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靶向蛋白质降解TPD作为一种新兴的治疗手段，正在从基础研究走向临床应用，为药物开发带来了全新的思路和策略。本文将对发表在Nature Reviews Molecular Cell Biology上的一篇综述文章《Targeted protein degradation: from mechanisms to clinic》进行解读，深入了解这一领域的最新进展和未来方向。一、靶向蛋白质降解的原理与机制TPD的核心在于利用小分子药物诱导特定蛋白质的降解。其最常见的形式是通过小分子介导的泛素化过程，将目标蛋白质与泛素连接酶联系起来，从而标记目标蛋白质进行降解。这一过程主要依赖于泛素-蛋白酶体系统（UPS），其中E3连接酶起着关键作用，它们能够识别并结合特定的蛋白质靶标，进而通过泛素化作用标记这些蛋白质，使其被蛋白酶体识别并降解。文章详细介绍了TPD的多种机制，包括自然存在的分子胶降解剂（molecular glue degraders）和人工设计的PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras）。分子胶降解剂是一类单价小分子，它们能够结合E3连接酶或目标蛋白质，促进E3连接酶与目标蛋白质之间的新相互作用，从而导致目标蛋白质的降解。而PROTAC则是一种双功能分子，包含两个不同的结合基团，一个用于结合E3连接酶，另一个用于结合目标蛋白质，通过连接这两个基团，PROTAC能够将E3连接酶和目标蛋白质拉近，从而诱导目标蛋白质的降解。图1 PROTACs和分子胶降解剂诱导目标蛋白降解的模式二、自然存在的靶向蛋白质降解机制自然界中已经存在一些分子胶降解剂，它们能够诱导蛋白质之间的相互作用，包括促进泛素连接酶与非天然底物的结合。例如，病毒能够劫持宿主的E3连接酶，通过小肽或蛋白质改变泛素连接酶的底物特异性，从而降解宿主的靶标蛋白质，增强病毒的感染性和病毒粒子的产生（图2a和2b）。此外，植物中的生长素（auxins）也能够作为一种分子胶，通过与E3连接酶复合体结合，诱导早期生长素响应蛋白的降解，从而调控植物的生长发育（图2c）。图2 生物分子诱导降解的自然方式示例三、靶向蛋白质降解的早期探索在药物研发领域，TPD的诞生标志着一种革命性治疗策略的出现。这一理念最早在2001年由Sakamoto团队提出，他们设计出首个蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子——Protac-1。这一分子由两部分组成：一端是结合目标蛋白MetAP-2的配体，另一端是招募SCF泛素连接酶的肽段，中间通过连接子相连。尽管Protac-1在细胞裂解液中成功诱导了MetAP-2的降解，但由于肽段稳定性差且难以穿透细胞膜，其应用受到了限制。真正的突破发生在2008年，Crews课题组开发了第一个全小分子PROTAC。他们利用雄激素受体（AR）的配体与MDM2抑制剂通过化学连接子结合，成功在细胞内实现了AR的降解。这一成果证明了小分子PROTAC的可行性，但也暴露了早期PROTAC的局限性，如分子量过大和细胞渗透性差等问题。随后的研究聚焦于优化E3泛素连接酶的配体。2012年，基于HIF-1α羟基脯氨酸结构的VHL配体被开发出来，显著提升了PROTAC的效率和特异性。与此同时，沙利度胺及其衍生物被证实可高效结合CRBN，为PROTAC设计提供了另一类重要工具。这些进展使得PROTAC技术逐渐成熟，并催生了如ARV-110和ARV-471等进入临床试验的候选药物。早期的探索不仅解决了PROTAC的分子设计难题，还为后续的分子胶降解剂和其他新型降解技术奠定了基础。如今，TPD已成为药物研发的热点领域，为癌症、神经退行性疾病等难治性疾病的治疗带来了新的希望。四、意外发现的蛋白质降解剂：从偶然到突破在靶向蛋白质降解（TPD）的发展历程中，许多关键突破并非来自精心设计的实验，而是源于科学探索中的意外发现。其中最著名的例子莫过于沙利度胺（thalidomide）及其衍生物的作用机制解析。