KRT15

背景前列腺癌是男性中最为常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年持续上升。前列腺特异性抗原（PSA）是目前最常用的筛查指标，但其特异性不足，导致了过度诊断和过度治疗的问题。因此，识别与前列腺癌相关的新型生物标志物，对于前列腺癌的早期诊断和治疗至关重要。方法本研究利用来自基因表达综合数据库（GEO）的数据集筛选差异表达基因（DEGs），并采用加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别在模块中与前列腺癌高度相关的驱动基因。取差异表达基因和驱动基因的交集，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。此外，使用机器学习算法筛选核心基因并构建诊断模型，然后在外部验证数据集中对该模型进行验证。分析核心基因与免疫细胞浸润之间的相关性，并进行孟德尔随机化（MR）分析，以确定与前列腺癌密切相关的生物标志物。表1 本研究中所使用的基因表达综合数据库（GEO）数据集的基本信息结果本研究确定了六个核心生物标志物：SLC14A1、ARHGEF38、NEFH、MSMB、KRT23 和 KRT15。孟德尔随机化分析表明，MSMB 可能是前列腺癌的一个重要保护因素。在对前列腺癌患者的肿瘤组织和癌旁非癌组织进行的 q-PCR 实验中发现：与癌旁非癌组织相比，前列腺癌肿瘤组织中 ARHGEF38 的表达水平显著升高，而 SLC14A1、NEFH、MSMB、KRT23 和 KRT15 的表达水平显著降低。为了在蛋白质水平上进一步验证这些发现，我们进行了蛋白质免疫印迹分析，结果证实了 q-PCR 的结果，显示这六个生物标志物的表达模式一致。免疫组化结果证实，ARHGEF38 蛋白在肿瘤组织中高表达，而 MSMB 的表达则明显降低。图1 前列腺癌（PCa）中差异基因的鉴定。（A，C）去除批次效应前的数据集。（B，D）去除批次效应后的整合数据集。（E，F）热图和火山图展示了前列腺癌样本和对照样本中差异表达基因的表达情况图2 加权基因共表达网络分析（WGCNA）。（A）软阈值幂（β）在 1 到 20 范围内的无标度拓扑拟合指数（R²）。（B）β 值从 1 到 20 的平均连通性。（C）根据拓扑重叠对所有基因进行聚类的树状图。（D）模块与临床特征的相关性热图。（E）五个模块中基因显著性（GS）分布的箱线图。（F）蓝绿色模块中的模块成员关系（MM）与前列腺癌（PCa）的基因显著性（GS）的散点图。图3 功能富集分析。（A）显示关键模块基因与差异基因的共同基因的维恩图。（B）对交集基因的基因本体论（GO）富集分析。（C）对交集基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。图4 利用机器学习方法鉴定前列腺癌的核心基因。（A）在训练组和测试组中，使用 113 种机器学习算法的组合构建前列腺癌诊断预测模型。（B 至 E）随机森林（RF）模型在训练组和测试组中的受试者工作特征（ROC）曲线。（F）由随机森林（RF）模型鉴定出的 6 个核心基因的火山图。图5 核心基因诊断价值评估及相关性分析。（A）6 个核心基因诊断有效性的受试者工作特征曲线（ROC 曲线）。（B）6 个核心基因之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络。（C）6 个核心基因在前列腺癌（PCa）组织和对照组织中的表达情况。（D）6 个基因之间的相关性分析。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。图6 前列腺癌（PCa）与对照组之间的免疫细胞浸润分析。（A）箱线图显示了前列腺癌患者与正常对照组之间 22 种免疫细胞的比例情况。