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慢病毒制备的CART好？还是质粒转座子制备的CART效果好？从成本上看，肯定是质粒直接电转T更节省。表型或者效果呢？ 最近发表在预印本上一篇文章详细研究了两种制造CAR T细胞的方法对细胞功能的影响。比较了慢病毒转染(LV)和睡美人转座子(SB)两种技术，针对CD19和IGLV3-21R110两种靶点，评估了T细胞的激活和共抑制标志物表达。结果表明，SB技术可能通过激活细胞内的核酸感应通路，导致T细胞出现类似衰竭的表型。 通过LV慢病毒转导或SB转座子将CAR基因导入T细胞。LV转导的T细胞使用CD3/CD28 Dynabeads激活，加入慢病毒，并在含有IL-15的培养基中培养。SB转座的T细胞同样的条件激活，然后通过MaxCyte GT电穿孔系统将SB转座酶mRNA和GenCircle CAR质粒构建体导入T细胞。 CAR T细胞的工程化和扩增：使用SB转座方法时，慢性淋巴细胞白血病（CLL）来源的T细胞中，CAR的表达率相对较低，不如健康的供者高。无论使用SB还是LV方法，R110-CAR的表达量均低于CD19-CAR 。CAR密度（通过scFv的平均荧光强度（MFI）估算）在SB和LV制造的CAR T细胞之间没有显著差异。尽管SB转座方法因电穿孔程序而导致细胞损伤，但T细胞扩增和细胞活力在第一周内恢复 。 CD4/CD8比例和T细胞分化：LV转导生产的CAR T细胞主要以CD4+ T细胞为主，而SB转座生产的CAR T细胞则更多地向CD8+ T细胞转变 ，尤其抗R110 CAR T细胞的CD8+ T细胞转变更为明显 。SB转座生产的CAR T细胞主要表现出幼稚样T细胞表型（CD45RA+, CCR7+），而LV转导生产的CAR T则显示出包括终末分化细胞在内的不同CD4+ T细胞分化阶段 。 强直CAR信号和共抑制：在没有靶细胞或抗原的情况下，SB转座生产的CD4+ scFv+ T细胞与LV转导生产的CAR T细胞相比，早期激活标志物CD69的表达有所增加，表明存在强直CAR信号 。SB转座生产的T细胞表达更多的TIM-3和LAG-3，而LV转导生产的T细胞表达更多的PD-1 。 单细胞RNA测序：SB转座生产的T细胞显示出增殖性CD4+/CD8+ γδ T细胞的趋势，且这些细胞高表达KLRF1 。SB转座生产的CAR T细胞中，与干细胞样记忆T细胞（Tscm）相关的标志物表达略高 ，且与肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）和JAK-STAT信号传导相关的促炎基因表达较高 。有意思的是，mRNA的递送显著增加了CD69、PD-1、TIM-3和LAG-3的表面表达。 综合来看： •对于健康供体来源的T细胞：如果需要更多的CD8+ T细胞亚群，SB转座可能更合适。但需要注意的是，SB转座可能导致更强的初始激活和不同的共抑制标志物高表达。 •对于CLL患者来源的T细胞：LV转导可能更适合，因为SB转座在CLL来源的T细胞中CAR表达效率较低。此外，CLL患者来源的T细胞增殖能力较弱，SB转座需要电击转染，会进一步降低其增殖能力。 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记 PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统的重要组成部分,具有细胞毒性和免疫调节双重功能。 NK细胞的免疫活性是由大量的细胞表面受体介导的，这些受体识别不同的配体并介导不同的信号通路。 在目前已知的四种天然细胞毒性受体（NCR）中，三种在NK细胞中组成型表达（NKp30、NKp46和NKp80），而NKp44仅存在于活化的NK细胞表面。这些受体与其配体的结合向细胞传递强烈的激活信号。NCR 的信号转导通过相关蛋白 DAP12、NKp44 中的 ITAM 基序、NKp30 和 NKp46 中的 FcεRIγ 和 CD3δ 进行（图1）。 