USP3

引言 组蛋白H2AK119位点单泛素化修饰（H2AK119Ub）是调节基因转录、DNA损伤修复和高阶染色质结构的关键表观遗传学标志。H2AK119Ub由泛素E3连接酶PRC1写入，并被USP3, USP12, USP16, USP21, USP22, USP46, PR-DUB and Mysm1等多种去泛素化酶擦除。其中，USP16是最早在2007年被鉴定到的H2AK119Ub核小体去泛素酶。USP16对H2AK119Ub的擦除在细胞周期M期进展、基因表达、干细胞自我更新和细胞衰老中至关重要。在阿尔茨海默症中，抑制USP16表达能逆转干细胞衰老和记忆丧失【1】。此外，基因定位在二十一号染色体的USP16在唐氏综合征（也称“21-三体综合征”）患者体内剂量依赖地过表达，导致干细胞缺陷等障碍【2,3】。尽管USP16具有很重要的生理与病理功能，但我们尚不清楚USP16催化H2AK119Ub核小体去泛素化的机制细节。 近期报道的H2AK119Ub被异源二聚体去泛素化酶PR-DUB选择性擦除的机制显示PR-DUB催化亚基BAP1和辅因子ASXL协同识别核小体H2A-H2B酸性区域、核小体DNA SHL 0和SHL 6，将BAP1的活性中心靶向H2AK119Ub的异肽键，进而切割泛素【4,5】。然而，USP16与PR-DUB分属不同的去泛素化酶家族（USP家族与UCH家族），且USP16以单亚基形式独立擦除H2AK119ub（BAP1需要ASXL激活），表明USP16通过一种独特的识别和催化机制去泛素化H2AK119Ub核小体。 2024年6月25日，清华大学化学系刘磊团队和上海交通大学潘漫团队在Nature Structural & Molecular Biology在线发表Structural and mechanistic basis for nucleosomal H2AK119 deubiquitination by single-subunit deubiquitinase USP16的研究文章，揭示了人源单亚基去泛素化酶USP16以一种不依赖于核小体酸性区域的独特模式识别和去泛素化H2AK119Ub核小体，展现出与PR-DUB完全不同的H2AK119Ub去泛素化机制。 本研究中，作者首先通过本团队2011年发展的多肽合成领域广泛使用的多肽酰肼法【6】、通过四片段分割法化学合成了具有天然异肽键链接的H2AK119Ub组蛋白（图1），并与其它三种核心组蛋白（H2B、H3、H4）组装成八聚体，随后缠绕601序列的DNA组装成H2A K119位点精准泛素化修饰的核小体。体外去泛素化实验表明，USP16在H2AK119Ub核小体底物而非组蛋白八聚体底物上具有泛素切割活性，表明USP16行使功能依赖完整的核小体结构。 图1. 天然异肽键的H2AK119Ub组蛋白的化学合成路线【7】（Credit: Nature Structural & Molecular Biology） 接着，为构建稳定酶-底物复合物，作者通过二溴丙酮方法合成了H2AK119Ub模拟物样品（图2）【8】，将泛素的羧基末端与H2A K119C的侧链通过烷基化反应连接起来，该链接形式可以耐受去泛素化酶的水解切割。 图2. 异肽键不可水解的H2AK119Ub组蛋白的化学合成【8】（Credit: Nature Structural & Molecular Biology） 随后作者将该不可水解的H2AK119Ub组蛋白组装成核小体，与人源全长USP16蛋白组装复合物，并通过冷冻电镜解析了整体分辨率为3.05 Å的1:1结合比例的复合物结构。在该结构中，USP16与H2AK119Ub核小体的相互作用主要分为三个部分：1) USP16的碱性残基R755和K272/K273分别识别核小体SHL 6.5和SHL 0 DNA；2) USP16与组蛋白H2A羧基末端尾巴和H2B羧基末端螺旋相互作用；3) USP16识别泛素分子上的L8、I36、I44和L71/L73互作热点区域。