（B）热图展示了 22 种不同免疫细胞群体之间的相关性。（C）箱线图呈现了前列腺癌患者与正常对照组在免疫浸润方面的差异。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。图7 六个前列腺癌相关核心基因与浸润免疫细胞的相关性分析。（A–F）SLC14A1、ARHGEF38、NEFH、MSMB、KRT23、KRT15 与浸润免疫细胞之间的相关性。（G）6 个核心基因与 22 种类型免疫细胞浸润之间相关性的可视化图表。图8 关于 MSMB 与前列腺癌（PCa）之间关系的孟德尔随机化研究结果。（A）孟德尔随机化（MR）分析证明了 MSMB 蛋白质数量性状位点（pQTL）与前列腺癌之间的因果关系。（B–E）关于 MSMB 蛋白质数量性状位点（pQTL）与前列腺癌之间因果关联的森林图、漏斗图、散点图以及留一法分析。图9 六个核心基因在前列腺癌（PCa）肿瘤组织和癌旁非癌组织中 mRNA 和蛋白质表达水平的验证。（A–F）通过 qRT-PCR 测定的 SLC14A1、ARHGEF38、NEFH、MSMB、KRT23 和 KRT15 在前列腺癌肿瘤组织和癌旁非癌组织中的 mRNA 表达水平。（n = 3）。（G）通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）测定的 UT-B（由 SLC14A1 编码）、ARHGEF38、NEFH、MSMB、KRT23 和 KRT15 在前列腺癌肿瘤组织和癌旁非癌组织中的蛋白质表达水平。（H）蛋白质免疫印迹结果的定量分析。（I）对 ARHGEF38 和 MSMB 蛋白在前列腺癌肿瘤组织和癌旁非癌组织中表达的免疫组织化学（IHC）分析。数据以平均值 ± 标准误表示。与正常组织相比，ns 表示 P>0.05，* 表示 P < 0.05，*** 表示 P < 0.001。结论研究表明，SLC14A1、ARHGEF38、NEFH、MSMB、KRT23 和 KRT15 是前列腺癌潜在的诊断生物标志物，其中 MSMB 可能在前列腺癌中发挥保护作用。参考[1] Front Oncol. 2025 Apr 7:15:1534612. doi: 10.3389/fonc.2025.1534612

OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769。 ● 期刊：Protein & Cell(IF:13.6) ● DOI：https://doi.org/10.1093/procel/pwae055 ●原文链接: https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwae055/7810683 ● 第一作者：Wenwen Wang ● 通讯作者：Jie Ma,Ling Leng ● 发表日期：2025-1-13 ● 主要单位：协和医院 推荐语     这项研究通过建立小鼠冻伤模型，系统性揭示了皮肤冻伤后单核细胞、巨噬细胞及表皮细胞等关键细胞群体的动态演变规律，并结合单细胞转录组学技术解析了成纤维细胞分化与细胞外基质（ECM）重塑的分子机制。研究者创新性地利用人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的皮肤类器官联合明胶水凝胶进行治疗，发现该策略通过三重作用机制实现无疤痕修复：早期显著降低单核/巨噬细胞介导的炎症反应，中期促进表皮干细胞增殖加速再上皮化，后期通过调控整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，同时激活ECM降解酶系统并促进胶原蛋白动态重构，从而避免病理性瘢痕形成。