YTHDF1

【导读】 前列腺癌（PCa）是泌尿系统中常见的恶性肿瘤，仍是男性中最常见的癌症。 4月18日，郑州大学第一附属医院与上海交通大学研究团队合作共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“YTHDF1/RNF7/p27 axis promotes prostate cancer progression”，本研究中，研究人员表明参与 N6-甲基腺苷（m6A）修饰信号通路的读取蛋白之一 YTHDF1 在前列腺癌（PCa）癌组织和细胞中高表达，这与不良的临床结果相关。本研究揭示，YTHDF1 敲低通过蛋白酶体降解信号降低 p27 蛋白稳定性，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和异种移植瘤形成。候选 p27 目标 E3 泛素连接酶筛选确定 RNF7 是 YTHDF1 的直接下游靶点，且依赖于 m6A。此外，研究人员提供了证据表明 YTHDF1 或 RNF7 耗竭通过增加细胞凋亡使肿瘤细胞对化疗药物顺铂敏感。本研究结果表明，NEDD8 泛素样修饰抑制剂 MLN4924 在体外和体内均能有效抑制前列腺癌进展。本研究强调了 YTHDF1/RNF7/p27 轴在前列腺癌中的关键作用，表明其有可能成为新的治疗靶点。 https://www.nature.com/articles/s41419-025-07648-3#Sec19 研究背景 01 前列腺癌（PCa）是泌尿系统中常见的恶性肿瘤，据最新的癌症统计数据，它仍是男性中最常见的肿瘤。前列腺癌单独占新诊断病例的五分之一，前列腺癌的死亡率在男性肿瘤中也位居第二。年龄较大、基因突变、饮食和炎症是前列腺癌发病的重要因素。此前有报告称，由于饮食习惯以植物为主，前列腺癌在东方国家较为罕见。然而，根据 2000 年至 2011 年中国癌症统计数据，随着我国生活水平的提高、环境污染的加剧以及饮食结构的逐渐西化，前列腺癌的发病率和死亡率也显著上升。 RNF7 可作为前列腺癌的潜在治疗靶点 02 为了探究抑制 RNF7 是否具有与 YTHDF1 相似的临床应用潜力，研究人员使用了小分子抑制剂MLN4924，，通过阻断蛋白拟素化来使 RNF7 失活。研究人员发现 MLN4924 显著降低了肿瘤细胞的活力。与之前的结果一致，向肿瘤细胞中添加 MLN4924 显著抑制了肿瘤细胞的增殖，并以浓度和时间梯度依赖的方式增强了 p27 蛋白的稳定性，但对转录本没有影响，且这种增强作用依赖于泛素化。此外，MLN4924 与顺铂（DDP）联合治疗显著增加了细胞凋亡。另外，异种移植瘤形成实验验证了 MLN4924 给药抑制了肿瘤生长，并增强了肿瘤细胞对 DDP 的敏感性，这从增加的 p27 和 CC3 阳性以及减少的 Ki67 免疫组化染色比例得到了证实，无论是否接受 DDP 治疗。总之，上述数据表明，拟素化抑制剂 MLN4924 未来有望进一步开发用于治疗前列腺癌患者。 拟素化抑制剂MLN4924抑制了肿瘤生长 结论 03 这些结果表明，靶向 YTHDF1 可能会将前列腺癌从“免疫冷”肿瘤转变为“免疫热”肿瘤，从而提高对免疫检查点阻断疗法的敏感性。总之，本研究结果强调了 YTHDF1 在前列腺癌进展中的关键作用，并表明其可能成为未来临床干预的治疗靶点。 参考资料： https://www.nature.com/articles/s41419-025-07648-3#Sec19 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 责任声明：本稿件如有错误之处，敬请联系转化医学网客服进行修改事宜！ 微信号：zhuanhuayixue 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 浙江｜2025年5月9日 ▶ 首届精准医学国际学术研讨会暨队列研究先锋计划颁奖仪式 🕓 上海｜2025年6月12-15日 ▶ 第七届上海国际癌症大会暨第十八届全国医学生物技术研讨会暨第六届中德双边论坛 🕓 上海｜2025年7月17-18日 ▶ 第四届长三角体外诊断产业高峰论坛 🕓 北京｜2025年9月19-20日 ▶ 第六届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会 🕓 上海｜2025年11月14-15日 ▶ 第二届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

在慢病毒载体和病毒样颗粒（VLP）的生产中，数字孪生（DT）技术的应用展示了显著的优势。本研究通过开发和验证一个结合了所有单元操作的基于物理化学的机械模型和过程分析技术（PAT）策略的数字孪生，展示了自主操作方法对生产规模的好处。数字孪生技术允许实时接收来自物理过程的数据，并通过实施合适的控制策略来控制过程，以保持产品质量。 对于灌流模式下的连续操作，主要挑战在于有效分离VLP和细胞（包括细胞碎片）的大颗粒物质，因为它们的大小相似。在这里，需要创新的切向流过滤操作，以避免低机械应力泵的快速堵塞。使用模拟案例研究，实现了生产率的两倍提高，这种增长与之前针对其他实体（如质粒DNA、单克隆抗体（mAb）和单链可变片段（scFv）片段）的改进类似。 将数字孪生应用于先进过程控制（APC）策略的优势已证明，在99.9%的可靠性下，生产率可额外提高20%。这种方法不仅提高了生产效率，还确保了产品质量的一致性，为生物制药行业的连续生产提供了强有力的支持。 简介生产模式 补料分批上游与批次下游：2003年首次报道采用补料分批上游和批次下游模式进行LV和VLP的生产。该模式在早期为LV和VLP的生产提供了基础，但存在一定的局限性。 灌流模式：近年来，灌流模式逐渐被应用于LV和VLP的生产，能够实现更高的细胞密度和产物浓度，从而提高生产效率。MPI小组和Cervera集团等均开展了相关研究，展示了灌流模式在连续上游生产中的潜力。生产细胞系统 人类胚胎肾细胞 (HEK293)：是LV和VLP生产的主要细胞系统，具有高转染效率和易于培养的特点。 其他细胞系：如鸭胚胎源性EB66细胞和永生化禽悬浮细胞系等，也被用于特定病毒系统的生产研究。下游工艺 批次下游工艺：通常包括直流深层过滤收获、核酸酶处理、超滤/洗滤（UF/DF）、阴离子交换（AEX）层析和尺寸排阻层析（SEC）等步骤，总产率一般在20%到40%之间。 半连续下游处理：通过批次直流深层过滤和在Mustang Q AEX膜层析之间循环进行，生产率比批次工艺高出13倍。病毒样颗粒 (VLP) 的特点 与LV的区别：VLP与基于HIV-1的LV不同，后者通常采用具有细胞毒性的水泡性口炎病毒（VSV-G）糖蛋白进行假型化，需要在生物安全2级条件下生产。 