PDCD4

关注并星标CPHI制药在线 倍半萜内酯是一大类次生代谢产物，绝大多数来源于菊科植物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性。根据羧基骨架、取代基的类型和位置，倍半萜内酯类可分为吉马内酯（germacranolides）、愈创木内酯（guaianolides）、伪愈创木内酯（pseudoguaianolides）、桉烷内酯类（eudesmanolides）、榄香烷内酯（elemanolides）等。       近年来发现具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯主要来源于青蒿素类、土木香内酯类、地胆草内酯类、鹅不食草内酯类、小白菊内酯类等。青蒿素是在菊科植物黄花蒿中发现的倍半萜内酯类化合物，其衍生物双氢青蒿素和青蒿琥酯对多种肿瘤具有显著的抑制作用。在土木香 Inula helenium L.中发现的具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯类化合物主要有土木香内酯、异土木香内酯、木香烃内酯和去氢木香内酯。在地胆草Elephantopus scaber L.中发现的具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯类化合物主要有去氧地胆草素、异去氧苦地胆苦素和地胆草种内酯等。在鹅不食草 Centipeda minima L.中发现的具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯类化合物主要有山金车内酯 D和短叶老鹳草素。在小白菊 Tanacetum parthenium L.中发现的具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯类化合物主要有小白菊内酯、二甲氨基小 白菊内酯、乌心石内酯、Epoxymicheliolide和Dimethylaminomicheliolide。       此外，从其他植物中分离的倍半萜内酯也具有肿瘤抑制作用，如从旋覆花属植物 Inula aucheriana 中分离得到的化合物旋覆花内酯 Britannin对多数肿瘤细胞具有抑制作用；来自中药白术 Atractylodes macrocephala中的倍半萜内酯有白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ；来自泥胡菜 Hemistepta lyrata Bunge的有Hemistepsin A；来自中药苍耳Xanthium strumarium L. 的有叶黄制菌素；来自肿柄菊Tithonia diversifolia A. Gray. 的有圆叶肿柄菊素 C tagitinin C；来自于毒伞芹 Thapsia garganica L. 的有毒胡萝卜素；来自牛樟芝Antrodia cinnamomea 的有 Antrocin；来自于旋覆花属植物 Inula oculus-christi 的有天人菊内酯。       倍半萜内酯类化合物的抗肿瘤作用机制       倍半萜内酯类天然产物抗肿瘤活性的作用机制主要包括氧化应激、铁死亡、诱导凋亡、诱导自噬以及调节和提高免疫力。       1氧化应激倍半萜内酯可通过抑制硫氧还蛋白还原酶（TrxR1）或核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）诱导 ROS 的产生。土木香内酯在胃癌细胞 BGC-823和SGC-7901 中，通过抑制 TrxR1 的活性诱导 ROS 生成，进而激活 MAPK 通路，最终诱导肿瘤细胞的凋亡。土木香内酯可通过 ROS 积累和内质网应激，抑制三阴乳腺癌细胞 MDAMB-231 细胞活性。