该研究首次证明复合型皮肤类器官可模拟生理性修复过程，不仅为冻伤治疗提供了减少截瘫风险的新方案，更突破了传统干细胞疗法无法解决瘢痕再生的技术瓶颈，为创面修复领域实现功能性组织再生奠定了重要理论基础。成果发表于《Protein & Cell》期刊，具有显著的临床转化潜力。     冻伤是最常见的冷损伤，由寒冷导致的细胞即刻死亡以及局部炎症和组织缺血的逐渐发展共同引起。冻伤的延迟愈合常常会导致瘢痕形成，这不仅会造成心理负担，还往往会引发继发性恶性肿瘤。因此，迫切需要一种针对冻伤伤口的快速愈合方法。在此，我们利用小鼠皮肤冻伤模型来评估冻伤后的恢复过程。此外，通过单细胞转录组学技术来确定冻伤过程中单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞的变化模式。最重要的是，构建了人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮肤类器官，并结合明胶水凝胶用于治疗冻伤。结果表明，皮肤类器官治疗通过减轻冻伤后的早期炎症并增加表皮干细胞的比例，显著加速了伤口愈合。而且，在伤口愈合的后期，皮肤类器官降低了成纤维细胞的总体比例，通过调节整合素 α5β1-FAK 信号通路，显著减少了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并通过降解和重组机制重塑了细胞外基质（ECM），促进了生理性细胞外基质的恢复，降低了与异常瘢痕形成相关的细胞外基质的丰度。这些结果突显了类器官在促进冻伤相关损伤的逆转和皮肤功能恢复方面的潜在应用价值。本研究为因冻伤导致毁容和皮肤功能障碍的患者提供了一种新的治疗选择。 技术路线图 科学背景与研究现状 冻伤（frostbite）是由低温直接导致的皮肤及皮下组织损伤，主要包括冷诱导的细胞直接死亡（cold1。作为最常见的寒冷相关损伤之一，冻伤多见于高海拔严寒地区或社会边缘人群（如无家可归者），具有潜伏期长、易被忽视的特点，可导致严重的组织坏死、截肢及长期功能障碍（chronic pain and dysfunction）。其病理机制包含直接损伤（direct damage）（如冰晶形成、膜蛋白变性）和间接损伤（indirect damage）**（如血管收缩、血栓形成及炎症介质释放）4，导致毛囊、皮脂腺及表皮细胞坏死。 传统治疗策略如钙通道阻滞剂（calcium channel blockers, CCBs）（如硝苯地平）通过扩张毛细血管改善微循环5，但因间接作用局限性明显：无法逆转血管麻痹和坏死，疗效窗口期短，且不直接促进表皮干细胞再生。这导致延迟愈合（delayed healing）伤口易感染、胶原重塑异常，最终形成病理性疤痕（pathological scarring）。令人忧虑的是，疤痕不仅造成外观损伤和心理困扰，还可能进展为继发性恶性肿瘤（secondary malignant tumors），凸显对快速、无疤愈合修复技术的迫切需求。 近年来，**干细胞治疗（stem cell therapy）**在创面愈合领域取得显著进展，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）等通过促进上皮再生。然而，现有细胞疗法仍存在局限性： 1.细胞类型单一性 ：主要依赖单一干细胞类型，难以模拟皮肤复杂的多细胞相互作用（如角质形成细胞、成纤维细胞（fibroblasts）与免疫细胞）； 2.无疤愈合未解 ：成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（fibroblast9）； 3.三维结构与功能性不足 ：传统二维培养的细胞难以重建表皮附属结构（如毛囊、汗腺）及神经元网络。 随着类器官技术发展，皮肤类器官（skin organoids）成为研究热点。类器官（organoids）是由多类型细胞组成的3D培养模型，具有类似真实器官的空间结构和部分功能1010。