ARNT

-01-引言缺氧诱导因子（HIFs）是高度保守并受氧气丰度调节的转录因子，对各种生物适应有限的氧气供应至关重要。在缺氧发生时，HIFs可以直接促进靶基因的转录，例如红细胞生成素（EPO）、血管内皮生长因子（VEGFs）或对细胞外腺苷的产生和信号传导至关重要的基因产物。HIF激活的作用包括红细胞生成刺激、缺氧期间的细胞代谢优化以及缺血和炎症期间的适应性反应。相比之下，HIF抑制可以用于治疗各种癌症、视网膜新生血管和肺动脉高压。在过去的十年里，人们已经开发出多种有效调节HIFs功能的药物，并在临床试验中进行了测试。这些药物在治疗癌症、心脏的缺血再灌注损伤、急性肾损伤、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、炎症性肠病、病原体感染、出血性休克和肾贫血等疾病方面展现出良好的应用前景。同时， HIF激活剂或抑制剂的广泛应用也面临着具体的挑战。-02-一、HIFs的分子结构和功能HIF途径的氧依赖性调节是细胞和系统适应低氧水平的核心。HIFs的紧密调节是由几种关键酶介导的，包括因子抑制HIF（FIH）、HIF PHDs和von Hippel–Lindau蛋白（pVHL）。HIFs的活性转录形式由一个α单元（HIFα）和一个β单元（HIF1β）组成。HIFα对调节HIFs的转录活性至关重要。目前，已鉴定出HIFα的三种亚型：HIF1α、HIF2α和HIF3α。所有三种异构体在N末端都含有一个碱性螺旋-环-螺旋和两个Per-Arnt-Sim结构域（bHLH-PAS），在C末端都含有氧依赖性降解结构域，而只有HIF1α和HIF2α含有反式激活结构域。在这三种异构体中，HIF1α被鉴定为与EPO启动子区结合的转录因子。HIF2α和HIF3α后来被发现是基于它们与HIF1α的序列同源性。人HIF1α和HIF2α的氨基酸同源性为53.4%，人HIF1α和HIF3α的氨基酸序列同源性为57.1%。有趣的是，三种HIFα亚型根据组织和细胞的特异性具有不同的功能作用。HIF1α在所有细胞类型中都表达，而HIF2α最初被认为仅在内皮细胞中表达，然而，最近的研究表明HIF2α具有在血管内皮细胞外的功能。HIF1α和HIF2α协同增强共享靶基因如EPO或VEGF的表达。然而，HIF1α和HIF2α可能具有相反的生物学功能。例如，HIF1α特异性调节诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因，而HIF2α控制精氨酸酶1的表达，从而对巨噬细胞极化或癌症转移的调节产生相反的作用。而HIF3α缺乏反式激活结构域，因此，它被认为是一种抑制元件。与HIF1α和HIF2α相比，HIF3α及其各种异构体和剪接变体的功能作用还有待进一步阐明。所有三个HIFα亚基都需要与其异二聚体伴侣HIF1β相互作用才能具有转录活性。HIF1β在N末端含有一个bHLH PAS结构域，用于DNA与HIFα的结合和二聚化。与对氧依赖性降解敏感的HIFα不同，HIF1β在所有哺乳动物细胞中结构性表达，与氧的可用性无关。-03- 二、HIFs的缺氧调节HIF1α或HIF2α的氧依赖性失活是一个由几个关键酶和分子通过羟基化和泛素化控制的多步骤过程。一旦HIFα与HIF1β二聚化，其随后转移到细胞核中以调节基因转录。HIFα和HIF1β上的bHLH PAS结构域对二聚化和DNA结合至关重要。同时，辅因子p300和CBP的募集对反式激活至关重要。进入细胞核后，HIFα–HIF1β–p300–CBP复合物与位于HIF靶基因启动子区的缺氧反应元件（HRE）结合，并激活转录。HIF的调节首先通过FIH——一种氧依赖性天冬酰胺羟化酶——通过在C-末端反式激活结构域（C-TAD）结构域内羟基化Asn803来抑制HIF系统，阻止共激活物、CBP和组蛋白乙酰转移酶p300的结合。HIF途径的中央调控与含有HIF脯氨酰羟化酶结构域的蛋白（HIF-PHDs）的酶活性有关。HIF-PHD有三种亚型：PHD1（也称为EGLN2）、PHD2（也称为EGLN1）和PHD3（也称为EGLN3）。PHD1和PHD2促进Pro402和Pro564在人HIF1α上的羟基化，而PHD3仅羟基化Pro564。羟基化过程高度依赖于氧和α-酮戊二酸作为底物和铁作为催化剂的可用性。羟基化后，HIFα与pVHL结合，并被延伸蛋白B、延伸蛋白C、cullin 2（CUL2）、环盒蛋白1（RBX1）和E3泛素连接酶形成的复合物泛素化，导致随后的蛋白酶体降解。-04-三、HIFs激动剂 目前，临床上开发的激动剂主要通过抑制HIF-PHDs来阻止脯氨酸羟基化和随后的蛋白酶体降解来激活HIF。有五种HIF PHD小分子抑制剂已进入III期临床，包括roxadustat（阿斯利康）、vadaustat（阿科比亚）、daprodustat（葛兰素史克）、molidustat（拜耳）和desidustat（Zydus）。自从发现靶向HIF PHDs的小分子HIF激活剂以来，临床焦点一直集中在肾性贫血上，这主要是由于HIF激动对EPO的大量调节。一些化合物显示出与红细胞生成刺激剂（ESA）相当的治疗效果。日本已经批准了五种HIF PHD抑制剂，此外，roxadustat还在其他国家或地区获得批准，包括欧盟、中国、韩国和智利。