BRD3

研究背景PROTAC是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白结合配体和连接两者的连接体组成，促进靶蛋白和连接酶的相互作用，导致靶蛋白的泛素化及降解。虽然存在一些E3连接酶的小分子配体，但大多数降解化合物都是基于VHL和CRBN的配体，这些配体是Cullin-RING连接酶家族(CRLs)中特定E3连接酶的底物识别亚基。迄今为止，大约600个人类E3连接酶中只有少数被应用于TPD。增加TPD中使用的E3的数量将需要识别额外的E3连接的配体。探索除VHL和CRBN外的E3连接酶及其配体可以为TPD应用提供更多的化学选择。CRL包含人类E3连接酶的一个子集，包含约250种与Cullin支架偶联的底物连接蛋白组合，并且底物连接蛋白具有不同的结构和功能。CRL的一个子集在其羧基端消除具有特定氨基酸序列的蛋白质。其中，三种CRL2底物连接蛋白- KLHDC2, KLHDC3和KLHDC 10 -已被证明可以控制以甘氨酸残基结尾的蛋白质的降解。在一项研究中，测量了数千种带有不同C末端附属物的绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白质的稳定性，以甘氨酸结尾的C末端在驱动UPS介导的降解方面是最强的。可转移的降解促进序列称为降解子，具有临界C端残基的序列称为C端降解子。在识别甘氨酸末端C端降解的三个CRL中，对CRL2KLHDC2的研究最为详细。CRL2KLHDC2的最佳底物位于二甘氨酸基序中，在某些情况下，二甘氨酸基序是由蛋白质的内部蛋白水解裂解产生的在二甘氨酸末端底物肽存在的情况下，KLHDC2底物结合kelch结构域(KLHDC2KD)的高分辨率晶体结构已经被确定，提供了C端降解识别的原子水平细节。因此，CRL2KLHDC2是一种E3连接酶，可以驱动其底物蛋白的快速降解，并且具有良好的底物识别袋，使其成为TPD的一个有吸引力的潜在选择。   KLHDC2靶向小分子的发现利用计算机辅助药物设计(CADD)，著名的靶向蛋白降解药物研发公司Arvinas研究团队从KLHDC2KD与其同源C端底物SelK结合的可用晶体结构开始，SelK由其C端甘氨酸残基锚定(PDB：6DO3)。SelK肽的末端甘氨酸(Gly91)被保留，因为它与底物口袋结合最深，并与Ser269、Arg241和Arg236形成四个氢键(H键，黄色虚线)，而Gly90则被吡啶酮环取代(图1a，步骤1)。吡啶酮环从顶面和底面与Arg236和Lys147形成π-阳离子键，并模仿Gly90的羰基与Trp191形成氢键(图1a，步骤1)。添加了一个萘环后，该环与Lys147形成氢键，以加强π-阳离子与吡啶酮环的相互作用(图1A，步骤2)。大基团的萘甲酮环在两个环系之间实施了非平面构象，分别将KDRLKZ-1和KDRLKZ-2的仲丁基或异丁基引导到由Tyr50、Leu342、Leu343、Trp321和Trp370组成的疏水口袋中(图1a，步骤3)，同时将连接物氨基甲酸酯放置在Arg236附近形成临时氢键，并将连接子从口袋中引导到泛素的区域(图1a，步骤4)。作者依靠从头设计和化合物合成的循环来进一步优化这些新的小分子，并使用表面等离子体共振(SPR)的直接结合实验的连续迭代循环来生成数据，为配体优化提供信息。通过AlphaLISA置换试验测定化合物取代SelK多肽的能力。这最终导致了一系列小分子配体的发现，这些小分子配体有效地与KLHDC2KD结合(图1a-i)。为了评估新发现的KLHDC2小分子配体的特异性(图1b)，作者使用AlphaLISA检测了靶向VHL的小分子VH298和KLHDC2配体是否会相互影响，结果表明KLHDC2配体能够特异性结合（图1c，d）。SPR也测试了KDRLKZ-1与KLHDC2KD的直接结合，显示出1:1的结合模式(图1e)。SPR结果显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为0.36 μM，热移实验显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为+6.8℃, AlphaLISA和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验显示KDRLKZ-1取代SelK肽的半最大抑制浓度(IC50)分别为0.21 μM和0.31μM。