令人意外的是，USP16不与核小体上的染色质互作热点区域——H2A/H2B酸性区域产生相互作用。 综上，这项研究揭示了单亚基去泛素化酶USP16擦除H2AK119Ub修饰的独特机制，强调了H2AK119Ub去泛素化机制的多样性，为理解USP16的疾病相关突变提供了结构框架。 向期刊提交的封面概念图：核小体H2AK119Ub擦除模式的多样性，后方的起钉锤（PR-DUB）需要以木板（核小体H2A/H2B酸性区域）为支点拔出钉子（H2AK119Ub）；前方的钳子（USP16）不需要木板支撑即可拔出钉子（H2AK119Ub）（Credit: Nature Structural & Molecular Biology） 参考文献 https://www.nature.com/articles/d41591-024-00013-5 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

*仅供医学专业人士阅读参考人类生活在充满微生物的环境中，必须有高效的宿主防御机制才能保证生存。人体免疫系统是一个复杂的防御系统，它保护身体免受病原体（如细菌、病毒、真菌和寄生虫）的侵害。免疫系统主要分为两部分：先天免疫和后天免疫。先天免疫系统又称为固有免疫、非特异性免疫、非专一性防御，是生物体非特异性、无记忆性的病原体防御功能，用以抵御病原体入侵的第一道防线，包括一系列的物理屏障系统、固有免疫细胞及固有免疫分子。后天性免疫也称为获得性免疫、适应性免疫、特异性免疫、专一性防御，是一种经由与特定病原体接触后，产生能识别并针对特定病原体启动的免疫反应。与先天免疫系统不同，后天免疫系统对特定的病原体做出特异性的反应。后天免疫系统可以在初次感染某种病原体后产生免疫记忆，并在下一次感染这种病原体时产生更强的抵抗力。这一特征是疫苗接种的理论基础，这样的免疫记忆可以为机体提供长时间的保护。因此，在传统的免疫学教科书的认知里面，只有后天免疫系统存在免疫记忆。然而，就在最近一两年的时间里，科学家们惊奇地发现，人体的先天免疫细胞也存在“免疫记忆”。根据“先天免疫记忆”最后产生的结果是“强化”或者是“钝化”，“先天免疫记忆”可以进一步划分为“驯化”型先天免疫记忆或者是“耐受”型先天免疫记忆。表观遗传学修饰被发现在长期的“先天免疫记忆”形成中扮演着重要作用；然而，对于短期的“先天免疫记忆”形成的分子机制，人们现在还一无所知。近日，由南加州大学和中山大学研究人员组成的联合研究团队发现，通过巧妙地调控一个关键的去泛素化酶分子USP3在细胞核与细胞质之间的时空转运，先天免疫细胞可以快速而高效地形成短期“耐受”型免疫记忆。这一发现对于了解先天免疫记忆的形成机制至关重要，也为治疗急性和慢性炎症、严重脓毒症和脓毒性休克，以及由慢性炎症引发的癌症提供了新的治疗药物研发方向。这项重要的研究成果近日发表在《欧洲分子生物学学会报道》杂志上，南加州大学的王荣福教授和中山大学的崔隽教授是论文的通讯作者，论文的第一作者是段天昊博士。论文首页截图NF-kB（核因子活化B细胞k轻链增强子）信号通路被认为是先天免疫和后天免疫中最关键的通路之一，最早由诺贝尔奖得主David Baltimore在1986年发现。目前，NF-kB信号通路已被证实在免疫、炎症、细胞生存以及应激反应等多个生物学过程中扮演着至关重要的调控作用，对于维持机体内部平衡和应对外部环境变化具有重要意义。为了探究对先天免疫的控制，科学家们首先在这个信号通路中对去泛素化酶蛋白家族的功能进行了筛选。结果显示，其中一个重要的去泛素化酶USP3能够明显抑制先天免疫细胞的NF-kB信号通路激活和炎症反应。