2023年2月2日，daprodustat在美国获得了FDA的批准，用于治疗接受透析的成年患者中与慢性肾脏疾病（CKD）相关的贫血。其他HIF PHD抑制剂，如vadadustat已在35个国家获得批准，包括日本、澳大利亚和许多欧洲国家。HIF PHD抑制剂的其他临床适应症，如ARDS，仍处于早期阶段。除了肾性贫血，ARDS是另一个临床适应症，正在进行使用HIF激活剂治疗的临床安全性和有效性试验。ARDS期间的HIF是一种内源性保护途径，可在药理学上进一步用于早期ARDS治疗或预防。在ARDS期间，HIF1α在肺泡上皮细胞中具有优化其碳水化合物代谢和细胞外腺苷信号的功能。HIF2α也有助于ARDS期间的肺部保护，例如，通过维持内皮细胞的屏障完整性。HIF-PHD抑制剂在大型III期临床试验中显示出良好的短期安全性记录，并且与严重的副作用无关。长期使用（3个月以上）HIF PHD抑制剂可能会产生不必要的副作用，包括慢性HIF激活引起的靶向效应和与HIF PHD抑制剂对单个羟化酶的特异性相关的脱靶效应。最重要的一点，由于HIF激活与癌症进展相关，尤其是肾透明细胞癌（ccRCC），长期HIF激活可能导致癌症的发展或进展。HIF PHD抑制剂的另一个潜在靶向副作用涉及过度的红细胞生成和血栓栓塞并发症，重大心血管不良事件（MACE）风险的增加也是与长期使用HIF-PHD抑制剂相关的一个潜在问题。-05-四、HIF抑制剂HIF在许多疾病中可能是有害的，例如某些癌症和肺动脉高压。因此，已经开发出抑制HIFs的药物，正在进行临床测试。早期的药物干预侧重于抑制HIF表达或促进HIF降解。最近的小分子抑制剂，如PT2977，抑制HIF2α和HIF1β转录活性异二聚体的形成。癌症HIFs通常在大多数人类癌症中观察到，特别是在实体瘤中。肿瘤内缺氧和炎症是HIF的主要机制，以及常见于VHL疾病相关癌症（如ccRCC）的基因突变。许多癌症激活途径可以导致HIF激活，包括TP53、PTEN、EGFR和HER2的体细胞突变或表观遗传学改变。癌细胞利用HIF途径通过各种机制驱动癌症进展，如促进血管形成、代谢重编程、免疫逃避、细胞存活以及治疗耐药性。HIF1α在实体瘤中高水平表达，且与预后不良有关。在癌症中HIF1α的治疗靶向已经取得了相当大的努力和进展。例如，PX-478已在癌症患者的I期剂量递增研究中进行了测试（NCT00522652），并显示出有效的HIF1α抑制和合理的安全性。ASO EZN-2968在难治性实体瘤患者中研究HIF1A RNAi的早期努力由于赞助者的兴趣丧失而提前终止。然而，EZN-2968/RO7070179最近在晚期HCC患者中进行了研究；总体而言，EZN-2968/RO7070179在癌症患者中具有良好的耐受性。肺动脉高压肺动脉高压是指平均肺动脉压高于20 mmHg，其特征是由内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞的异常增殖、细胞外基质沉积和炎症细胞的募集引起的肺血管阻力增加。在肺动脉高压期间，HIF1α通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B减少内皮集落形成细胞的增殖，并通过驱动miR-9-1、miR-9-3和miR-322的表达促进肺动脉平滑肌细胞增殖。HIF1α还诱导肺动脉平滑肌细胞中CD146的表达，从而导致血管重塑。小分子HIF2α抑制剂，如belzutifan，可减轻VhlR200W小鼠的肺动脉高压，这些小鼠在Vhl中具有功能缺失突变。然而，HIF抑制剂尚未进入临床试验，以评估其治疗人类肺动脉高压的疗效。视网膜新生血管视网膜新生血管是许多视网膜疾病的发病机制，包括糖尿病视网膜病变和视网膜静脉阻塞。在眼部新生血管形成过程中，新生成的血管缺乏紧密连接，导致血浆渗漏、玻璃体出血和牵引性视网膜脱离，导致严重的视网膜功能障碍和视力丧失。临床前研究以及对缺血性视网膜疾病患者的研究表明，HIF1α和HIF2α在视网膜新生血管形成过程中发挥重要作用。HIF抑制剂地高辛抑制视网膜中的HIF1α和HIF2α，并且在视网膜病小鼠模型中使用减少了视网膜新生血管。此外，在氧诱导的缺血性视网膜病变中，HIF抑制剂阿哌拉韦的治疗减少了小鼠的视网膜新生血管并改善了视力。此外，眼内注射HIF抑制剂32-134D改善了糖尿病眼病小鼠模型中的视网膜新生血管形成。总之，这些研究证明了HIF1α和HIF2α的药理学抑制在各种类型视网膜病变的视网膜新生血管形成中的潜在有益作用，未来有必要进行这方面的临床研究。-06-结语从20世纪90年代初首次发现HIF到最近FDA批准HIF激活剂和HIF抑制剂用于治疗人类疾病，这是一段非凡的旅程。这一成功源于对HIF调节途径的广泛研究，对HIF和PHD功能作用机制的深入理解。未来还需要很多努力来确定如何将这些药物最佳地用于其他疾病条件或其他潜在的药理学策略，以实现更特异的靶向。参考资料：1.Targeting hypoxia-inducible factors: therapeutic opportunities and challenges. Nat Rev Drug Discov.2023 Dec 20.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