这种上世纪50年代作为镇静剂使用的药物，因其严重的致畸性被撤市，却在几十年后意外成为多发性骨髓瘤的革命性疗法。2010年，科学家们发现沙利度胺及其衍生物（如来那度胺、泊马度胺）能够结合E3泛素连接酶CRBN，并诱导转录因子IKZF1和IKZF3的降解。这一发现不仅解释了这类药物的治疗机制，也揭示了其致畸性的根源——它们同时会降解发育关键蛋白SALL4。这种"分子胶"的作用模式，即小分子通过重塑蛋白质相互作用界面来诱导靶蛋白与E3 连接酶的结合，为TPD领域开辟了新方向。另一个意外发现的典型案例是抗癌药物indisulam。这款最初作为细胞周期抑制剂的磺胺类药物，后来被证明能够招募DCAF15连接酶来降解剪接因子RBM39。结构生物学研究显示，indisulam在DCAF15和RBM39之间充当"化学桥梁"，稳定两者间的相互作用。这种机制与经典的分子胶有所不同，展现了小分子诱导蛋白质降解的多样性。最令人惊讶的发现或许要数激酶抑制剂CR8的故事。这个CDK抑制剂被意外发现能够介导细胞周期蛋白K的降解，但机制却与传统认知大相径庭——CR8并不直接连接E3连接酶和靶蛋白，而是通过改变CDK12的构象，使其意外获得与DDB1结合的能力。这种非典型的降解模式再次拓展了人们对分子胶的理解边界。五、新型分子胶降解剂的发现近年来，分子胶降解剂的发现已成为靶向蛋白降解领域的重要研究方向。沙利度胺衍生物和Indisulam等分子胶降解剂最初是通过回顾性研究被偶然发现的，这促使科学家们开始系统性探索新型分子胶，以扩大潜在靶点的覆盖范围。在早期理性设计分子胶的案例中，研究人员通过增强β-catenin与其E3连接酶SCFβ-TrCP的相互作用，开发出小分子NRX-1933（图3a），该化合物能够绕过β-catenin降解所需的磷酸化依赖途径。经过进一步优化得到的NRX-252114显著提高了对特定磷酸化β-catenin的招募和泛素化效率，展现了分子胶技术在靶向致癌蛋白方面的潜力。另一种重要策略是对已知具有分子胶活性的E3连接酶（如CRBN）的配体进行化学修饰。通过对CRBN的戊二酰亚胺配体进行结构改造，研究人员成功开发出靶向IKZF2转录因子的高效降解剂NVP-DKY709和ALV系列化合物。这些经过结构优化的分子胶不仅展现出高度选择性，还能够区分高度相似的蛋白家族成员，其中部分候选药物已进入临床开发阶段。与此同时，沙利度胺衍生物的应用范围也在不断扩展，通过表型筛选发现的GSPT1靶向降解剂，以及优化后的来那度胺衍生物CC-92480，都显示出分子胶技术在靶向非锌指蛋白方面的广阔前景。随着研究的深入，新型筛选技术为分子胶发现提供了强大支持。研究人员开发了多种创新方法，包括利用基因编辑细胞系结合表型筛选、整合大规模小分子与遗传依赖性数据，以及应用DNA编码化合物库等高通量技术。这些技术进步不仅加速了新型分子胶的发现，也为拓展可成药靶点空间提供了新思路。当前，分子胶降解剂的研究正处于快速发展阶段，其在疾病治疗中的应用潜力正在被不断发掘，未来有望为肿瘤等难治性疾病提供更精准的治疗策略。六、靶向降解的变体尽管TPD领域正在追求的大多数机制主要集中在新相互作用的诱导上，但将它们视为单一机制是不正确的。事实上，这个概念存在许多变体，导致不同的生物学和临床效果。内源性小分子诱导的核受体新相互作用：核受体是一类结构相似的转录因子，其活性受配体调控。部分核受体（如视黄酸受体α、糖皮质激素受体和雌激素受体）在配体结合后会通过蛋白酶体途径降解。虽然这些配体并非传统意义上的分子胶，但它们能诱导核受体构象变化，暴露出保守的疏水裂隙，进而被核共激活因子（NCOA）识别并激活下游转录。然而，该疏水裂隙也可作为一种遮蔽型降解信号（degron），被HECT家族E3泛素连接酶UBR5识别，从而与NCOA竞争结合核受体，促使其降解。这一过程中，核受体的降解信号受到双重屏蔽：一方面在非活性状态下受螺旋12的位阻保护，另一方面在配体结合后被NCOA直接占据。选择性雌激素受体降解剂（SERD）是一类通过不同机制靶向降解雌激素受体（ER）的核受体配体，用于治疗HER2阴性、激素受体阳性乳腺癌。