作用的蛋白质提供了新的可能性。 图6：过去二十年（2003-2024年）PROTAC领域的主要蛋白靶标。来源：CAS Content Collection。 PROTAC的临床试验增长迅速 自2020年以来，处于临床前开发阶段的药物数量增加了四倍多。截至2024年，共有六种PROTAC处于I期和II期临床试验阶段（见图7）。考虑到最早与PROTAC相关期刊文献可追溯到2001年——仅仅二十多年前，这是一个了不起的成就。 这些临床试验中的大多数针对未指定形式的癌症，但乳腺癌和前列腺癌也很突出。针对乳腺癌和前列腺癌的药物均已进入II期和III期。例如，由Arvinas和Pfizer设计用于治疗乳腺癌的PROTAC药物vepdegestrant（ARV-471）已进入III期（参考文献）。GT20029是苏州的开拓药业股份有限公司设计的首款外用PROTAC，也是一种有前景的靶向雄激素受体的治疗方法，目前已进入II期。 针对阿尔茨海默症、帕金森病和亨廷顿病涉及的蛋白靶标，以及与人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎和自身免疫性疾病相关的激酶的临床前试验也正在进行中。PROTAC治疗靶点的多样性表明，这些药物具有治疗多种难以治疗的病症的潜力。 图7：(A)过去十年中处于不同临床试验阶段（临床前、I期、II期和III期）的PROTAC药物数量。(B)目前正在开发的PROTAC药物针对的各种疾病/适应症。圆圈的大小代表药物的数量。数据源自 Pharmaprojects Citeline Intelligence。 克服PROTAC临床应用所面临的挑战 虽然PROTAC确实非常有前景，但其发展仍处于早期阶段，在广泛应用于临床之前尚须解决一些重要挑战。一个关键的发展将是确保PROTAC仅与受损细胞或不健康细胞中的目标蛋白结合。脱靶效应，即PROTAC降解健康细胞中的蛋白质可能危害很大。解决这个问题的一个潜在办法是设计新型的PROTAC，如PHOTAC和CLIPTAC，它们有可能会实现活性PROTAC在时空上可控的释放。 表征是另一项挑战——大多数表征技术侧重于测试设计的PROTAC是否能与目标蛋白结合，但并未测试或考虑活细胞内PROTAC与目标蛋白之间的相互作用。相关知识的欠缺阻碍了对PROTAC可失效的点进行深入了解。 最后，由于PROTAC往往不符合Lipinski类药五原则，因此设计它们用于口服给药十分困难。开发新的制剂和药物递送系统是克服这一障碍的必要条件。 这些进展还需开展大量研究工作，但共价抑制剂等非传统模式的进展表明，新方法可以在新疗法中发挥重要的作用。鉴于其在靶向导致癌症和其他疾病的蛋白质方面有如此巨大的潜力，科学界投入大量时间和精力来实现突破是明智之举。 Copyright © 2024 American Chemical Society 点击“阅读原文” 你“在看”我吗？

研究背景由与E3泛素连接酶配体连接蛋白质靶向配体形成的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的靶向蛋白质降解已成为一种通过蛋白酶体介导的降解致病蛋白质的强大治疗方式。虽然有超过600个E3连接酶，但是大多数PROTAC只利用了Cullin-RING E3泛素连接酶的底物受体——cereblon和VHL。近年来，还发现了许多其他针对其他E3连接酶的募集蛋白，包括cIAP、MDM2、DCAF16、DCAF11、RNF114、RNF4、FEM1B、KEAP1和DCAF1。并不是所有的E3连接酶都对癌细胞活力至关重要，因此，癌细胞中可能会出现耐药机制，从而损害E3连接酶募集并使PROTAC无效。开发针对泛素-蛋白酶体机制核心成分的募集剂，例如针对对细胞活力至关重要的CUL1-CUL7 E3连接酶中的Cullin-RING E3连接酶复合接头蛋白（如DDB1、SKP1 或ELOB/ELOC）的募集剂，可以避免PROTAC可能产生的潜在未来耐药机制。