-01-引言1976年，美国科学家Poland与Glover在研究剧毒污染物二噁英（TCDD）时，意外发现了一种能与毒素特异性结合的蛋白——芳香烃受体（AHR）。自此近50年间，AHR因介导环境毒素的致癌、致畸作用而被视为"危险分子"，药物研发领域对其避之不及。 然而，近年研究揭示了AHR的另一面：它不仅参与免疫调控，更是连接肠道菌群代谢、膳食营养与疾病机制的核心枢纽。2016年，首个AHR激活剂Tapinarof获批治疗银屑病，标志着这一靶点从"毒理噩梦"正式逆袭为"免疫治疗新星"。-02-一、AHR的结构AHR是含bHLH-PAS结构域的配体依赖性转录因子。AHR在氨基末端包含一个bHLH结构域，这对DNA结合至关重要，其次是两个PAS结构域，PAS-a和PAS-B，以及羧基末端的一个转录激活结构域（TAD）。bHLH结构域介导AHR与特定DNA基序的结合，以控制靶基因的转录活性；它还促进了与ARNT的二聚化。PAS-A参与AHR-ARNT异二聚体的稳定。PAS-B含有一个配体结合口袋，激动剂通过诱导构象变化来结合和激活AHR，从而暴露核定位信号，促进AHR易位到核中。一旦与DNA结合，AHR的C末端TAD就会与转录调节因子和辅激活因子相互作用，激活靶基因的表达。PAS-A和PAS-B结构域之间的铰链区是灵活的，在配体诱导的构象变化中起着至关重要的作用。-03- 二、AHR的配体和信号通路AHR激动剂包括多种外源性和内源性分子。外源配体主要由二恶英等环境污染物组成，二恶英通常是工业过程和燃烧的产物。内源性配体包括几种代谢副产物和天然化合物，如色氨酸衍生物和微生物代谢物。在激动剂结合后，AHR信号机制可分为经典和非经典信号途径。重要的是，AHR信号模式的多样性使细胞能够对各种刺激做出反应，从而促进对细胞环境的适应。典型的AHR信号通路是由激动剂与细胞质中的AHR-伴侣复合物结合启动的。这种相互作用诱导AHR的构象变化，导致AIP从AHR复合物中解离，并暴露出N端核定位信号。AHR激动剂复合物随后与转运蛋白和输入蛋白-β相互作用，后者介导其核输入。一旦进入细胞核，AHR激动剂复合物就会与ARNT异二聚体化。这种异二聚是AHR转录活性的关键步骤，涉及AHR和ARNT的构象变化。AHR–ARNT复合物与特定的DNA序列结合，这些DNA序列包含一个共有的5′-TNGCGG-3′序列，其中AHR与5′-TGCG相互作用，ARNT与序列的GTG-3′半位点相互作用。在多种AHR靶基因中，有异生物质代谢酶，细胞因子IL-10和IL-21以及参与细胞代谢的酶。非典型AHR信号转导涉及核和/或细胞质途径。在核机制中，AHR激动剂复合物与其他转录因子相互作用并调节其活性。例如，AHR通过直接相互作用和间接机制控制核因子-κB（NF-κB）的活性。此外，AHR促进Krüppel样因子4（KLF4）和KLF6驱动的转录程序的表达，而抑制信号转导子和转录激活子（STAT）信号。-04-三、AHR信号的免疫调控作用AHR通过多层次的调控网络（代谢、转录、表观）平衡免疫激活与抑制，其在维持屏障稳态、调控适应性/固有免疫细胞分化及应答中具有重要作用。AHR在免疫系统中的免疫调节作用机制可归纳为以下方面：一、免疫稳态的维持AHR通过调控树突状细胞（DCs）功能，维持肠道上皮细胞的完整性。AHR激活的DCs通过诱导IL-10和IL-22的表达，促进调节性T细胞（Treg）分化，抑制促炎性T细胞（TH17），从而减轻结肠炎等炎症反应。此外，肠道共生菌代谢色氨酸（Trp）生成AHR配体（如吲哚类化合物），AHR激活后增强肠道抗菌肽表达，维持微生物群稳态。二、免疫细胞分化的调控树突状细胞（DCs）：AHR激活的DCs下调MHC II类分子和共刺激分子（CD80/CD86），减少促炎因子（IL-6、IL-12、TNF），并诱导吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO1/IDO2）生成色氨酸代谢产物，促进Treg分化。 AHR激动剂（如TCDD）诱导DCs分泌TGF-β和IL-27，增强Tr1细胞生成，Tr1细胞是不表达转录因子Foxp3但产生高水平IL-10的调节性T细胞，从而抑制TH17细胞介导的自身免疫反应。T淋巴细胞：AHR信号通过配体特异性（如TCDD与FICZ）调控T细胞分化。例如： TGF-β联合TCDD诱导Foxp3+ Treg分化，抑制自身免疫；FICZ激活AHR驱动TH17分化，加重实验性自身脑脊髓炎（EAE）等疾病。此外，AHR通过色氨酸代谢生成犬尿氨酸（Kyn），抑制STAT1磷酸化，促进SMAD1介导的免疫抑制。先天性淋巴细胞（ILCs）：AHR对肠道ILC3的存活与功能至关重要，通过诱导IL-7R、Bcl-2和Notch表达，促进IL-22分泌，抵抗病原体（如Citrobacter rodentium）。AHR协同RORγt调控ILC3在感染中的抗菌反应。-05-四、靶向AHR的药物开发自身免疫疾病Tapinarof是一种天然鉴定的具有AHR激动剂活性的二苯乙烯化合物，由Dermavant Sciences开发，并于2022年获得FDA批准，用于治疗成人斑块状银屑病。