生产细胞系：本文描述的VLP是由一种新型稳定的293FMos1.Gag/Mos2S.Env生产细胞系产生的，该细胞系表达嵌合体Gag和Env蛋白。灌流工艺的挑战与创新 挑战：灌流工艺中，有效分离VLP和细胞碎片等大颗粒物质是一个主要挑战，因为它们的尺寸相似，容易导致膜污染和堵塞。 创新：研究者们探索了切向流过滤（TFF）等技术，以提高切向流去除碎片和细胞的能力，从而提升过滤效率和生产性能。 基础知识和最新技术 生物制药的连续生物生产（Continuous Biomanufacturing, CBM）相较于传统的批次生产具有显著优势，包括更高的敏捷性、灵活性、产品质量、成本节约以及社会效益。然而，制药行业仍然主要依赖于批次生产工艺，这在一定程度上限制了行业的创新和效率。这种依赖性导致了生产过程中的不灵活性和不稳健性，可能会对公众健康造成风险，因为生产失败可能导致药品供应瓶颈。 连续生产的一个主要优势在于其能够显著增加产量，同时避免了传统批次生产中常见的诸多问题。这种生产方式的灵活性使得在面临供应瓶颈或紧急情况需要迅速提升产量时，能够更加高效地响应。例如，在全球性公共卫生事件中，连续生产能够快速调整产量以满足激增的药品需求。 传统的批次工艺由于其全球分布的供应链，容易受到各种外部因素的干扰，如自然灾害、政治冲突等，导致生产中断和供应链断裂。而连续生物生产则可以实现区域性和国家性生产，减少了对全球供应链的依赖，从而降低了这种脆弱性。例如，一些国家正在探索建立本地化的连续生产设施，以确保在国际供应链受阻时仍能稳定供应药品。 这种生产模式的转变不仅提高了生产的稳定性和可靠性，还为制药行业带来了更高的运营效率和成本效益。因此，连续生产在现代制药行业中具有重要的战略意义，有助于构建更加稳健和灵活的药品供应链。 连续生物生产（Continuous Biomanufacturing, CBM）支持使用先进的过程控制（Advanced Process Control, APC），这种控制策略可以显著提高产品质量，同时降低初始投资成本。虽然批次工艺也可以从APC中获益，但对于连续工艺来说，可靠的控制策略是实现自动化操作的关键。此外，CBM通常对环境的影响较小，因为它能够更有效地利用资源并减少废物产生。然而，CBM也要求有训练有素的技术人员来操作和维护复杂的生产系统。 连续生物生产（Continuous Biomanufacturing, CBM）的另一个潜在优势在于其能够显著缩短供应链。传统的批次生产流程往往需要将中间产品存储在容器中，并运输到全球各地的下一个生产环节，这不仅增加了物流成本，也延长了生产周期，并且带来了产品在存储和运输过程中变质或污染的风险。 相比之下，CBM允许生产过程在地理上更加集中，可以按区域或全国范围组织生产。例如，可以在靠近原材料供应地或目标市场的地区建立连续生产设施，从而减少中间产品的存储和运输需求。这种区域化的生产布局不仅降低了物流成本，还加快了产品的上市速度，提高了生产的灵活性和响应速度。 此外，缩短供应链还有助于降低生产过程中的不确定性和风险。在全球供应链受到自然灾害、政治冲突或其他外部因素干扰时，区域化的连续生产可以更好地保障生产的连续性和稳定性，确保药品等重要产品的稳定供应。因此，CBM在优化供应链管理方面具有重要的战略意义，有助于提高整个生物制药行业的效率和韧性。 在现代生物技术中，开发和实施基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）的工艺方法的数字孪生（Digital Twin, DT）是极具挑战性的任务之一。这些方法要求在经过验证的可接受范围内实现灵活的操作点，并通过过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）支持的先进过程控制（Advanced Process Control, APC）来实现自动化。 与传统的基于离线分析和不灵活工艺规范的工艺控制相比，这种方法具有显著优势。传统的工艺控制依赖于事后检测和调整，而基于QbD的数字孪生和PAT结合的APC能够实现实时监测和控制，确保产品质量始终处于预期范围内。这种实时控制不仅提高了生产效率和产品质量，还降低了生产成本和风险。 在药物底物领域，病毒样颗粒（VLP）作为一种灵活的疫苗平台，显示出了巨大的潜力。基于HIV的VLP，例如HIV-1 Gag VLP，因其能够高效组装和释放VLPs而非常突出。通过添加异源囊膜蛋白，如SARS-CoV-2的S蛋白，可以使这些VLP更加通用。由于这些是囊膜VLP，因此精确的过程控制和最短的保持时间至关重要。 HIV属于逆转录病毒家族，是一种慢病毒，感染后会导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。艾滋病患者更容易受到致命的机会性感染。尽管经过了25年多的探索，但尚未开发出有效的候选疫苗，这凸显了进行更深入研究的必要性。 VLP为抗原呈递提供了一种有前景的方法。这些多蛋白和膜颗粒在结构和组织上类似于真实病毒，但不含有病毒基因组，因此它们安全且不可复制。HIV的Gag、Pol和Env多聚蛋白在颗粒成熟过程中被蛋白水解加工成亚单位蛋白。然而，在没有pol基因编码的病毒蛋白酶的情况下，VLP也可能保持由未裂解的Gag前体蛋白组成的未成熟HIV颗粒。 与可溶性抗原相比，VLP更胜一筹，因为它们无需添加佐剂即可诱导更强的细胞和体液免疫反应。它们的颗粒状和重复性结构使抗原呈递细胞能够有效吸收，并触发体液和细胞免疫反应。 在哺乳动物细胞中生产HIV类VLP（尤其是在悬浮培养中）非常复杂，因为这些囊膜纳米颗粒易受剪切力、pH波动和渗透压的影响。为了克服这些挑战，质量源于设计（Quality by Design, QbD）方法将工艺参数与产品质量特性联系起来。基于QbD的工艺开发正日益成为生物制药行业的标准，并且是监管机构的要求。全面的控制策略对于实现所需的质量目标产品概况至关重要。经过验证的工艺模型可以定义设计空间，以避免不合格（Out of Specification, OOS）批次。通过基于这些模型开发数字孪生（Digital Twin, DT），可以实现先进过程控制（Advanced Process Control, APC）。整体QbD方法可确保产品质量从开发到生产始终保持一致。通过工艺模型实时预测质量属性，即使在提交后也能实现持续优化。 为了实现病毒样颗粒（VLP）的连续生产，需要一个生物反应器系统来温和地截留对剪切敏感的细胞，同时从反应器中取出产品。有多种系统可用于动物细胞的截留，包括基于膜的系统，例如交替切向流过滤（ATF）和切向流过滤（TFF），以及基于密度差异的系统，例如沉降器（倾斜和声学）或水力旋流器。 ATF灌流是抗体等重组蛋白连续生产中应用最广泛的细胞截留技术。然而，HI-VLP的尺寸通常在100至150 nm之间，这对基于膜的系统提出了独特的挑战。这些颗粒容易堵塞膜，并导致产品在生物反应器中积累。