CIP2A

清华大学药学院饶燏团队开发基于降解的蛋白质分析策略：以雷公藤红素的靶点研究为例背景介绍PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）PROTAC技术是近年来新兴的前沿化学生物技术。其原理是通过一个异双功能小分子同时拉近目标蛋白和E3泛素连接酶之间的距离，进而诱导目标蛋白的多聚泛素化以及通过泛素-蛋白酶体途径的降解。目前为止，该技术已经成功实现了上百种靶蛋白的降解。靶点鉴定（Target identification）天然产物作为药物发现的重要来源，拥有多样的化学结构及广泛的生物学活性。通过表型筛选，科学家们能够深入地了解受天然产物影响的细胞表型、信号通路和疾病表型，但天然产物精准的靶点鉴定仍然是该领域面临的主要挑战。由于天然产物通常具有多靶点特性，并且与靶蛋白的结合力中等或偏弱，现有的靶点鉴定策略在鉴定天然产物的特定靶点时面临着一定的挑战。目前最为主流的靶点鉴定策略是基于活性的蛋白质分析（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）。该策略的原理是先通过小分子与靶蛋白之间形成共价键，随后通过linker引入报告基团如荧光基团或biotin，再通过凝胶荧光成像或biotin富集后的定量蛋白质组学来进行靶点鉴定。对于非共价小分子，ABPP需要外源引入光交联基团来实现共价交联。尽管该技术目前已被广泛应用于小分子药物的靶点鉴定，但它仍存在一些局限性。其高度依赖于小分子与靶蛋白之间的结合力，因此需要形成稳定的共价相互作用，而光交联基团的引入条件较为苛刻，且会产生大量的非特异性结合并对组学结果的分析造成一定的干扰。目前尚缺少一种基于非共价结合的靶点鉴定策略，而PROTAC技术的出现有望填补该空白。PROTAC的本质是小分子诱导的蛋白质互作，其不完全依赖于小分子与靶蛋白之间的结合力，理论上，弱结合靶蛋白通过PROTAC技术也能够实现高效的降解。科研快讯2024年4月25日，清华大学药学院饶燏团队在Advanced Science上发表了题为“Degradation-Based Protein Profiling: A Case Study of Celastrol”的研究性论文。在这项研究中，作者结合了PROTAC技术与蛋白质组学技术，系统性地提出了全新的靶点鉴定策略——基于降解的蛋白质分析（Degradation-Based Protein Profiling，DBPP），并将其应用于中药活性成分雷公藤红素的靶点鉴定（图1）。通过使用一整套PROTAC工具箱，作者成功鉴定了雷公藤红素的三个已知靶点PI3Kα、IKKβ、CIP2A以及三个潜在新靶点CHK1、OGA、ERCC6L，证明了该策略的强大能力。DBPP策略是PROTAC技术在靶点鉴定领域的新应用，为解决领域内关键问题提供了新方法。图1 ABPP与DBPP对比模式图研究内容首先，研究者们基于雷公藤红素的构效关系研究构建了相应的PROAC化合物库（图2）。综合考虑细胞表型、linker的长度及类型等多个因素，他们挑选出由四个PROTAC分子组成的靶点鉴定工具箱。图2 PROTAC化合物库的构建及工具箱的选择随后，他们分别对工具箱中的PROTAC分子进行了TMT标记的定量蛋白质组学实验（图3）。综合组学分析结果与雷公藤红素的生物学功能，他们初步挑选了包括PI3Kα、IKKβ、CHK1、OGA、NEK7、DCAF16在内的六个潜在靶点。通过对上述靶点的初步验证，他们进一步聚焦于PI3Kα、IKKβ、CHK1和OGA的研究。在此过程中，他们发现不同的分子对不同的靶蛋白表现出了一定程度的降解选择性，该结果与实验设计的初衷相符合。接着，他们对上述靶点开展了进一步的验证工作。他们先通过两个已知靶点PI3Kα、IKKβ建立了一套适用于DBPP的评估体系，其中包括靶蛋白降解普适性的验证、降解机制的验证、三元复合物形成的验证以及雷公藤红素与靶蛋白之间直接相互作用的验证。并将该体系成功应用于新靶点CHK1和OGA的研究。最后，他们对DBPP策略进行了两个方面的优化。通过综合分析降解组学和IP组学以及引入混合分子蛋白质组学的方式，他们进一步提高了该策略的效率及准确性。