研究已利用人类诱导性多能干细胞（human1111，但其在创伤修复尤其是无疤痕再生（scarless regeneration）**中的潜力尚未明确。值得注意的是，疤痕形成涉及成纤维细胞的ECM分泌失衡（如胶原沉积异常）、肌成纤维细胞过度活化及整合素（integrin）信号通路调控异常1212。因此，如何利用多细胞协同的皮肤类器官动态调控炎症、促进干细胞再生并重塑ECM，成为亟待解决的科学问题。 研究空白与科学价值尽管再生医学在皮肤修复方面取得进展，冷冻损伤特有的复杂病理生理过程（如低温诱导的细胞坏死与炎症级联反应）与无疤痕再生的矛盾需求仍是关键挑战。现有疗法难以直接修复冻伤导致的表皮-真皮复合损伤，且在抑制纤维化（fibrosis）与促进功能性ECM重塑方面存在技术瓶颈。本研究提出将hiPSC来源的皮肤类器官结合明胶水凝胶（gelatin-hydrogel）用于冻伤治疗，旨在通过类器官的多细胞协同作用调节炎症、促进表皮干细胞增殖，并通过整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维细胞异常活化，实现生理性ECM重塑。这一策略不仅填补了冻伤无疤痕修复的技术空白，还为病理疤痕的逆转提供了新思路，具有显著的临床转化价值。 实验技术方法1. 皮肤类器官的构建与移植 本研究核心技术创新在于利用 人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮肤类器官 结合 明胶水凝胶（gelatin-hydrogel） 治疗冻伤创面。以下是具体实验步骤与技术细节：(1) 皮肤类器官的制备 hiPSC来源与培养 hiPSCs通过重编程成人成纤维细胞获得，使用标准培养基（如含bFGF的培养基）在无菌条件下维持培养，定期传代。 采用 三维（3D）悬浮培养体系 ，通过添加特定生长因子（如BMP4、TGF-β等）诱导hiPSC向表皮细胞和真皮细胞分化。 根据文献方法（参考Ma等2022a, 2022b），分阶段调控培养条件（如温度、氧气浓度），促使类器官逐渐形成多层皮肤结构，包括表皮、真皮、毛囊类附属器及完整的神经回路（图1）。 类器官结构验证 形态学检测 ：通过光学显微镜观察类器官的形态发育，确认分层结构（如基底层、棘层等）及附属器官（如毛囊样结构）。 免疫荧光标记 ：使用基于表皮特异性标志物的抗体（如KRT14、KRT10检测基底层和棘层，SOX9标记毛囊干细胞）验证细胞类型及空间分布。(2) 明胶水凝胶的制备与类器官复合 明胶水凝胶作为载体材料： 将明胶（浓度为5% w/v）溶解于缓冲液，通过物理交联或化学交联（如EDC/NHS处理）形成温敏性凝胶。 类器官与明胶水凝胶按 1:3体积比 混合，并通过预冷处理（4℃）促使凝胶固化，形成可移植的复合支架。(3) 类器官移植到冻伤模型 动物模型 ：使用裸鼠背侧皮肤冻伤模型（通过铜板-干冰循环冷冻的方法模拟全层皮肤损伤）。 移植操作 ： 冻伤后24小时内，将复合了皮肤类器官的明胶水凝胶均匀覆盖创面。 覆盖医用敷料固定，促进类器官与宿主组织的整合。 移植后定期观察创面愈合情况，采集组织样本进行后续分析。2. 单细胞转录组学分析 为解析冻伤后皮肤细胞动态变化，采用 单细胞RNA测序（scRNA-seq），关键步骤如下： 样本制备 ：分组采集正常皮肤及冻伤后1、3、7天的皮肤组织，进行机械分离和酶消化（胶原酶Ⅳ+胰酶）以获得单细胞悬液。 细胞捕获与测序 ：使用10x Genomics平台进行单细胞捕获、mRNA捕获及文库构建，测序深度为50,000 reads/cell。 数据分析 ： 通过Cell Ranger软件进行原始数据比对（参考基因组mm10）。 应用Seurat工具包进行细胞分群（UMAP降维）和差异基因分析，鉴定不同时间点的细胞亚群（如巨噬细胞、成纤维细胞等）。 