尽管ATF灌流技术在重组蛋白的生产中很流行，但HI-VLP的工艺处理需要进行特定的调整，以避免这些问题并确保生产过程无问题。 对于病毒颗粒生产过程中的细胞截留，声学分离器以及深层过滤器与中空纤维组件的创新组合已被证明是成功的。为了加速基于密度的分离中的细胞沉降，可以通过声共振场增加重力。声学分离器不仅能够分离产品，还能去除死细胞、宿主细胞蛋白和双链RNA，从而提高细胞密度。然而，为了扩大规模和提高吞吐量，需要增加输入功率以保持分离效率。这会导致分离器内的温度升高，因此需要有效的温度控制。此外，声学分离器内溶氧浓度的降低会影响细胞活力。 大孔管状过滤器是尺寸相关分离的首选，因为它可以确保有效的细胞截留和良好的产品渗透性。与声学分离器相比，细胞可以完全循环到生物反应器中，因此不会发生细胞损失。此外，再循环时间更短，因为细胞分离不需要沉淀细胞。 在灌流方面，大孔管状过滤器比声学分离器具有决定性的优势。通过避免使用冷却系统和复杂的泵送策略以及完全截留细胞，管状过滤器效率更高且更易于操作。具体来说，大孔管状过滤器具有以下优点： 高效的细胞截留：大孔管状过滤器能够有效截留细胞，确保细胞完全循环回生物反应器中，避免细胞损失。这与声学分离器相比，后者在高细胞密度培养中可能会出现细胞损失的问题。 简化的操作流程：大孔管状过滤器的操作流程相对简单，不需要复杂的温度控制和泵送策略。这使得整个灌流过程更加高效和易于管理。 减少再循环时间：由于大孔管状过滤器不需要细胞沉淀，再循环时间更短。这提高了生产效率，减少了生产周期。 自动化程度高：大孔管状过滤器可以实现高度自动化，减少人工干预，提高生产过程的稳定性和可靠性。 占地面积小：大孔管状过滤器设备占地面积小，有效利用空间，适合在有限的空间内进行大规模生产。 环境友好：大孔管状过滤器的所有操作过程都在密闭的容器和管道中进行，不会污染工作场所，保持工作环境的清洁。 节约用水：大孔管状过滤器采用压缩空气反吹和稀酸或小度水洗涤，节约用水，减少废水处理成本。 减少产品浪费：大孔管状过滤器的反吹、脱饼、排渣过程在密闭容器中进行，渣饼完全进入回收系统，没有浪费。 质量保证、质量控制和质量源于设计 基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）的工艺开发已成为创造病毒样颗粒（VLP）、质粒DNA (pDNA) 和片段等新医药产品的领先方法。这种方法可确保始终如一的高质量产品，并允许在批准后进行工艺改进。与单克隆抗体（mAb）的既定平台工艺相比，这些新产品缺乏类似的标准化工艺，这凸显了基于QbD的开发的重要性。 QbD理念的核心在于通过科学和质量风险管理，预先定义目标并强调对产品与工艺的理解及工艺控制。这种方法贯穿于药品的整个生命周期，从研发到生产再到上市后的生命周期管理，确保产品质量的稳定性和一致性。在QbD框架下，关键质量属性（CQA）、关键物料属性（CMA）和关键工艺参数（CPP）的确定是基础，通过这些要素的深入理解和控制，可以定义出设计空间（Design Space），并在其中灵活调整工艺参数，以实现产品质量的持续保证。 FDA（美国食品药品管理局）、EMA（欧洲药品管理局）、ICH（人用药品注册技术要求国际协调会）以及各行业工作组都纷纷采取行动，发布了大量的指南，其中比较突出的就是与质量源于设计（QbD）相关的ICH-Q8至Q13。 ICH-Q8：该指南主要关注药品开发过程中的质量设计，强调从研发阶段开始就应考虑产品质量，通过科学的设计和风险评估来确保药品的质量。 ICH-Q9：涉及质量风险管理，为药品开发和生产过程中的风险管理提供了框架和方法，帮助识别、评估和控制风险。 ICH-Q10：介绍了药品质量体系，强调在整个产品生命周期内对药品质量的持续管理和改进。 ICH-Q11：主要针对原料药的开发和生产，提供了关于原料药质量控制的指导。 ICH-Q12：涉及药品生命周期管理中的技术变更，为药品上市后的变更管理提供了指导。 ICH-Q13：是关于连续制造的指南，描述了连续制造的概念、科学方法和监管考虑，适用于原料药和药品的连续生产。 在工艺开发中实施质量源于设计（QbD）原则，需要经过验证的设计空间来确保产品质量的一致性。设计空间是通过实验数据或对工艺的深刻理解来开发的，它定义了输入变量和工艺参数的多维组合，这些组合能够保证产品质量。因此，工艺开发中对数字孪生（Digital Twin, DT）的需求日益增加。数字孪生技术可以通过创建生产过程的虚拟模型，在虚拟环境中模拟和优化生产过程，从而在实际生产之前发现潜在问题并进行调整。这种方法不仅提高了生产效率和产品质量，还为工艺的持续改进提供了可能。 预测工艺模型（Digital Twin, DT）是定量定义和基于知识的工艺优化的关键工具。它们加速了工业开发，同时有助于生成过程知识。这些模型减少了实验工作量，并且由于它们基于物理化学原理，因此它们的适用性超出了最初批准的设计空间。然而，重要的是要确保所使用的任何模型至少与它要替代的实验一样准确和精确。一次只研究一个因素的研究可以表明在多变量研究中应考虑哪些参数。应用实验设计（Design of Experiments, DoE）原则可以创建实验设计来表征设计空间。 过程分析技术和工艺策略 连续生物生产的研究表明，可以实现高产品质量并准时可靠地交付生物制药。向连续生产的转变表明该过程应该实现自动化。尽管与大宗或石化生产等传统方法相比，连续工艺的运行时间相对较短（通常为2周至2个月），但自主运行能够实现产品质量的一致性，并通过先进过程控制（APC）策略将运行状态保持在最佳状态。其好处包括降低运营成本、减少生产工作体积，并通过实时放行检测（RTRT）显著节省质量保证（QA）的成本。 APC以数字孪生（DT）为基础，DT是基于经过验证的工艺模型，必须在监管决策过程中得到明确验证。这些与过程分析技术（PAT）相结合，执行基于统计的数据分析，以制定工艺过程控制策略。PAT通过及时测量原材料和过程中材料的关键质量和性能属性来设计、分析和控制生产，确保最终产品质量。 将数字孪生（DT）融入生物制药的连续生产过程需要过程分析技术（PAT）和质量源于设计（QbD）等关键技术和概念。大多数传感器（尤其是光谱传感器）都是基于化学计量计算，例如偏最小二乘回归和主成分分析，这些方法已在文献中广泛使用。但是，也有基于模型的传感器，它们可以基于质量和能量平衡以及扩展卡尔曼滤波器。这些传感器的实施更耗时，但由于它们基于物理化学原理，因此可以更深入地了解该过程。 在连续生物生产的自动化过程中，数字孪生（DT）依赖于在线过程数据来实时更新工艺模型中的信息。除了压力、电导率、pH值和温度等基本工艺参数外，还需要目标成分和主要杂质的浓度，以确保DT捕获的数据可靠。为了实现这一目标，拉曼光谱、傅里叶变换红外（FTIR）、紫外可见光、荧光和圆二色性等光谱技术已被证明是适用于各种生物生产过程的分析方法。 这些光谱技术提供了对生产过程中化学和生物分子的实时监测能力。