RAB35

引言 内吞（endocytosis）是将细胞外的营养物质、细胞膜受体、脂类等通过细胞膜运输进入细胞的囊泡运输过程，大部分物质在内吞后会被运送到早期内体（early endosome）进行分选。约70-80%的内吞后的膜蛋白如受体、通道蛋白和转运蛋白等，会通过循环途径（recycling）再次回到细胞膜。内吞和循环对细胞的生存、稳态和环境交流等至关重要，内吞和循环的紊乱与癌症和神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。 哺乳动物细胞可通过不同途径实现受体等的循环，包括广泛研究的“快速”和“慢速”循环途径。“快速”循环途径主要由小GTP酶Rab4或Rab35调控，可将内吞后的货物从早期内吞体直接运输回细胞膜；“慢速”循环途径则主要由Rab11调控，从近核的早期循环体（early recycling compartment, ERC）或循环内体（recycling endosome）回收货物。然而，目前对于上千种不同的膜蛋白如何正确且高效地循环回细胞膜的途径及相关机制仍然知之甚少，是否存在独立于经典的“快速”和“慢速”途径之外的的循环方式仍待探索。 2024年9月19日，中国科学院遗传与发育生物学研究所的何康敏团队在Nature Cell Biology杂志在线发表了题为Clathrin-associated carriers enable recycling through a kiss-and-run mechanism研究论文。该研究报道了一条新的快速囊泡循环途径，并将其命名为CARP（clathrin-associated fast endosomal recycling pathway）。 在先前合作发表于Nature杂志的研究工作中（Nature 2017;552(7685):410-414），基于耦合探测原理（coincidence detection），开发了一系列clathrin包被内吞囊泡特异的磷酸肌醇脂质分子探针。其中PI(4,5)P2特异的耦合探测探针，含有可同时弱结合PI(4,5)P2的脂质结合结构域以及弱结合clathrin的蛋白结构域，该探针可被特异招募至同时存在clathrin和PI(4,5)P2的囊泡结构上。在将该探针表达至基因编辑同时荧光标记clathrin及其衔接蛋白AP2的细胞中，利用三色全内反射荧光显微镜（TIRFM）对细胞膜进行成像时，该团队发现除了clathrin和AP2同时双阳性的内吞囊泡，还存在一类在细胞膜上短暂停留的clathrin阳性而AP2阴性的囊泡，其能够快速招募PI(4,5)P2特异的耦合探测探针。进一步，通过晶格光片显微镜三维成像和掠入射结构光照明显微镜（GI-SIM）的超分辨成像等多种成像方式，证实了clathrin阳性AP2阴性的囊泡是来自于细胞内的囊泡结构，其能够与细胞膜发生短暂（~5-60 s）互作并再次回到细胞内，其独特的动力学与经典的内吞囊泡和循环囊泡均不同，该团队将其命名为CARP囊泡。通过基因编辑和单分子成像等方法，该团队发现细胞内的CARP囊泡高度富含另外一种clathrin的衔接分子AP1，并通过胞吐的标志物和光电联合成像等，证明了clathrin/AP1阳性的CARP囊泡以“kiss-and-run”的方式，与细胞膜发生半融合。 为了解析CARP囊泡的组成、来源、功能和调控机制，该团队利用clathrin特异的PI(4,5)P2耦合探测探针，建立了基于TIRFM的活细胞成像筛选和图像分析体系。通过对文献报道的参与囊泡运输的近两百种蛋白的时空动态进行分析，发现了一系列与CARP囊泡相关的蛋白分子，包括Arf1、Rab1、Rab11、exocyst组分、VAMP2等SNARE蛋白、dynamin等，这些蛋白在CARP囊泡与细胞膜融合前、融合中、剪切后等不同阶段招募。通过进一步的实验，证明了这些不同的蛋白在CARP囊泡的生成、运输或融合等不同阶段起着重要的调控作用。 通过活细胞成像和超分辨成像等方法，该团队进一步发现CARP囊泡生成于早期内体。有趣的是，CARP囊泡的组分与VPS35等经典的retromer组分在早期内体上定位于不同的区域，敲除和敲降retromer、retriever等retrieval复合物的核心组分，并不影响CARP囊泡的生成，提示CARP囊泡以独立于retrieval复合物的方式生成于早期内体。在功能上，通过追踪配体激活的GPCR家族β2-肾上腺素能受体以及RTK家族表皮生长因子的内吞以及随后的循环过程，发现这些受体可在内吞两三分钟后即通过CARP途径回到细胞膜。此外，CARP囊泡也能够介导转铁蛋白受体等受体的持续性循环。 模式图（Credit: Nature Cell Biology） 综上所述，借助于耦合探测脂质探针、基因编辑、多种成像技术和图像定量分析等，何康敏团队发现的CARP循环途径，其生成方式、与细胞膜的融合方式、功能以及关键调控因子等与经典的循环途径有所不同，可能是一种新的循环方式（下图）。该途径的发现，丰富了对于内吞循环的方式和机制的认知，也揭示了clathrin在介导内吞之外也介导循环的新功能。 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41556-024-01499-4 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：外泌体逐渐被认为是细胞间通讯的重要媒介。它们将活性生物分子传递给目标细胞，并在多种生理和病理过程中发挥重要作用，展现出作为疾病新治疗策略的巨大潜力。方法：在这篇综述研究中，我们研究了过去二十年间发表的关于外泌体在不同疾病中应用的文章，以及这一领域的视角和挑战。结果：外泌体的主要临床应用包括将其用作生物标志物、无细胞治疗剂、药物传递载体、外泌体动力学的基础分析以及癌症疫苗。来自人类或植物的不同来源的外泌体被用于各种临床试验中。大多数研究人员使用循环系统中的外泌体进行生物标志物实验。间充质干细胞（MSCs）和树突细胞（DCs）是两种广泛认可的外泌体来源。MSCs衍生的外泌体通常用于炎症治疗和药物传递，而DCs外泌体用于在癌症患者中诱导炎症反应。然而，外泌体的临床应用面临各种问题和挑战。此外，基于外泌体的临床试验的转化需要符合特定的良好生产规范（GMP）。在这篇综述中，我们根据应用类型和疾病对临床试验中的外泌体进行了总结。