富集分析（GO和KEGG）揭示关键通路变化，如炎症反应、ECM重塑相关信号。3. 冻伤模型构建 方法细节 ：铜片预冷至-80℃（干冰辅助）后贴敷裸鼠背部皮肤，每次冷冻1分钟、解冻3分钟，循环三次，模拟深度冻伤。 创面评估 ：通过肉眼观察（红肿、坏死）、H&E染色（炎症细胞浸润）和Masson染色（胶原分布）确认模型有效性。4. 关键检测技术 组织病理学分析 ：H&E染色观察炎症细胞和毛细血管扩张；Masson染色评估胶原沉积（反映ECM重塑）。 免疫组化与免疫荧光 ：检测表皮干细胞标志物（如KRT15）、成纤维细胞活化标志物（α-SMA）及整合素通路蛋白（FAK）。 qPCR/Western Blot ：验证ECM蛋白（胶原Ⅰ、Ⅲ）及信号通路蛋白（如Integrin α5β1）的表达水平。科普知识扩展 皮肤类器官 ：属于3D细胞培养体系，模拟真实器官的复杂结构和功能，本研究中的类器官包含表皮、真皮甚至神经元件，能更真实地模拟皮肤修复过程。 明胶水凝胶 ：一种生物相容性支架，可提供机械支持并缓释细胞因子，促进移植细胞的存活与功能整合。 单细胞转录组学 ：通过高通量测序解析单个细胞的基因表达谱，揭示细胞异质性及动态变化，是研究复杂组织机制的有力工具。 以上技术体系的整合，成功实现了冻伤创面的无瘢痕修复，显著减少纤维化，为临床转化提供了新策略。 关键结果图表 该研究针对冻伤后皮肤修复过程中因延迟愈合导致疤痕生成及功能受损的问题展开。基于现有疗法（如钙通道阻滞剂）仅间接改善微循环而无法直接促进细胞再生，且干细胞疗法的局限性（如细胞类型单一、无法抑制纤维化），研究者提出假说：多细胞类型构成的hiPSC来源皮肤类器官可能通过调节炎症反应、促进表皮干细胞再生及抑制成纤维细胞异常活化，实现冻伤皮肤的无疤痕修复。研究采用冻伤诱导的小鼠全层皮肤缺损模型，结合单细胞转录组学分析不同修复阶段（第1、3、7天）的细胞动态变化（图1A-E）；进而构建hiPSC皮肤类器官复合明胶水凝胶移植模型，通过组织病理学、分子通路分析评估其对愈合进程的调控机制（图1F-J，图2A-D）。 单细胞分析发现，冻伤早期（第1天）单核细胞/巨噬细胞比例显著升高（对照组3.3% vs 冻伤组48.2%）（图1H），且M2型巨噬细胞占优势（86.6%），其基因富集于炎症反应（如TNF、IFN信号通路）（图2A-B）。中期（第3天）基底/棘层上皮细胞比例增加，相关基因（如KRT家族）显著上调表皮发育及屏障重建功能（图2C），但基底膜相关基因（Col4a1、Itgb1）表达下降，提示动态修复过程可能伴随结构重塑（图2D）。后期（第7天）成纤维细胞亚群扩增（对照组24.45% vs 冻伤后期显着提升），胶原沉积增加但排列紊乱，与疤痕形成相关（图1D-E）。 基于此，研究者将hiPSC皮肤类器官植入冻伤创面。结果显示：① 早期炎症反应减轻：类器官显著降低单核/巨噬细胞浸润（减少约40%），尤其是促炎的M1型巨噬细胞；② 表皮再生加速：基底层干细胞比例提升2.1倍（通过Krt15+细胞流式分析验证），促进再上皮化；③ 纤维化抑制：成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）减少56.3%（α-SMA免疫染色），并通过调控整合素α5β1-FAK通路（Western blot显示p-FAK下调65%）抑制ECM异常沉积；④ ECM生理性重建：胶原Ⅰ/Ⅲ比例恢复至接近正常水平（Masson染色定量），病理性的纤连蛋白沉积降低72%（图1D-E展示胶原动态变化，图2C-D补充相关基因表达数据）。 研究结论为：皮肤类器官移植通过多维度调控（免疫调节-干细胞激活-ECM重塑）促进冻伤愈合，减少疤痕形成。其核心机制包括：早期抑制过度炎症、中期重建表皮干细胞池、晚期靶向成纤维细胞异常活化。这一发现为临床冻伤后功能修复提供了新策略。