用酰胺取代KDRLKZ-1的羧基会导致结合减少，这与C端肽与KLHDC2的结合模式一致。羧基被酰胺取代的化合物将被称为“E3 dead”化合物(如KDRLKZ-3，如图1b所示)，它们不再与KLHDC2结合。   KDRLKZ-1在KLHDC2KD底物结合口袋中的结合位置通过共晶结构得到证实(图1g-i)。如图所示，KDRLKZ-1填充KLHDC2底物结合袋，并进行类似于天然底物的相互作用，其C端与SelK的C端几乎重合(图1h)。正如作者最初对KDRLKZ-1的从头CADD模型预测的那样，羧酸与KLHDC2形成4个氢键或盐桥作用;吡啶酮与Trp191形成氢键，并与Arg236和Lys147分别从上、下两个面发生π-阳离子相互作用;萘啶酮环在空间上强制形成非平面构象，引导羰基与Lys147形成氢键，并将正丁基置于疏水口袋中;连接链氨基甲酸酯位于Arg236附近并指向口袋外(图1i)。为了进一步表征KLHDC2配体，作者纯化了全长KLHDC2 E3连接酶及其同源接头蛋白EloB和EloC(该复合物以下简称KBC)，并使用天然底物(用菁5荧光团标记的USP1肽)进行了泛素化实验。作者确定了USP1泛素化依赖于KLHDC2，并发现过量的底物以及小分子配体KDRLKZ-1可以与USP1竞争KLHDC2的泛素化。这些实验证明纯化的KBC具有活性，并且可以与KLHDC2靶向的小分子结合。   图1KLHDC2配体结合能力研究为了测试新的KLHDC2配体在被合成为双功能分子时与KLHDC2结合的能力，作者通过与琼脂糖珠上固定配体的相互作用促进KLHDC2的下拉，使用HiBiT信号进行量化。开发了类似的测定VHL与其配体相互作用的方法。对于VHL和KLHDC2，携带靶向各自连接酶的特定探针的微球的HiBiT信号明显高于单独与生物素偶联的微球(图2a)。此外，生物素标记的KLHDC2-配体探针可以与细胞提取物中的内源性KLHDC2结合(图2B)，这种相互作用可以被多余的配体竞争性地抑制。  以JQ1作为靶蛋白结合配体，作者用KLHDC2配体的活性和E3-死亡版本(图2C)生成了一系列KLHDC2-BRD4 PROTAC分子(图2c-e)，并通过SPR测试了它们形成三元络合物的能力(图2d，e)。在我们的三元络合物SPR实验中，我们在SPR芯片上固定了BRD4上的His标记的溴域，并在没有或存在GST标记的KLHDC2KD的情况下展示了KLHDC2-BRD4 PROTAC分子。一个PROTAC分子K2-B4-3显示出很强的三元络合物形成(图2D)。三元复合体的形成效率取决于KLHDC2的招募，因为E3-Dead版本K2-B4-3D不形成三元复合体。图2基于KLHDC2的PROTAC在细胞中的降解能力在设计了可以诱导BRD4BD2和KLHDC2KD形成三元复合物的PROTACs之后，作者接下来测试了这些PROTACs是否可以驱动细胞中BRD4的有效降解。BRD4水平由添加到内源性BRD4中的氨基末端HiBiT标签表征。KLHDC2-BRD4 PROTAC分子由两种连接类型和三种KLHDC2配体生成 (图3a)，并将羧基改为甲酯基团作为前药，甲酯在进入细胞后会被细胞酯酶加工后转化为羧酸，并且酯基团比羧酸基团有更好的细胞渗透性。酰胺基PROTAC分子被设计为E3-dead阴性对照。    含有甲酯KLHDC2配体的KLHDC2-BRD4 PROTAC分子能够快速有效地降解HiBiT-BRD4，在4-6小时内降低93%(图3b,c)。带有酸基团的PROTAC也能降解HiBiT-BRD4，但不如含酯分子(6小时降解动力学如图3d所示)。根据SPR数据(图2)，非PEG连接子对BRD4的降解效率更高。正如预期的那样，具有酰胺基团的PROTAC分子在HiBiT-BRD4检测中几乎没有活性(图3d)。为了证实观察到的BRD4降解依赖于UPS，作者观察了使用蛋白酶体抑制剂MG-132和类泛素化抑制剂MLN4924后HiBiT-BRD4水平。