图3 靶点验证及策略优化总结综上，研究者在该工作中将PROTAC技术与多种蛋白质组学技术相结合，提出并进一步优化了DBPP非共价靶点鉴定新策略，该策略不仅适用于天然产物的靶点鉴定，还可用于现有药物分子的脱靶研究以及老药新用。通过与现有的靶点鉴定策略相互补充，DBPP策略有望推动药学相关领域的发展。饶燏团队长期从事蛋白质靶向降解技术的开发工作，致力于发展新型降解技术及其应用，已取得了一系列研究成果：将PROTAC首次应用于相分离，建立了基于PROTAC的BRD4相分离研究新方法（Cell Discovery 2023）；提出了 PROTAC 和分子胶协同应用的模式，首次设计合成了新型双靶、双机制的降解剂，为靶向降解技术的发展提出了新的思路（Cell Research 2021）；实现难成药靶点的药物开发，设计合成全球首例选择性CDK2降解剂，实现AML高效且低毒的分化治疗（Nature Chemical Biology 2021）；构建高效的BTK降解剂，解决临床中出现的Ibrutinib耐药问题（Cell Research 2018；Leukemia 2019）;构建PROTAC系统性敲除模型，快速可逆实现动物体内蛋白敲除（Cell Discovery 2019）；构建新型CDK4/6降解剂，有效抑制肿瘤增殖（Journal of Medicinal Chemistry 2019）。此次研究也是该团队拓展PROTAC在小分子靶点鉴定领域的新应用。致谢清华大学药学院饶燏课题组2018级博士生倪智豪、2020及博士生施奕（CLS项目）为该论文共同第一作者，清华大学药学院博士生刘乾隆，已毕业博士王立国以及昌平实验室研究员孙秀云参与了该工作，清华大学饶燏教授为通讯作者。该研究得到了首都医科大学高伟教授和清华大学邓海腾教授的帮助，并得到了清华大学蛋白质化学与组学平台的技术支持。该研究得到了中国国家自然科学基金和国家重点研发计划的大力支持。科学家小档案饶燏 清华大学药学院饶燏，清华大学药学院教授。主持国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金重点项目，并获药明康德生命化学研究奖杰出成就奖、树兰医学青年奖、中源协和生命医学创新突破奖。1999年本科毕业于山东医科大学药学院（现山东大学药学院），2002年硕士毕业于沈阳药科大学。2007年在美国佐治亚大学/University of Georgia获博士学位。2007-2009年在美国斯隆-凯特琳癌症中心/Memorial Sloan-Kettering Cancer Center从事博士后研究。2010年1月回清华大学开展独立研究工作。2014年起分别任美国化学学会杂志ACS Medicinal Chemistry Letter编委，中国化学快报Chinese Chemical Letters青年编委，Chinese Journal of Medicinal Chemistry《中国药物化学杂志》编委。饶燏教授长期从事药物发现的化学生物学研究，研究工作主要围绕‘抗重大疾病先导化合物的发现和优化’展开。近年来主要致力于蛋白质靶向降解技术（PROTAC）的开发和应用。代表性论文发表于Nature Chemical Biology, Nature Communications, Cell Research, Cell Discovery, Leukemia, Journal of Medicinal Chemistry, Protein & Cell 等学术期刊。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言肿瘤细胞通常被认为线粒体呼吸有缺陷，但人类非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织相对于邻近的良性肺有增强的葡萄糖氧化。2024年2月6日，中国医学科学院/北京协和医学院周光飙、王桂珍及刘雨桃共同通讯在Cell Discovery (IF 34)在线发表题为“CIP2A induces PKM2 tetramer formation and oxidative phosphorylation in non-small cell lung cancer”的研究论文，该研究表明癌蛋白蛋白磷酸酶2A (CIP2A)抑制糖酵解并促进非小细胞肺癌细胞的氧化代谢。