NKp30 的质量为 30 kDa，包含一个138 个氨基酸长的Ig 样胞外结构域、一个 19 个氨基酸的跨膜 (TM) 结构域和一个 33 个氨基酸的胞质尾。 NKp30的胞外域包含Ig样折叠，通过短柄结构域与跨膜α螺旋（红色）连接。Ig 样结构域由8个β链组成，形成两个反向平行的β片层（黄色），通过Cys39和Cys108之间的二硫键连接（图2）。胞外结构域包含两个参与配体结合的N连接糖基化的潜在位点。 TM结构域包含带正电荷的精氨酸残基，与ITAM接头分子CD3ζ和FCεRIγ的 TM 结构域中带负电荷的天冬氨酸结合。这也是其他 NK 细胞激活受体的共同特征。 NKp30在几乎所有人类的NK细胞上都有表达，是免疫球蛋白超家族的I型跨膜激活受体。NKp30 介导的反应由特定配体（例如肿瘤细胞衍生的B7-H6）的结合触发，并引发细胞毒性介质TNF-α、IFN-γ、穿孔素和颗粒酶的分泌。 当NKp30与激动剂抗体或配体结合后，会将强烈的激活信号转导给细胞，该NCR的信号转导通过NKp30中的FcεRIγ和CD3ζ的ITAM基序发生（图3）。NKp30激活可诱导NK细胞的细胞毒作用和细胞因子分泌功能，在抗肿瘤、抗病毒和抗寄生虫感染中发挥着重要的作用。 NKp30 受体可能与多种配体类型结合。痘病毒血凝素 (HA)，与NKp30结合充当拮抗剂；人巨细胞病毒外皮蛋白 pp65 (HCMV pp65) 也能够阻断 NKp30 参与的触发信号；恶性疟原虫红细胞膜蛋白1 (PfEMP-1) 被鉴定为 NKp30 和 NKp46 的强激活配体，一旦结合，就会导致受感染细胞裂解。 配体BAT3 BAT3（HLA-B 相关转录物 3，也称为 BAG6、BCL2 相关 athanogene 6）是一种蛋白质伴侣，肿瘤细胞响应应激信号而过度表达。BAT3 促进黑色素瘤患者外泌体介导的转移，并已被确定为肝细胞癌、肠胃间质瘤、非小细胞肺癌患者的预后生物标志物。 配体B7-H6 NKp30配体B7-H6在正常组织和细胞中几乎不表达或低表达，当细胞发生癌变或感染时，B7-H6分子表达上调。 与其他 B7 家族蛋白不同，在稳态条件下，B7-H6 不会在正常人体组织中表达，但在炎性应激下会被诱导表达。相应地，B7-H6 已被证明会在各种不同的肿瘤组织上表达。B7-H6 会与自然杀伤细胞上的 NKp30 激活受体结合，诱导细胞毒性，从而促进抗肿瘤免疫应答。与此相对的是，研究还显示可溶性 B7-H6（可由 ADAM 介导的胞外域脱落产生）与某些癌症中的 NKp30 表达减少和自然杀伤细胞功能障碍相关,这表明B7-H6 在某些条件下可能负向调节免疫应答。此外,在利用人乳腺癌或神经胶质瘤细胞系开展的研究中发现，B7-H6 可促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡，这进一步表明 B7-H6 可能参与了肿瘤发生。同样，B7-H6 在人卵巢癌中的高水平表达与肿瘤进展和转移呈正相关。 目前，布局NKp30的企业并不多，且多处于临床前开发阶段，主要集中于抗体药物研发。另外，NKp30已在嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 疗法中也得到了探索！ 吉满生物科技（上海）有限公司，是位于上海浦东的一家以创新为驱动的工程化细胞系研发公司，基于自有的国内最大报告基因平台、慢病毒平台以及最迅速的药研网资讯平台，目前已构建出700余株现货单克隆细胞系产品，覆盖ROR1/DLL3/SLC39A6/TROP2/BCMA/BDCA/TREM2……200余新药热门靶点，其中有100余靶点开发有对应luciferase reporter方法，更有国内独家/首家CCR8, BDCA, TREM2和GAPR等luciferase的assay平台。 