氟维司群作为经典SERD，其结构在雌二醇骨架上引入疏水性长链，通过系统性化学修饰优化而成。尽管多种SERD被开发，但直至2023年1月依拉司群才成为第二个获批的SERD。SERD研发成功率较低，部分原因在于其ER拮抗和降解机制复杂。例如，氟维司群的主要抗雌激素效应可能并非直接降解ER，而是显著抑制ER在细胞核内的迁移。研究发现，不同结构的SERD通过不同途径降解ER：丙烯酸侧链类SERD依赖SUMO化修饰和E3连接酶RNF111，而碱性侧链类则通过UBR5介导的类似雌二醇的降解途径。SUMO化修饰可能使ER被RNF111识别并进一步泛素化，但其临床意义仍需深入研究。小分子共价降解剂：近年来，共价配体技术为靶向蛋白降解（TPD）领域提供了新的策略。这类分子能够通过共价或可逆共价反应直接修饰泛素-蛋白酶体系统（UPS）的组分，从而改变蛋白相互作用网络，或作为PROTAC的招募手柄。例如，天然产物宁宾内酯（nimbolide）被发现通过共价修饰E3连接酶RNF114的C8半胱氨酸残基，干扰其底物识别能力。基于这一机制，研究人员将宁宾内酯改造为PROTAC的E3配体，成功靶向降解转录调控因子BRD4。共价片段筛选（FBLD）技术进一步推动了共价降解剂的开发。通过筛选具有广泛半胱氨酸反应活性的共价片段，研究人员发现了与E3连接酶（如DCAF16）结合的活性位点，并将其与可逆抑制剂（如靶向BRD4或FKBP12的分子）偶联，构建出新型PROTAC。共价修饰E3连接酶相比传统可逆PROTAC可能具有更持久的活性，因其配体驻留时间与E3的自然周转时间相耦合。目前，针对DCAF1、DCAF11、RNF116等E3连接酶的共价降解剂已被陆续报道。此外，在筛选靶向BRD4的分子胶时，研究人员意外发现一类基于JQ1（BET溴结构域抑制剂）的共价分子能够招募CUL4DCAF16至BRD4的第二溴结构域（BRD4BD2），形成“模板辅助共价修饰”复合物。冷冻电镜结构解析表明，DCAF16的第58位半胱氨酸是共价修饰的关键位点。另一项研究则报道了双功能分子IBG1，它能同时结合BRD4的两个溴结构域，诱导构象变化并形成DCAF16的新底物界面（图3b）。值得注意的是，这些分子最初在基于DCAF15配体的PROTAC筛选中被发现，后通过CRISPR筛选证实其依赖DCAF16发挥作用。这些研究不仅揭示了共价降解剂在靶向“不可成药”蛋白方面的潜力，也强调了蛋白-蛋白相互作用的复杂性。未来需进一步优化共价修饰策略，并谨慎验证降解机制，以推动其向临床转化。通过小分子诱导聚合降解：近年来，研究发现某些小分子可通过诱导靶蛋白聚合，进而引发泛素化-蛋白酶体降解。例如，小分子化合物BI-3802能诱导B细胞淋巴瘤蛋白6（BCL6）形成聚合物而非简单聚集。通过荧光标记和电镜观察，研究人员发现BI-3802处理后，BCL6首先形成荧光焦点并逐渐消失，进一步结构解析揭示该分子在BCL6的BTB结构域间形成对称的新相互作用界面，促使同源二聚体自聚合（图3b）。这种聚合状态增强了E3连接酶SIAH1/2的招募，最终导致BCL6被降解。类似的机制也见于急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗。APL由PML-RARA融合基因驱动，而三氧化二砷（ATO）和全反式维甲酸（ATRA）通过不同途径降解该致癌蛋白：ATO诱导PML和PML-RARA寡聚化，促进其与泛素结合酶UBC9相互作用并降解；ATRA则通过激活RARA的核受体功能（如前述激素受体降解机制），使其暴露降解信号而被蛋白酶体清除。这些发现不仅揭示了蛋白聚合作为降解触发信号的新范式，也为开发针对难治性疾病的降解疗法提供了新思路。直接招募靶蛋白至蛋白酶体的降解新策略：传统上，靶向蛋白降解（TPD）依赖于泛素化标记，但最新研究探索了绕过泛素化、直接利用蛋白酶体降解的途径。一项突破性研究采用mRNA展示技术，筛选出能与蛋白酶体亚基PSMD2高亲和力结合的大环肽MC1（纳摩尔级结合力）。冷冻电镜结构解析显示，MC1结合在PSMD2的C端结构域与螺旋结构之间的独特区域，靠近26S蛋白酶体的底物通道入口。