加州大学伯克利分校Nomura课题组研究了CUL1-RING E3连接酶接头蛋白SKP1是否可以被募集用于PROTAC介导的新底物降解。研究内容该课题组在基于凝胶的基于活性的蛋白质分析（ABPP）中筛选了1284个半胱氨酸反应性共价配体，筛选了针对人SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物（图1）。该筛选产生的性能最良好的化合物是EN884（图2）。EN884显示了SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物中人SKP1蛋白的半胱氨酸反应性探针的剂量反应置换（图3）。   图1.半胱氨酸反应性共价配体库筛选结果（针对SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物）图2.EN884结构图3.EN884与半胱氨酸探针反应该课题组对与 EN884 一起孵育的SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物进行了串联质谱（MS/MS）分析，以确定修饰位点（图4），发现了一个被修饰的位点——SKP1上的C160（图5），该位点由于特定的F-Box结构域，表现出独特的构象。因此，该课题组假设EN884可能会利用SKP1和CUL1底物受体之间的集体界面并结合。图4.串联质谱分析图5.结合位点位置 接下来，该课题组合成了两个基于EN884的炔烃功能化探针SJH1-37-m、SJH1-37-p（图6）。基于凝胶的ABPP评估这些探针与SKP1复合物的结合，与对位相比，间位结合能力更佳（图7）。    图6.探针结构图7.探针结合能力值得注意的是，由于C160位置特殊，EN884和SJH1-37m不与单体SKP1结合（图8）。这表明，CUL1复合物的其余部分，或至少是底物受体，是配体与SKP1结合所必需的。图8.探针与单体SKP1结合       该课题组进一步证明，SJH1-37m通过SKP1的下拉在细胞中结合SKP1，而不是不相关的蛋白质，如GAPDH（图9）。   图9.SJH1-37m探针的SKP1下拉接下来，该课题组进行了基于质谱的ABPP，以使用先前建立的同位素脱硫生物素-ABPP（isoDTB-ABPP）鉴定HEK293T细胞中EN884参与SKP1的半胱氨酸。该课题组发现EN884在SKP1上与C160有7%的最小参与（图10）。这种最小参与与已应用在PROTAC（包括DCAF16、DCAF11和RNF114）中的其他共价E3连接酶募集剂观察到的最小参与一致。图10.HEK293T细胞中EN884的isoDTB-ABPP分析为了证明共价SKP1配体可用于PROTAC应用，该课题组合成了四种不同的PROTAC，通过C2、C4、C5或PEG3连接子将EN884的衍生物与BET家族抑制剂JQ1连接起来，分别生成SJH1-51A、SJH1-51B、SJH1-51C和SJH1-51D（图11）。所有四种PROTAC都降解了HEK293T细胞中BRD4的短亚型（图12），其中使用C4烷基接头的SJH1-51B观察到的降解最强。   图11.四种PROTAC结构图12.四种PROTAC降解效果并且，基于串联质量标记（TMT）的MDA-MB-231细胞中SJH1-51B的定量蛋白质组学分析显示BRD4中等选择性降解，其中16种蛋白质的水平显着降低>50%（图13）。   图13.SJH1-51B的定量蛋白质组学与蛋白酶体介导的降解一致，SJH1-51B介导的BRD4降解通过用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理而减弱（图14）。它还显示出对活性Cullin RING E3连接酶所需的NEDD化的依赖性，NEDD化抑制剂MLN4924可减弱BRD4的降解（图15）。