临床前研究证实，tapinarof是一种直接与AHR-ARNT异二聚体结合的AHR激动剂。它诱导角质形成细胞中CYP1A1和皮肤屏障成分角蛋白、聚丝蛋白、外皮蛋白的表达，以及表皮屏障的神经酰胺脂质成分的表达，并抑制T细胞中促炎细胞因子的表达，包括IL-17A和IL-17F。在治疗成人斑块状银屑病的III期试验中，与赋形剂对照组相比，tapinarof局部用药显示出临床意义和统计学上的显著优势。此外，还观察到持续使用的持久效果和缓解效果。在一项长期扩展研究（PSOARING 3）中，41%接受tapinarof治疗的患者实现了疾病的完全清除，并且在停药后能够维持疾病控制，中位时间为4个月。tapinarof抑制了记忆T细胞在体外的产生、活性和持久性，这些效应可能有助于临床研究中观察到的缓解。DMVT-506是一种与tapinarof具有相似药理学特征的AHR激动剂，Dermavant Sciences正在开发用于其他炎症性疾病的药物。除了局部制剂外，DMVT-506还被开发为IBD的口服缓释剂型，以及哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的干粉吸入剂。Azora Therapeutics正在开发天然AHR激动剂靛玉红的局部和口服制剂，用于治疗过敏性皮炎，Galileo Biosystems正在开发治疗性AHR调节剂，用于治疗炎症和自身免疫性疾病。礼来公司最近为AHR激动剂颁发了两项专利，表明其对炎症领域的积极兴趣。癌症此外，AHR拮抗剂正在癌症患者中进行临床评估。BAY2416964是一种旨在抑制AHR的小分子，其目的是增强对癌症的免疫反应。一项I期临床试验正在确定BAY 2416964在晚期癌症患者中的最高耐受剂量（NCT04069026）。此外，BAY2416964与抗PD-1免疫检查点抑制剂pembrolizumab联合用药治疗晚期实体癌患者，如头颈部癌症、肺癌和癌症（NCT04999202）。同样，另一种名为IK-175（Ikena Oncology）的AHR拮抗剂正在早期试验中作为单一药物和与抗PD-1抗体nivolumab联合使用，用于晚期或转移性实体瘤患者，包括尿路上皮癌（NCT04200963）。其它除了以上的临床试验外，还有20项其他临床试验已经完成或正在进行中，以研究使用内源性和膳食配体以及合成小分子调节AHR的临床效果。在内源性配体中，补充l-色氨酸（一种代谢为AHR激动剂的氨基酸）正在评估对无麸质饮食无反应的活检确诊乳糜泻患者的疗效（NCT05576038）。另一项研究评估了内源性AHR激动剂（如Kyn）在识别与阻塞性睡眠呼吸暂停相关的高血压患者方面的鉴别潜力（NCT04646902）。菊粉是一种来自植物的膳食纤维，通过直接与AHR相互作用或增强AHR与XREs的结合来诱导CYP1A的表达。菊粉对慢性肾病患者肠道微生物组、肠道屏障功能、细菌代谢产物和免疫细胞的影响正在研究中（NCT05071131）。临床前和早期临床研究结果都支持这些化合物的治疗潜力，但在对其临床疗效得出明确结论之前，还需要进一步的临床研究。-06-结语AHR的逆袭史，验证了基础研究颠覆性突破的威力——通过解码生物学本质，曾经的"危险分子"也能蜕变为治疗利器。随着首个AHR药物落地，我们正站在免疫代谢治疗的新起点。未来，期待更多跨界创新将AHR的调控潜力转化为普惠疗法，为自身免疫病、肿瘤、感染性疾病患者带来新曙光。参考资料：1.The aryl hydrocarbon receptor: a rehabilitated target for therapeutic immune modulation. Nat Rev Drug Discov.2025 Apr 17.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

缺氧诱导因子 2α (HIF-2α, hypoxia-inducible factor 2α) 是透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 的关键致癌驱动因素。默沙东的第一代 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在 ccRCC 患者中表现出良好的临床活性。然而，PT2385 受到可变且剂量有限的药代动力学的限制。本文描述了第二代 HIF-2α 抑制剂 PT2977 的发现，该抑制剂通过氟取代实现了药效增强、及减少 2 相代谢促进药代动力学特征的改善。对于小分子药物的PK优化具有显著参考意义，同样强调了临床候选分子多动物模型PK研究的重要性。PT2977（Belzutifan）已于2021年获批上市治疗透明细胞肾细胞癌，2025-02-18 批准上市用于治疗VHL综合征相关肿瘤。 肾癌是最常见的 10 种癌症之一。透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌形式。尽管靶向疗法和免疫疗法已大大改善了 ccRCC 患者的预后，晚期或转移性疾病患者 5 年存活率只有 12%。对于患有转移性疾病的 ccRCC 患者，迫切需要更好的治疗方案。 