研究人员将MC1与高亲和力的BRD4配体（BET抑制剂）偶联，成功将BRD4直接招募至蛋白酶体，并实现其降解。这一策略突破了传统PROTAC依赖E3连接酶泛素化的限制，为靶向降解提供了全新思路，尤其适用于难以泛素化的靶点。未来，该技术可能拓展至更多疾病相关蛋白，推动蛋白降解疗法的创新。七、拓展E3连接酶在靶向蛋白降解中的应用目前，PROTAC技术主要依赖CRBN和VHL这两种E3连接酶，而能直接结合E3连接酶的小分子配体仍较为稀缺，限制了PROTAC对新连接酶的探索（图3c）。尽管CRBN和VHL在降解效率和速度上表现优异，但利用其他E3连接酶可能带来独特优势，例如：（一）组织特异性降解：通过选择仅在神经或造血系统表达的E3连接酶，可增强PROTAC的组织靶向性，减少脱靶效应。（二）亚细胞定位调控：核内或染色质结合的E3连接酶可用于精准降解转录因子等难成药靶点。近期研究已开始系统鉴定组织特异性E3连接酶及其配体，为拓展PROTAC应用奠定基础。然而，当前挑战在于如何高效发现特异性结合新E3连接酶的小分子。开发能系统性筛选“配体-连接酶”对的平台，将成为推动PROTAC临床转化的关键。图3 不同的分子机制导致底物募集以进行靶向蛋白质降解八、靶向蛋白降解的选择性与特异性小分子蛋白降解剂（如PROTAC和分子胶）的选择性受多种因素影响，包括：（一）E3连接酶与靶蛋白的结合特性：不同E3连接酶（如CRBN或VHL）会影响降解的靶标范围，且PROTAC与靶蛋白的结合亲和力并不完全决定降解效率。（二）三元复合物的形成与泛素化效率：有效的靶蛋白泛素化是降解选择性的关键。（三）组织特异性表达：靶蛋白和E3连接酶的组织分布可影响降解效果，例如VHL在血小板中低表达可减少BCL-XL靶向PROTAC的毒性。（四）亚型选择性设计：针对高度相似靶点（如CDK4/CDK6、BRG/BRM）开发亚型特异性PROTAC可进一步提高选择性。尽管分子胶和PROTAC通常被认为具有高度特异性，但研究发现基于CRBN的降解剂可能脱靶降解IKZF1或SALL4等蛋白，强调需通过靶向和无偏筛选全面评估脱靶效应。此外，降解选择性还受时间、动力学和底物竞争的影响，需在临床前研究中系统优化。九、临床观点尽管靶向蛋白质降解（TPD）领域已涌现出多种创新机制，但目前获得FDA批准的药物仍屈指可数。临床研发管线中的分子却展现出丰富多样性，如表1所示，尤其是针对IKZF1/3等靶点的分子胶降解剂（如CC-92480、CFT-7455等）已进入I/II期试验，其应用从血液肿瘤逐步拓展至实体瘤。PROTACs凭借模块化设计优势，在靶点覆盖上更为广泛，针对雄激素受体（ARV-110）、雌激素受体（ARV-471）及BTK（NX-2127）等靶点的候选药物正针对血液瘤、实体瘤和自身免疫疾病开展临床试验。沙利度胺类似物的成功案例为TPD提供了重要验证，但其胚胎毒性风险也警示着该技术的潜在挑战。分子胶虽具有优异的药代动力学特性，但发现过程仍依赖偶然性；而PROTACs虽设计灵活，却面临分子量大、组织靶向性不足等问题。耐药性机制（如CRBN突变、外排泵MDR1上调）和脱靶效应（如沙利度胺衍生物意外降解SALL4）成为临床转化的重要障碍。值得注意的是，常规动物模型对某些降解靶点不敏感，这增加了毒性评估的复杂性。TPD的独特优势在于"事件驱动"的药理学特性，但其治疗潜力仍受限于：某些疾病需要同时抑制通路活性；组织特异性递送效率不足；以及降解后可能触发的代偿机制。新兴应用领域如神经退行性疾病（靶向Tau蛋白）和感染性疾病（抗病毒BacPROTACs）正在拓展TPD的疆界，但需要开发更精准的降解策略。未来突破将依赖于E3连接酶工具箱的扩充、组织特异性递送技术的创新，以及对降解生物学更深入的理解。这一领域正站在从概念验证向全面临床获益转化的关键节点。表1 Clinical trials utilizing degrader molecules十、靶向蛋白质降解的未来展望靶向蛋白质降解（TPD）领域已展现出令人振奋的多样性，从传统的PROTACs和分子胶降解剂，到新兴的抗体靶向嵌合体（AbTACs）、自噬靶向嵌合体（AUTACs）和溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）等技术不断涌现。