科学家们之后在NF-kB信号通路分子水平，炎症基因RNA转录水平以及炎症因子释放水平分别对USP3的功能进行了验证，所有结果均显示USP3是一个强大的炎症抑制分子。为了进一步验证USP3在生理水平上的作用，科学家们采用骨髓移植方法制备了免疫系统中特异性缺失USP3的嵌合小鼠。研究结果显示，USP3的缺失显著影响了小鼠在内毒素诱导的脓毒性休克模型中的存活率。进一步实验显示，USP3能够有针对性地去除NF-kB信号通路中一个重要分子MyD88上的K63连接的泛素链，从而抑制炎症信号通路的激活。然而，这就带来了一个问题！从上图中，我们不难看出，USP3通常都在细胞核里游荡，而MyD88的激活则发生在细胞质里面，按理说它们俩应该井水不犯河水，互不打扰啊！那困在细胞核里面的USP3如何能抑制处于细胞质里面的MyD88所引起的炎症反应呢？为了解决这个疑问，科学家们进行了实时活细胞成像实验。他们惊讶地发现，一旦NF-kB信号通路被激活，USP3便能快速从细胞核“越狱”，迅速移动到细胞质内，针对MyD88进行“降维打击”。更加引人注目的是，科学家们发现，当他们对USP3的核定位序列（NLS）进行突变，使其能够自由“徜徉”于细胞核和细胞质之间时，其功能变得异常强大，犹如“猛虎出笼”，它可以直接把MyD88身上的泛素链“干”到一点不剩！根据这个观察，科学家们突然想到，或许先天免疫细胞正是通过调控USP3的“猛虎出笼”，来建立短暂的“先天免疫记忆”。当先天免疫细胞感知到病原微生物的刺激时，它可以预先调动部分USP3从细胞核移至细胞质，形成“耐受型先天免疫记忆”。一旦有大量病原微生物入侵，细胞质中的USP3能够快速响应，迅速去除MyD88的泛素链，以防止过度激活炎症信号通路所引发的“细胞因子风暴”，从而保护宿主免受致命感染危险。后续科学家们在多个层面验证了这一假设，并发现，缺乏USP3的嵌合小鼠，在经历连续三天低剂量内毒素注射后，依然未能形成正常的耐受型免疫记忆。这进一步证明了USP3在先天免疫细胞建立免疫记忆过程中的关键作用！总的来说，这项研究首次在基因转录后的修饰水平上，揭示了先天免疫细胞形成免疫记忆的分子机制。通过精巧地调控USP3分子在细胞核和细胞质之间的移动，先天免疫细胞实现了短期免疫记忆，这种机制让我们不禁惊叹于生命进化的神奇之处啊。如此看来，咱们的免疫学教科书又得修改了！参考文献：Duan T, Feng Y, Du Y, et al. USP3 plays a critical role in the induction of innate immune tolerance. EMBO Rep. 2023;e57828. doi:10.15252/embr.202357828责任编辑丨BioTalker

导读：肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，是全球日益严重的公共卫生问题。HCC的主要遗传改变之一是Wnt/β-连环蛋白信号传导的失调，β-连环蛋白的激活与肝细胞癌的进展有关。近日，中南大学湘雅医院周乐杜等在《Cell  Death & Disease》上发表题为“USP8 positively regulates hepatocellular carcinoma tumorigenesis and confers ferroptosis resistance through β-catenin stabilization”的研究论文，研究表明，USP8通过β-连环蛋白的翻译后机制激活了Wnt/β-连环蛋白信号传导，USP8的高表达促进HCC的进展并抑制铁死亡。靶向USP8可能是肝癌患者的有希望的策略。https://www.nature.com/articles/s41419-023-05747-7研究背景 01 肝细胞癌是一种侵袭性和毒性实体瘤，参与HCC发生和进展的潜在分子机制在很大程度上仍不清楚。