我们还讨论了关于外泌体动力学和临床应用的主要问题和挑战。结论：外泌体是临床试验中治疗许多疾病的有希望的平台。这个令人兴奋的领域正在迅速发展，对外泌体发挥各种作用的潜在机制的理解还远远不完整，需要在这些小囊泡的研究中进一步进行多学科研究。 背景 细胞外囊泡（EVs）是由大多数细胞通过多种机制产生的异质性细胞衍生囊泡，通过转移生物信号如许多非编码RNA、编码RNA、DNA链、片段和脂质到对应细胞，促进细胞间通讯。EVs还可以通过许多体液传递其货物/信息，包括循环系统、唾液、脑脊液（CSF）、尿液、牛奶和支气管肺泡灌洗液（BALF）。一旦传递到目标细胞，EVs可以通过驱动不同的信号通路来调节受体细胞的命运和形态，这可能导致正常生理或病理学，具体取决于EVs的来源和细胞状态。越来越多的证据表明，EVs在一系列细胞过程中发挥关键作用，包括增殖、生长、发育、血管生成、免疫调节、感染、转移、重编程和重塑。已经记录了三种主要的EVs亚类，包括微囊泡（MVs）或外泌体、凋亡体和小外泌体（图1）（表1）。MVs指的是由质膜产生的EVs，大小范围为100-1000纳米，通过一个复杂的机制，称为脱落或质膜的芽生，类似于病毒向外芽生细胞膜。另一种越来越吸引科学家注意的EVs是小外泌体，大小范围为30-150纳米。这些囊泡据报道在大小和货物上也是异质的，因此在目标细胞信号上发挥着不同的功能。小外泌体的起源是参与内吞作用途径的囊泡，是一种称为多囊泡体（MVBs）的晚期内吞体开始产生小外泌体。EVs的最新进展表明，小外泌体的生物生成可能与另一个内膜系统相互作用，以维持细胞稳态。例如，正常生理和几种疾病中报道了小外泌体信号通路和自噬之间的串扰。在过去的十年中，寻求改善治疗结果并专注于精准医疗的外泌体的转化医学有了显著增加。外泌体具有独特的性质，吸引了研究人员使用它们来治疗许多疾病，包括退行性疾病和癌症。到目前为止，已经使用不同来源的外泌体进行了许多临床试验来治疗各种疾病。尽管这种方法很有趣，临床试验也显示出满意的结果，但这个领域存在一些挑战和限制，需要进一步的调查来验证这些结果，并为基于外泌体的研究引入一个黄金标准。系统地检查外泌体的效率和安全性需要确定它们的个性和纯度。国际细胞外囊泡协会（ISEV）通过在2014年和2018年发布MISEV指南，启动了EVs分离和表征程序的标准化，这些指南讨论了在基于EVs的研究中必须考虑的最重要的特征。此外，EV-TRACK数据库成立于2017年，为研究人员在发表前提供他们的纯化和表征方法，并就实验计划的可能限制提出建议（https://evtrack.org/about.php）。本文概述了外泌体的潜在临床应用以及在这条路线上的挑战和问题。 图1 细胞外囊泡(EVs)的生物生成。EVs的两个主要亚类是外泌体和微囊泡(MVs)。外泌体的生物生成过程复杂，发生在细胞质中位于多囊泡体(MVBs)内。ESCRT复合体和不同的分子以依赖ATP和不依赖ATP的方式，促进外泌体的装载、排序和形成。外泌体的货物来自高尔基体、内体途径和细胞质。Rab蛋白介导内体室和外泌体的细胞内运输。MVBs已报道能与质膜、溶酶体或两栖体融合。当MVBs与质膜融合时，外泌体被释放到细胞外环境中。有证据表明外泌体生物生成途径可能与自噬通路存在交叉。MVBs可能与自噬体融合形成称为“两栖体”的混合囊泡，这些囊泡最终与质膜或溶酶体融合。MVs比外泌体大，通过向外芽生和脱落过程从质膜形成。EVs可以通过三种可能的方式影响目标细胞的命运和信号通路，包括内吞作用、受体-配体相互作用，以及与质膜的直接融合。 外泌体 外泌体是指许多细胞释放到细胞外基质中的膜结合囊泡。主要思想是这些纳米颗粒在细胞内生成，在多囊泡体（MVBs）内，通过MVBs膜的内陷，导致在MVBs内生成腔内囊泡（ILVs）（图1）。 这些囊泡可能被称为前外泌体，当MVBs与细胞膜融合后，它们可以被分泌出细胞；现在被称为外泌体。MVBs总是不将ILVs排出细胞外，而是它们可能与溶酶体融合，随后ILVs及其货物被降解以供回收和重复使用，以维持细胞稳态。此外，有证据表明MVBs可能与自噬途径的自噬体融合，并生成称为“两栖体”的混合囊泡，随后，两栖体现在可能与血浆膜融合并分泌带有其他货物的外泌体。了解MVBs如何以及为什么与不同的膜融合一直是一个长期目标，因为这对区分外泌体的异质性以及相关的生理后果、调节它们在临床使用中的产生以及监测病理条件至关重要。MVBs膜上存在各种分子和复合物，它们介导货物装载和向内芽生膜的排序，并使新形成的ILVs掐入MVBs。例如，一个由四个复合物组成的与ESCRT相关的机制，以调节的方式使用ATP分子介导生物生成和装载ILVs，或者涉及一个不依赖ESCRT的机制。许多与MVBs相关的Rab蛋白以不同的方式促进MVBs的运动。其中，Rab7、Rab8、Rab11、Rab27和Rab35在调节外泌体途径中的作用已被认可。SNARE蛋白是短分子，它们促进MVBs和细胞质膜的融合。分泌到细胞空间后，外泌体与目标细胞相互作用，这些细胞要么靠近，要么远离。有人提出，外泌体或其他EVs利用三种机制来影响受体细胞的功能，包括内吞作用（例如吞噬作用和胞饮作用）、受体-配体相互作用和直接融合，这些机制导致细胞和生物过程的变化，参与正常生理或恶化病理条件。这是外泌体的旅程；然而，需要进一步的调查来确定外泌体是如何为一个明确的目的而产生的。外泌体的货物包括来自细胞膜、内体室、细胞质和来自内膜系统的分子，如高尔基体[7,18]。外泌体在干燥过程中呈现特定的双凹形或杯状，而在透射电子显微镜下它们呈现球形[26]。这些囊泡的密度为1.08-1.19 g/ml，具有常见的外泌体标记物，如CD9、CD63、CD82、CD81、Alix和Tsg101。成千上万种类型的生物分子存在于外泌体中，包括蛋白质、众多RNA和脂质，这些数据被各种数据库收集和呈现，如Vesiclepedia（http://www.microvesicles.org）、Exocarta（http://www.exocarta.org）和中国的一个生物信息学实验室（http://bioinfo.life.hust.edu.cn）。了解驱动外泌体生物生成和装载的机制，以及外泌体的货物和外泌体被其他细胞摄取的方式，将支持科学家实现精细和高效的转化医学。值得一提的是，完全理解外泌体的性质、纯度和来源对于下游实验至关重要。例如，来自干细胞的外泌体可能参与再生和正常生理，而来自感染或癌细胞的外泌体则介导病理学（图2）。 