尽管这些创新方法前景广阔，但近期进入临床开发的主流仍将是PROTACs和分子胶降解剂。分子胶降解剂因其分子量小、生物利用度高和效力强而独具优势，但其发现仍主要依赖偶然性，且结构-活性关系极为敏感，单个原子的改变就可能完全改变底物特异性。相比之下，PROTACs的模块化设计使其能够更系统地开发，但大分子量带来的药代动力学挑战仍需长期优化。值得注意的是，PROTACs的靶点多为已被传统方法靶向的蛋白，因此需要更强的临床优势证据。该领域的快速发展正在催生更广泛的邻近诱导药理学概念，包括调控转录/表观遗传的TCIPs、诱导蛋白磷酸化的PhosTACs、去泛素化的DUBTACs等。这些技术将小分子诱导邻近的应用从单纯的蛋白质降解扩展到更广泛的蛋白功能调控。未来，随着对天然降解机制的深入挖掘和人工智能等技术的应用，TPD有望突破现有"不可成药"靶点的限制，为癌症、神经退行性疾病等难治性疾病带来变革性疗法。正如来那度胺等已获批药物所展示的，即使偶然发现的降解剂也能为患者带来显著获益，这为TPD的未来发展提供了最有力的证明。全文链接：https://doi.org/10.1038/s41580-024-00729-9

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Sophia 导读： 由于缺乏有效的治疗靶点，三阴性乳腺癌 （TNBC） 是最致命的乳腺癌亚型。 2024年4月3日，复旦大学李大强，邵志敏及 Fang-lin Zhang共同通讯在《Science Advances》上发表题为“SF3A2 promotes progression and cisplatin resistance in triple-negative breast cancer via alteRNAtive splicing of MKRN1”的研究论文， 研究揭示了SF3A2在TNBC进展和顺铂耐药中以前未知的作用，突出了SF3A2作为TNBC患者的潜在治疗靶点。 https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj4009 研究背景 01 乳腺癌（BC）是一种高度异质性的疾病，临床上根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达状态进行分类，以指导治疗决策，从而大大改善BC患者的预后。然而，大约 15% 至 20% 的 BC（称为三阴性乳腺癌 （TNBC））缺乏这些受体的表达，因此不能从内分泌和抗 HER2 治疗中获益，这进一步解释了与其他 BC 亚型相比， TNBC 的侵袭性更强、复发风险更高、预后更差。化疗仍然是TNBC患者全身治疗的主要手段。顺铂是一种DNA损伤剂，是目前最有效的化疗药物之一，广泛用于单独使用或与其他药物联合用于治疗TNBC。然而，相当一部分患者出现化疗耐药性，最终导致治疗失败，这是药物治疗的主要障碍。因此， 确定针对TNBC进展和化疗耐药性的新治疗靶点是当务之急。 研究进展 02 为了确定促进TNBC进展的潜在靶标，我们使用复旦大学上海肿瘤中心（FUSCC）-TNBC定量蛋白质组和RNA测序（RNA-seq）数据集分析了136个剪接因子的表达水平。根据log2FC（倍数变化）>1的筛选标准，与相邻正常组织相比，TNBC标本中有84个剪接因子在蛋白质水平失调，而64个剪接因子在mRNA水平失调（图1A）。其中，48个剪接因子在蛋白质和mRNA水平上均失调（图1，B和C，前30名）。 我们选择SF3A2进行进一步研究，因为它在我们的筛选列表中排名靠前，而且在TNBC中的作用不明确。 SF3A2 在 TNBC 肿瘤中经常过表达，其高表达表明 TNBC 患者预后不良。 在 FUSCC-TNBC 队列中， 与正常乳腺组织相比，TNBC 组织中 SF3A2 的表达水平明显升高（图 1、D 和 E）。 为了进一步验证这些结果，我们随后通过免疫印迹测定法检测了 20 对 TNBC 和正常组织中 SF3A2 的蛋白质水平。