最重要的是，该课题组证明SKP1敲低完全减弱了SJH1-51B在HEK293T细胞中对BRD4的降解（图16）。图14.硼替佐米预处理结果图15.MLN4924预处理结果图16.SKP1敲低细胞结果BRD4是一种相对容易被PROTAC降解的蛋白质。因此，该课题组接下来测试了共价SKP1募集剂是否可用于降解另一种新底物蛋白——雄激素受体（AR）。该课题组合成了4种AR PROTAC，将共价SKP1募集剂与来自ARV-110的Arvinas AR PROTAC靶向配体连接起来，没有连接子或C4、C6或C7烷基连接子，分别产生SJH1-63、SJH1-62C、SJH1-62D和SJH1-62B（图17）。该课题组观察到所有4种PROTAC的AR降解，其中带有C7烷基接头的SJH1-62B在LNCaP前列腺癌细胞中显示出最有效和最强大的AR降解（图17）。 图17.四种AR PROTAC结构与降解效果该课题组进一步证明，SJH1-62B介导的AR降解在蛋白酶体抑制剂预处理后减弱（图18）。定量蛋白质组学分析还表明，AR与其他11种蛋白质的选择性降解在5000多种定量蛋白质中也显著降低（图19）。图18.SJH1-62B的硼替佐米预处理结果图19.SJH1-62B的定量蛋白质组学研究总结 该课题组发现了一种SKP1募集物，它共价靶向位于SKP1和CUL1 F-box底物受体界面的SKP1的固有无序C160。这一观察结果为发现仅在含有IDR的蛋白质与其相互作用的蛋白质形成复合物时出现的可连接位点提供了概念证明。他们进一步证明，这种共价SKP1配体可用于PROTAC应用，以降解细胞中的新底物，如BRD4和AR。鉴于SKP1的重要性，SKP1的共价募集可能潜在地克服在癌症治疗中利用非本质E3连接酶的PROTAC的耐药性机制。虽然该课题组证明了在PROTAC中使用Cullin RING E3连接酶衔接蛋白的概念，但SKP1配体仍处于早期阶段，需要进行重大的药物化学优化，以提高效力、选择性和类药物特性。   该课题组的研究结果还强调了使用共价化学蛋白质组学方法来识别泛素-蛋白酶体系统中蛋白质的补充物的实用性，该系统可用于靶向蛋白质降解应用。作者：潘相奕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月29日参考文献Exploiting the Cullin E3 Ligase Adaptor Protein SKP1 for Targeted Protein Degradation ACS Chemical Biology 2024 19 (2), 442-450. DOI: 10.1021/acschembio.3c00642    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

靶向蛋白质降解已成为针对导致疾病蛋白的化学生物学和治疗干预的一种强大的新模式。绝大多数 PROTAC 降解剂都会选择两种 CRL 之一的活性：von Hippel-Lindau Cullin 2 连接酶复合物 (CRL2 VHL ) ( 12 - 14 ) 和 cereblon Cullin 4 连接酶复合物 (CRL4 CRBN )，利用内源泛素-蛋白酶体系统的活性来诱导靶蛋白的泛素化和随后的降解。然而，迄今为止公开的大多数关于PROTAC三元复合物的结构、生物物理和机理研究仅限于CRL的底物受体/适配器成分，因此缺乏完全组装的催化活性CRL复合物。此外，PROTAC 介导的泛素化的机制和结构研究仍然很少或分辨率有限。为了充分实现和指导降解剂药物的设计和优化，越来越需要了解降解剂如何招募整个天然催化酶来阐明其作用机制。近日，Alessio Ciulli团队在bioRxiv上发表了题为Mechanism of degrader-targeted protein ubiquitinability的研究论文，其团队通过结合冷冻电镜结构、交联捕获策略和泛素化赖氨酸的生化鉴定，确定了整个 PROTAC 诱导的 Cullin 2 RING 连接酶 VHL 催化机制的结构和机制，以及它如何在其高度特异性的情况下催化泛素化。