此外，土木香内酯在食管腺癌细胞 KYAE-1中，可下调 Nrf2 表达，诱导细胞内ROS 积累，进而诱导细胞凋亡。       2铁死亡铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，是由细胞膜上的脂质过氧化物的毒性积累引发的。青蒿素和双氢青蒿素在非小细胞肺癌A549细胞中，可下调铁死亡的核心负调节器胱氨酸/谷氨酸转运体（xCT），上调铁死亡正向调节因子转铁蛋白受体（TFRC）的 mRNA 水平，诱导 A549 细胞铁死亡。去氧地胆草素及其衍生物DETD-35 在黑色素瘤细胞 A375 和A375-R中，可重塑谷胱甘肽和初级代谢、脂质/氧脂质代谢并造成线粒体损伤，诱导黑色素瘤细胞的脂质ROS 积累并触发铁死亡。       3诱导凋亡细胞凋亡是肿瘤细胞程序性死亡最重要的途径。大多数倍半萜内酯是通过诱导肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤的目的。乌心石内酯能上调肝癌细胞HepG2 和 Hepa 1-6 中细胞凋亡诱导因子（AIF）和细胞色素 C 的表达，诱导凋亡。木香烃内酯在结直肠癌细胞 HCT-15、HCT-116 和DLD1中，通过激活和诱导 p53 的稳定性，诱导凋亡。异木香内酯在食管鳞癌细胞 KYSE30中，上调 PDCD4 的表达，下调Bcl-xL和XIAP的表达，诱导细胞凋亡。青蒿琥酯可使荷 H22肝癌小鼠的实体瘤组织标本中的 Bax 基因表达增加、Bcl-2 基因表达减少、Bcl -2 /Bax 比例下降，表明青蒿琥酯可下调PCNA和Bcl-2的表达、上调 Bax 的表达，诱导细胞凋亡。小 白菊内酯( PN) 能诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，而正常淋巴细胞在同等条件下不受影响。PN 的凋亡活性是通过引起MM细胞的氧化应激而介导的，并进一步推测 NADPH 的氧化活性与PN介导的MM 细胞ROS的产生相关。泽兰内酯可上调Hela 细胞 p53 的表达、上调 Bax 的表达、下调 Bcl-2 的表达，使Bcl-2 /Bax比值降低，诱导细胞凋亡。       4细胞自噬细胞自噬可介导细胞凋亡和细胞周期阻滞。例如青蒿琥酯在膀胱癌细胞T24和EJ中可诱导自噬，随后激活细胞凋亡，且 AMPK-mTORULK1 途径参与自噬和凋亡的过程。小 白菊内酯在胰 腺癌细胞 Panc-1中，可诱导肿瘤细胞自噬，并显著上调 p62/SQSTM1、 Beclin 1和LC3Ⅱ的表达，最终诱导凋亡。青蒿素和双氢青蒿素在上皮性卵巢癌细胞 SKOV3 中，可阻滞细胞周期在 G2/M 期，且诱导自噬。       5双向调节和提高免疫力灌胃给予S180 荷瘤小鼠青蒿琥酯，青蒿琥酯60、30、15 g·kg-1·d -1均能显著抑制S180 的生长和升高S180荷瘤小鼠血清 IgG 的抗体水平，对2，4-二硝基氟苯( DNFB) 诱导的迟发性超敏反应有增强作用，并可诱导淋巴细胞转化为淋巴母细胞，提高小鼠的免疫功能。双氢青蒿素对豆蛋白 A( ConA) 诱导的小鼠 T 细胞的增殖有明显的抑制作用，是一种潜在的免疫抑制剂。异土木香内酯对人肝肿瘤细胞( HLE) 的增殖具较强的抑制活性，还对小鼠移植性肿瘤 H22的生长有抑制作用，并且不降低荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，推测异土木香内酯有可能是通过提高机体的免疫能力来实现其抗肿瘤活性的。       倍半萜内酯类化合物与抗肿瘤药物的联用       肿瘤耐药性是肿瘤治疗的一大障碍，越来越多的研究表明，将天然产物与抗肿瘤药物联用可以带来更好的治疗效果。在倍半萜内酯类化合物与抗肿瘤药物的联用中，主要是与化疗、放疗和免疫治疗联用。倍半萜内酯类化合物可与多种化疗药物联用，对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用，可达到增敏、增效的协同作用。