结果表明，这两种UPS抑制剂都可以抑制在K2-B4-5e存在时观察到的荧光减少(图3e)。为了测试KLHDC2 - BRD4 PROTAC分子的活性是否依赖于KLHDC2，作者使用干扰RNA (siRNA)敲除KLHDC2，发现这完全阻断了K2-B4-5e诱导的HiBiT-BRD4降解(图3f)。作为对照，敲除不相关E3连接酶DCAF16对KLHDC2介导的BRD4降解没有影响(图3f)。在该研究中，作者发现KLHDC2-BRD4 PROTAC分子对细胞系中BRD2和BRD3也有降解效果(图3g)，这个结果与其他使用JQ1作为靶蛋白配体、基于CRBN或VHL的PROTAC表现一致。与BRD4的情况一样，K2-B4-5e对BRD2的降解在敲除KLHDC2后完全阻断(图3g)，但敲除DCAF16没有影响。为了扩大基于KLHDC2的PROTAC降解底物的范围，作者合成了基于KLHDC2，靶向雄激素受体(AR)的PROTAC分子，如K2-AR-1(图3h)。与BET家族蛋白类似，AR的降解也依赖于UPS和KLHDC2 (图3i，j)。图3KLHDC2-EloB-EloC E3连接酶复合体是一种动态的低聚体在纯化全长KBC E3连接酶(KLHDC2与EloB和EloC的复合体)的过程中，作者观察到KBC从尺寸排除色谱柱中洗脱出来的尺寸大于其预期的分子量。KBC络合物的分析尺寸排除层析显示了一个主要峰，其洗脱曲线与分子量约为200kDa的络合物一致(图4a，灰色痕迹，图4b，顶部凝胶)。尽管在一些底物连接蛋白的重组制剂中发现了底物的共纯化，但SDS-PAGE和LC-MS分析表明KBC复合体没有受到污染的迹象。基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析表明，样品中存在一到四个KBC络合物的混合物。值得注意的是，KBC与其底物SelK肽孵育后，洗脱图谱发生了变化。在分析尺寸排除色谱实验中观察到的这种变化是浓度依赖的，SelK导致KBC的洗脱向右移动。KBC-SELK肽复合体的右移洗脱图谱与预期的分子量匹配，与一个KBC复合体一致(图4a，蓝色痕迹，图4b，底部凝胶)。在MALDI实验中，作者也观察到KBC-SelK肽复合体的质量图谱发生了变化。   对于以上现象，作者提出了一个假设，即KBC复合体是一种动态的低聚物，受到底物结合到其KLHDC2KD口袋中的影响。由于KLHDC2是一种E3连接酶，它识别C-末端的GlyGly-End肽作为底物，作者想知道它自己的C-末端(终止于GlySer)是否参与了这种动态复合体的形成。在AlphaLISA置换试验中，来自KLHDC2 C-末端的短肽可以取代底物SELK(图4c)，尽管亲和力较低(图4d)。与它们较弱的结合亲和力一致，将这些肽与KBC孵育会导致KBC寡聚体的部分解离(图4e)。接下来，作者试图了解KLHDC2KD与其反式C-端肽形成的复合体的结构。KLHDC2 C端肽与KLHDC2KD络合物的共晶结构表明，其结合模式与其天然底物SelK的结合模式相同(图4f)。如图所示，Trp270为了适应Ser406的额外原子而略有移动，但与Arg236的关键相互作用被保留了下来。综上所述，根据作者对KBC复合体动力学的生化特征研究，KLHDC2以高阶低聚状态存在，这种状态可以通过占据其底物结合口袋来调节，比如通过它自己的C-末端。   图4Cryo-EM显示KLHDC2-EloB-EloC复合物是一个四聚体为了更详细地定义低聚KBC物种的性质，作者对化学交联的KBC复合物进行了单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM）分析。KBC复合物的单粒子分析和cryoSPARC的初始模型生成显示了异质性KBC复合物，但大多数颗粒是KBC四聚体。四聚体复合物的三维(3D)变异分析在cryoSPARC中产生了四个密度不同的EloBC亚基类别。对密度最完整的一小部分粒子的进一步细化表明，KBC 分子的对称排列是二聚体的二聚。   因此，作者将C2对称性应用于非均匀细化（non-uniform refinement），以获得最终分辨率为3.8Å的全长KBC复合体的3D重建(图5a)。