CIP2A结合到丙酮酸激酶M2 (PKM2)并诱导PKM2四聚体的形成，丝氨酸287作为PKM2二聚体-四聚体转换所必需的新磷酸化位点。CIP2A将PKM2重定向到线粒体，通过在苏氨酸69位点磷酸化Bcl2，导致Bcl2的上调。临床发现肿瘤组织中CIP2A水平与磷酸化PKM2 S287水平呈正相关。以CIP2A为靶点的化合物与糖酵解抑制剂协同抑制细胞体外和体内增殖。这些结果表明CIP2A通过促进四聚体PKM2的形成来促进氧化磷酸化，并且靶向CIP2A和糖酵解在非小细胞肺癌中具有治疗潜力。癌细胞表现出Warburg效应(有氧糖酵解)，通常被认为线粒体呼吸有缺陷。然而，最近的证据表明，癌细胞也保留线粒体呼吸，这使得细胞增殖。通过术中13C-葡萄糖在体内输注，人类非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤相对于邻近良性肺具有增强的葡萄糖氧化。与此一致的是，小鼠肺癌肿瘤的生长需要电子传递链氧化泛醇，而癌细胞中缺乏线粒体复合物III会损害肿瘤的生长。与正常肺组织相比，KRAS驱动的小鼠肺肿瘤增加了葡萄糖对三羧酸(TCA)循环的贡献，而丙酮酸的线粒体代谢对于体内肿瘤的形成至关重要。在细胞水平上，肺腺癌细胞线粒体复合体I和复合体II呼吸活性显著增加；胆管癌干细胞(CSCs)具有更有效的呼吸表型，并依赖线粒体氧化代谢来维持干细胞，而胰腺癌CSCs依赖于氧化磷酸化(OXPHOS)，代谢可塑性非常有限。在三阴性乳腺癌中，一些癌蛋白，如C-JUN，可以抑制糖酵解途径，而MYC和MCL1通过增加OXPHOS和活性氧的产生，共同维持CSC对化疗的耐药性。然而，氧化代谢在癌细胞中的作用和机制仍有待阐明。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由催化C亚基、结构α亚基和调节/可变B亚基12组成，它的能力被PP2A的癌症抑制剂(CIP2A)抑制，CIP2A是一种多功能癌蛋白，以前被称为KIAA1524或p9013-15。CIP2A与100多种蛋白质相互作用，并参与许多信号通路。CIP2A结合并阻止c-Myc的蛋白水解降解，并与DNA拓扑异构酶II结合蛋白1 (TopBP1)相互作用，以维护染色体稳定性，并使粉碎的染色体在有丝分裂进入时聚集。CIP2A调节细胞周期进程，促进恶性转化，并使癌细胞耐药。CIP2A在70%以上的实体或血液恶性肿瘤中过表达，并与患者预后不良相关。小鼠CIP2A缺乏可导致对DMBA诱导的基底样乳腺癌形成的抗性，抑制CIP2A可诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡或细胞衰老，并在体外和体内显示出治疗效果。因此，CIP2A在癌变过程中发挥着重要的作用，更多地研究其生物学功能可能有助于开发CIP2A抑制剂来治疗癌症。CIP2A诱导PKM2构象变化和生物学功能的示意图（Credit: Cell Discovery）一些报道表明CIP2A与代谢重编程有关。在慢性髓性白血病细胞系K562中，CIP2A可增强线粒体呼吸功能。在人视网膜色素上皮RPE1细胞中，CIP2A的缺失使代谢转向糖酵解途径，增加糖酵解相关基因的表达，并下调TCA周期相关基因。然而，CIP2A在代谢重编程中的作用机制及其与代谢酶的潜在相互作用有待进一步研究。该研究检测了CIP2A在代谢重编程中的作用和作用机制，发现CIP2A通过诱导PKM2寡聚化促进NSCLC细胞的氧化代谢，其中S287是决定二聚体转换的关键氨基酸。CIP2A通过PKM2介导的Bcl2苏氨酸磷酸化上调Bcl2 (T)。体外和体内实验表明，CIP2A抑制剂联合糖酵解抑制剂对NSCLC细胞的抑制作用增强。该研究揭示了CIP2A在调节PKM2寡聚化中的新功能，并为非小细胞肺癌的治疗提供了潜力。原文链接https://www.nature.com/articles/s41421-023-00633-0责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Science最新发布：全世界最前沿的125个科学问题热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈

健康的细胞努力保持我们的DNA的完整性，但是有时在细胞分裂过程中，一条染色体会与其他染色体分离并发生断裂。随后，这些微小的DNA片段在新的细胞中以随机的顺序重新组合，有时会产生致癌的基因突变。 健康的细胞努力保持我们的DNA的完整性，但是有时在细胞分裂过程中，一条染色体会与其他染色体分离并发生断裂。随后，这些微小的DNA片段在新的细胞中以随机的顺序重新组合，有时会产生致癌的基因突变。 这种染色体破碎和重新排列被称为染色体碎裂（chromothripsis），发生在大多数人类癌症中，特别是骨骼、大脑和脂肪组织的癌症。染色体碎裂现象在十多年前首次被描述，但科学家们并不了解漂浮的DNA片段如何能够重新组合起来。 在一项新的研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员解答了这个问题，发现染色体碎裂后的DNA片段实际上被拴在一起。这使它们能够在细胞分裂期间作为一个整体迁移，并被其中的一个新的子细胞重新捕获，在那里它们以不同的顺序重新组装。相关研究结果于2023年6月14日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Mitotic tethering enables inheritance of shattered micronuclear chromosomes”。 论文通讯作者、加州大学圣地亚哥分校医学院细胞与分子医学系主任Don W. Cleveland博士说，“这类似于一个被砸碎的汽车挡风玻璃，这种安全玻璃的设计是为了让所有的碎块保持原位。我们在这项新的研究中所做的是找到这样的安全玻璃并确定它的几个核心成分，我们如今可以将它们作为治疗靶标进行探索。” 当染色体断裂并重新排列时，这可以以多种方式启动或加剧癌症。比如，如果一个肿瘤抑制基因在这个过程中被破坏，细胞将变得更容易形成肿瘤。 在其他情况下，染色体上通常不相近的基因会突然拼接在一起，产生一种新的致癌融合蛋白。在染色体碎裂期间，许多这样的变化同时发生，而不是逐渐发生，从而加速了癌症产生或它的治疗抵抗性。 图片来自Nature, 2023, doi:10.1038/s41586-023-06216-z。 既然这些作者确定了这一过程中的一个早期步骤---将破碎的DNA片段拴在一起---他们想知道他们是否能阻止这一过程。通过破坏这种拴系，他们可能会阻止重新排列的染色体的形成，从而减少可能携带致癌突变的细胞数量。 为了做到这一点，论文第一作者Prasad Trivedi博士设计了一种拴系蛋白的改良版，以便他能按要求诱导它的破坏。当他这样做时，这种拴系复合物解体了，断裂后的DNA片段没有聚集，所产生的细胞显示出存活率下降。 这些作者提出，这种拴系复合物中的蛋白，特别是CIP2A（cellular inhibitor of PP2A），可能是染色体不稳定肿瘤的一种有吸引力的治疗靶标。 Cleveland说，“染色体护理和修复过程在许多方面促成了癌症，因此我们越了解它如何起作用，我们就能更好地对它进行微调以治疗癌症。”（生物谷 Bioon.com） 参考资料： 1. Prasad Trivedi et al. Mitotic tethering enables inheritance of shattered micronuclear chromosomes. Nature, 2023, doi:10.1038/s41586-023-06216-z. 2. Tethering of shattered chromosomal fragments paves way for new cancer therapieshttps://medicalxpress.com/news/2023-06-tethering-shattered-chromosomal-fragments-paves.html