在联合放疗中，乌心石内酯可增强X线对宫颈癌Hela 细胞的抑制作用和凋亡诱导作用，抑制 HeLa 细胞的硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性，诱导活性氧（ROS）生成。Dimethylaminomicheliolide 可提高小鼠结直肠癌细胞 CT26 和胶质母细胞瘤细胞 GL261 对放疗的敏感，诱导 ROS 生成、细胞凋亡和 DNA双链断裂，且可与抗 PD-L1 抗体（α-PD-L1）结合，产生协同抗肿瘤效果。双氢青蒿素可通过抑制冷诱导 RNA 结合蛋白（CIRBP）的表达减少肺癌 A549细胞的线粒体自噬和辐射抗性，敲除CIRBP 基因可抑制 A549R 细胞的线粒体自噬和辐射抗性，与双青蒿素联用可进一步抑制 A549R 细胞的线粒体自噬和辐射抗性。Antrocin 与放疗联用可抑制前列腺癌 DAB2IP 基因敲除抗辐射细胞系（LAPC4-KD 和 PC3-KD）及 shControl 细胞系（LAPC4-Con 和 PC3-Con）的增殖并诱导其凋亡，下调 PI3K/AKT 和 MAPK信号通路，调节细胞周期并诱导凋亡。在联合免疫治疗中，青蒿素可增敏人慢性髓原白血病 K562 细胞和淋巴瘤 Raji 细胞以及小鼠淋巴瘤 YAC-1 细胞对 NK 细胞介导的细胞溶解。白术内酯Ⅰ可显著促进人结直肠癌细胞 HCT116、 SW837 和小鼠结直肠癌细胞 MC38、CT26 的肿瘤抗原呈递，增强 CD8+T细胞的细胞毒性反应，提高肿瘤对免疫疗法的反应。       目前，倍半萜内酯类中以小白菊内酯为基础合成的Dimethylaminomicheliolide 和以毒胡萝卜素为基础合成的 Mipsagargin 均已进入临床试验阶段，展示出巨大的潜力。倍半萜内酯类天然产物不仅可抑制耐药肿瘤细胞，在药物联用中也呈现增敏、增效的作用，倍半萜内酯类化合物可增加细胞对化疗药物、放疗射线以及免疫疗法的敏感性，产生协同作用，增强细胞毒性，诱导细胞凋亡。所以寻找抗肿瘤药物作用的新靶点，研究开发天然抗癌新药，可以降低化疗的成本，更能减轻肿瘤患者的痛苦，使更多的肿瘤患者都能得到及时、有效的治疗，提高肿瘤患者的生活质量。       参考资料       [1]朱华野,朴惠顺.倍半萜内酯类化合物抗肿瘤作用机制的研究进展[J].华西药学杂志,2015,30(03):381-383.       [2]林金榕,陈四保.倍半萜内酯类天然产物抗肿瘤活性及机制研究进展[J].中南药学,2023,21(06):1589-1598.       作者简介       小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。智药研习社近期直播报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

具有巨大结构多样性的天然产物对各种疾病具有治疗作用，大约25%-50%的上市药物来源于天然产品。含有亲电基团的一类天然产物能够与蛋白质的亲核试剂形成不可逆键。 具有巨大结构多样性的天然产物对各种疾病具有治疗作用，大约25%-50%的上市药物来源于天然产品。含有亲电基团的一类天然产物能够与蛋白质的亲核试剂形成不可逆键。这些共价抑制剂被认为具有提高药效、选择性和药效持续时间的优势，这表明来自天然来源的共价抑制剂为药物发现和开发提供了丰富的资源。 Eriocalycin B（EB）、17-羟基jolkinolide B（HJB）、孤雌内酯（PN）、黄原胶（XT）和穿心莲内酯（AG）是具有多种抗癌活性的萜类天然产物，通常带有亲电基团（α、β-不饱和羰基和/或环氧化物），能够共价修饰蛋白质半胱氨酸残基。然而，它们的直接靶点和潜在的分子机制在很大程度上仍不清楚，这限制了这些化合物的发展。 