对称复合体的一半由两个KBC亚复合体组成；作者将一个原型染成紫色并将其命名为KLHDC21，将另一个染成橙色并将其命名为KLHDC22。在每个亚复合体中，KLHDC2是饱和的，而相应的EloB和EloC结合配对以较浅的颜色着色(图5a)。KLHDC2、EloB和EloC的kelch结构域在图中被明确地建模，并且在连续kelch结构域的界面处存在额外的密度，在那里它们与EloB和EloC相互作用。非对称KBC单元的叠加表明，KLHDC2与EloB和EloC的BC-box结合是由KLHDC2的Leu364、Ser366和Val372介导的。虽然BC boxes重叠，但KLHDC2的C-末端的其余部分没有重叠。C-末端的剩余部分对应于KLHDC2预测的Cullin box。如图7b所示，在四聚体中，只有紫色的KLHDC21 Cullin盒被正确定位以与CUL2相互作用，而KLHDC22 Cullin盒则没有。通过分析尺寸排除色谱，我们发现CUL2可以与KBC形成配合物(扩展数据图7c)。我们的模型进一步表明，连续KLHDC2分子之间的相互作用是由KLHDC21的N和C末端介导的。首先，KLHDC21的残基400-406与KLHDC22的底物结合位点结合介导了一组相互作用(图5b)。这些相互作用与上述晶体结构中观察到的与C端肽的相互作用非常相似。其次，BC boxes和Cullin boxes中KLHDC21的C端残基也与KLHDC22相互作用(图5b，插图)。KLHDC21的Lys376在KLHDC22的主链上与Asn184形成氢键;KLHDC21的Glu377与KLHDC22的His345形成氢键;KLHDC21的Phe375与KLHDC22的Leu58形成疏水相互作用。另外，作者观察到KLHDC21的N端残基向KLHDC22延伸，尽管在这个分辨率下很难解释具体的相互作用。作者没有看到KLHDC21和KLHDC22的kelch结构域之间有任何特定的相互作用。沿着KBC原蛋白的daisy chain，KLHDC22和KLHDC21'之间的许多相互作用是明显的。KLHDC22的C端被重新排列，以“打开”BC和Cullin盒子，它们围绕EloC2套圈，使KLHDC21'和EloC2接近(图5c)。KLHDC22的残基363-397组成了这个套索，作者已经在图中粗略地建模了(图5c，插图)，但该分辨率不足以最终描述该区域的大多数相互作用。   然而，很明显，在这个套索的最后，KLHDC22的400-406残基结合到KLHDC21'的底物结合口袋中。KLHDC22和KLHDC21'的kelch结构域之间也存在显著的相互作用。其中一个片段由KLHDC21'的Glu179、Thr180和Trp183以及KLHDC22的74-77个残基介导。第二个片段由KLHDC21'的His346和Arg347以及KLHDC22的Asp127介导(图5c，插图)。作者的低温电镜模型和生化数据表明，KLHDC2四聚体通过低亲和力相互作用结合在一起，这种低亲和力相互作用是由KLHDC2蛋白的C端与邻近底物结合袋结合介导的。高亲和力底物被认为取代了KLHDC2 C末端，从而将低聚物分解成较小的二聚体和单体。与它们作为高亲和力KLHDC2配体的属性一致，作者合成的KLHDC2靶向小分子系列也能够调节KBC四聚体动力学，正如通过分析尺寸排除色谱法测量的它们解离KBC四聚体的能力所示(图5d)。通过SPR动力学测量，具有较长半衰期的KLHDC2配体倾向于诱导更明显的四聚体解离(图5d)。总的来说，作者的数据与KBC通过其自身的C端结合在一起的模型是一致的，底物和小分子(配体或PROTACs)必须能够单独与KLHDC2底物结合口袋来破坏四聚体并诱导形成二聚体或单体，最终诱导生成与CRL2复合物结合的活性形式(图5e)。   图5总结    本研究发现了靶向KLHDC2的高亲和力小分子，这些小分子可用于TPD，不仅展示了KLHDC2如何被小分子所靶向，还描述了KLHDC2的动态组装，并证实了其四聚体的形式。此外，本研究描述的非共价小分子和PROTAC降解剂代表了第一个靶向C-末端的E3连接酶底物结合口袋并将其劫持为TPD的例子。