例如，拉曼光谱能够提供关于分子内振动的信息，这对于识别物质和分子主链构型非常有价值。FTIR则擅长探测分子内振动的“指纹区域”，能够提供详细的原子键合特性。紫外可见光和荧光光谱可以用于监测目标成分的浓度和纯度。圆二色性光谱则常用于研究生物大分子（如蛋白质和核酸）的二级结构。 本研究的目的是探索强化批次生产的替代方案。通过深层过滤收获或使用切向流深层过滤（TFDF）技术进行连续收获后，利用超滤/透析（UF/DF）进行透析和初步纯化。随后，通过阴离子交换（AEX）层析法进行进一步纯化。为了满足基于质量源于设计（QbD）的自动化工艺要求，需要数字孪生（DT）。DT能够实时接收来自物理过程的数据，并通过实施合适的控制策略来控制过程，以保持产品质量。此外，DT还可以调节过程中的波动和干扰。 图 1. HI-VLP 批次生产流程概述以及连续工艺/收获和下游工艺选项的替代方案。 详细的实验操作和数据分析，请参考原文。 结果 细胞截留系统的评估 在培养过程中，最初采用补料分批模式进行，随后转入交替切向流（ATF）模式继续灌流。灌流进行三小时后，过滤器完全堵塞。在此过程中，共收集到150 ml滤液，相当于过滤器的载量约为50 L/m²。为了更好地理解堵塞情况及本研究所用物料系统，进行了颗粒分析。在第二次收获时，采用与文献中相似的切向流深层过滤（TFDF）过滤器，从补料分批中收获整个细胞培养液。正如预期，在培养过程中，培养基中的颗粒总数随时间逐渐增加（见图2a）。此外，随着细胞数量的增加，更多的细胞外囊泡（EV）被释放到培养基中，导致产品在颗粒总数中的比例下降。同时，还可以观察到平均直径随时间的增加（图2b）。这表明较大囊泡以及EV和产品的可能聚体的比例有所增加。 图2. 针对补料分批培养的过滤实验的颗粒分析结果。(a) 培养时间内的颗粒总数和 VLP 在总颗粒数中的百分比，(b) 培养时间内的基于数值的直径，以及 (c) TFDF 过滤回流液和滤液的粒径与颗粒密度的关系。 对切向流深层过滤（TFDF）滤液的粒径分析显示（见图2c），所有大于约700纳米的颗粒均被分离。由于过滤组件的截止孔径为2-5微米，因此导致过滤器堵塞的临界尺寸范围可缩小至0.7-5微米。所有颗粒中约有10%处于此尺寸范围内。Lorenzo等人能够证明细胞培养液中的粒径分布相当。 通过深层过滤进行批次收获 作为对比测试，进行了深层过滤，该过滤在批次工艺中用作收获。使用了Milistak+ D0HC过滤器。第一层（CE25）的截留孔径为4至8微米，第二层（DE40）的截留孔径为0.55至1微米。 从压力曲线（图3a）可以看出第一层的阻塞情况。因此，主要阻塞发生在4微米以上的尺寸范围内。由于第二层的压力也增加（图3b），因此尺寸范围在0.6至4微米之间的颗粒也会沉积。这大约占第一层的10%。因此，总共有10%的总颗粒介于0.6至4微米之间。过滤载量约为50 L/m²，与Helgers等人的数据一致。用于直接收获而无需预先澄清。这与在ATF模式下使用TFDF过滤器进行细胞截留的连续培养观察到的过滤器载量相当。这表明ATF模式的行为主要类似于直流过滤，与传统的中空纤维组件相比，滤液通过孔隙的回流很少或没有，这应该会延迟过滤器的堵塞。这可能是由于深层过滤器的孔结构，它不具有均匀的结构，但随着过滤器深度的增加而变窄。 图3. Milistak+ D0HC 深层过滤器顶层（CE25，截留孔径：4-8 μm，棕色点）和底层（DE40，截留孔径：0.6-1 μm，绿点）的压力与过滤载量的关系。 为了确定阻塞机制，绘制了恒流运行模式下死端过滤的四种主要阻塞机制的压力曲线。可以使用线性回归来确定主要的阻塞机制和阻塞常数。借助确定的阻塞常数，可以得到图 4所示的压力曲线。 图4. 使用 Milistak+ 深层过滤器 D0HC 进行收获时的压力过程（黑点），其中阻塞常数通过线性回归确定，分别针对饼（灰线）、完全（红线）、中间（蓝线）和标准（绿线）阻塞机制。 分析表明，压力的增加不能完全用滤饼的形成来解释。由于细胞培养液是一种多分散混合物，形成单分散滤饼层的可能性很小。由于所用的过滤材料导致的异质状态，仅假设完全堵塞而不考虑其他堵塞机制是不合适的。 根据判定系数（见表1），可以将堵塞机制标准（R²为0.995）和中间堵塞（R²为0.975）鉴定为主要存在的机制，这与之前的收获结果一致。 表 1. 深层过滤批次收获的四种主要阻塞机制的回归质量和确定的阻塞常数 ATF 模式下通过 TFDF 过滤器进行细胞截留 在ATF实验中，使用的ATF流速约为0.5 L/min，初始时滤液流量设定为1 mL/min。这是为了达到80 pL/cell/day的灌流速率，以在850 mL的工作体积下实现目标细胞密度>17 M/mL。在过滤过程的其余阶段保持此泵设置，以便实验在恒定的跨膜压（TMP）约1.1 bar下进行（见图5）。LMH在开始时显著下降，从第375分钟起仅略有下降（对应于过滤器载量为17 L/m²），此时滤液流量已接近于零（见图5）。因此，评估分为两个部分，以确定滤液流量减少的现有阻塞机制：从实验开始到过滤载量为17 L/m²（图6）以及从17 L/m²到结束。由于灌流中实现的过滤载量为50 L/m²，这与使用深层过滤进行收获的过滤载量相当，因此假设使用ATF和TFDF过滤器的收获主要是直流过滤。 图5. 在 ATF 模式下使用 TFDF 过滤器进行收获时，LMH 和跨膜压随过滤时间的变化。 图6. 在 ATF 模式下，当过滤载量 <17 L/m2 (S1) 和 >17 L/m 2 (S2，透明色) 时，使用 TFDF 过滤器的 LMH收获过程 (黑点)；滤饼 (灰线)、完全 (红线)、中间 (蓝线) 和标准 (绿线) 阻塞机制。 通过线性回归确定的阻塞常数产生了图6所示的曲线。第一部分（<17 L/m²）可以用完全阻塞机制很好地描述，过滤载量最高可达约15 L/m²（R²为0.994）。第二部分（>17 L/m²）没有明显的阻塞机制趋势。然而，通过对第一部分在15–17 L/m²范围内的评估，实验过程可以用标准阻塞机制很好地描述（R²为0.996）。因此，颗粒既沉积在孔内（>15 L/m²），也直接沉积在孔上。与深层过滤收获相比，没有形成滤饼，这表明通过交替切向流（ATF）成功去除了>5 μm的颗粒，例如细胞。 TFF 模式下 TFDF 过滤器的细胞截留 另一补料分批通过使用切向流过滤（TFF）模式的切向流深层过滤（TFDF）过滤器完全收获。为了实现1-2 L/min的补料流速并降低剪切力，采用了隔膜泵。在较低的补料流速下，由于颗粒去除效率较低，预计过滤器污染会更高，从而导致跨膜压（TMP）增加和产品渗透性及滤液流量降低。当液体膜孔隙性（LMH）降低时，TMP在回流液侧最高增加了0.3 bar（见图8）。最大TMP来源于文献中记录的最大值。此外，更高的TMP预计会导致更多颗粒在压力驱动力的作用下被迫进入深层过滤器，从而导致滤液流量和产品渗透率的加速下降。