图片来源：https://doi.org/10.1038/s41401-023-01072-z 近日，来自上海药物研究的研究者们在Acta Pharmacol Sin.杂志上发表了题为“Investigation of targets and anticancer mechanisms of covalently acting natural products by functional proteomics”的文章，该研究揭示了天然产物的共价修饰靶点及其抗肿瘤活性的潜在分子机制。 在这项研究中，研究者进行了基于TMT的定量蛋白质组学分析，以在全系统范围内识别显著差异表达的蛋白质和调节的途径。途径富集分析显示，所有这五种天然产物都影响了泛素介导的蛋白水解途径。由于EB和PN具有更高的增殖抑制活性，研究者开发了一个ABPP平台来识别它们优先修饰的靶标以及确切的共价结合位点。 定量蛋白质组学和ABPP实验都表明PN与蛋白质泛素化事件有关，Western印迹分析进一步验证了这一点。选择PN的潜在靶点USP10进行进一步验证。体外结果显示PN共价修饰了USP10，并对USP10的功能产生了抑制作用。与阴性对照细胞相比，USP10敲低MDAMB-231细胞对PN介导的细胞生长抑制具有显著的抗性。这些结果表明，PN通过至少部分共价结合USP10来抑制MDA-MB231细胞的增殖。值得注意的是，PN含有一个α，β-不饱和羰基和一个环氧化物，这两个基团都能修饰半胱氨酸。需要对结构-活性关系进行进一步研究，以阐明该化合物的药效团。 PN处理样品中USP10下游底物的蛋白质表达变化显示，RAF1、RPS2和SKP2的表达水平显著下调。RAF1是RAS激活和下游MEK-ERK信号传导之间的关键环节，参与增殖、分化和凋亡等多种细胞过程。RPS2在恶性前列腺癌症样本中过度表达，可能成为潜在的治疗靶点。SKP2是SCF（SKP1-CUL1-F-box蛋白）E3泛素蛋白连接酶复合物的底物识别成分，通过降解程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）促进乳腺癌症。 EB和PN的显著差异表达蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络。 图片来源：https://doi.org/10.1038/s41401-023-01072-z 综上所述，EB和PN可能具有相似的分子机制，部分是通过调节蛋白泛素化，而ABPP的结果表明EB和PN可以与不同的靶标相互作用。这些关于EB潜在靶点的线索可能有助于理解EB影响的乳腺癌症细胞增殖的分子机制，这仍需要通过其他独立实验进一步验证。（生物谷 Bioon.com） 参考文献 Wen-si Zhao et al. Investigation of targets and anticancer mechanisms of covalently acting natural products by functional proteomics. Acta Pharmacol Sin. 2023 Mar 17. doi: 10.1038/s41401-023-01072-z.

▎药明康德内容团队编辑历史上，新药开发的过程可以分为三个阶段，依靠不知道确切活性分子的天然产物，知道确切的分子信息但是不知道具体的作用机制，以及理性药物设计。近年来PROTAC分子等靶向蛋白降解剂就是理性药物设计的一个代表。近日发表的一篇深度综述指出，PROTAC分子的成功揭示了理性设计异双功能分子（heterobifunctional molecules）的前景，根据目标靶点，可以利用双功能分子招募不同的效应子，达到特定的效果，这一策略具有变革新药开发的潜力。 异双功能分子的设计自从2001年以来日渐受到关注，它们通过将内源性效应子与蛋白靶点拉近产生作用。其中，PROTAC分子能够将E3连接酶募集到靶点蛋白附近，促进它们的泛素修饰，并通过蛋白酶体降解。