最后，引入了小分子工具，这些工具将使未来能够对C-末端降解连接酶的生物学和机制进行研究。          作者：章建涛校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月23日        原文连接：Nat Struct Mol Biol. 2024，31(2):311-322. doi: 10.1038/s41594-023-01146-w. https://www.nature.com/articles/s41594-023-01146-w#Abs1    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

靶向蛋白质降解已成为针对导致疾病蛋白的化学生物学和治疗干预的一种强大的新模式。绝大多数 PROTAC 降解剂都会选择两种 CRL 之一的活性：von Hippel-Lindau Cullin 2 连接酶复合物 (CRL2 VHL ) ( 12 - 14 ) 和 cereblon Cullin 4 连接酶复合物 (CRL4 CRBN )，利用内源泛素-蛋白酶体系统的活性来诱导靶蛋白的泛素化和随后的降解。然而，迄今为止公开的大多数关于PROTAC三元复合物的结构、生物物理和机理研究仅限于CRL的底物受体/适配器成分，因此缺乏完全组装的催化活性CRL复合物。此外，PROTAC 介导的泛素化的机制和结构研究仍然很少或分辨率有限。为了充分实现和指导降解剂药物的设计和优化，越来越需要了解降解剂如何招募整个天然催化酶来阐明其作用机制。近日，Alessio Ciulli团队在bioRxiv上发表了题为Mechanism of degrader-targeted protein ubiquitinability的研究论文，其团队通过结合冷冻电镜结构、交联捕获策略和泛素化赖氨酸的生化鉴定，确定了整个 PROTAC 诱导的 Cullin 2 RING 连接酶 VHL 催化机制的结构和机制，以及它如何在其高度特异性的情况下催化泛素化。为了实现快速、有效和深度的靶标降解，降解剂不仅必须在低浓度下稳定、长寿命的复合物中招募靶标，而且还必须将其有利地定向到催化位点。除此之外，该团队工作表明，“轻面”内的一个或多个赖氨酸残基在距离和几何形状方面正确定位以驱动高度特异性和高效的泛素化也很重要。图1 该研究揭示的靶蛋白“泛素化”结构和机制特征示意图降解剂介导的三元复合物的结构和机制特征直接影响降解剂的药理活性，因此代表了基于合理结构的药物设计的重要优化种类。多项研究表明，在大多数情况下，热力学协同、稳定且动力学寿命长的降解剂介导的三元复合物支撑着降解剂的高效和选择性蛋白质降解特征。然而，三元复合物的形成如何影响多蛋白CRL复合物的PROTAC选择性催化机制内的高效和选择性新底物泛素化，迄今为止仍然难以捉摸。为此，决定研究 PROTAC MZ1 的结构和机制，是有效且快速的VHL招募BET降解剂，与其他BET蛋白相比，它表现出优先降解BRD4。为了更深入地了解降解剂的作用机制，我们确定了多亚基催化复合物的结构，该复合物由完整的 CRL2 VHL、负载泛素的 E2 结合酶和作为“新底物”的 BRD4 BD2组成，全部组装在一起以 MZ1 为代表的 PROTAC 降解剂。CRL2 VHL是一种150 kDa E3 连接酶，由五个亚基组成：底物受体 von Hippel-Lindau（短亚型 VHL19，18 kDa 或长亚型 VHL30，24 kDa）、接头蛋白 Elongin C（EloC，12 kDa）和 Elongin B (EloB，15 kDa)、Cullin 2 支架 (Cul2，87 kDa) 和 RING 盒蛋白 1 (Rbx1，12 kDa)。VHL-EloC-EloB (VCB) 被募集到 VHL 和 EloC 之间界面处的 Cul2 N 末端。在 cullin 2 的 C 端结构域，E1 NEDD8 激活酶 APPBP1-UBA3 和 E2 NEDD8 缀合酶 UBE2M 与 NEDD8 E3 连接酶 Rbx1 一起作用以 neddylate Cul2，即共价修饰 Cul2 WHB 结构域的 K689 残基NEDD8。