在大多数患者中，ccRCC 的特征是由于遗传易感性、体细胞突变或甲基化导致肿瘤抑制因子 von Hippel–Lindau (VHL) 失活。VHL 蛋白 (pVHL) 是 E3 泛素连接酶复合物的组成部分，可介导蛋白酶体的蛋白质降解。pVHL 的主要作用是调节缺氧诱导因子 (HIF) 转录因子家族，包括 HIF-1α、HIF-2α 和较少表征的 HIF-3α。与 HIF-1α 不同，在成人中，HIF-2α 的表达仅限于内皮细胞、肾成纤维细胞、肝细胞、肠腔上皮细胞、胰腺间质细胞、心肌细胞、间质细胞和肺 II 型肺泡细胞。重要的是，HIF-2α 活性已被证实是 ccRCC 中的关键致癌驱动因素。在小鼠 ccRCC 肿瘤模型中，pVHL 缺陷细胞系中 HIF-2α 表达的抑制可抑制肿瘤生长，效果与重新引入 pVHL 相当。此外，稳定变体 HIF-2α 的表达能够克服 pVHL 的肿瘤抑制作用。HIF-2α 还被证实有助于其他恶性肿瘤（如多形性胶质母细胞瘤）的肿瘤形成，其中缺氧是肿瘤微环境的一个关键特征，并且已观察到 HIF-2α 活性与生存率之间的相关性。 HIF-2α 的活性受氧依赖性缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶 (PHD) 控制。 当氧气供应充足（常氧）时，这些酶会使 HIF-2α 氧依赖结构域上的特定脯氨酰残基羟基化，从而为 pVHL 产生底物识别位点。pVHL 识别修饰形式的 HIF-2α，与其结合，并将其作为靶标进行快速蛋白酶体降解。在缺氧条件下，PHD 没有足够的氧气来催化 HIF-2α 的羟基化，并且 pVHL 无法结合未修饰的 HIF-2α。因此，HIF-2α 会积聚并转移到细胞核中，在那里它与组成性表达的芳烃受体核转运蛋白 (ARNT，也称为 HIF-1β) 二聚化，形成活性转录因子复合物。该复合物可识别 DNA 上的缺氧反应元件 (HRE)，从而增加多种蛋白质的表达，其中许多蛋白质协同调节血管生成、增殖、迁移和免疫逃避。在 ccRCC 中，绝大多数患者的 pVHL 存在缺陷或缺失，这导致 HIF-2α 即使在常氧条件下也会积累和转录激活。 尽管靶向 DNA 结合转录因子存在固有困难，但开创性的研究表明，与 HIF-2α 内袋结合的小分子可以变构抑制 HIF-2α 和 ARNT 之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用，从而抑制转录活性。在之前的报告中，我们披露了我们在迭代基于结构的药物设计和合理修改的指导下所做的努力，以确定一系列具有优异效力和物理和药理特性的新型 HIF-2α 抑制剂。这项工作导致了第一代 HIF-2α抑制剂化合物 1 （PT2385）的发现（图 1），这是第一个进入临床开发的 HIF-2α 抑制剂。虽然 PT2385 与高度可变的药物暴露相关，但在接受过大量治疗的晚期 ccRCC 患者中观察到抗肿瘤活性，提供了 HIF-2α 靶点验证。本文通过优化效力和 DMPK 特性导致了从 PT2385 到第二代临床候选化合物 2 （PT2977）的发现。 图 1.　化合物 1 和 2 的结构。 2. 第一代HIF-2α抑制剂PT2385： 人体临床暴露/药效不足 此前，评估 PT2385 安全性、药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 的首次人体研究在晚期 ccRCC 患者中完成。PT2385 以 100-1800 毫克的剂量口服(bid)，按照标准 3 + 3 剂量递增设计，随后以推荐的 2 期剂量 (RP2D，800 mg bid ) 进行扩展阶段。PT2385 耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性。PT2385 治疗导致血浆促红细胞生成素 (EPO)（一种 HIF-2α 调节基因）在所有剂量下迅速下降，表明靶标参与的生物活性。PT2385 在这些接受过大量治疗的患者中表现出良好的抗肿瘤活性。与 PT2385 水平低于 500 ng/mL（1.4 个月）的患者相比，PT2385 谷浓度高于 500 ng/mL 的患者的 PFS（14.3 个月）有所改善（图 2）。PT2385 血浆浓度 500 ng/mL 相当于 786-O 细胞（VHL 突变 ccRCC 细胞）中VEGFA分泌试验中的 EC85。 在 786-O 小鼠异种移植模型中，PT2385 谷血浆浓度也需要达到 500 ng/mL 才能达到最大抗肿瘤活性。 图 2.　稳态暴露谷浓度为 <500 ng/mL（红线）的患者与谷浓度为 >500 ng/mL（黑线）的患者无进展生存期 (PFS) 曲线比较。 3. PT2385 的人体 PK 分析 对患者体内 PT2385 药代动力学曲线的评估表明，相当一部分患者暴露不足。所有 25 名接受单剂量 800 mg PT2385 (RP2D) 的患者的个体时间-血浆浓度曲线表明，患者可分为“正常暴露”组和“低暴露”组（ 图 3）。有 6 名患者属于“低暴露”组，他们从 PT2385 治疗中获得的临床益处很少。 图 3.　接受 800 mg PT2385 治疗患者的浓度-时间曲线。