值得一提的是，在蛋白酶体之外，细胞的自噬系统、内体/溶酶体、磷酸化通路、核酸酶（RNase）都可以被招募。它们不但可以用于靶向降解蛋白，还可以对它们进行转译后修饰（PTMs）。异双功能分子不但可以特异性降解蛋白，还可以特异性降解RNA。▲异双功能分子用于新药开发的潜在方向（图片来源：参考资料[1]）扩展靶向蛋白降解的适用范围靶向降解胞外蛋白和膜蛋白——LYTACs蛋白酶体之外，内体/溶酶体也是细胞降解蛋白的重要平台。在2020年7月，Carolyn R. Bertozzi教授的研究团队在《自然》杂志上发表了突破性研究，介绍了称为LYTAC的蛋白降解技术。这种双特异性分子的一端能够与细胞外蛋白结合，另一端能够与CI-M6PR受体结合，形成的复合体会被细胞吞噬，并且送到溶酶体中进行降解。新一代的LYTAC分子能够成功引导肝细胞对细胞外蛋白的吞噬，从而完成组织特异性LYTAC降解。 ▲LYTACs作用机制和代表性化合物（图片来源：参考资料[1]）综述作者表示，LYTAC分子是PROTAC分子很好的补充，可以用于降解PROTAC分子无法靶向的细胞外蛋白和细胞膜蛋白。它们是治疗与这些蛋白相关疾病的重要工具，比如由于G蛋白偶联受体或离子通道功能失常导致的疾病。扩展对细胞内物质的降解范围——AUTACs自噬系统在溶酶体介导的细胞内物质降解方面具有重要作用。它可以降解广泛底物，包括受损的细胞器、聚集的蛋白、和细胞内废物。第一代AUTAC分子和新一代称为AUTOTAC的分子将靶向靶标蛋白的分子与激活自噬作用的小分子化合物连接起来。它们在体外和动物实验中，已经显示出有效清除细胞内蛋白聚集体的能力。 ▲AUTACs作用机制和代表性化合物（图片来源：参考资料[1]）综述作者表示，AUTAC/AUTOTAC分子进一步扩展可以降解的细胞内靶标的范围。值得一提的是，这一技术可以用于靶向降解与疾病相关的聚集蛋白，即使它们的功能未得到完全澄清。比如，与神经退行性疾病相关的tau蛋白聚集体，与心脏疾病相关的免疫球蛋白轻链聚集体等等。理论上，AUTACs可以在不影响野生型蛋白的情况下特异性降解聚集体。除了靶向降解靶点蛋白，异双功能分子还可以介导对靶标的转译后修饰，从而调节它们的功能。精准改变蛋白功能靶向降低蛋白磷酸化——PHORCs/PhosTACs蛋白的磷酸化和去磷酸化是最重要的转译后修饰之一，因为它们与调节多重生物功能相关。2019年，募集磷酸酶的异双功能分子的研究首次发表，研究人员利用双功能分子，将PP1磷酸酶募集到AKT和EGFR附近并且导致靶点蛋白的去磷酸化。基于这一发现，PROTAC研究的先驱之一，耶鲁大学Craig M. Crews教授的课题组开发了名为磷酸化靶向嵌合体（PhosTACs）的分子。它们能够募集丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（PP2A），对PDCD4蛋白和FOXO3a蛋白进行去磷酸化。综述作者指出，PHORCs/PhosTACs是通过调节靶点蛋白磷酸化，精准改变其功能的有力工具。由于它不影响蛋白的表达水平，因此可能可以避免降解蛋白造成的潜在不良副作用。它还可以用于治疗由于靶点过度磷酸化导致的疾病。比如，阿尔茨海默病的标志性特征之一是超级磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结。目前的蛋白激酶抑制剂在抑制tau蛋白磷酸化方面并未表现出足够的特异性。PHORCs/PhosTACs技术可以提供靶向tau蛋白磷酸化的另一种机制。 ▲PHORCs/PhosTACs的作用机制（图片来源：参考资料[1]）靶向提高蛋白磷酸化——PHICS如前所述，蛋白激酶在调节底物磷酸化状态中也起到重要作用。很多细胞信号通路的激活依赖蛋白激酶的磷酸化功能。PHICS的作用机制与前面提到的PHORCs/PhosTACs相反，通过将内源性蛋白激酶招募到靶点附近，提高靶点蛋白的磷酸化。 ▲PHICS的作用机制和代表性化合物（图片来源：参考资料[1]）扩展乙酰化修饰调控的蛋白范围——AceTAGs赖氨酸的乙酰化是另一种非常常见的蛋白转译后修饰。