为了实现快速、有效和深度的靶标降解，降解剂不仅必须在低浓度下稳定、长寿命的复合物中招募靶标，而且还必须将其有利地定向到催化位点。除此之外，该团队工作表明，“轻面”内的一个或多个赖氨酸残基在距离和几何形状方面正确定位以驱动高度特异性和高效的泛素化也很重要。图1 该研究揭示的靶蛋白“泛素化”结构和机制特征示意图降解剂介导的三元复合物的结构和机制特征直接影响降解剂的药理活性，因此代表了基于合理结构的药物设计的重要优化种类。多项研究表明，在大多数情况下，热力学协同、稳定且动力学寿命长的降解剂介导的三元复合物支撑着降解剂的高效和选择性蛋白质降解特征。然而，三元复合物的形成如何影响多蛋白CRL复合物的PROTAC选择性催化机制内的高效和选择性新底物泛素化，迄今为止仍然难以捉摸。为此，决定研究 PROTAC MZ1 的结构和机制，是有效且快速的VHL招募BET降解剂，与其他BET蛋白相比，它表现出优先降解BRD4。为了更深入地了解降解剂的作用机制，我们确定了多亚基催化复合物的结构，该复合物由完整的 CRL2 VHL、负载泛素的 E2 结合酶和作为“新底物”的 BRD4 BD2组成，全部组装在一起以 MZ1 为代表的 PROTAC 降解剂。CRL2 VHL是一种150 kDa E3 连接酶，由五个亚基组成：底物受体 von Hippel-Lindau（短亚型 VHL19，18 kDa 或长亚型 VHL30，24 kDa）、接头蛋白 Elongin C（EloC，12 kDa）和 Elongin B (EloB，15 kDa)、Cullin 2 支架 (Cul2，87 kDa) 和 RING 盒蛋白 1 (Rbx1，12 kDa)。VHL-EloC-EloB (VCB) 被募集到 VHL 和 EloC 之间界面处的 Cul2 N 末端。在 cullin 2 的 C 端结构域，E1 NEDD8 激活酶 APPBP1-UBA3 和 E2 NEDD8 缀合酶 UBE2M 与 NEDD8 E3 连接酶 Rbx1 一起作用以 neddylate Cul2，即共价修饰 Cul2 WHB 结构域的 K689 残基NEDD8。这种修饰已被证明可以诱导 cullin-RING 复合物的构象重排，并促进 E2 泛素结合酶的结合。因此使用冷冻电镜 (cryo-EM)确定完全活跃的 NEDD8-CRL2 VHL与 BRD4 BD2的结构。该课题组用~4.0 Å分辨率的冷冻电镜结构首次有机会了解新底物 BRD4 BD2与PROTAC 和全长活性 E3 连接酶复合物的整体构象。全长CRL2VHL-MZ1- Brd4BD2三级结构验证了相对于VHL的新底物的晶体结构，并揭示了系统内微妙的灵活性，允许在底物结合和E3连接酶的催化位点之间的间隙桥接泛素化（图2）。图2 MZ1使BRD4 BD2新底物朝向Rbx1接下来的目标是确定BRD4溴结构域上的哪些赖氨酸残基最容易被泛素化并成为泛素化的目标。具有 UBE2R1 和 UBE2D2 的体外泛素化产物（也称为 UbcH5b，被认为优先用第一个泛素引发底物）通过 SDS-PAGE 解析，切除 BRD4 泛素化产物的条带，用胰蛋白酶消化，和通过质谱鉴定的K-GG修饰肽。他们一致地鉴定出 BRD4 BD2上的 8个泛素化位点（K333、K346、K249、K355、K362、K368、K445 和 K456）（图3A）。由于 MZ1 对 BRD4 和 BRD2 的泛素化和降解选择性高于 BRD3 ( 13 , 29 , 40 )，因此我们通过不同 BET 蛋白中 BD2 的序列比对检查了已鉴定的泛素化赖氨酸残基的保守性（图3C）。发现 K456 位点在 BET BD2 中严格保守，K346、K349和K368 也是如此，而其他两个残基（K333 和 K445）在普遍表达的 BRD2/3/4 中严格保守，但在 BRDT 上则不然（图3C）。