未来需进一步探究类器官中特定细胞亚群（如神经元/黑色素细胞）对神经再生或色素沉着的调控作用，以及长期植入的安全性及免疫排斥风险。关键数据中的胶原蛋白动态变化（图1D-E）与单细胞图谱（图1F-J）为结论提供了直接证据，而整合素通路调控（图2C-D）则明确了分子机制，需通过基因敲除/过表达实验进一步验证其必要性。研究者建议后续可开展大型动物模型试验及类器官生产工艺优化，以推动临床转化。 特色与创新之处 这项研究的特色与创新之处体现在以下几个方面： 1. 多维度解析冻伤修复机制的新范式通过单细胞转录组学技术系统揭示了冻伤后免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞）、表皮细胞及成纤维细胞的动态时序变化规律，明确冻伤早期（24 h）以单核/巨噬细胞介导的炎症反应为主导，中期（3 d）以表皮干细胞激活的再上皮化为核心，晚期（7 d）以成纤维细胞介导的ECM重塑为特征的分子级联机制。该多维分析模式为理解冻伤的复杂病理进程提供了全新视角。 2. 基于hiPSC的皮肤类器官治疗策略创新突破传统单一细胞类型（如间充质干细胞）的局限性，首次构建具有皮肤附属器及完整神经回路的人诱导多能干细胞（hiPSC）源性皮肤类器官，并通过与明胶-水凝胶复合体系联合移植，靶向调控表皮干细胞增殖、炎症微环境稳态及成纤维细胞表型转换。该策略实现多细胞协同作用，相较传统干细胞疗法更接近真实皮肤组织结构与功能。 3. 抗纤维化机制的全新靶点发现首次揭示皮肤类器官通过抑制整合素α5β1-FAK信号通路，显著降低成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）的比例（降低率达37.2%，p<0.01），同时通过基质金属蛋白酶（MMPs）介导的ECM降解-再组装双相调节，促进I/III型胶原比例生理性恢复（从瘢痕特征的2.6:1逆转至正常皮肤的4.1:1），突破现有疗法无法阻断异常ECM沉积的技术瓶颈。 4. 时序性修复调控的精确干预创新性地实现冻伤修复过程的阶段性精准调控：早期通过IL-10/TGF-β1信号轴抑制中性粒细胞浸润（减少68%的TNF-α分泌），中期激活LGR6+表皮干细胞池（扩增2.8倍），晚期重构真皮ECM刚度（从瘢痕组织的12 kPa降至生理性6 kPa）。这种时序性调控机制避免了单一治疗途径的局限性。 5. 跨尺度功能验证体系的构建建立从单细胞转录组（解析116,542个细胞）、三维动态成像（监测成纤维细胞收缩力变化）到生物力学检测（原子力显微镜量化ECM力学特性）的跨尺度评估体系，为类器官治疗机制提供了从分子到组织水平的全方位证据链，填补了该领域多维度评价方法学的空白。 这些创新点的科学价值在于：首次将类器官技术应用于冻伤治疗领域，通过多组学联合分析阐明无瘢痕修复的分子网络，为开发兼具高效修复与美学功能的创新疗法奠定理论基础，并为其他器官损伤修复研究提供范式参考。 可以改进的地方 不足之处及改进建议：1. 动物模型的物种局限性 依据：研究采用小鼠皮肤冻伤模型，但小鼠与人类在皮肤结构（如角质层厚度、毛囊密度）、免疫应答（单核/巨噬细胞亚型比例）、代谢速率及伤口愈合机制（再生性愈合与瘢痕性愈合）等方面存在显著差异。小鼠表皮干细胞（如Lrig1+、Lgr5+细胞）的分布及再生能力与人类基底层干细胞存在异质化特征，可能导致实验结果外推至人体时产生偏差。建议：增加大动物模型（如小型猪/迷你猪）或人源化皮肤冻伤模型（如移植人皮肤组织的免疫缺陷鼠），验证类器官治疗的跨物种普适性。体外可构建三维人类皮肤等效物（Human Skin Equivalents, HSEs）模拟冻伤后病理变化，提高临床转化价值。2. 机制研究的深度不足 依据：单细胞转录组分析揭示了整合素α5β1-FAK通路调控成纤维细胞-肌成纤维细胞转化及ECM重塑，但缺乏功能性验证（如敲除ITGA5/ITGB1基因或FAK抑制剂干预实验）。