红线代表血浆中 PT2385 浓度较低的患者。 预计 PT2385 在人体中的肝清除率将处于低到中等水平，在人肝微粒体 (HLM) 中的提取率 (ER 或观察到的清除率/肝血流量) 为 22%，在人肝细胞中为 44%。在人肝细胞孵育中，HPLC-UV 色谱图唯一可检测到的代谢物是葡萄糖醛酸 PT2639 ( 图 4A)，这表明 PT2385 在人体中的主要代谢途径可能是葡萄糖醛酸化。在临床前研究中，PT2639 不与 HIF-2α 结合，在闪烁近距离分析 (SPA) 中 IC50 大于 100 μM。在 1 期临床试验中，单次口服 800 mg PT2385 后 ，PT2639 的浓度明显高于 PT2385（图 4B）。平均 AUC 和 C max 的代谢物/母体比分别为 6.9 和 9.7。根据临床前数据，患者体内 PT2639 的高浓度有些令人惊讶。虽然犬体内的 PT2639 循环水平很高（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 1.8），但小鼠体内并不存在，且大鼠体内的 PT2639 浓度明显低于 PT2385（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 0.24）。 图 4.　(A) 葡萄糖醛酸代谢物 3 (PT2639) 的结构。(B) 单次口服 800 mg PT2385 后 PT2385 和 PT2639 的平均血浆浓度。 在 I 期剂量递增研究中，PT2385 的 AUC 随着剂量从 100 mg 增加至 800 mg，通常与剂量成比例增加，而当剂量递增至 1800 mg 时并未进一步增加（ 图 5 A）。与母体药物不同，其代谢物 PT2639 在较高剂量下暴露量增加超过比例（ 图 5 B）。对于口服药物，水溶性是一个重要参数，可能导致生物利用度不足和变化。PT2385 是 BCS 2 类化合物，在 pH 7.4（15 μg/mL）时具有中等热力学水溶性，并且具有高渗透性。在临床前物种中，PT2385 在小鼠、大鼠和狗中表现出良好的口服生物利用度。这表明PT2385 大量地代谢为 PT2639 可能是导致其药代动力学特征不佳的主要因素。 图 5.　(A) 剂量-反应图显示 PT2385 的剂量限制性暴露。 (B) 剂量-反应图显示 PT2639 的超比例暴露。 4. PT2385 临床中药代问题的机制？ 为了确定哪种人类尿苷 5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 负责直接葡萄糖醛酸化 PT2385，将 11 种重组表达的 UGT 与 50 μM PT2385 一起孵育，并监测 PT2639 的形成 ( 图 6)。结果表明 PT2385 是 UGT2B17 的底物。UGT2B17 主要在人体肠道中表达，其在肠道中的含量远高于肝脏。UGT2B17 在肠道中的 mRNA 表达量比在肝脏中高出约 13 倍， 肠道中的蛋白质丰度比肝脏中高 4.4 倍。在所有 UGT 中，2B17 异构体在肠道中的表达最高。它占肠道中 UGT 异构体总量的 59%，但在肝脏中仅占 3%。基因多态性、肠道中高丰度都导致了口服 UGT2B17 代谢药物的暴露量不同，这可能是首过代谢的结果。 图 6.　重组人 UGT 催化形成 PT2639。 此外，评估了导致患者观察到的 PT2385 剂量限制性药物暴露的其他潜在机制。在小肠中，外排转运蛋白在葡萄糖醛酸代谢物的处置中起着重要作用。P-gp、BCRP 和 MRP2 是小肠中表达的三种主要外排转运蛋白。浓度高达 300 μM 时，PT2385 和 PT2639 在 MDCKII-MDR1 和 MDCKII-BCRP 细胞中的外排比小于 2，这表明它们不是 P-gp 或 BCRP 的底物。在表达人类 MRP2 蛋白的膜囊泡中的 MRP2 转运蛋白测定中，还评估了 PT2385 和 PT2639。未观察到 PT2385 的 MRP2 依赖性摄取。然而，与不含 ATP 的囊泡相比，含有 ATP 的囊泡对 PT2639 的 MRP2 摄取量大约高 32 倍，表明存在主动运输。随着 PT2639 浓度的增加，表达 MRP2 的囊泡对 PT2639 的摄取量达到稳定水平，表明主动运输已达到饱和。MRP2 抑制剂苯溴马隆可消除 ATP 依赖性活性。因此, PT2639 是 MRP2 的底物，并且在较高浓度下 PT2639 可以使 MRP2 饱和。 最终, 提出了一个吸收模型来解释 PT2385 的肠道代谢（ 图 7 ）。口服后，PT2385 通过被动跨细胞扩散被肠细胞吸收。一小部分 PT2385 作为母体运输到血液中，而其余药物则被 UGT2B17 大量代谢形成 PT2639。然后 PT2639 可以遵循两种途径之一：吸收进入血液或主动 MRP2 介导运输到肠腔。一旦进入胃肠道，PT2639 就可以在细菌 β-葡萄糖醛酸酶的作用下转化为 PT2385，后者可以进行肠道重吸收，从而形成再循环。 PT2639 在犬中的 PK数据支持该模型, 给犬静脉 (iv) 和口服管饲 (po) 给药 PT2639 后，两种途径均产生了显著水平的 PT2385，并且口服给药比静脉给药产生的 PT2385 更多。 