在将细胞培养液浓缩1.6倍后，进行了0.6个设备体积（DV）的置换，使用培养基作为洗涤缓冲液。随后再次浓缩1.6倍，使得最终去除的滤液体积与补料量相同。 图7. 在 TFF 模式下使用 TFDF 对补料分批收获进行颗粒分析的结果。(a) 生物反应器样品的沉淀物和上清液中的颗粒总数以及 VLP 占颗粒总数的百分比，(b) 生物反应器样品的沉淀物和上清液中基于数量的直径，以及 (c) 上清液和沉淀物中尺寸范围为 0.75–5 μm 的颗粒的百分比。 图8. 使用 TFF 模式下的 TFDF 过滤器，收获过程中 LMH 和跨膜压力随过滤时间的变化。 随着工艺时间的推移，颗粒总数逐渐增加。此外，病毒样颗粒（VLP）在颗粒总数中的比例也上升至29%（见图7a）。文献中记录的瞬时转染产生的HI-VLP的比例为26-38%。此外，上清液和沉淀中的颗粒直径随着工艺时间的延长而增大，这表明细胞外囊泡（EV）的产生增加，可能是由细胞死亡引起的。当考虑过滤的临界尺寸范围（0.7-5微米）时，这一现象更加明显。在补料分批结束时的上清液中，所有测量颗粒中有29%处于这一范围内（见图7c），比之前使用的补料分批高出19%。 在1-2 L/min的循环速率下，跨膜压（TMP）约为0.06 bar，最大液体膜孔隙性（LMH）为1082 L/m²/h，在第一次浓缩期间下降到43.6 L/m²/h（见图7）。 对四种主要堵塞机理进行线性回归分析后，考虑到切向流的去除作用，可以确定R²为0.998的标准堵塞机理为第一次浓缩步骤中的当前机理（见表2）。标准堵塞机理的滤液通量变化过程如图9所示。因此，高循环率可以防止颗粒沉积在孔隙及其开口处。 表 2. TFF 模式下 TFDF 连续收获的四种主要阻塞机制的回归质量和确定的阻塞常数 图9. 使用 TFDF 过滤器在 TTF 模式下进行第一步浓缩时 LMH 收获过程（黑点）以及标准阻塞机制的结果过程。 在测试过程中，滤液中颗粒的直径从最初的112-146纳米略有增加（见图10c）。造成这种情况的原因可能是颗粒的聚体化。另一个原因可能是跨膜压（TMP）的驱动力，通过将TMP从0.06 bar增加到0.2 bar，更多的较大颗粒被推过孔隙。在整个实验过程中，过滤器的堵塞仅在滤液流量减少时明显，在将TMP增加到0.2 bar后，滤液流量最后约为100 L/m²/h。没有观察到产品渗透性的下降，因此可以实现96%的回收率和超过266 L/m²的过滤载量（图10a），而病毒样颗粒（VLP）占总颗粒数的比例增加到65%（图10b）。文献中报道，使用切向流深层过滤（TFDF）系统收获慢病毒载体（LV）的回收率为88-100%。 图10. (a) 回流液和滤液中的 VLP 总数，(b) 回流液和滤液中的颗粒总数和 VLP 比例，以及 (c) 基于数量的直径的进展。每个图都针对过滤器载量绘制。 工艺模式对比 为了比较不同工艺模式的生产率，我们采用了比生产率（STY）和单位体积生产率（Pv）作为指标。我们将采用深层过滤进行批次收获和利用切向流深层过滤（TFDF）技术进行连续收获的HI-VLP批次生产与连续生产进行了对比。在连续生产的研究中，考察了两种不同的灌流起始时间情景。第一种情景是，在批次阶段结束后，当细胞浓度达到至少4 M cells/mL且葡萄糖浓度低于2.5 g/L时开始灌流，这与文献中的描述一致。第二种情景则是先进行补料分批培养，直至目标细胞浓度超过17 M cells/mL才启动灌流。在细胞浓度达到20 M cells/mL后，引入细胞废弃步骤以维持恒定的活细胞浓度。由于接种液浓度较高，灌流开始时间比文献中提前了2天，使得总周期缩短至16天。对于灌流部分，还假设其截留产量与连续收获的产量相等。 图11展示了与批次工艺相比，不同工艺模式的STY和Pv。具体的绝对数值和工艺信息详见表3。由于连续收获的产量更高，STY提升了28%，而单位体积生产率则下降了1%。采用连续上游工艺（USP），STY可以显著提高12.3倍（补料分批+灌流）或13.95倍（仅灌流）。然而，由于培养基消耗量较大，单位体积生产率分别下降了22%（补料分批+灌流）和26%（仅灌流）。 图11. USP 中不同工艺模式的相对 STY 和单位体积生产率与以深层过滤作为收获的补料分批的关系。 表 3. USP 中不同工艺模式的 STY 和单位体积生产率以及工艺数据 连续生产的比生产率（STY）明显高于所考虑的补料分批工艺。然而，这并未考虑整个培养基消耗；因此，在此应考虑单位体积生产率。为了使较高的STY补偿较低的单位体积生产率，切向流深层过滤（TFDF）过滤器必须在整个工艺时间内对产品保持渗透性。文献中公布的HI-VLP灌流工艺运行时间长达6天。虽然这些实验都是用稳定的细胞系进行的，但产物的形成是从诱导开始的，并不是在整个过程中持续发生的。此外，Tona等人在感染后3天的收获过程中检测到了过滤器污染，因此必须省略第二个浓缩步骤。因此，对于本研究中使用的连续生产稳定细胞系系统，仍有待确定在不损失产品渗透性的情况下是否可以在目标14天内进行灌流。 工艺总结 评估整个工艺的最重要参数是 VLP 产量以及蛋白质和 DNA 减少量。表 4和图 12a显示了使用深层过滤进行批次收获和使用 TFDF 技术进行连续收获的各个工艺步骤。 表 4. 批次收获 (DF) 和连续收获(TFDF) 过程中的 VLP 回收率、总蛋白减少量和 DNA减少量 图12. (a) 在批次收获（DF，点）和连续收获（TFDF，方块）的过程中，VLP 回收率（棕色）、总蛋白质减少率（蓝色）和 DNA 减少率（绿色）；(b) 收获液的强度（橙色）、深层过滤产物（绿色）以及 UF/DF 产物（蓝色）以及 w/AEX 产物（棕色）随粒径变化的情况；(c) 收获后（左）、TFF 后（中）和 AEX 后（右）样品的 TEM 图像。 由于连续收获的产量提高了21%，因此整个过程的产量可提高1.28倍。在这两种工艺中，都可以去除98%（批次收获）或99%（连续收获）的蛋白质和99%的DNA。 对各个阶段的样本的大小和百分比强度进行分析，如图12b所示。强度曲线与Lorenzo等人的曲线相对应。如上所述，尺寸范围在700纳米至5微米之间的颗粒约占深层过滤过程中分离的总强度的10%。然而，在超滤/洗滤（UF/DF）后的浓缩过程中，大于2微米的颗粒再次可检测到，这可能是由于冷冻过程中聚体的形成和/或UF/DF过程中的浓缩所致。阴离子交换（AEX）增加了VLP尺寸范围的强度。此外，大于800纳米的颗粒会沉积，因此与UF/DF截留液相比，强度显著降低。 在各个工艺步骤中，使用透射电子显微镜（TEM）对完整病毒样颗粒（VLP）进行定性检测分析（图12c）。除了直接分析收获后的样品外，还分析了过滤步骤和层析分析后的样品，如图12b所示。检测到的VLP的预期尺寸范围为100至200纳米。除了VLP之外，还检测到细胞外囊泡（EV）。 