正如预期的那样，SF3A2在TNBC组织中的表达水平明显高于正常组织（图1，F和G）。此外，我们还分析了公开的CPTAC（临床蛋白质组学肿瘤分析联盟）和TCGA（癌症基因组图谱）数据集中SF3A2的表达水平。 与 FUSCC-TNBC 队列的结果一致，与正常组织相比，SF3A2 在 BC 组织中明显过表达，在 TNBC 中的表达水平高于其他 BC 亚型。 此外，Kaplan-Meier 分析表明，SF3A2 水平较高的患者在乳腺癌中的总生存期和无远处转移生存期较短。然而，值得注意的是，与所有乳腺癌患者相比，SF3A2 上调预测了 TNBC 患者的疾病预后更差（图 1H）。总的来说， 这些结果表明 SF3A2 在 TNBC 样本中异常上调，其较高的表达预示着 TNBC 患者的预后较差。 研究结果 03 在这项研究中，我们将 SF3A2 确定为 TNBC 中的一种癌蛋白，可作为 TNBC 患者的潜在治疗靶点。 从机制上讲，UBR5 调节 SF3A2 的泛素化和降解。反过来，SF3A2正向调节UBR5的蛋白水平，从而形成调节这两种癌蛋白在TNBC中的表达水平的反馈回路。SF3A2 至少部分通过促进 MKRN1 剪接开关来促进 TNBC 进展。此外，SF3A2 耗竭通过 MKRN1-FADD 通路诱导外源性细胞凋亡，并通过 DNA 损伤触发内源性细胞凋亡，从而增强细胞对顺铂治疗的敏感性（图 7L）。 总之，本研究描述了 SF3A2 在 TNBC 进展和顺铂耐药中以前未被识别的作用，表明SF3A2可能是TNBC的潜在治疗靶点。 参考资料： https://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(24)00090-4#%20 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过 免疫检查点阻断（ICB）疗法在多种肿瘤中都取得了巨大成功。然而，仍有许多患者对ICB没有响应，不同肿瘤中的免疫逃逸机制也需要进一步探索。 近日，由布罗德研究所（Broad Institute）的Robert T. Manguso和Kathleen B. Yates带领的研究团队，在著名期刊Nature Immunology发表重要研究成果[1]。 为了发现肿瘤逃避免疫治疗的机制，他们在接受ICB治疗的癌症模型中，开展了基因组层面的CRISPR筛选。 他们的发现让他们大吃一惊：在多种肿瘤模型中，肿瘤细胞对干扰素（IFN）感应性的丧失，竟然使得肿瘤对ICB的响应更加敏感。 具体来说，肿瘤的IFN信号通过两种方式发挥免疫抑制的作用：第一，肿瘤IFN感应能够上调经典的第一类主要组织相容性复合体（MHC-I）抑制自然杀伤（NK）细胞；第二，肿瘤IFN感应通过上调非经典的MHC-I类分子Qa-1b抑制CD8+T细胞。 要知道，大量的研究表明IFN-γ在肿瘤的免疫监视中发挥重要作用[2-4]。这一发现可以说颠覆了我们对IFN-γ信号的认知。 论文首页截图 接下来我们就一起来看看这个研究是如何开展的。 研究团队利用代表了5种癌症类型（黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、肾癌和结肠癌）的8个小鼠肿瘤模型，进行CRISPR体内筛选，找出ICB治疗后富集或清除的sgRNA，以鉴定与ICB抵抗性或敏感性相关的基因（指该基因缺失时分别与ICB抵抗性或敏感性相关）。 他们发现Nlrc5、Pten、Casp8、Ccar1、Ubr5、Dot1lh、Smg9和Pdcd10的缺失与ICB抵抗性相关，并对Ccar1缺失这一新发现的ICB抵抗机制进行体内实验验证。 在ICB敏感性方面，除了已报道的Ptpn2、Traf2、Ripk1、Serpinb9、Cd47、Atg7外，研究团队还发现了Calr、Rnf31、Vps45、Ilf2、Pnpo、Kcmf1、Fitm2、Morc2a和Thop1的缺失与ICB敏感性相关，并进一步对Calr、Med16和Rnf31缺失介导的ICB敏感机制进行体内实验验证。 