它们出现在超过10000个人类蛋白位点上，与基因转录，DNA损伤修复、蛋白折叠和信号传导相关。比如对组蛋白的乙酰化修饰可以通过表观遗传学影响多种基因的表达。科学家们已经开发出调控蛋白乙酰化的异双功能分子。名为AceTAG的系统先用基因工程给靶标蛋白加上一个的“标签”，然后将靶向这个“标签”的配体与招募乙酰转移酶的分子连接起来，生成特异性添加乙酰基团的异双功能分子。这一系统可以弥补传统乙酰化调节剂的缺陷，并且扩展乙酰化调节的蛋白范围。 ▲AceTAGs的作用机制和代表性化合物（图片来源：参考资料[1]）异双功能分子不但可以作用于蛋白，还可以介导对RNA分子的靶向调节。靶向降解RNA——RIBOTACRIBOTAC分子的作用方式是将靶向RNA的配体与招募内源性RNase的基团连接在一起，从而将RNase拉近到特定RNA附近，激活RNase特异性切割靶标RNA。RIBOTAC提供了靶向不可成药蛋白的另一种策略。而且，它提供了靶向非编码RNA的机会，这些非编码RNA占转录组的70%，影响多种疾病的进展。与基于序列靶向RNA的RNAi疗法和反义寡核苷酸（ASO）疗法相比，RIBOTAC的小分子特性让它们可能具有更好的药理学特征。而且一个RIBOTAC分子可以重复使用，降解超过一个RNA分子，这增强了RIBOTAC的效力。 ▲RIBOTAC的作用机制（图片来源：参考资料[1]）总结和展望作者表示，受到PROTACs的启发，科学家们已经开发出越来越多的异双功能分子，能够招募E3泛素连接酶之外越来越多的效应子。这些新系统不但能够弥补PROTACs的不足，而且进一步扩展了异双功能分子的应用范围。目前，这些异双功能分子的开发是新药开发备受关注的领域之一。然而作者表示，这一领域也面临多重挑战。未来的研究需要进一步对作用机制进行深入了解，包括嵌合分子的靶标特异性研究和三元复合体（靶标/异双功能分子/效应子）形成的动力学分析。这些研究有助于避免脱靶效应，并且有助于设计更有效的分子。此外，开发高亲和力和选择性的配体有助于提高异双功能分子的活性。目前用于招募效应子的配体有限，有的配体不但亲和力不高，而且可能抑制效应子的活性。如何有效招募效应子又不抑制它们的活性是设计异双功能分子的一大关键挑战。最后，改良目前异双功能分子的成药特征是研究的一个重要方向。由于分子量较大，目前很多异双功能分子的PK特征，溶解性和细胞渗透性不高。未来，在优化现有分子特征的同时，作者预计科学家们将开发招募更多效应子类型的能力，进一步丰富对靶点的调节。简言之，异双功能分子丰富了理性药物设计的理念，可以具有针对性地选择靶标蛋白和招募匹配的效应子，达到预期的调节效果。这一策略有望为小分子药物开发带来革命性的变化。作为一项新兴技术，PROTAC极大拓宽了未来人类进行药物开发在靶点选择上的可能性。从2016年这一技术刚刚起步之时，药明康德就开始布局PROTAC相关能力和技术，并积累了大量成功经验。随着近年来对PROTAC了解的逐步深入，公司针对PROTAC分子已搭建了完善的一体化赋能平台，集发现、合成、分析纯化和测试等能力于一体，帮助更多合作伙伴找到更多优秀的PROTAC分子。如您有相关业务需求，欢迎点击下方图片填写具体信息。参考资料：[1] Hua et al., (2022). Beyond Proteolysis-Targeting Chimeric Molecules: Designing Heterobifunctional Molecules Based on Functional Effectors. Journal of Medicinal Chemistry, https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c00316免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新