图2 外泌体的临床应用。在临床试验中，外泌体被用作生物标志物、无细胞治疗（外泌体治疗）、药物输送系统和癌症疫苗。来自植物细胞、间充质细胞、T细胞和树突细胞的外泌体被用于治疗不同的疾病。此外，这些来源的外泌体是药物输送系统的有希望的载体。在直接方法中，外泌体被装载治疗剂，而在间接方法中，适当的细胞通过基因工程改造或与治疗剂共培养以产生人工外泌体。 临床试验 已经很好地建立起来，外泌体是治疗许多疾病的理想候选者。在临床试验之前，许多临床前实验已经证实了外泌体治疗许多疾病的优势，从再生医学领域到癌症。近年来，外泌体在临床试验中进行了研究，总共有两种类型的外泌体在临床试验中使用，具体来说，人类细胞/样本和植物标本的外泌体。对ClinicalTrials.gov（https://clinicaltrials.gov/）的调查显示，外泌体的主要应用是生物标志物、外泌体治疗、药物输送系统和癌症疫苗（图3）。此外，一些试验旨在分析不同条件下人类样本中的外泌体。分析显示，共记录了116项试验，其中58项（50%）属于生物标志物应用（图3）。在外泌体治疗方面，已注册了33项（28.44%）研究（图4）。在药物输送系统试验中，有6项（5.17%）研究，而在外泌体基础分析方面，已注册了17项（14.66%）研究（图4）。最后，有2项临床试验（1.72%）与外泌体疫苗研究相关。临床试验中的外泌体需要符合良好生产规范（GMP）。GMP等级外泌体生产方法包括细胞类型、培养环境、培养系统和培养基。生产后还需要进一步纯化，通常分为三个步骤。GMP外泌体的第三个主题是建立表征和鉴定方法，包括物理配置和生物活性功能特征。此外，欧洲药品管理局（https://www.ema.europa.eu/en）发布了关于先进治疗药物产品分类的科学建议。该机构描述了细胞和分子生物技术的新科学进展导致了先进治疗的发展，如基因治疗、体细胞治疗和组织工程。这个生物医学的新兴领域为治疗人类疾病和功能障碍提供了新的机会。此外，它为研究人员提供了先进治疗药物产品的指导方针、建议和标准，并修订了指令和法规。 图3 基于外泌体的临床试验分析 图4 外泌体治疗产品当前良好生产规范（GMP）生产流程图 生物标志物应用 如上所述，外泌体存在于许多生物液体中，可能为监测正常生理状态下的细胞状态或病理条件发生时提供了一个新的窗口。通过简单的液体活检，如血浆、血清、尿液、唾液等，外泌体和其他细胞外囊泡可用于分析它们的货物，用于诊断、预后、进展和化疗抗性生物标志物应用。尽管大多数细胞类型都会释放外泌体，但有证据支持在几种病理条件下，如癌症，外泌体分泌上调。外泌体在大多数体液中是稳定的，并能保护生物分子免受降解。在病理条件下，细胞变化可以反映在细胞释放的外泌体的生物成分中。外泌体的货物改变可以通过转录组学、蛋白质组学和脂质组学研究进行鉴定和分析；因此，特定分子水平的差异对于生物标志物应用将是有用的。不同的实验室已经显示了癌细胞及其体外外泌体的miRNAs差异表达，此外，一些在体外和动物癌症模型上进行的研究表明miRNAs表达水平的改变。不同的miRNAs正在开发中，包括miRNA-200-5p、miRNA-378a、miRNA-139-5p和miRNA-379用于肺癌，miRNA-21用于食管鳞状细胞癌，被建议作为非侵入性诊断生物标志物。此外，外泌体蛋白对许多癌症具有生物标志物潜力。在癌症的情况下，早期发现肿瘤对于有效治疗至关重要。如图4A和B所示，其中43项（74.13%）临床试验与癌症生物标志物研究相关，其余属于其他疾病（约25.87%）。深入了解外泌体货物排序机制及其分泌、通过特定体液的转移以及在生理设置和不同疾病背景下的稳定状态水平，将产生更强的生物标志物，用于监测疾病的发生和发展。此外，进一步的研究对于验证外泌体生物标志物与传统癌症生物标志物相比的特异性和灵敏度至关重要。 药物输送应用 外泌体作为用于输送治疗剂的生物纳米平台已在临床前和临床实验中进行了研究。在纳米技术领域，设计智能载体进行靶向药物输送是黄金标准。外泌体可能是将几种药物输送平台制剂转化为临床应用的良好申请者。从药物输送的角度来看，外泌体在磷脂结构方面类似于脂质体。然而，外泌体可以从各种体液和细胞中收集，具有不同脂质和表面蛋白和受体的复杂结构；这些生物分子可能有助于组织和细胞靶向，而一些则保证最小的非靶向相互作用。这些独特的蛋白质装饰的磷脂膜可能具有与邻近和远距离目标相互作用的理想条形码。尽管进行了广泛的研究，基于外泌体的药物输送系统相对于其他合成纳米载体（如脂质体）的优越性，以及相关的利益风险比仍然是辩论的问题。治疗剂，包括核酸、蛋白质和药物，至少可以通过两种通用方法插入外泌体，然后被运送到特定目标。这些方法是直接方法或外源性方法，其中药物通过几种方法加载到分离的外泌体中；以及间接方法或内源性方法，其中亲本细胞被加载药物或基因改造以表达所需的蛋白质、受体和RNA。如果亲本细胞正确产生所选分子的外泌体，则内源性方法具有较低的复杂性水平。或者，有一种称为外泌体启发的脂质体的方法，其中一个所需的脂质体与外泌体融合以构建混合载体。正在进行的临床试验表明，外泌体被用于输送治疗剂，例如，在ClinicalTrials.gov资源中有六项临床试验注册（https://clinicaltrials.gov/ct2/home）。在两项临床试验中，作者旨在通过直接方法将姜黄素封装到植物衍生的外泌体中，用于治疗结直肠癌和肠易激综合症（NCT01294072和NCT04879810）。此外，三项临床试验旨在修改间充质干细胞（MSCs），以产生过度表达的外泌体（表2）。这些试验都没有完成，到目前为止结果尚不可用。值得一提的是，一些临床试验使用来自肿瘤细胞的微粒来输送药物（例如NCT02657460和NCT01854866）。这些研究使用了微粒而不是外泌体的术语，并且在ISEV基于EVs研究的指南之前就已经记录了。 尽管研究人员已经努力利用外泌体的独特属性来推进智能药物输送系统，这些系统在药代动力学、靶向和安全性方面显示出可观的利润，与合成纳米载体相比，临床转化这些结果面临挑战。由于外泌体本身的特征复杂性、尺寸异质性和自然（批次到批次）的差异贯穿其组装过程，其固有的生物发生过程风险高于原始合成制造方法。此外，需要技术上可行且可重复的方法来用治疗药物加载它们。尽管脂质体的加载方法已经优化并在工业环境中使用，但外泌体仍然需要这样的方法。当前的细胞培养和外泌体纯化方法限制了标准化和大规模生产外泌体的实施。