这种修饰已被证明可以诱导 cullin-RING 复合物的构象重排，并促进 E2 泛素结合酶的结合。因此使用冷冻电镜 (cryo-EM)确定完全活跃的 NEDD8-CRL2 VHL与 BRD4 BD2的结构。该课题组用~4.0 Å分辨率的冷冻电镜结构首次有机会了解新底物 BRD4 BD2与PROTAC 和全长活性 E3 连接酶复合物的整体构象。全长CRL2VHL-MZ1- Brd4BD2三级结构验证了相对于VHL的新底物的晶体结构，并揭示了系统内微妙的灵活性，允许在底物结合和E3连接酶的催化位点之间的间隙桥接泛素化（图2）。图2 MZ1使BRD4 BD2新底物朝向Rbx1接下来的目标是确定BRD4溴结构域上的哪些赖氨酸残基最容易被泛素化并成为泛素化的目标。具有 UBE2R1 和 UBE2D2 的体外泛素化产物（也称为 UbcH5b，被认为优先用第一个泛素引发底物）通过 SDS-PAGE 解析，切除 BRD4 泛素化产物的条带，用胰蛋白酶消化，和通过质谱鉴定的K-GG修饰肽。他们一致地鉴定出 BRD4 BD2上的 8个泛素化位点（K333、K346、K249、K355、K362、K368、K445 和 K456）（图3A）。由于 MZ1 对 BRD4 和 BRD2 的泛素化和降解选择性高于 BRD3 ( 13 , 29 , 40 )，因此我们通过不同 BET 蛋白中 BD2 的序列比对检查了已鉴定的泛素化赖氨酸残基的保守性（图3C）。发现 K456 位点在 BET BD2 中严格保守，K346、K349和K368 也是如此，而其他两个残基（K333 和 K445）在普遍表达的 BRD2/3/4 中严格保守，但在 BRDT 上则不然（图3C）。然而，在 BRD4 BD2和 BRD2 BD2中有两个残基位置带有可泛素化的 Lys ，但在 BRD3 BD2中带有非泛素化的 Arg 残基。该分析表明，虽然 BRD4 BD2和 BRD2 BD2相对于 BRD3 BD2的机械选择性的主要贡献者和驱动因素很大程度上取决于三元复合物中新底物的优先识别，但至少部分可能是BRD2/4 中存在这两个泛素化赖氨酸残基（但 BRD3 中不存在）也可能有所贡献。总之，我们的泛素化数据确定了一组可泛素化的赖氨酸，它们位于最接近 Rbx1 的目标蛋白的表面，与存在于相反表面的非泛素化的赖氨酸明显不同。我们还发现单个赖氨酸残基似乎优先泛素化，而总体赖氨酸保守和定位无法清楚地解释 MZ1 对不同 BET BD2 的机械选择性。图3 BRD4溴结构域在E3连接酶RING结构域可接近的赖氨酸上泛素化。为了更好地了解 cullin RING 连接酶如何介导新底物的泛素化，他们开发了一种方法来捕获与 UBE2R1在 Ub-BRD4 BD2上的活性泛素链延伸相对应的过渡态类似物物种（图4A）。在这个泛素化结构模拟物中，野生型 Brd4 BD2首先在 N 端融合到泛素 (G76S、K48C) 的 C 端，模拟受体泛素 (Brd4 BD2 -Ub A )。UBE2R1（C93K、S138C、C191S、C223S）突变体通过C93K 残基处的稳定异肽键不可逆地装载野生型泛素（UBE2R1-Ub D）。将所得的Ub(G76S, K48C)-BRD4 BD2用小型双马来酰亚胺乙烷 (BMOE) 交联剂生物化学交联至 UBE2R1(C93K, S138C, C191S, C223S)-Ub 的 E2 受体位点附近的 S138C残基并纯化 (BRD4 BD2 - Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D）（图 3A，图 S9）。与 MZ1 和 (NEDD8)-CRL VHL一起孵育后，通过凝胶电泳和质量光度分析观察到完整的复合物形成（图4B-C）。在 (NEDD8)-CRL2 VHL -MZ1-Brd4 BD2 -Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D复合物中，MZ1 和交联底物-E2 缀合物充当N端和C端区域之间的稳定桥梁。