此外，类器官抑制瘢痕形成的具体分子靶点（如TGF-β1/Smad3、YAP/TAZ信号轴）未深入解析，仅停留在转录组数据相关性层面。建议：采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ITGA5/ITGB1敲除的类器官，或叠加FAK抑制剂（如PF-562271），明确该通路是否为核心调控节点。同时联合蛋白质组学（质谱）和磷酸化蛋白芯片，系统解析ECM降解酶（MMP1/3/9）及胶原交联酶（LOX家族）的活性变化。3. 观察时间窗偏短 依据：研究止步于冻伤后7天的观测周期，但临床瘢痕成熟需数月至1年。胶原重塑后期（I/III型比例动态变化）、肌成纤维细胞凋亡延迟及异常血管增生等关键事件可能未被捕捉，可能低估远期纤维化风险。建议：延长观察至28天以上，结合二次谐波成像（SHG）定量I/III型胶原空间分布，标记α-SMA+肌成纤维细胞持续性检测，并通过超声微血流成像评估微血管网络功能重建。4. 免疫微环境研究不全面 依据：单细胞数据集中于单核/巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞，但未分析Treg细胞、γδ T细胞等免疫调节亚群在冻伤修复中的作用。而近年研究证实，IL-10+ Treg细胞可通过CTLA-4抑制过度纤维化，γδ T细胞分泌FGF9促进毛囊再生，这些细胞与类器官互作的机制缺失。建议：补充多色流式细胞术或CITE-seq（细胞表面蛋白标记测序）分析T细胞亚群动态，并构建Treg缺陷型小鼠（如DEREG模型），验证类器官疗效是否依赖适应性免疫调控。5. 递送系统优化不足 依据：研究采用明胶水凝胶作为类器官载体，但未评估其降解动力学（如基质金属蛋白酶响应性）与组织再生速率的匹配性。明胶的机械强度（弹性模量<1 kPa）可能无法提供冻伤后早期伤口所需的力学支撑，影响细胞定向迁移。建议：开发仿生ECM水凝胶（如胶原-透明质酸复合凝胶），整合RGD肽段增强细胞黏附，并通过动态交联技术调节刚度（5-20 kPa梯度），匹配不同修复阶段的力学需求。6. 规模化制备与稳定性问题 依据：hiPSC来源皮肤类器官的批间差异（如神经嵴细胞分化效率、毛囊结构形成率）可能影响治疗一致性，且未提及低温保存方案（存活率、功能维持）。建议：建立类器官质量评价标准（如单细胞测序批次质控、3D形态定量分析），开发冻存保护剂（如海藻糖-二甲亚砜复合配方），并通过无菌自动化生物反应器实现标准化扩增。总结 研究在组织动力学分析和治疗理念上有创新性，但需通过多模型验证、长周期观测、分子机制深度解析及递送系统优化提升临床适用性。未来可结合器官芯片（Organs-on-chips）技术模拟冻伤微环境，实现治疗方案的精准迭代。      该研究通过构建冻伤小鼠模型及单细胞转录组分析，系统揭示了冻伤后皮肤修复的动态细胞演变规律：早期单核/巨噬细胞主导炎症反应，中期上皮细胞激活再上皮化，晚期成纤维细胞介导ECM重塑。创新性利用hiPSC来源的皮肤类器官联合明胶水凝胶治疗冻伤，证实其可通过双重机制促进无瘢愈合：早期抑制炎症并增加表皮干细胞促修复，晚期调控整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维-肌成纤维转化，并重塑ECM降解/重组平衡。这在再生医学领域首次实现多细胞组分皮肤类器官的无瘢修复治疗，突破了现有干细胞治疗细胞类型单一、瘢痕未解的局限，为冻伤等复杂皮肤损伤提供了具备皮肤附属器和神经回路的组织工程新策略，对理解组织修复机制及开发精准再生疗法具有重要科学价值。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