实验结果的数字再现 HEK293细胞的培养 先前发表的简化代谢组学模型已适应新的细胞系和改良的培养基，并模拟了补料分批培养。 通过调整参数设置，可以计算出图13所示的氨基酸、葡萄糖、乳酸、产品浓度和活细胞密度。 图13. 氨基酸（单位：mM）、活细胞数（VCD，单位：M cells/mL）和产品浓度（单位：VLPs/mL）的模拟曲线（线）。绿色框标记与实验数据（点）匹配度较高的模拟曲线，红色框标记不匹配的模拟曲线。 在考虑的21种目标物质中，有17种的预测结果非常准确。 为了检验所有氨基酸的重要性，模拟了一个三级因子实验计划。为此，在补料中将每种氨基酸的浓度分别减少或增加50%。实验设计的统计评估基于p值的降低。最大活细胞密度、在最大细胞密度下的工艺时间、产品浓度、倍增时间以及单位细胞生产力被用作目标变量。这些值是基于实验数据设定的。所有其他目标变量的显著参数都是相同的。 图14显示了超过2 log值显著性线（蓝线）的参数。精氨酸、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸和异亮氨酸被确定为最显著的单个参数（见图14）。这些氨基酸的模拟浓度曲线与实验数据非常吻合。模型无法以足够精度再现的氨基酸对于所研究的系统而言并不显著。因此，该模型能够再现显著氨基酸的实验数据，因此被认为是有效的。 图14. 所有重要氨基酸（log值 >2，蓝线）对单位细胞生产力的log值（效应强度）。 为了基于模型优化与特异性生产力相关的补料策略，模拟了一个三级因子实验设计，其中时间点（t1-t6）和添加的补料培养基的量（V1-V6）分别根据实验值增加或减少50%。 通过逐步降低p值，对实验设计（DoE）相对于实验实现的特异性生产率进行了统计评估。特异性生产率的异常值向下（约为0.3-0.7）和向上（>1.5）是由于补料时间和补料添加量的不利或有利组合造成的，这将模型质量降低至R²为0.72。大多数参数组合导致的特异性生产率低于实验实现的特异性生产率（<1）。 从重要性列表（图15b）中可以看出，随着工艺的进行，添加的补料量的重要性日益增加。这同样适用于补料时间，其中补料时间t4在观察范围内无关紧要，而补料时间t3是补料时间的第二重要参数。如果通过模型预测最佳补料策略，则在所研究的测试范围内，更高的补料量总是会导致单位生产率提高。然而，更高的补料率会导致更高的乳酸形成，这会影响细胞生长，从而影响生产率。例如，当补料量增加三倍时，单位生产率会降低50%以上。无法明确说明时间点，尽管在进行的实验中，一些较早的补料时间会提高单位生产率（见图16）。 图15. 补料时间和补料量对单位细胞生产力的回归和影响强度（a）实际与预测图（b）。 图16. UF（a）和 DF（b）的 LMH 随时间变化的实验曲线和模拟曲线比较。 内联 DF 超滤/洗滤（UF/DF）的数字孪生（DT）预测与实验结果非常吻合。每次实验开始时液体膜孔隙性（LMH）的下降是由于边界层阻力增加导致通量缓慢下降而引起的。 AEX 层析法 在使用阴离子交换（AEX）层析法进行纯化建模时，模型参数是通过实验确定的。轴向分散系数和空隙率是通过测量电导率和梯度以流体动力学方式确定的。由于空隙率在很大程度上取决于分子特性，因此使用具有类似柱的经验值作为指导。Hengelbrock等人已经提到了HIV Gag-VLP的相关数据。分馏用于确定浓度和等温参数。图17比较了所得的模拟结果，其中模型参数包括电导率、病毒样颗粒（VLP）浓度以及DNA和蛋白质浓度。使用该模型，曲线匹配得非常好，并且处于实验和模拟精度范围内。 图17. 实验层析图和模拟层析图在电导率、pH 值、DNA、蛋白质和 VLP 浓度方面的比较，其中 w/AEX 的负载为 0.75 CV。 过程控制策略 为了开发基于经过验证的数字孪生（DT）（包括质量源于设计（QbD）方法下的过程分析技术（PAT）策略）的自主操作系统，必须执行以下工作包。首先，必须进行风险评估，包括初始的鱼骨图（Ishikawa）分析以及后续的单因素（OFAT）和多因素（MFAT）研究。这些研究会产生风险排名，其中总结了确定的风险严重程度分数。这可以定义关键工艺参数（CPP），这些参数将分为控制良好的CPP（WC-CPP）和需要进一步控制的CPP，后者是最终控制策略的一部分。此外，还需要一个经过实验验证的独特DT，并且需要选择一个PAT概念。成功标准是能够足够快速和精确地基于PAT确定关键工艺属性（KPA）。文献中已经针对PCC和CTCC模式下的连续层析的不同系统详细描述了此工作流程以及膜工艺，特别是SPTFF。这些研究涵盖了与本工艺相同的单元操作，包括批次和连续操作。已发表经过验证的工艺模型和参数确定工作流程。因此，本研究的重点是讨论哪种控制策略适合不同的工艺步骤。 根据图 18所示的流程图，详细说明了 CPP 和 KPA 以及所选的 PAT探针，解释了控制策略： 图18. APC 作为 DT 和 PAT 的组合的工艺流程图。 在上游工艺（USP）中，拉曼和傅里叶变换红外（FTIR）技术已被证明是可行的，并且选择了拉曼检测器来测量葡萄糖和乳酸浓度，以实现优化的补料策略。浊度决定了总细胞密度（TCD），传感器可用于活细胞密度（VCD）测量。此外，SOPAT系统可实现细胞系统的粒径分布（PSD）。由于病毒样颗粒（VLP）由异质的大颗粒分布表示，因此需要离线的尺寸排阻色谱-多角度光散射/动态光散射（SEC-MALS/DLS）来测量高颗粒量和宽颗粒分布的产品浓度，例如在培养后进行过滤。在这里，数字孪生（DT）与其它在线数据一起输入并给出VLP滴度浓度，该浓度已通过离线SEC-MALS/DLS验证。在USP期间，产品和杂质浓度、体积或任何组合都可能有所不同。由于污染物浓度低，需要离线测量DNA和宿主细胞蛋白（HCP）的纯度。因此，纯度是借助DT按DNA和HCP与VCD/TCD比率的比例在线估算的。本文讨论了在批次模式（表5）和连续模式（表6）下采用和不采用控制策略时下游工艺（DSP）控制这些波动的情况。（表格内容，请参考原文。） UFDF1和2利用PID标准控制器来控制PI和MFC检测的跨膜压（TMP）和液体膜孔隙性（LMH），以及FTIR检测器来精确评估缓冲液置换质量。UFDF中的关键工艺参数（CPP）/良好控制的CPP（WC-CPP）是剪切速率、TMP、最终产品浓度和上样缓冲液的置换体积。剪切速率通过MFC控制并保持在控制空间内。由于剪切速率取决于流速，因此取决于泵速，因此这是一个WC-CPP，没有问题。TMP通过PI测量并保持在控制空间内。如果观察到TMP增加，则打开控制阀。这也是一个WC-CPP。 阴离子交换（AEX）通过二极管阵列检测器（DAD）控制分馏分切割点的紫外（UV）限值，作为基于事件的切割标准。对于AEX，上样质量应保持恒定以确保稳定的处理和调度。因此，需要使用DT（经SEC-MALS/DLS验证）和MFC测量浓度和上样量。