因此，要使外泌体被视为可靠的治疗载体，需要可扩展的制造工艺，以快速、成本效益和可重复的方式生产外泌体。 外泌体治疗 如今，人们对使用细胞衍生物（如外泌体）而非干细胞进行治疗的兴趣日益增加。来自干细胞的外泌体代表了与干细胞相同的治疗和临床益处。目前，已知许多来自原生干细胞的外泌体已被证明能够恢复不利条件和受损组织。一些实验室采用了提高外泌体产量和改善外泌体治疗潜力的策略，包括干细胞的预处理、干细胞的遗传修饰以及外泌体与生物材料的结合。例如，使用去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺来促进间充质干细胞（MSCs）分泌外泌体，而不影响其调节能力。其他物理策略包括将干细胞与低氧、酸性介质和脂多糖共同孵育。除了动物细胞，微生物和植物衍生的外泌体也被认为具有。然而，这些外泌体/EVs的安全性需要评估。在临床背景下，外泌体已注册用于治疗多种疾病。近年来，由于COVID-19肺炎的爆发；由于其免疫调节和再生潜力，MSCs衍生的外泌体正日益受到检验。根据ClinicalTrials.gov资源（https://clinicaltrials.gov/ct2/home），共有33项外泌体治疗临床试验注册，其中20项临床试验使用了MSCs衍生的外泌体（60.60%）。研究人员还使用植物、T细胞和DCs衍生的外泌体治疗不同疾病。大多数研究（9项临床试验）属于SARS-CoV-2肺炎治疗（图4）。这些结果表明，来自MSCs的外泌体经常用于再生医学。然而，一些研究表明，MSCs外泌体治疗有时被视为“双刃剑”。与令人满意的结果相反，外泌体治疗的安全性、副作用和不良结果尚不完全清楚。一项临床研究旨在调查植物（葡萄）外泌体预防头颈部癌症放化疗相关口腔粘膜炎的能力（NCT01668849）。最近，FDA指出，内布拉斯加州接受未经批准产品治疗的患者报告了严重的不良反应，这些产品被宣传为基于外泌体的产品。该机构强调，目前没有监管批准的外泌体产品，患者被一些诊所欺骗，以预防和治疗多种疾病。除了外泌体的产量，许多其他属性也受到选择的分离方法的影响。外泌体的纯度和物理化学属性是受不同分离方法影响的主要因素。可以使用不同的方法，如超滤、尺寸排除色谱、水相两相系统和基于聚合物的沉淀，用于外泌体的大规模生产。达到临床使用的大规模所需外泌体是一个主要挑战。外泌体的产量通常少于1 µg外泌体蛋白/mL培养基，而大多数研究中外泌体的有益剂量约为10-100 µg外泌体蛋白/小鼠。在临床试验中使用外泌体需要符合GMP。在GMP中，外泌体的显著问题普遍存在。首先，大规模生产。实现基于外泌体的治疗的一个主要问题是外泌体的低生产力。其次，收集高质量和统一的外泌体。外泌体的物理化学和纯度属性是受不同分离方法影响的主要问题。第三，标准化储存条件。第四，开发外泌体的治疗潜力。对于外泌体的压倒性低效率，阐明它们的治疗潜力可能是一种可能的解释。过度表达或富集治疗性生物分子是提高治疗潜力的简单方法（图5）。此外，将外泌体输送到目标组织/细胞是一个关键问题。由于外泌体的生物学效应是通过它们被目标细胞摄取来实现的，因此澄清和控制外泌体的生物分布对于临床治疗应用是必要的。骨髓来源的MSCs、人类心脏祖细胞、单核细胞来源的DCs、脂肪组织来源的干细胞和HEK293细胞等五类细胞已在GMP中用于生产外泌体。尽管已有几项实验研究报告，但关于植物衍生外泌体的GMP生产证据较少。总的来说，一个正常的临床试验项目和监督监测值得注意，以确认患者在接受干细胞和外泌体治疗时的安全性。 图5 分析基于外泌体的生物标志物临床试验(A, B)以及针对不同疾病的基于外泌体治疗的临床试验(C) 外泌体疫苗 肿瘤细胞衍生的外泌体已被用于治疗以引发强烈的抗肿瘤免疫反应。此外，基于外泌体的疫苗对几种传染病显示出了希望的结果。来自先天免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体有潜力被用作癌症疫苗（图2）。外泌体上的几种活性分子，如MHC和共刺激分子，促进免疫细胞的抗肿瘤反应。最近在分析外泌体货物方面的进展也导致了活性剂的增加，这些活性剂可能被用于癌症免疫疗法。基于对外泌体在癌症免疫疗法中功能的广泛研究，已经使用外泌体进行了许多临床前研究。在接受抗Survivin免疫疗法的胶质母细胞瘤患者中，CD9+/SVN+和CD9+/GFAP+/SVN+外泌体的低水平与患者持续生存相关。此外，肿瘤细胞衍生的外泌体含有DNA链，这些DNA链可以通过STING/cGAS途径诱导免疫细胞反应，因此，这些外泌体可能在免疫检查点治疗中调节肿瘤免疫。来自癌症患者的DCs衍生外泌体在一些小规模临床试验中被证明是安全和可行的用于免疫疗法。DCs外泌体免疫疗法在精确和精确的免疫反应方面优于其他疗法。此外，DCs外泌体免疫疗法具有更高的生物稳定性和生物利用度，成本更低。在第一阶段I临床试验(NCT01159288)中，作者使用自体DCs衍生外泌体进行疫苗接种，以对抗转移性黑色素瘤，并展示了它们的安全性。然而，他们没有观察到深刻的CD4+或CD8+T细胞反应；仍然需要检查疫苗抗原分布背后的机制。此外，在另一项研究中，DCs衍生外泌体已被证明可以增加NSCLC患者的NK溶解活性并诱导MAGE特异性T细胞反应。在一项免疫疗法II期临床试验中，作者旨在通过使用IFNγ DCs外泌体来增强进展期NSCLC患者的T细胞和NK免疫反应。作者报告说这些外泌体可以增强患者的NK细胞的抗肿瘤免疫。然而，关键的临床结果，无进展生存期(PFS)的50%，没有实现，研究中没有描述出色的免疫反应。最后一个可信的选择是将DCs外泌体疫苗与基于NK的疗法相结合，以产生针对NK依赖性肿瘤的协同免疫原性结果。此外，似乎构建一种经过修饰的永生化DC系库，该库被修饰以表达单一MHC II分子和/或没有MHC蛋白，可以使DCs外泌体的恒定生产变得有希望，减少治疗成本和细胞培养时间间隔。在对免疫细胞招募有抵抗力的脑癌中，DCs外泌体在小鼠模型中已被证明对胶质瘤有希望，表明这些外泌体免疫疗法可以成为胶质母细胞瘤的新疗法。根据目前的研究结果和临床试验，外泌体被认为将成为各种癌症的免疫治疗疫苗。临床试验管理了符合当前GMP标准的自体DCs外泌体。迄今为止的临床试验对于证明自体外泌体管理的可行性和短期安全性非常重要，但基于外源性外泌体产品的疗法的安全性问题将更加严格。尽管一些研究已经描述了大量外泌体生产的协议和生物相容性的发展，但需要额外的临床前和临床审查以确认。