数据展示 H_NKp30 Reporter Jurkat Cell Line(Genomeditech/GM-C29776)使用两种NKP30抗体包被激活验证结果 H_NKP30 CHO-K1 Cell Line（Genomeditech/GM-C29749）使用Anti-NKP30 hIgG1 Antibody(BGA-1833)（Genomeditech/GM-49311AB）流式验证结果 H_NKP30 HEK-293 Cell Line（Genomeditech/GM-C30360）使用Anti-NKP30 hIgG1 Antibody(BGA-1833)（Genomeditech/GM-49311AB）流式验证结果 Cynomolgus_NKP30 CHO-K1 Cell Line（Genomeditech/GM-C33009）使用Anti-NKP30 hIgG1 Antibody(BGA-1833)（Genomeditech/GM-49311AB）流式验证结果 吉满生物助力药物研发，紧随前沿靶点资讯，储备几百株现货细胞，覆盖GPCR、细胞因子、免疫检查点、TAA等多领域近200余个靶点。 参考资料：【1】doi: 10.1111/bph.15222【2】https://en.wikipedia.org/wiki/NCR3 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

Lydia Lynch等人揭示，正常组织或肿瘤组织中的γδ T细胞具有明显异质性，分别具有细胞毒性和促进伤口愈合的功能。对此，他们通过优化细胞扩增方法，获得了杀伤、代谢能力增强的γδ T细胞 γδ T细胞是一类“非常规” T细胞，仅占外周血T细胞群体中的一小部分。 不走寻常路的γδ T细胞，与其它T细胞上的抗原受体（TCR）组成结构不同，而且活化过程不依赖于MHC-抗原的配对识别。组织稳态发生变化时，γδ T细胞能够迅速响应，活化后快速产生细胞因子来对抵御病原体感染或抗肿瘤。这些特性，使得γδ T细胞成为细胞过继免疫治疗的强力候选者。此外，基于癌症基因组图谱（TCGA）的分析表明，γδ T细胞与大多数实体瘤的积极预后相关，是对预后最有利的一类免疫细胞[1]。 然而，看似美好的γδ T细胞似乎对我们有所隐瞒。 美国哈佛大学医学院的Lydia Lynch和她的同事们发现，结直肠癌肿瘤内，除了行使细胞毒性功能的γδ T细胞，还存在促进肿瘤细胞生长的γδ T细胞，表达与伤口愈合相关的双调蛋白（AREG）。不仅如此，他们开发了一种扩增方式对γδ T细胞进行优化，使其过继转移给结直肠癌小鼠后，不再产生AREG，而是仅表现为细胞毒性表型，明显抑制肿瘤生长[2]。 文章于近日发表在《自然·癌症》期刊上。 论文首页截图 基于TCGA数据库，Lydia Lynch等人首先发现，在卵巢癌、肺腺癌、子宫内膜癌中，高水平的肿瘤浸润γδ T细胞与患者更高的生存率相关，但在结直肠癌中并没有显著相关性。也就是说，在不同癌症类型中，γδ T细胞可能有着不止一副面孔。 为了探索是否具有异质性，研究者们对子宫内膜癌和结直肠癌肿瘤内的γδ T细胞，展开一系列单细胞RNA测序（scRNA-seq）等分析。 结果显示，γδ T细胞的基因表达模式更接近于自然杀伤细胞（NK）和先天性淋巴细胞（ILCs），而不是CD8+T细胞、CD4+T细胞。肿瘤内的γδ T细胞高表达颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ等细胞毒性效应分子，低表达PD-1、CTLA4等免疫检查点。 根据功能表型，研究者们发现，子宫内膜癌肿瘤浸润γδ T细胞整齐划一，只有一种表型，即细胞毒性。结直肠癌肿瘤内的γδ T细胞却没有统一干着杀伤肿瘤细胞的活儿，而是分为细胞毒性、伤口愈合、中间过渡这三种表型。 具体来看，细胞毒性效应分子和免疫检查点在细胞毒性表型γδ T细胞中表达量最高，在伤口愈合表型γδ T细胞表达量中最低。能够促进组织修复的双调蛋白（AREG）只在伤口愈合表型和中间过渡表型γδ T细胞中表达，且在前者高表达。 