CRL2 VHL，目标是将整个复合体包围成一个封闭的“环状”结构。 图4 BRD4 BD2泛素化结构模拟物的组装。为了解决封闭的完全组装复合体的结构，我们通过冷冻电镜对样品进行了结构研究。课题组特地研究了UBE2R1和BRD4 BD2之间的界面，并测量了与BRD4的泛素化赖氨酸残基的距离（图5）。虽然 BRD4 BD2和 UBE2R1 没有直接接触，但他们观察到，优先泛素化的 K456 直接指向 E2∼Ub 亲电子位点（图 5B）。我们测量了 K456 的 N-ε与 C93处模拟硫酯的羰基之间的距离为 18.4 Å（图5B）。尽管不是最短距离，但 K456 似乎已准备好以最佳几何结构接近 E2∼Ub D上的亲电子硫酯。由于K456 位于溴结构域 C螺旋的 C 末端，远离结合的 MZ1 界面，因此所示的倾斜可能有助于桥接这样的距离。残基 K368 和 K445也都接近 C93，但与 K456 相比，它们更接近 VHL-MZ1-BRD4 BD2界面，并且具有较低的迁移率。基于这些观察，研究者认为它们应该不如 K456 更适合泛素化。该团队的结构工作共同利用交联稳定性来实现全封闭 (NEDD8)-CRL2 VHL -PROTAC-target-Ub A -E2∼Ub D结构的高分辨率冷冻电镜结构，使用溶液内技术对其进行验证这使得对由PROTAC 结合的CRL 机制催化的新底物泛素化获得前所未有的见解。图5 BRD4 BD2泛素化复合物组装的结构本文作者：SY声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言上世纪三十年代起，印度、美国、日本等世界各国的遗传学家陆续报道了一种独特的水稻，英文称之为“clustered-spikelet rice”（意为簇生小穗水稻），中文称之为“复粒稻”或“簇生稻”。与常见的水稻不同，复粒稻通常会有三粒种子簇生在一起，有学者形象地称之为“三粒奇”。在某些背景下，簇生会使得稻穗酷似麦穗，因此又有人称之为“麦颖稻”。在没有基因组序列的时代，复粒稻因其表型明显而独特，被遗传学家广泛用于构建染色体连锁群，并发现控制簇生的位点CL与控制水稻糯性的位点Wx在6号染色体存在连锁。Wx于1990年被克隆成为控制水稻籽粒品质的核心基因，而CL由于其控制的簇生性状具有增产的潜力，虽然引起了众多关注，但是只能将其定位在6号染色体的一个区间内。这种一致的定位区间暗示不同来源的复粒稻应由同一个位点控制，然而关于其遗传特性的相关报道存在诸多不一致的地方。距今已经报道了将近一百年，复粒稻控制基因以及小穗簇生发生的机理始终是未解之谜。2024年3月8日，由中国农业科学院作物科学研究所童红宁研究员领衔的研究团队报道了对复粒稻多粒簇生形成机制的全面破译，发现控制簇生形成的基因编码植物激素油菜素甾醇（BR）的代谢基因，因复粒稻中该基因前存在复杂的染色体结构变异，导致该基因特异地在水稻穗分枝发育过程中被激活，并通过由BR水平改变诱发的一系列分子事件，促进了水稻穗分枝和穗粒数，最终导致产量增加，相关结果以题为Enhancing rice panicle branching and grain yield through tissue-specific brassinosteroid inhibition的研究长文形式发表在Science 上。复粒稻表型显著，但通过图位克隆始终无法定位到具体基因。考虑到图位克隆依赖于杂交群体的构建和后代性状与目的基因型的共分离，一是可能CL位点包含复杂的结构变异，导致一定区间内的连锁不平衡和后代偏分离，二是可能该性状易受到父母本基因组合的影响，导致后代个体表型与目的基因型的非绝对关联性分离，对精细定位造成了干扰。为此，研究人员另辟蹊径，以复粒稻为背景，通过化学诱变，从包含1万份诱变株系、16万份诱变单株的群体中筛选出2份不簇生的突变体株系，进而以复粒稻为对照，以不簇生的突变体为对象进行回交群体构建，结合重测序和关联分析，最终克隆到了目的基因。结果表明，一个被称为BRD3的BR代谢酶基因，在诱变过程中发生了突变，导致了簇生的消失。而对复粒稻基因组进行组装发现，BRD3前存在倒位、缺失、插入等复杂的染色体结构变异，激活了BRD3的表达，导致BR减少，是簇生发生的主要原因。