最后，相对较小的尺寸和统一的形状使外泌体能够成功逃避单核吞噬系统的清除，不仅延长了它们的循环时间，也暗示了它们在细胞-细胞通信中的优越性。 结论 在过去二十年中，EVs/外泌体领域取得了惊人的进步。许多研究人员正在进行外泌体的发现和应用，为人类健康提供帮助。然而，指导方针、标准化、命名和动力学仍需取得更一致的方法。外泌体在体内转移的事实以及货物通过体液传递和送达目标的机制存在不足，是我们建议需要进一步考虑的领域。我们主要鼓励来自不同学科的研究人员，如临床医生、细胞生物学家、技术权威和计算机专家的合作，可以在外泌体假定的任何领域带来重大飞跃。在这项研究中，我们根据潜在应用和疾病类型，认真审查了外泌体的治疗应用和最近临床试验的现状。尽管临床前研究描述了有希望的结果，但获得更大成果需要对外泌体基础治疗进行许多改进。人类和衍生的植物外泌体已在临床试验中记录。来自人类细胞的外泌体占大多数，并与植物相比有完整的报告。外泌体的临床应用包括用作预后和诊断疾病的生物标志物、药物输送载体、无细胞治疗和癌症疫苗。所有这些应用都伴随着挑战和限制，需要更多的探索和标准化。进一步的研究表明，符合GMP的人类外泌体可以满足临床试验的使用需求。我们认为，外泌体在疾病管理中的有效性主要取决于技术进步，这些技术进步允许它们的发现、对不同疾病发展的敏感性和特异性。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 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病毒和细胞外囊泡（EV）共享许多特性。细胞用于制造、包装和释放EV的机制同样被病毒利用来实现其复制、组装和释放。病毒可能通过增加EV的产生或操控EV来传播其遗传物质或蛋白质，而EV则可能携带免疫调节分子和病毒抗原，从而激活抗病毒免疫反应，对调节病毒感染具有关键作用。这种相互作用是极其复杂的，它不仅揭示了EV和病毒在多种疾病发展中的相关性，还为联合治疗提供了新的视野。本文将概述病毒与EV的相互关系，并讨论近五年来在病毒-EV治疗工程方面的主要进展。 多细胞生物依赖细胞间的通讯来调控其生理学的多个方面。这种通讯定义了细胞生长和行为的微环境，对于集体防御病原体至关重要。大多数细胞间通讯是通过生物活性分子的运输实现的，这些分子可以通过被动扩散或通过载体如EV来运输。EV是细胞分泌的膜囊泡，具有不同的大小、成分和来源，能够通过传递生物活性分子来诱导受体细胞产生生理变化。EV中包含的生物分子种类繁多，根据其来源组织、免疫状态和细胞环境的不同而异，目前通过ExoCarta、Vesiclepedia和EVpedia等在线数据库进行记录。 EV的来源多样，包括多泡体（外泌体）、质膜（微泡）以及其他细胞器，如自噬体。微泡的直径通常在50至1000纳米之间，通过肌动蛋白-肌球蛋白网络的ATP依赖性收缩从质膜释放。外泌体是直径在30至150纳米之间的EV，最初在多泡体内形成，随后在多泡体与质膜融合后释放。与外泌体不同，微泡的分泌依赖于特定的细胞信号通路。微泡和外泌体的膜组成有许多共同特征，包括四跨膜蛋白、磷脂酰丝氨酸脂质、细胞粘附蛋白和细胞内运输蛋白。受体细胞对它们的摄取遵循相似的途径和机制。自噬体衍生的EV则是自噬体非经典加工的结果，它们通过与内体或多泡体融合，或直接与质膜融合来释放。 EV在免疫反应中发挥着重要作用，它们可以携带抗原和免疫刺激因子，激活针对病原体和肿瘤的免疫反应，同时通过排出有害物质如细胞质中的核DNA来维持细胞稳态。在妊娠、干细胞分化和损伤修复中，EV也扮演着关键角色。例如，脂肪间充质干细胞分泌的EV对控制细胞增殖、迁移和凋亡至关重要，并且在血管生成、神经再生和免疫反应中也发挥着重要作用。尽管许多EV调节的信号通路对细胞稳态和宿主免疫有益，但在某些情况下，EV也可能传播或加剧病理状况，如携带与神经退行性疾病相关的错误折叠蛋白，或促进肿瘤进展和炎症反应。 EV与病毒之间的联系非常紧密。病毒可以利用EV途径来促进其生命周期的各个方面，包括进入宿主细胞、排出以及调节宿主的免疫反应。同时，EV也可以作为警告宿主细胞病毒感染并激活抗病毒反应的工具。病毒和EV之间的相互作用对病毒的发病机制具有重要影响。例如，通常用于警告周围细胞病毒感染并激活抗病毒反应的EV，可能被某些病毒劫持，从而降低邻近细胞的免疫反应，使它们更易感染。 在这篇综述中，我们将重点讨论过去十年来关于EV和病毒相互作用的发现。我们将首先描述EV的生物合成途径，并探讨病毒如何为了自身利益而利用或操纵这些途径。接着，我们将研究EV在病毒传播和发病机制中的作用，以及EV、病毒和免疫系统之间的相互关系。最后，我们将关注EV在病毒相关疾病中的作用，并探讨将病毒和EV结合作为治疗方法的有前景的策略，特别是针对肿瘤的治疗。 病毒和 EV 相互交织的细胞内途径 EV生物合成途径 EV 由细胞多泡体 (MVB) 中包含的腔内囊泡 (ILV) 分泌。生物合成途径始于内体成熟为 MVB，此时膜货物招募诱导内体膜内部出芽和 ILV 形成的因子。这些货物可能包括蛋白质、核酸、代谢物和脂质。根据货物类型及其与EV包装复合体的相互作用，货物的吸收由不同的机制控制。 将蛋白质包装到 EV 中取决于翻译后修饰（主要是泛素化，在某些情况下还包括苏素化），以及与插入 MVB 内的脂质和蛋白质的特定相互作用。泛素化蛋白的摄取已被广泛研究，并由运输（ESCRT）机制所需的内体分选复合物介导。泛素化蛋白与 ESCRT-0 相互作用，后者招募 ESCRT-I，包括 TSG101 亚基。ESCRT-I 依次招募 ESCRT-II 和 -III。总而言之，ESCRT 机制在液泡蛋白分选相关蛋白 4 (VPS4) 的帮助下介导 MVB 的内陷和 ILV 的分裂。然后需要去泛素化来对 EV 内的蛋白质进行分类（图 1 A）。在某些情况下，SUMO 化还介导 ESCRT 机制对蛋白质的摄取。例如，Kunadt等人研究表明，α-突触核蛋白的苏酰化对于其与 ESCRT 复合物的相互作用以及将其包装到 EV 中是必要的。 图 1. 病毒和 EV 使用相互交织的生物发生途径。( A ) EV生物合成途径：从MVB形成到EV释放。EV 的形成需要 ESCRT 复合体将 ILV 中的货物内化到 MVB 内，Rab-GTPases-11、-27 和 -35 将 MVB 运输到质膜，以及 SNARE 复合体用于 MVB 与质膜融合并释放 ILV，成为EV。