这通过按比例调整体积来确保AEX的正确上样量。如果浓度低于所考虑的工艺变化，则上样时间和/或上样量会随着体积的增加而相应增加。 批次模式浓度控制场景 在批次工艺中，数字孪生（DT）（经SEC-MALS/DLS验证）检测到的产品浓度波动最多可增加2倍，这些波动在UFDF1步骤中得到控制。典型的UFDF过程包括初始浓缩阶段、澄清过滤（DF）和最终浓缩。 为了使DF阶段的浓度保持恒定，与上游工艺（USP）浓度波动成比例，在初始浓缩阶段进行的体积减少较少。因此，为了在DF阶段结束时实现相同的缓冲液置换，需要随着时间的推移按比例置换缓冲液，从而导致液体膜孔隙性（LMH）增加。然而，LMH的增加受到临界通量值的限制，而临界通量值又取决于颗粒浓度以及进料流速。对于LV SPTFF，Chaubal等人对此进行了研究。他们发现，在进料通量为55 LMH时，3E10颗粒/mL的临界通量为41 LMH。由于批次UFDF1中的正常工作点设置为20 LMH，因此将LMH增加2倍将是上限。通过这种控制策略，成比例的较大产品体积将被发送到阴离子交换（AEX）步骤，这将需要通过额外的循环进行调整。 或者，可以将增加的USP浓度直接发送到AEX，而在中间的UFDF1中，工艺参数与参考值保持不变。这将导致UFDF操作期间颗粒浓度成比例增加。如果选择此策略，则需要增加进料通量以抵消增加的污染风险。反过来，体积流量的增加会导致剪切应力和潜在的颗粒损失。通过这种方法转发的产品体积将保持不变；但是，增加的浓度将与USP波动成比例，需要在AEX中通过额外的循环进行处理。 因此，在两种策略之间做出选择时，建议在UFDF步骤中调整浓度，并将比例较大的产品体积转发到AEX步骤，因为UFDF中的污染和剪切应力较少。 体积波动控制场景 在批次模式下，收获体积可能会因补料培养基消耗量的轻微调整而有所变化。然而，与生产细胞的整体生产力相比，收获体积的变化不应超过±10%，这可能导致浓度增加高达2倍。这些体积变化可以在UFDF1中得到有效控制，从而使得后续AEX步骤的体积保持恒定，而病毒样颗粒（VLP）浓度则成比例地增加或降低。 DNA 浓度波动 典型的慢病毒载体（LV）生产平台预期的DNA浓度水平在上游工艺中低于1 mg/L。目前尚无过程分析技术（PAT）检测器能够稳健地检测到如此低的浓度。尽管大多数已发表的工艺策略都包括使用核酸酶的酶促消化步骤来处理DNA，但本工艺不会引入任何添加剂，以减少分析和工艺工作量，从而确保完全去除此类酶。为了确保最终产品配方中的DNA低于规格限值（<10 ng/剂），从超滤/洗滤（UFDF1）到阴离子交换（AEX）和最终UFDF2的分离因子足够大，使得在参考情景中，DNA浓度低于1.5 ng/剂，即使上游工艺中DNA杂质水平增加高达6倍也是可以接受的。对于过程控制，借助数字孪生（DT）确定与DNA和宿主细胞蛋白（HCP）相关的病毒样颗粒（VLP）纯度。离线分析用于质量保证（QA）。 如果AEX后的DNA水平超过此阈值，则可以通过增加UFDF2中的澄清过滤（DF）次数进一步降低DNA水平。 连续模式浓度控制场景 由于实际的灌流体积流速和浓度会随时间变化，工艺必须补偿这些波动以确保产品的恒定产量和质量。这是通过质量流量控制器确定的，并通过增加单通道切向流过滤（SPTFF）中的液体膜孔隙性（LMH）来调节，以保持体积流量恒定，具体细节在批处理部分有更详尽的描述。通过这种策略，可以平衡±10%的实际波动。基于紫外（UV）检测的控制器用于在装载期间监测突破，可保持脉冲色谱柱（PCC）的切换时间，从而优化塔的装载。假设浓度恒定，这意味着PCC中需要额外纯化10%的产品，这在PCC的工艺设计范围内。当流速再次降低时，任何进一步的增加都需要通过待处理的PCC前面的缓冲罐进行缓冲。产品质量减少10%将导致PCC中的装载周期更长，这也应该在规范范围内。 同样的逻辑也适用于上游工艺（USP）中产品浓度偏差±10%的情况，在这种情况下，波动由PCC通过减少上样时间来控制。浓度的任何进一步增加都会导致PCC上样时间减少，从而导致调度问题，其中下一个要上样的柱尚未完成重新平衡步骤。此时，当USP浓度再次降低时，需要将进料转移到缓冲罐中进行处理。正如Löfgren等人所述，病毒样颗粒（VLP）浓度的降低将通过增加PCC中的上样时间来控制。 为了保证最终产品的纯度，需要考虑灌流液中的DNA浓度。如批次控制策略中所述，所开发的工艺足够稳定，可以处理高达+600%的偏差。与批次模式不同，在连续工艺中，SPTFF不可能有额外的处理时间；在极少数情况下，如果出现DNA污染，则需要通过额外的批次超滤/洗滤（UFDF）来纯化产品。 讨论和结论 在交替切向流（ATF）模式下使用管状深层过滤器进行的灌流实验显示，过滤载量非常低，不足50 L/m²。实验表明，在ATF模式下，过滤器被尺寸在700 nm至5 μm之间的颗粒（主要是细胞碎片）阻塞。 为了验证过滤能力低的原因是否是交替切向流去除颗粒不足，使用相同的过滤组件（2-5 μm截留孔径）进行收获，但用低剪切膜泵以切向流过滤（TFF）代替ATF，结果过滤能力从50 L/m²提高到了266 L/m²。Quattroflow系列膜泵因其在生物生产中的广泛应用，如超滤/洗滤（UF/DF）等操作，使得该解决方案易于实现工业规模放大。 所提出的下游工艺（DSP）与现有的完全集成、封闭和连续的工艺不同。产品分离和5倍浓度增加是通过连续UF/DF实现的，使用单通道切向流过滤（SPTFF）技术和300 kDa中空纤维膜，在40 LMH下运行。进一步纯化是通过阴离子交换（AEX）在1 × 10¹¹ VLP/mL吸附的负载下进行的，最终UF/DF的性能参数与UF/DF1相同。总工艺收率为59%（比文献高1.5-3倍），DNA（1.5 ng/剂）和蛋白质减少了99%，从而确保了法规要求的低于10 ng DNA/剂的纯度水平，达到了产品规格。 数字孪生（DT）支持加速工艺设计和开发，包括过程控制系统配置在内的基本和详细工程，并结合现有过程控制系统启用操作员培训模拟器等。此外，操作员的工作量也大大减少，因为他们能够并行操作不同的工厂 - 这是提高产品稳定性和产能的最理想选择。基于数字孪生的过程自动化将所需操作员的数量减少了一半，并大幅降低了他们的工作量甚至压力水平。 在下游工艺（DSP）中，数字孪生（DT）和过程分析技术（PAT）支持的实时放行检测（RTRT）可将DSP的生产效率提高2倍，因为消除了保持时间。借助DT，可以显著减少批次故障；先进过程控制（APC）可提供99.9%的可靠性。在上游工艺（USP）中，可以通过绘制代谢图来优化补料，从而将生产率提高高达70%。通过使用PID控制器实施优化控制策略，可以精确控制USP中的关键工艺参数（CPP），例如pH值和溶氧浓度。此外，还可以控制诸如波动体积流量（特别是碱）等干扰变量，从而将关键工艺属性（KPA）保持在理想范围内。通过使用这种控制策略，可以降低批次失败率，并减少导致产品浓度和质量变化的过程波动。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