CRISPR筛选发现的与ICB抵抗性或敏感性相关的基因 研究团队进一步对清除的sgRNA进行了通路富集分析，令人意外的是，MHC-I类抗原呈递信号通路相关的基因在除Lewis肺癌细胞（LLC）外的所有模型中都被清除，细胞因子响应、II型IFN和先天免疫相关的基因也在多个模型中被清除。这提示这些基因的缺失可以使得肿瘤细胞对ICB更加敏感。 我们都知道，IFN-γ可以上调MHC-I类分子的表达，从而促进细胞毒性CD8+T细胞（CTL）识别肿瘤细胞[4]。还有很多研究表明，IFN感应性的丧失与ICB的抗性相关[2,3,5,6]。在类似的小鼠肿瘤模型中进行体外CRISPR筛选，发现肿瘤细胞IFN和抗原呈递通路的丧失会引起肿瘤细胞对CTL杀伤的抵抗[7]。而本研究发现抗原呈递和IFN通路相关基因的清除竟然与ICB的敏感性相关，这似乎与上述研究结果相矛盾。 为了搞清楚矛盾背后的原因，Manguso团队进一步对比了他们的体内CRISPR筛选结果和前人的体外CRISPR筛选结果，结果发现了一些与IFN（如Jak1、Ifngr1、Ifngr2）和抗原呈递（如Tap1、Tap2、B2m）相关的基因，在体外和体内CRISPR模型中分别发生了富集和清除。 这一发现提示，在体外研究中，这些基因的缺失可能促进了肿瘤细胞对T细胞杀伤的抵抗；而在体内研究中，这些基因的缺失让肿瘤细胞对T细胞更敏感。 体外模型与体内模型中CRISPR筛选得到的sgRNA对比 为了进一步探究IFN诱导肿瘤细胞对ICB抵抗的机制，Manguso团队对比了ICB治疗后的清除的sgRNA与IFN-γ刺激后改变的IFN刺激基因（ISG）。结果显示，抗原呈递相关基因（H2-T23、B2m、Tap1、Tap2、Tapbp和Erap1）在ISG中富集，这些基因同样在ICB治疗后清除的sgRNA中富集，这提示这些基因能够被IFN-γ刺激诱导上调，并与ICB治疗的抵抗性相关。 体外实验也说明，在IFN-γ或IFN-β刺激后，经典MHC-I类分子H-2K、H-2D，非经典MHC-I类分子Qa-1b以及PD-L1的表达会发生上调。这些结果提示IFN诱导的ICB抵抗机制可能是由MHC-I类分子的上调所介导的。 IFN-γ刺激能够诱导多种发挥ICB抵抗性的基因上调 为了验证这一假设，研究团队设计了一种体内竞争性实验，以检测IFN-γ感应基因和MHC-I类抗原呈递途径相关基因的遗传上位性。 他们将对照sgRNA和靶向Ifngr1或Jak1（IFN-γ感应基因）的sgRNA转染的KPC细胞（这些细胞分别是对照sgRNA背景、Tap1敲除背景和B2m敲除背景，Tap1和B2m为MHC-I类抗原呈递途径相关基因）1：1混合，然后将这些细胞分别在NSG鼠，WT鼠和接受ICB治疗的WT鼠体内成瘤，对比不同组中转染对应sgRNA的细胞的富集与清除。 结果显示，在对照sgRNA背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞被清除；而在Tap1和B2m敲除背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞没有发生显著清除。这提示相比于对照细胞，IFN感应性缺陷的细胞具有依赖于MHC-I类的竞争劣势，即IFN感应性通路发挥功能依赖于MHC-I类分子的表达。 IFN-γ感应基因发挥功能依赖于MHC-I类抗原呈递途径相关基因 在人类基因组中，6p21.3基因座编码MHC-I类分子表达相关的基因，如TAP1、TAP2、TAPBP、PSMB8和PSMB9等[8-10]。TCGA中多种癌种都有超过10%的肿瘤发生了6p21.3缺失，然而6p21.3缺失与绝大多数肿瘤患者的生存无关。 在接受抗PD-1治疗的肾透明细胞癌患者队列中，当肿瘤为6p21.3两倍性时，高ISG特征与患者更差的生存相关。然而在6p21.3缺失的肿瘤中，高ISG特征不再与患者更差的生存相关。这提示肾透明细胞癌中，IFN介导的ICB抵抗作用依赖MHC-I类分子。 