图 7.　PT2385 吸收模型。 其中, UGT2B17、MRP2 和 β-葡萄糖醛酸酶单独发挥作用和协同作用。这三个成分的遗传多态性和不规则表达可能都在观察到的 PT2385 可变暴露中发挥作用。 5. 化合物设计和先导物优化 尽管模型很复杂，但 PT2385 的药代动力学问题可能都与肠道中 UGT2B17 将 PT2385 大量代谢为 PT2639 有关。因此，主要策略是减少葡萄糖醛酸代谢物的形成，同时保留 PT2385 的效力、选择性和药理学特性。 葡萄糖醛酸化是人体药物代谢的重要途径。葡萄糖醛酸化通常是药物代谢的第二步，作用于氧化代谢产生的羟基化产物。然而，它也可以直接与含有羟基、羧酸、氨基或硫醇官能团的药物发生反应。葡萄糖醛酸化是一种由 UGT 酶催化的 SN2 反应，其中代谢药物或母体药物充当亲核试剂，PT2385 作为二级醇，辅因子 UDP-α-D- 葡萄糖醛酸 (UDPGA, 4 ) 充当亲电试剂（ 图 8）。 图 8.　PT2385 的葡萄糖醛酸化反应。 如图 9 所示，PT2385 的蛋白质抑制剂晶体结构揭示了两种关键的蛋白质-配体相互作用。PT2385 中的羟基与 Tyr281（结合水分子）和 His293 形成氢键网络。HIF-2α 中的三个残基，Met252、His293 和 Tyr278 必须移动以适应这种氢键网络的形成。这些移动导致 HIF-2α 中的 Tyr278 与 ARNT 中的 Phe446 之间发生极为不利的空间冲突，从而导致 HIF-2α：ARNT 二聚体破坏并抑制 HIF-2α 转录活性。PT2385 中的吸电子甲基砜基团通过降低苯环的电子密度来增强结合亲和力。 图9. PT2385（橙色）与 HIF-2α PAS-B*/ARNT PAS-B* 二聚体（pdb: 5TBM）的复合结构。Tyr281 和 His293 突出显示（洋红色）。虚线表示氢键相互作用，红色球体表示水分子。 由于羟基对二聚体破坏、细胞效力和物理特性的重要性，作者对第二代 HIF-2α 抑制剂的设计策略是保留羟基，但显著降低其在葡萄糖醛酸化中的反应性，从而提高药代动力学性能。与未取代的类似物相比，茚满醇系列中的孪生二氟基团可使细胞效力提高 10 到 20 倍。推测顺式氟原子参与分子内 C–F···H–O 静电相互作用，从而降低配体结合所需的脱溶惩罚。然而，高电负性的氟原子通过强诱导作用，也可能增加羟基部分在葡萄糖醛酸化反应中的反应性。最终，对核心茚满醇（Indanols）的一系列取代发现了化合物2 PT2639 和化合物13 活性显著提高（表 １）。 表 1. 核心茚满醇（Indanols）取代的 SAR 为了探索氟对葡萄糖醛酸化速率的影响，在 HIM 和UGT2B17 Supersomes™ (重组代谢酶系统) 中评估了化合物 1、2、6-9 和 13 的稳定性。酶动力学参数 V max 和 K m 总结在 表 2 中。对于 PT2385，在 HIM 和重组 UGT2B17 中 Vmax 值分别为 49 和 280 (pmol/min)/mg 蛋白质， K m 值分别为 20 和 11 μM。化合物 13 具有最高的葡萄糖醛酸化率(最高 V max 值和最低 K m 值)。葡萄糖醛酸化率第三高的化合物是化合物 8。 在化合物 2 和 7 中，仅保留了高效力，和低反应性的顺式氟原子。化合物 2 和 7 产生葡萄糖醛酸代谢物的速度至少慢 20 倍。预计这两种化合物将提供更好的口服暴露量，并且对人类的影响更小。 此外，化合物 2 中的顺式苄基氟进一步增强了药效。 图 10.  葡萄糖醛酸形成底物浓度与速率图：(A) 在人肠微粒体 HIM 中孵育；(B) 在 UGT2B17 Supersomes 中孵育。 表 2. 代表性化合物的酶动力学参数 6. PT2977 的体外药效和ADMET表征 在 HIF-2α 荧光素酶测定和 VEGFA 分泌测定中，PT2977 的效力强 2 至 3 倍（ 表 3 ）。PT2977 的 log D 7.4 比 PT2385 低约 1 个对数单位。通常，用氟取代氢会略微增加亲脂性。然而，文献中已报道的例子表明氟化会降低分子亲脂性。PT2977 极性的增加可能是由于靠近醇的氟原子与两个具有顺式构型的邻位电负性氟原子产生的高分子偶极子相结合所致。 亲脂性降低意味着血浆蛋白结合率显著降低。在人血浆蛋白结合试验中，PT2977 的结合率比 PT2385 低约 30%（52% VS. 82%）。通过结合游离分数和细胞效力的改善，计算出 VEGFA 分泌试验中 PT2977 的游离分数调整 EC85 为 75 ng/mL。PT2977 在各种物种的微粒体和肝细胞中都是一种低清除率化合物，并且它在浓度高达 50 μM 时不会抑制 CYP P450 酶。 表 3. 抑制剂 PT2385 和 PT2977 的体外概况 7. PT2977 在临床前物模型的 PK 表 4 总结了静脉注射后 PT2977 的药代动力学特性。PT2977 在小鼠、狗和猴子中的血浆清除率 (Clp) 较低，在大鼠中的清除率中等。体内形成葡萄糖醛酸代谢物的可能性较低。 表 4. PT2977 在临床前物种中静脉给药后的 PK 参数 小鼠、大鼠、狗和猴子口服 PT2977 可获得良好的血浆暴露量。 