编辑丨王多鱼 排版丨水成文 近年来，生物大分子的液-液相分离（LLPS）现象及其所形成的无膜亚细胞结构——生物分子凝集体（Biomolecular condensates），已成为科研领域的热点。这些凝集体能够在不依赖膜结构的情况下，对生物大分子进行空间分隔，从而实现对细胞生理过程的精准时空调控。其中，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是这一调控机制的重要基础。因此，深入解析特定生物分子凝集体中的蛋白质互作，对于揭示其形成机制与功能具有重要意义。 然而，由于生物分子凝集体的动态形成过程及缺乏清晰膜结构边界的特性，传统物理分离、免疫共沉淀等方法难以有效保留其互作信息。同时，其内部结构的复杂性和拥挤性，使得基于可扩散探针的邻近标记方法易产生较多假阳性结果。带有光交联基团的非天然氨基酸能在蛋白质翻译过程中被整合进感兴趣的蛋白质（POI）中，并在光激发后产生固定在蛋白质上的活性中间体，从而实现高度时空特异性的交联，广泛应用于捕获活细胞中的直接和瞬时PPI。其中，可代谢插入的光交联氨基酸作为天然氨基酸的类似物，能够通过细胞代谢通路全局性引入整个蛋白质组中相应氨基酸位点，实现多点插入，在捕获LLPS体系中的多价相互作用时具有优势。 2024年11月5日，北京大学陈鹏教授课题组在 Nature Chemistry 期刊发表了题为：Spatiotemporal protein interactome profiling through condensation-enhanced photocrosslinking 的研究论文。 该研究报道了一种时空特异的蛋白质光交联技术——DenseMAP（Condensation-enhanced Spatial-directed Metabolic Incorporation-Assisted Photo-crosslinking），通过将空间特异的蛋白质标记与凝聚增强的光交联相结合，对活细胞中特定生物分子凝集体的蛋白质相互作用进行了高效捕捉和鉴定。 首先，研究团队利用生物信息学手段分析了20种氨基酸在生物分子凝集体蛋白质组中的分布，发现赖氨酸丰度较高，且由于残基带正电，较多地分布于蛋白质互作界面，基于此他们开发出δ位带有光交联基团双吖丙啶（diazirine）的新型光交联赖氨酸（δ-photo-lysine，δK*）。与此前报道的γ位带有光交联基团的光交联赖氨酸相比，新型探针更易合成，光交联的效率更高。他们还验证了插入δK*后对细胞正常生理状态和蛋白质功能的影响很小，之后又通过1,6己二醇处理以及相分离功能失活突变体的交联实验证明，基于纳米级的交联半径以及多位点插入的特性，δK*在拥挤的相分离体系中具有更高的交联效率，实现了一种“凝聚增强”的效应。 DenseMAP策略及其生物学应用示意图 由于生物分子凝集体有着复杂的组织结构，其中的蛋白质也可大致分为两类，分别是“客户”蛋白（client protein）和“骨架”蛋白（scaffold protein），前者一般同时分布在多个亚细胞区域，仅在特定条件下进入动态形成的生物分子凝集体中；而后者则介导了特定生物分子凝集体的形成，往往具有单一的空间定位，其多价相互作用普遍覆盖了其中的“客户”蛋白。因此，对于不同类型的蛋白质，研究团队设计了两种DenseMAP的应用路线。 对于同时具有多个定位的“客户”蛋白（client），研究团队通过偶联生物素连接酶（BirA）的特定生物分子凝集体的“骨架”蛋白对其进行标记，与DenseMAP的凝聚增强交联相互配合，能够特异地捕捉位于感兴趣的生物分子凝集体内的POI的互作蛋白质组。根据这一思路，利用G3BP1-BirA结合δK*，捕捉和鉴定了应激颗粒（SG）中SARS-CoV-2的核衣壳（N）蛋白的互作蛋白质组，并解析了宿主激酶介导的磷酸化对N蛋白在SG中与许多功能性RNA结合蛋白互作的促进作用，进一步阐释了病毒与宿主相互拮抗过程的机制。他们也鉴定和比较了m6A修饰的“阅读器”YTHDF1、YTHDF2在SG中的互作蛋白质组，验证了此前对于二者在SG形成过程中具有不同性质的结论。 另一方面，由于许多生物分子凝集体展现出复杂的“亚区域”（Subcompartment）结构，往往每一个亚区域通过特定的“骨架”蛋白来维持结构并招募“客户”蛋白，进而实现物质的动态交换。然而，由于结构上的紧密交织，这些亚区域的蛋白质组很难通过传统的物理分离或邻近标记手段精确地区分与鉴定。值得注意的是，对于单一定位的“骨架”蛋白，无需额外引入标记手段即可获得其在特定亚区域的直接互作蛋白，这类蛋白质因其对区域内“客户”蛋白的广泛直接相互作用，使得其互作组实际上可以看作是该亚区域蛋白质组的一个缩影。基于此，利用DenseMAP策略来获取“骨架”蛋白的互作组，为深入研究生物分子凝集体中特定亚区域的性质提供了新的视角。 此前研究表明，核仁最外侧的颗粒组分（granular component，GC）层在压力条件下能够储存细胞核内的错误折叠蛋白质，从而保护细胞维持正常功能，在蛋白质质量控制（PQC）中扮演着关键角色。为了进一步探索这一机制，研究团队运用DenseMAP策略，捕捉并鉴定了在正常生理条件以及热刺激条件下，GC层中“骨架”蛋白NPM1的互作组，发现热刺激后，GC亚层蛋白质组中SUMO化修饰的蛋白质含量显著增加。经过一系列生物学验证，研究团队揭示了SUMO化修饰，尤其是SUMO2/3，能够通过其序列上的R-motif与NPM1相结合，进而招募那些本身不含有R-motif的错误折叠蛋白进入核仁进行暂时储存。这一发现不仅为核仁在PQC中的机制提供了重要的补充，同时也为理解渐冻症（ALS）等神经退行性疾病的发病机理，以及探索潜在的治疗策略提供了新的线索和依据。 综上所述，该研究巧妙地融合了空间特异的蛋白质标记技术与凝聚增强的代谢光交联探针，开发了一种高效且普适的时空特异光交联技术——DenseMAP。这一策略能够精准地捕捉和鉴定活细胞中特定生物分子凝集体内蛋白质的相互作用，为深入阐释无膜细胞器的功能机制、动态变化过程和疾病相关机理提供了强有力的工具。 北京大学化学与分子工程学院陈鹏教授为本文的通讯作者，博士毕业生李可心、谢肖、高瑞为论文共同第一作者。此外，北京大学基础医学院李婷婷教授及博士毕业生陈钊铭在生物信息学方面做出了重要贡献。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41557-024-01663-1 设置星标，不错过精彩推文 开放转载 欢迎转发到朋友圈和微信群  微信加群  为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。 点在看，传递你的品味