结直肠癌肿瘤里有三股γδ T细胞势力 接下来，研究者们发现，实际上无论是在健康组织还是肿瘤组织中，NK细胞、树突状细胞等多种免疫细胞都有表达AREG蛋白。只不过，唯独γδ T细胞会在肿瘤组织中上调表达AREG。 与健康组织相比，结直肠癌组织中，γδ T细胞表达的AREG水平上调，尤其是在“冷肿瘤”——没有DNA错配修复缺陷（MMRp）的结直肠癌中，AREG水平更高；而在对免疫治疗敏感、具有DNA错配修复缺陷（MMRd）的结直肠癌中，γδ T细胞表达的IFN-γ水平上调。 与AREG、IFN-γ表达水平变化相符，不同功能表型的γδ T细胞分布情况有变。中间过渡表型γδ T细胞在健康结直肠组织中占主导地位，在肿瘤中减少；细胞毒性和伤口愈合表型γδ T细胞在肿瘤中聚集，且分别在MMRd、MMRp结直肠癌中所占比例更高。 不同类型结直肠癌中的γδ T细胞表型分布情况，以及AREG或IFN-γ表达情况（每张小图左→右：健康组织、MMRP肿瘤、MMRD肿瘤） 研究者们进一步对不同表型γδ T细胞的免疫特征进行描述。结果显示，IFNγ+TIGIT+γδ T细胞表现为细胞毒性表型，AREG+NKp80+细胞表现为伤口愈合表型。还有一类同时表达TIGIT和NKp80的γδ T细胞群体，即中间过渡表型。 通过在培养皿中进行细胞划痕实验以模拟组织创伤，他们发现，AREG+NKp80+γδ T细胞能够诱导两种人结直肠癌细胞（SW480、HCT116）增殖，拥有促进肿瘤组织修复的能力。如果使用西妥昔单抗处理来阻断AREG与其受体EGFR的互作，可以抑制AREG+NKp80+γδ T细胞的效果。 AREG+NKp80+γδ T细胞促进结直肠癌细胞增殖，修复划痕 以上结果指出，结直肠癌肿瘤中的γδ T细胞存在两股势力。一方通过表达IFN-γ等效应因子，担负着杀伤肿瘤细胞的作用；另一方则是通过表达AREG蛋白帮肿瘤救死扶伤，促进肿瘤细胞增殖、修复伤口。还有一部分中间过渡γδ T细胞，兼具两大势力的表型。 既然如此，γδ T细胞要想成为细胞过继免疫疗法的候选者，得想办法抑制其表达AREG蛋白才行，不然反向成为给肿瘤加油鼓劲了。 于是，研究者们使用IL-1、IL-18、αCD3、αCD2等因子在体外诱导γδ T细胞扩增，并进行一系列条件优化。最终，他们开发出一种能够增强γδ T细胞的细胞毒性并提高其代谢活性的扩增方法。 γδ T细胞得改造一下才能用[3] 在结直肠癌患者来源的异种移植瘤小鼠模型中，研究者们对γδ T细胞过继免疫治疗的效果进行验证。 结果显示，将强化过的γδ T细胞转移到携带肿瘤的小鼠体内后，与对照组（PBS处理）相比，小鼠肿瘤生长得到显著抑制。这些γδ T细胞在肿瘤微环境中稳定扩增，表达更高水平的IFN-γ，更重要的是，在肿瘤以及其它任何器官组织中都不产生AREG蛋白。 强化过的γδ T细胞几乎不表达AREG（第一代方法Gen1优化后得到第二代Gen2） 总体来说，Lydia Lynch等人揭示，正常组织或肿瘤组织中的γδ T细胞具有明显异质性，分别具有细胞毒性和促进伤口愈合的功能。对此，他们通过优化细胞扩增方法，获得了杀伤、代谢能力增强的γδ T细胞，在小鼠体内表现出更强的抗肿瘤效应，不再表达AREG蛋白，这为结直肠癌免疫治疗提供了新的思路。 参考文献： [1]Gentles, A. J. et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat. Med. 21, 938–945 (2015). [2]https://www.nature.com/articles/s43018-023-00589-w [3]Coffelt, S.B., Suzuki, T. The two sides of the γδ T cell coin. Nat Cancer (2023). https://doi.org/10.1038/s43018-023-00587-y