MVB 膜中的泛素化货物招募 ESCRT-0，ESCRT-0 又招募 ESCRT-I、-II 和 -III，介导膜内陷。ESCRT-III 复合物在 VPS4 的帮助下形成细丝诱导 ILV 建模和断裂。( B ) 病毒劫持 EV 生物合成途径。( B1 )HAV衣壳进入MVB，在EV中分泌并形成“准囊膜”病毒。HAV 病毒衣壳结构域 VP2 和 VP1pX 招募 ALIX、ESCRT-III 和 VPS4 进入 MVB。MVB 与质膜融合后，准囊膜的 HAV 被释放。有囊膜病毒SARS - CoV-2、HCMV 和HBV也进入MVB ，在那里它们获得病毒囊膜。( B2 ) HIV 通过劫持 ESCRT 复合物获得其囊膜。HIV 囊膜蛋白 (Env) 招募与二聚化病毒 RNA 相关的 Gag 和 Gag/Pol 多蛋白。然后，Gag p6 结构域从质膜招募 ESCRT 复合物、ALIX 和 VPS4 以及芽。( B3 )HSV-1通过劫持ESCRT复合物逃离细胞核。插入内核膜的 HSV-1 病毒核包络复合物 (NEC) 会招募 ESCRT-III 和 VPS4 并在核囊膜内出芽。然后，含有HSV-1衣壳的囊泡与外核膜融合，并在胞质溶胶中释放HSV-1衣壳。HSV-1 随后通过在反高尔基体囊泡内出芽，然后通过胞吐作用获得病毒囊膜。( B4 )祖先逆转录转座子Arc蛋白募集ALIX并被分泌。Arc 编码衣壳 GAG 结构域，该结构域自组装成包含 Arc mRNA 的病毒样衣壳。衣壳可能会招募 ALIX，从而增强质膜的出芽以及含有 Arc 衣壳和 mRNA 的 EV 的分泌。 蛋白质可以通过不依赖于ESCRT复合体的非经典途径被分选入EV中。例如，ALIX能够绕开ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II，直接在多泡体（MVB）内结合并运输未泛素化的货物。此外，ALIX还能被细胞质蛋白Syntenin招募，后者与MVB膜上的Syndecan结合，形成多聚糖-蛋白复合物，通过部分ESCRT独立途径促进内体小泡（ILV）的形成。同时，蛋白质还可以通过鞘脂依赖性、ESCRT独立机制被包装进ILV。MVB膜含有鞘脂，可被中性鞘磷脂酶-2（n-SMase-2）水解生成神经酰胺，神经酰胺的插入可诱导MVB膜形成负曲率，进而形成ILV。神经酰胺进一步转化为1-磷酸鞘氨醇（S1P），可增强S1P受体的活性，参与ILV内货物的分类。 与蛋白质相比，核酸如何被包装进EV的过程尚不完全清楚，但可能涉及多种机制。miRNA等小RNA分子根据RNA结合蛋白识别的序列基序被包装进EV，这些RNA结合蛋白包括异源核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）、突触结合蛋白结合胞质RNA相互作用蛋白（SYNCRIP）、Argonaute2、Y-Box结合蛋白1（YBX-1）、MEX3C、主要穹窿蛋白（MVP）和La蛋白。这些RNA结合蛋白与MVB膜蛋白如Caveolin-1（Cav-1）、n-SMase-2和VPS4相互作用，促进miRNA进入MVB。例如，苏酰化的hnRNPA2B1可结合特定miRNA序列（GGAG），然后被招募到MVB。在细胞应激时，Cav-1从质膜小窝重新定位到MVB，导致hnRNPA2B1被吸收。基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA（mtDNA）也可能被分选进MVB。受损的gDNA可通过微核被转运出细胞核，最终释放到细胞质中。同样，在细胞应激时，mtDNA可能渗漏到细胞质中，然后被MVB吸收。 四跨膜蛋白在EV生物合成中也起着重要作用。这些蛋白参与多种生理过程，如细胞迁移、粘附和信号传导。多种四跨膜蛋白，如CD63、CD9和CD81，位于MVB内，支持蛋白质和核酸货物的运输、选择和分类到ILV，以及受体细胞对EV的摄取。例如，CD63在微核膜上被发现，可促进gDNA从微核分选到ILV。 一旦货物被包装进ILV，MVB要么与溶酶体融合被降解，要么移动到质膜并在那里通过SNARE复合物调节的过程释放ILV到周围环境中，形成EV。MVB向质膜的转运由Rab GTP酶介导，Rab-11和Rab-35介导不依赖于ESCRT的MVB分泌，而Rab-27在依赖于ESCRT的途径中发挥作用。其他Rab蛋白如Rab31也被发现参与EV生物合成，通过独立于ESCRT的途径促进ILV的货物摄取，并抑制MVB与溶酶体的融合。 分泌的EV可在多种体液中发现，如血液、尿液、唾液等，其在体内的半衰期受多种因素影响。一些研究表明，EV在小鼠体内的半衰期可能很短，静脉注射后30分钟内可检测到。EV可扩散到同一组织中的周围细胞，也可分布到远处组织。EV对特定细胞类型的选择性由产生它们的细胞决定，甚至可能影响它们在特定器官中的积累。基质内因素也影响EV的流动性和分布。EV通过EV相关跨膜分子被特定受体细胞内化，如ICAM-1、整合素等。EV的内化机制包括膜融合、网格蛋白介导的内吞作用等，受EV纯度、尺寸、丰度和局部环境等因素影响。 病毒劫持 EV 生物合成途径 病毒已经采取了劫持EV生物合成机制的策略，以帮助其生命周期的各个阶段。RNA 和 DNA 病毒都可以通过使用 ESCRT 复合物和 Rab-GTP 酶获得病毒囊膜。有囊膜病毒在进入 MVB 时可以获得病毒囊膜，如人类巨细胞病毒 (HCMV)、人类疱疹病毒 6 (HHV-6)、SARS-CoV-2、登革热病毒 (DV) 和乙型肝炎病毒 (HBV) 中所观察到的那样。例如，HBV 大乙型肝炎表面蛋白 (LHB) 劫持 Rab5B，导致其从内质网转运至 MVB。在那里，LHB 招募 HBV 衣壳和 TSG101 并在 MVB 内出芽。然后，HBV 劫持 Rab7a 和 Rab27，从而增强 MVB 成熟并与质膜融合。 无囊膜病毒也会劫持 ESCRT 复合体，并在 EV 内分泌其病毒颗粒或病毒基因组，正如在甲型肝炎病毒 (HAV)、戊型肝炎病毒 (HEV)、肠道病毒 71 (EV71) 和蓝舌病毒中观察到的那样 。这些所谓的准囊膜病毒可以避免免疫识别并增强其对不同细胞类型的趋向性，同时以非溶细胞方式离开细胞。HAV 衣壳招募 ESCRT-III、VPS4 和 ALIX，使病毒衣壳在 MVB 内向内出芽，并随后在 EV 内释放。