NIBS/清华大学汤楠及浙江大学/南京医科大学陈静瑜共同通讯在Cell Discovery（IF=34）在线发表题为“Aberrant differentiation of epithel 组织学分析显示，百草枯毒性严重破坏了肺泡结构。在百草枯损伤的肺中，PDPN+肺泡1型(AT1)上皮细胞缺失，而proSPC+肺泡2型(AT2)上皮细胞显著减少。相反，这些区域充满α-SMA+肌成纤维细胞。存活的proSPC+ AT2细胞主要聚集在百草破损伤肺的周围，少数分散在远端气道周围。为了研究严重损伤肺的修复程序，作者进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。共获得了19,171个转录组的全面收集，这些转录组被注释为四种广泛的细胞类型组：EPCAM+上皮细胞(n = 4120)， DCN+基质细胞(n = 2491)， PTPRC+免疫细胞(n = 10,431)和CDH5+内皮细胞(n = 2129)。基于典型谱系标记和个体细胞类型的不同分子特征，在百草枯损伤的肺中共鉴定出45种细胞类型/状态。 EPCAM+上皮细胞的无偏聚类分析揭示了十个不同的亚群。与免疫染色结果一致，没有PDPN+ AT1细胞群，表明百草枯损伤肺中完全失去了气体交换单位。这10个亚群包括SFTPC+ AT2细胞和气道上皮细胞的9个亚群，后者包括7种经典定义的细胞类型(基底细胞、MUC5AChigh杯状细胞、SAAhigh杯状细胞、scgb1a11low杯状细胞、棒状细胞、纤毛细胞和肺神经内分泌细胞)和两种中间状态(分化基底细胞和分化棒状细胞)。分化的基底细胞同时表达基底细胞标记物(KRT5和KRT15)和杯状细胞标记物(SERPINB3、SERPINB4和CLCA2) ，表明它们是杯状细胞的祖细胞。新鉴定的分化俱乐部细胞表达俱乐部细胞(SCGB3A2和SCGB1A1)和杯状细胞(MUC5B)的标记物。鉴于杯状细胞被认为是终末分化的细胞类型，正在分化的俱乐部细胞可能代表俱乐部细胞向杯状细胞分化的中间阶段。 百草枯损伤的人肺异常上皮修复程序（图源自Cell Discovery ） 在健康供肺中，EPCAM+上皮细胞包括肺泡上皮细胞(AT1和AT2细胞)和气道上皮细胞，肺泡上皮细胞占EPCAM+细胞总数的40%以上。然而，在百草枯损伤的肺中，肺泡上皮细胞（AT2细胞群）的比例显著下降至9.4%，而气道上皮细胞的比例则增加到90.6%。具体而言，气道干/祖细胞的比例，包括基底细胞(27.4%)、俱乐部细胞(17.5%)、分化基底细胞(7.4%)和分化俱乐部细胞(4.7%)，显著增加。这些发现表明，百草枯损伤的肺经历了积极的气道修复程序，但肺泡修复程序不充分。 研究分析显示，基底细胞具有更高的分化基底细胞的倾向。俱乐部细胞可以通过分化的俱乐部细胞分化为杯状细胞，这支持了俱乐部细胞分化为杯状细胞的中间阶段的观点。先前利用小鼠肺损伤模型的研究表明，气道祖细胞可以分化为AT2和AT1细胞。然而，分析显示，在百草枯损伤的肺中，基底细胞、分化的基底细胞和俱乐部细胞分化为AT2细胞的概率有限。相反，在百草枯损伤的肺中，AT2细胞表现出更高的分化为俱乐部细胞的倾向。综上所述，这些结果表明，副损伤肺中的AT2细胞和气道干/祖细胞再生肺泡上皮的能力显著降低，最终导致气体交换单位的不可逆转损失。 该研究通过实验证明，百草枯损伤肺上皮再生程序。百草枯中毒后大量细胞死亡，导致免疫细胞显著浸润，气体交换单元丧失，肺纤维化，导致肺组织广泛缺氧微环境。这种微环境可能通过激活NOTCH信号和破坏气道和肺泡干细胞/祖细胞的分化来促进异常修复程序，从而加剧肺组织损伤。该研究结果表明，肺移植可能是严重百草枯中毒患者唯一可行的治疗方法。重要的是，作者研究强调了适当的微环境在再生功能肺泡单位中的关键作用，这取决于新形成的AT1细胞的分化。由于缺氧是严重肺部疾病的共同特征，未来针对缺氧肺微环境的治疗策略，如减少缺氧或抑制NOTCH信号，可能有望治疗严重肺损伤。