寻找更多新的候选靶点并改善治疗策略是一个紧迫的问题。泛素化是最重要的翻译后修饰之一，它对细胞稳态至关重要，在细胞蛋白降解机制中起核心作用。泛素化涉及由三种酶介导的泛素分子的顺序转移：泛素激活酶（E1）、泛素偶联酶（E2）和泛素连接酶（E3）。E3泛素连接酶选择性介导底物的泛素偶联，可通过去泛素化酶逆转。E3连接酶或去泛素化酶的失调在各种人类癌症中经常观察到。然而，DUB在HCC中的潜在作用尚未得到充分确定。研究进展 02 USP8 是一种 DUB，属于泛素特异性加工（USP）蛋白酶家族。USP8的表达经常在多种癌症类型中过表达，包括肺癌、乳腺癌、胆管癌、胃癌和黑色素瘤。USP8被确定为肿瘤中的增殖和转移增强剂。在本研究中，我们将USP8确定为一种有效的DUB药物，可以去泛素化和稳定HCC中的β-连环蛋白。首先，USP8和β-连环蛋白相互作用。协同IP分析确定了USP8和β-连环蛋白之间的相互作用。其次，USP8减少了β-连环蛋白多泛素化，并以取决于其DUB活性的方式促进β-连环蛋白的稳定。USP8的缺失显著降低了β-连环蛋白的蛋白丰度，USP8-WT的异位表达可以恢复β-连环蛋白丰度的降低，但不能恢复其催化无活性突变体USP8C786A.在蛋白酶体抑制剂MG132的处理下，USP8缺失不能进一步影响β-连环蛋白水平。USP8耗竭缩短了β-连环蛋白的半衰期。USP8-WT的异位表达，但USP8的异位表达C786A，显着降低β-连环蛋白的泛素化。体内去泛素化试验表明，USP8可以剂量依赖性方式直接去除β-连环蛋白上的泛素链。为了进一步找出USP8去除了β-连环蛋白上哪种类型的泛素链，我们使用一系列泛素突变体进行了泛素化测定，包括K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63。我们观察到USP8显著降低了β-连环蛋白的K48连接的多泛素化。由于通过Ub的K48进行多泛素化通常会导致蛋白酶体降解，USP8可以通过从β-连环蛋白中去除K48连接的泛素链来维持β-连环素的稳定性。最后，USP8可以通过β连环蛋白促进HCC的肿瘤增殖、侵袭和茎样特性。敲低USP8显著抑制肿瘤增殖，侵袭和茎样特性。此外，β-连环蛋白表达的恢复消除了USP8耗竭诱导的影响。我们进一步检查了USP3的小分子抑制剂DUB-IN-8，以验证我们的发现。正如预期的那样，DUB-IN-3处理以剂量依赖性方式抑制HCC细胞增殖，侵袭和干细胞样特性。相应地，DUB-IN-3处理降低了β-连环蛋白丰度，降低了β-连环蛋白的多泛素化。CHX分析表明，DUB-IN-3处理后β-连环蛋白的半衰期显著缩短，表明DUB-IN-3与USP8耗竭一样，促进β-连环蛋白泛素化和降解。最近的一项研究表明，Wnt/β-连环蛋白信号通路通过上调GPX4的表达来减弱细胞脂质过氧化水平，从而抑制铁死亡。在本研究中，我们观察到USP8的抑制促进了HCC细胞的铁死亡。进一步的机制分析表明，USP8稳定β-连环蛋白，USP8的耗竭降低了GPX4的蛋白水平，表明USP8可能通过Wnt/β-连环蛋白/GPX4轴参与铁死亡。机制图。USP8 是一种β连环蛋白 DUB，可稳定β连环蛋白并通过其去泛素化活性促进肿瘤生长、侵袭、肿瘤干样特性和铁死亡抵抗力。总之，我们证明了USP8是一种β连环蛋白DUB可稳定β连环蛋白并通过其去泛素化活性促进肿瘤生长，侵袭，肿瘤干细胞样特性和铁死亡抵抗力。我们的研究结果为USP8在Wnt/β-连环蛋白信号通路中的作用提供了新的见解，并揭示了利用USP8抑制剂进行HCC治疗的潜在治疗策略。参考资料：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05747-7