HEV 蛋白 pORF3 与 TSG101 相互作用，导致病毒衣壳募集并将其包装到 MVB 中，然后再进行 HEV-EV Rab27a 依赖性分泌。EV71 衣壳和 RNA 也在 EV 内部以非裂解方式释放。最后，蓝舌病毒包装到 EV 中是由非结构病毒蛋白 NS3 介导的，NS3 是与 TSG101 相互作用所必需的并允许在 MVB 内摄取（图 1 B1）。 此外，一些病毒还劫持 ESCRT 和 Rab-GTPase 蛋白以在不进入 MVB 的情况下完成其复制周期。首先，病毒招募 ESCRT 复合物来获得病毒囊膜。例如，人类免疫缺陷病毒 (HIV) 招募 ESCRT-I、-II、-III、ALIX 和 VPS4 从质膜中出芽（图 1 B2）。同样，黄热病病毒 NS3 蛋白通过结合 ALIX 介导内质网 (ER) 内的病毒出芽，从而可能招募 ESCRT 复合物。其次，一些在细胞核内形成衣壳的病毒通过劫持 ESCRT 复合物到达细胞质。例如，插入内核膜内的单纯疱疹病毒 1 (HSV-1) 核包络复合物 (NEC) 会募集 ESCRT-III 并结合成熟的衣壳。这允许 HSV-1 衣壳以 ALIX、TSG101 和 ESCRT-II 独立的方式在核膜内内部出芽。然后病毒衣壳通过与外核膜融合而释放到胞质溶胶中。HSV-1 随后通过在跨高尔基体囊泡内出芽获得最终的囊膜，并通过胞吐作用分泌（图 1 B3）。其它病毒也会劫持 Rab-GTP 酶来运输其病毒物质，例如带有 Rab10 的流感病毒 (IAV)，或增强其复制周期，如丙型肝炎病毒 (HCV) 和 Rab27a 所观察到的。最后，病毒可以劫持 ESCRT 机制，形成病毒复制酶复合物。例如，番茄丛状突瘤病毒 p33 复制蛋白劫持 VPS4、ESCRT-I 和 ESCRT-III，并介导过氧化物酶体内病毒 RNA 基因组的排序，病毒在过氧化物酶体内复制并免受细胞免疫监视。 来自病毒感染细胞的 EV 有助于促进健康细胞的感染 EV 在病毒传播和健康细胞的感染性中发挥着重要作用。许多病毒通过胞外囊泡将传染性颗粒或遗传物质传递到周围细胞。这可以为囊膜病毒和非囊膜病毒提供一层外衣，使其免受免疫监视，同时允许病毒传播，如前文所述 HCMV、HHV-6、SARS-CoV-2、DV、HBV、HAV、HEV、EV71 和蓝舌病病毒。例如，含有病毒样颗粒的 DV-EV 将病毒转移到未感染的蚊子细胞中。此外，病毒-EV还运输可以诱导受体细胞主动感染的病毒基因组。来自人类pegivirus感染受试者的血清含有EV样颗粒，其将pegivirus RNA基因组转运至受体T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并介导这些细胞内病毒RNA的主动复制（图2A）。 图 2. 病毒-EV 增加受体细胞对病毒的摄取。( A ) 病毒-EV 增加受体细胞的病毒摄取和主动感染。有囊膜 [HCMV、HHV-6、Sars-CoV-2、DV、HBV] 和无囊膜 [HAV、HEV、EV71、蓝舌病毒] 病毒均分泌在病毒 EV 内，并诱导受体细胞主动感染。病毒基因组在病毒 EV 内的运输也可以诱导受体细胞的主动感染 [Pegivirus]。此外，病毒-EV可以在其表面呈现PS，从而增强其对受体细胞的摄取[HAV、EBV、寨卡病毒、HIV、柯萨奇病毒B3、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒。病毒-EV 还以不依赖于受体的方式诱导受体细胞的主动感染，如含有病毒基因组和蛋白质、病毒衣壳和蛋白质或与宿主 miRNA 和蛋白质相关的病毒 RNA 的病毒-EV 所观察到的那样 [EV71 、HCV、HBV、SFTS 病毒]。( B ) EV 介导的病毒感染性增强。一些病毒-EV 在受体细胞之间转移病毒受体，增加这些细胞对病毒的摄取[Sars-CoV-2、HIV]。其它含有病毒基因组、病毒 RNA 和蛋白质以及宿主粘附蛋白（ICAM-1 及其受体 LFA-1，整合素）的病毒 EV 增强病毒的细胞间传播 [HTLV-1] 。含有宿主粘附蛋白、抗原呈递受体、细胞因子和病毒 RNA 的病毒 EV 不会直接导致感染，而是以非病毒受体的方式增强病毒传播 [HIV-1]。病毒-EV 还可以通过抑制病毒复制来增强潜伏感染 [HSV-1]。( C ) EV 介导病毒在宿主之间的传播。单一病毒-EV可以运输和递送多种病毒颗粒至受体细胞，从而增强病毒感染[脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒B3、诺如病毒、轮状病毒。其中一些病毒-EV介导病毒粪口传播[诺如病毒、轮状病毒]。蚊子产生的病毒 EV 含有病毒基因组、病毒 RNA 和蛋白质，并呈递 PS [寨卡病毒] 或人类 CD63 四跨膜蛋白直系同源物，诱导哺乳动物细胞主动感染。 一些病毒改变 EV 的脂质和蛋白质组成，以增加新细胞的结合和摄取。例如，HAV、肠道病毒、EBV、寨卡病毒和HIV感染的细胞会分泌富含PS的EV。HAV-EV 富含 PS 和胆固醇。PS 结合 HAV 细胞受体 1 (HAVCR1) 并介导内吞作用，而胆固醇则结合 NCP1 内体蛋白并融合内体和 EV 膜，从而在细胞内释放 HAV 衣壳和基因组。同样，肠道病毒（脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒和柯萨奇病毒 B3 (CVB3)）被包装在富含 PS 的类自噬体细胞器内，PS 以病毒受体依赖性方式介导病毒进入。在潜伏感染期间，由于 PS 与 DC 上的 TIM-1 受体结合，含有病毒 miRNA 的 EBV-EV 被受体 DC 摄取。同样，感染 EBV 的淋巴瘤细胞分泌含有病毒 miRNA 和 PS 的 EV，并由单核细胞整合（图 2 A）。 EV 的独特组成还可以允许以不依赖于受体的方式摄取病毒并改变病毒向性，正如在 EV71、HCV、HBV 和血小板减少综合征 (SFTS) 病毒严重发烧中所观察到的那样。包含病毒基因组的 EV71-EV 由受体细胞以不依赖于受体的方式整合，因为病毒受体的敲低并不意味着受体细胞会摄取病毒。同样，HCV-EV包含病毒RNA和宿主miR-122和Ago2蛋白，这两者都是HCV复制时劫持的宿主因子。这些 HCV-EV 以不依赖于受体的方式诱导肝细胞主动感染。