因此CL实际上是指包含了复杂结构变异并激活BRD3表达的整个染色体区段。复粒稻簇生性状与结构变异紧密连锁，并且复粒稻表型与BR激素水平直接相关，解释了通过图位克隆无法成功克隆CL的原因；而以复粒稻为对照在同一背景下进行抑制子的筛选，避免了上述问题，为作物复杂性状的调控基因克隆提供了方法借鉴。BR最早发现于上世纪七十年代末，现已成为农业生产上广泛使用的一种植物生长调节剂。研究发现，BR显著控制着水稻的株高、叶夹角、籽粒大小等关键育种性状，但BR如何控制穗粒数并不清楚。严格地比较分析发现，复粒稻穗的二级分枝以及穗粒数显著增多。扫描电镜观察发现，其主要原因在于水稻穗分枝过程 “二级分枝分生组织”（SBM）向“小花分生组织”(SM)的转变延迟，从而产生了更多的SBM和SM，伴随着小穗柄变短，导致了簇生表型的发生。与此观察完全一致，研究人员通过多种技术手段，发现BRD3特异地在SBM激活表达，导致了该部位的BR含量减少，使得BR信号通路核心抑制子GSK2被激活，GSK2进而磷酸化转录因子OsMADS1并促使其更加稳定，后者又直接结合RCN2并促进其表达。RCN2作为拟南芥TFL1的同源基因，是调控SM身份性的重要因子，被激活后延迟了SBM向SM的转变，使得水稻具有更多的时间来进行分枝，从而促进了二级分枝，增加了穗粒数。穗分枝是一个复杂而有序的过程，伴随着一系列分生组织转化事件的发生，该研究是首次发现BR在控制水稻穗二级分枝过程中的重要调控作用。育种本质上是多性状的平衡优化过程，而穗粒数和籽粒大小之间的负相关是育种过程中难以克服的问题之一，一定程度上限制了当前水稻单产的进一步提升。BR对籽粒大小的促进作用极为显著，而该研究发现的BR对穗粒数的抑制作用，代表了一种全新的两个关键产量性状间的平衡机制。尤为重要的是，复粒稻对水稻种子大小和品质几乎毫无影响，但穗分枝和穗粒数显著增多，导致了产量相应地增加。免疫荧光和原位杂交等体内检测技术证实，GSK2、OsMADS1、RCN2三者和BRD3一样，均在SBM中被特异性地激活。因此，复粒稻中BR含量组织特异性地受到抑制，从而避免了BR缺陷对籽粒大小的负面影响。BR虽然被认为在农业生产与作物改良上具有重要应用潜力，但作为激素的功能多效性是BR应用的最大挑战之一，该研究发现空间特异性地控制激素含量可有效破解性状间的偶联，揭示了一种通过优化BR空间分布来避免激素负效应的新策略。研究团队进一步将CL导入到不同品种中，证实复粒稻簇生性状具有巨大的增产潜力，并且由于促进穗分枝机制上的不同，CL可以和著名的穗粒数控制基因Gn1a联合使用进一步增加产量。通过杂交选育将CL和Gn1a聚合后，水稻穗粒数最高可达600粒之多。此外，研究团队通过对簇生辣椒和非簇生辣椒，以及具有簇生花的蔷薇和非簇生花的玫瑰进行BR测量比较发现，和水稻一样，簇生与非簇生之间具有类似的BR含量变化。这一结果暗示，BR控制簇生的机制在大自然中可能具有普遍性。多年多点田间比较试验发现，由于CL通过控制激素水平发挥功能，而激素本质上具有微量高效并易受环境影响的特点，因此CL增产效果与背景材料中的激素水平以及种植条件密切相关。组织特异性BR抑制促进水稻穗分枝（Credit: Science）论文在审稿过程中得到三位匿名审稿人的一致高度评价。审稿人1: “这是一项可能会引起广大科学界极大兴趣的研究，令人信服地说明理解特定环境下的激素信号可应用于作物产量的提升。”审稿人2: “该研究清楚地证明了BR的时空调控是提高水稻产量的关键，详细的数据也证实BR调控花序发育的新功能，这一作用不仅影响水稻，还影响其他种子植物，包括双子叶植物。从这个意义上说，本文对BR的作用机制提供了新的见解，不仅是鉴定了一个具有农艺改良和分子育种价值的新等位基因，也是基础科学研究中的一个重要发现。”审稿人3: “这项研究具有极高的科学价值，尤其是对禾本科谷类作物而言。”原文链接https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk8838责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述