然而，在 BRD4 BD2和 BRD2 BD2中有两个残基位置带有可泛素化的 Lys ，但在 BRD3 BD2中带有非泛素化的 Arg 残基。该分析表明，虽然 BRD4 BD2和 BRD2 BD2相对于 BRD3 BD2的机械选择性的主要贡献者和驱动因素很大程度上取决于三元复合物中新底物的优先识别，但至少部分可能是BRD2/4 中存在这两个泛素化赖氨酸残基（但 BRD3 中不存在）也可能有所贡献。总之，我们的泛素化数据确定了一组可泛素化的赖氨酸，它们位于最接近 Rbx1 的目标蛋白的表面，与存在于相反表面的非泛素化的赖氨酸明显不同。我们还发现单个赖氨酸残基似乎优先泛素化，而总体赖氨酸保守和定位无法清楚地解释 MZ1 对不同 BET BD2 的机械选择性。图3 BRD4溴结构域在E3连接酶RING结构域可接近的赖氨酸上泛素化。为了更好地了解 cullin RING 连接酶如何介导新底物的泛素化，他们开发了一种方法来捕获与 UBE2R1在 Ub-BRD4 BD2上的活性泛素链延伸相对应的过渡态类似物物种（图4A）。在这个泛素化结构模拟物中，野生型 Brd4 BD2首先在 N 端融合到泛素 (G76S、K48C) 的 C 端，模拟受体泛素 (Brd4 BD2 -Ub A )。UBE2R1（C93K、S138C、C191S、C223S）突变体通过C93K 残基处的稳定异肽键不可逆地装载野生型泛素（UBE2R1-Ub D）。将所得的Ub(G76S, K48C)-BRD4 BD2用小型双马来酰亚胺乙烷 (BMOE) 交联剂生物化学交联至 UBE2R1(C93K, S138C, C191S, C223S)-Ub 的 E2 受体位点附近的 S138C残基并纯化 (BRD4 BD2 - Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D）（图 3A，图 S9）。与 MZ1 和 (NEDD8)-CRL VHL一起孵育后，通过凝胶电泳和质量光度分析观察到完整的复合物形成（图4B-C）。在 (NEDD8)-CRL2 VHL -MZ1-Brd4 BD2 -Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D复合物中，MZ1 和交联底物-E2 缀合物充当N端和C端区域之间的稳定桥梁。CRL2 VHL，目标是将整个复合体包围成一个封闭的“环状”结构。 图4 BRD4 BD2泛素化结构模拟物的组装。为了解决封闭的完全组装复合体的结构，我们通过冷冻电镜对样品进行了结构研究。课题组特地研究了UBE2R1和BRD4 BD2之间的界面，并测量了与BRD4的泛素化赖氨酸残基的距离（图5）。虽然 BRD4 BD2和 UBE2R1 没有直接接触，但他们观察到，优先泛素化的 K456 直接指向 E2∼Ub 亲电子位点（图 5B）。我们测量了 K456 的 N-ε与 C93处模拟硫酯的羰基之间的距离为 18.4 Å（图5B）。尽管不是最短距离，但 K456 似乎已准备好以最佳几何结构接近 E2∼Ub D上的亲电子硫酯。由于K456 位于溴结构域 C螺旋的 C 末端，远离结合的 MZ1 界面，因此所示的倾斜可能有助于桥接这样的距离。残基 K368 和 K445也都接近 C93，但与 K456 相比，它们更接近 VHL-MZ1-BRD4 BD2界面，并且具有较低的迁移率。基于这些观察，研究者认为它们应该不如 K456 更适合泛素化。该团队的结构工作共同利用交联稳定性来实现全封闭 (NEDD8)-CRL2 VHL -PROTAC-target-Ub A -E2∼Ub D结构的高分辨率冷冻电镜结构，使用溶液内技术对其进行验证这使得对由PROTAC 结合的CRL 机制催化的新底物泛素化获得前所未有的见解。图5 BRD4 BD2泛素化复合物组装的结构本文作者：SY声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