事实上，针对 HCV 糖蛋白 E1 或 E2 或参与 HCV 进入细胞内的宿主蛋白（SB-RI、ApoE、CD81）的抗体的存在并不会削弱病毒感染。SFTS-virus-EV 含有病毒 NS 蛋白和病毒颗粒，并以不依赖于病毒受体的方式诱导受体 HeLa 细胞的主动感染，正如缺乏抗 SFTS 病毒抗体的作用所表明的那样。此外，尽管 HBV 对肝细胞具有趋向性，但 HBV-EV 仍含有 HBV DNA、RNA 和蛋白质，可被自然杀伤 (NK) 细胞整合（图 2 A）。 EV还通过将病毒靶向宿主受体转运至通常不高水平表达它们的细胞来增加细胞对病毒感染的易感性。例如，EV在未感染的内皮细胞之间运输 SARS-CoV-2 病毒受体 ACE2和四跨膜蛋白 CD9。CD9 促进 ACE2 在受体细胞表面聚集，从而增强其对 SARS-CoV-2 感染的敏感性。同样，HIV-1 病毒受体 CCR5 在微粒内转移到外周血单核细胞 (PBMC)，但也转移到不内源表达 CCR5 的内皮细胞，从而允许 HIV-1 感染内皮细胞（图 2 B）。 含有病毒RNA的病毒EV也可以促进受体细胞的感染。HIV 感染的单核细胞衍生的巨噬细胞分泌含有 HIV-1 RNA、潜在的 HIV 逆转录酶、宿主细胞因子（白细胞介素 (IL) -3、-4、-8、-17、瘦素、肿瘤坏死因子 α (TNF- α))、抗原呈递受体和粘附因子（HLA、CD14、CD74、CD44R5、Fc 受体、纤连蛋白和半乳糖凝集素-3），并具有特定的脂质成分 (PS)。这些 HIV-1-EV 通过不依赖 CD4 的网格蛋白介导的内吞作用控制受体 T 细胞的感染。Narayanan等人研究表明，T 细胞系分泌的 HIV-1-EV 含有病毒 TAR RNA、Gag 和 Gp160 蛋白以及宿主 miRNA 机械蛋白。HIV-1-EV 转移 TAR RNA 通过下调 Bim 抑制细胞凋亡，从而促进 HIV-1 感染受体 Jurkat T 细胞。此外，人类 T 淋巴细胞病毒 1 型 (HTLV-1)-EV 含有病毒 RNA 和蛋白质，但也含有以下粘附蛋白：CD45、ICAM-1及其受体 LFA-1。这些 HTLV-1-EV 不会主动感染受体 T 细胞，而是增强受体细胞之间的细胞间接触。已知 CD45 和 ICAM-I/LFA-1 分别支持病毒生物膜和病毒突触的形成，从而促进病毒感染。病毒EV还可以促进潜伏感染并增强病毒在宿主之间的传播。例如，HSV-1-EV 包含控制 HSV-1 复制的病毒 miRNA（miR-H28 和 -H29），并下调 IFN 基因刺激剂 (STING)，这是一种激活抗病毒先天免疫的细胞质 DNA 传感器（图2B）。 病毒-EV 通过包装多个病毒颗粒来增强病毒颗粒的转移。这种包装能够将多种病毒基因组和蛋白质转移到受体细胞，从而提高细胞抗病毒免疫反应的存活率并增加整体感染性。在脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒和柯萨奇病毒 B3 (CVB3) 的自噬体衍生的 EV以及诺如病毒的 MVB 衍生的 EV 和轮状病毒的质膜衍生的 EV中观察到了这一点（图 2 C）。 病毒EV增强宿主之间的病毒传播 EV 中病毒颗粒的封装通过在宿主之间提供安全传输来提高病毒传播率。例如，当诺如病毒和轮状病毒在EV内部受到保护时，它们在通过粪便和胃肠道时不会被降解。这改善了这些病毒的主动粪口传播。另一个例子是 DV，它在节肢动物（白纹伊蚊和埃及伊蚊）的EV内传播到哺乳动物宿主。感染 DV 的蚊子细胞分泌的 EV 含有病毒 RNA（全长病毒基因组、病毒衣壳 mRNA）和蛋白质（病毒糖蛋白 E 蛋白），可促进蚊子细胞、小鼠细胞、人类皮肤角质形成细胞和血液内皮细胞的主动感染。有趣的是，这些 DV-EV 富含一种含有四跨膜蛋白结构域的蚊子糖蛋白 Tsp29Fb，它是人类 CD63 的推定直系同源物。Tsp29Fb 与 DV E 蛋白的相互作用对于节肢动物 DV-EV 被人类受体细胞摄取和主动感染是必需的。感染寨卡病毒的蚊子细胞分泌含有PS、病毒糖蛋白E蛋白和病毒RNA的EV，介导蚊子和哺乳动物细胞（猴内皮Vero细胞、人单核细胞、内皮血管细胞）的主动感染（图2C） 。 细胞根据祖先逆转录病毒序列产生 EV 生殖细胞的逆转录病毒感染导致宿主基因组的长期修饰，其中原病毒成为内源性逆转录病毒。内源性逆转录病毒与长末端重复（LTR）反转录转座子非常相似，因为它们都编码gag样、pro样和pol样基因，进行逆转录并整合到宿主基因组中。这些发现表明这两个元素之间存在潜在的共同祖先。有趣的是，一些 LTR 逆转录转座子还介导病毒样颗粒的形成，从而实现细胞间的生理通讯。 例如，哺乳动物基因 PEG10 和神经元基因 ARC 都是编码 GAG 类似物的 LTR 逆转录转座子。它们在分泌到 EV 中之前自我组装并封装自己的 mRNA。PEG10 基因编码衣壳、核衣壳、蛋白酶和逆转录酶 GAG 结构域。Segel等人研究表明，侧翼目的基因与 mPEG10 的非翻译区域允许在 EV 中运输目的 mRNA 并在组织内转移，这可用于基因治疗递送。ARC 基因编码衣壳 GAG 结构域，该结构域封装 Arc mRNA 并在分泌到 EV 中之前劫持 ALIX。然后，这些 EV 可以靶向神经元细胞，Arc mRNA 在神经元细胞中积极翻译。有趣的是，Arc 通过控制长期抑制和增强所需的蛋白质的合成来调节突触可塑性。因此，这种 Arc mRNA 在神经元之间的转移可能在哺乳动物的认知功能中发挥了原始作用（图 1 B4）。 此外，通过 EV 转移逆转录因子可以增强肿瘤发生。肿瘤细胞分泌富含人内源性逆转录病毒 (HERV) 元件（例如 Alu 和 LINE-1）的 EV，这些元件可促进受体细胞的肿瘤发生。例如，皮肤T细胞淋巴瘤分泌含有编码合胞素-1的HERV W元件的EV。EV 接收后，合胞素-1 介导受体细胞之间的膜融合，并可以改善细胞之间肿瘤信号的传递。 原文：C.Moulin, M.J.F.Crupi, C.S.IIkow, et al., Extracellular Vesicles and Viruses: Two Intertwined Entities. International Journal of Molecular Sciences, 2023. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。