图 11 比较了 PT2977 和 PT2385 的平均血浆浓度-时间曲线， 表 5 总结了母体和葡萄糖醛酸代谢物的药物暴露量 (AUC)。有趣的是，在啮齿动物中，PT2977 的口服暴露量仅略高于 PT2385，而这两种化合物在高等物种中的表现却截然不同。 PT2977 葡萄糖醛酸代谢物 (PT3317) 在狗体内的 AUC 约为母体的 30%，而 PT2639 (PT2385 葡萄糖醛酸代谢物) 的 AUC 几乎比母体高 2 倍。对于 PT2385，狗药代动力学可以更好地预测人类体内葡萄糖醛酸代谢物 PT2639 的形成。因此，PT2977 在人体内的葡萄糖醛酸化倾向会降低，药代动力学特征有显著改善。 图 11. 单次口服剂量后小鼠、大鼠、狗和猴子体内 PT2385 和 PT2977 的平均血浆浓度随时间的变化。 表 5. PT2385 与 PT2977 口服 PK 比较 8. PK/PD 关系和体内疗效 在皮下ccRCC 肿瘤的小鼠中进行了药代动力学/药效学 (PK/PD) 研究。口服 6 剂 PT2977（0.3、1 和 3 mg/kg）或 PT2385（10 mg/kg），每日两次。PT2977 有效且剂量依赖性地降低人类细胞周期蛋白 D1（受 HIF-2α 调控的靶基因）的 mRNA 水平（ 图 12A）。PT2977 在 1 mg/kg 时达到最大 PD 反应，而 PT2385 则需要更高的剂量 10 mg/kg。并且为了达到相同的 PD 效果，PT2977 的稳态谷血浆药物浓度约为 PT2385 浓度的 1/10（ 图 12B）。化合物 PT2977 在体内的效力比 PT2385 高约 10 倍。以 0.3、1 和 3 mg/kg 的剂量 PT2977 均导致肿瘤快速消退（ 图 12C），证实化合物 PT2977 的体内活性优于 PT2385。因此，PT2977 被选为第二代 HIF-2α 临床候选药物。 图 12. (A) PT2977 和 PT2385 在体内的 PK/PD 评估。 9. PT2977 的 1 期临床数据 在 1 期剂量递增试验中，晚期实体瘤患者接受 PT2977 治疗，剂量范围为 20 至 240 mg，每天一次，共 15 天（图 13）。PT2977 的暴露量随剂量增加而增加，直至剂量达到 120 mg（表 6）。高于 120 mg 的剂量并未显著增加暴露量。20 mg 剂量时达到目标稳态谷浓度 75 ng/mL，40 mg 及以上剂量时超过该浓度。 图 13. 实体肿瘤患者的平均血浆浓度-时间响应变化。虚线表示 786-O 细胞 VEGFA 分泌试验中 PT2977 的游离部分调整 EC85 为 75 ng/mL。 表 6. 每日口服一次 PT2977 的 PK 参数 如图 14A 所示，PT2977 治疗导致 EPO 表达快速且剂量依赖性降低。PT2977 120 mg qd 的 EPO 减少与 PT2385 高暴露患者的减少水平相当（ 图 14 B）。PT2977 耐受性良好，贫血是与药理作用一致的最常见不良事件。第 1 期剂量递增研究中未达到最大耐受剂量 (MTD)。根据 PK、PD 和安全性数据，RP2D 确定为 120 mg qd。 图 14. (A) 通过 HIF-2α 靶标促红细胞生成素 (EPO) 的降低来评估药效学反应。 (B) 高暴露 PT2385 患者的 EPO 降低。 图 15A 显示 PT2977 和葡萄糖醛酸代谢物 (PT3317) 的平均稳态血浆浓度随时间的变化。第 15 天，120 mg qd 剂量的 PT2977 的谷浓度 (24 小时) 为 500 ng/mL（代谢物/母体比为 0.32）。对于 PT2385，需要 13 倍的总日剂量才能在 12 小时时达到 860 ng/mL 的谷浓度（代谢物/母体比为6.0) 远高于 PT2977 ( 图 15B)。除了效力和游离分数更高之外，PT2977 暴露更一致，没有暴露不足的患者( 图 16)。 图 15.  PT2977（PT2385）和葡萄糖醛酸代谢物 PT3317（PT2639） 的平均血浆浓度随时间的变化。 图 16. 每天120 mg PT2977 或每天800 mg PT2385 的患者的 AUC。 10. 讨论 本文研究了首创 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在患者中的个体间 PK 变异性和低暴露量的潜在原因。根据循环代谢物鉴定和 UGT 表型分析，确定降低葡萄糖醛酸化速率将改善暴露量并降低患者中的变异性。 通过将 PT2385 中的一氟原子取代，可增强药效、显著降低亲脂性并大幅降低葡萄糖醛酸化。HIM 和 UGT 超体中的酶动力学研究揭示了氟取代和立体化学对葡萄糖醛酸化速率的影响。近年来，氟在现代药物化学和药物开发中的应用迅速扩展。 如2018 年 FDA 批准的 40% 以上的新化学实体 (NCE) 含有一个或多个氟原子。 该案例研究，强调了氟替代模式对内在效力、代谢物稳定性和药代动力学特性的重大影响。 参考:10.1021/acs.jmedchem.9b0071９ 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