肾透明细胞癌中高ISG特征仅在6p21.3两倍性肿瘤中与患者差的预后相关 研究团队为进一步鉴定体内杀伤IFN感应性缺陷肿瘤的免疫细胞，分别在ICB治疗时使用抗体清除CD8+T细胞、NK细胞和CD4+T细胞，结果显示NK细胞和CD4+T细胞的清除影响了对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤，而清除CD8+T细胞对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤没有影响。由于NK细胞不表达PD-1，而CD4+T细胞表达PD-1，研究团队推测ICB治疗后，CD4+T细胞辅助NK细胞发挥肿瘤细胞杀伤作用。 为进一步在体外验证NK细胞对IFN感应性缺陷肿瘤的杀伤能力，他们将Jak1缺陷和对照肿瘤细胞，分别与IL-12/18激活的NK细胞共培养，结果显示活化的NK细胞能够杀伤Jak1缺陷肿瘤细胞，而肿瘤细胞中Tap1或H2-K1的缺失可以逆转这一效应。这提示肿瘤IFN感应性可以通过上调经典的MHC-I类分子，在体内和体外抑制NK细胞的毒性。 Manguso团队进一步探究了哪些MHC-I类抗原呈递途径的基因发挥功能依赖于NK细胞，他们对比了NK细胞清除与不清除时，ICB治疗清除的sgRNA。结果显示，尽管Ifngr1、Ifngr2、Stat1、Jak1、Jak2和H2-K1的清除表现出NK细胞依赖性，靶向Tap1、Tap2、H2-D1和H2-T23这几个抗原呈递基因的sgRNA在NK细胞存在与不存在时都会发生清除。这说明部分MHC-I类抗原呈递分子的缺失，所引起的肿瘤细胞杀伤是非NK细胞依赖性的。 在上述基因中，H2-T23引起了Manguso团队的关注。因为H2-T23编码非经典MHC-I类分子Qa-1b（相当于人类中的人类白细胞抗原HLA-E），而Qa-1b能够结合抑制性受体NKG2A/CD94。这些结果提示尽管NK细胞介导了对IFN感应性丧失的细胞的杀伤，但是某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制其他的效应性细胞群。 某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制除NK细胞外的效应性细胞 为了探究Qa-1b表达抑制了哪些效应性细胞群，研究团队首先检测了Qa-1b的缺失是否会增强ICB响应。结果显示，Qa-1b的缺失会增强ICB响应，而Qa-1b的过表达能抑制ICB响应。 当在接受ICB治疗的小鼠胰腺导管腺癌（KPC）肿瘤模型中敲除HT-T23后，分别清除NK细胞和CD8+T细胞，结果显示NK细胞清除对于Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应没有影响，而CD8+T细胞清除抑制了Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应。这提示Qa-1b主要通过抑制CD8+T细胞发挥作用。 单细胞测序数据也提示，ICB治疗后引起效应、耗竭和增殖的CD8+T细胞亚群扩增。而效应、耗竭和增殖CD8+T细胞亚群高表达NKG2A（Klrc1）和CD94（Klrd1），这提示肿瘤细胞的Qa-1b表达可能通过与CD8+T细胞的NKG2A/CD94抑制性受体结合发挥作用。 ICB治疗时CD8+T细胞发挥杀伤Qa-1b缺陷肿瘤作用 由于IFN能够诱导Qa-1b的表达，Manguso团队假设肿瘤的IFN感应性可以通过Qa-1b抑制CD8+T细胞。然而由于肿瘤IFN感应性丧失可能引起经典的MHC-I类分子下调，导致对CD8+T细胞的抗性，从而掩盖IFN可能介导的抑制作用。为解决这个问题，利用嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行杀伤试验，由于CAR-T细胞的识别不依赖于MHC-I类分子，可以避免IFN-γ处理后MHC-I类分子上调带来的影响。 他们首先检测了CD19 CAR-T细胞对Qa-1b缺陷型CD19+KPC细胞的杀伤能力，结果显示CD19 CAR-T显著杀伤Qa-1b缺陷型肿瘤细胞，提示Qa-1b能够抑制CAR-T的杀伤能力。 为探讨Qa-1b上调是否是由IFN介导的CAR-T细胞杀伤抵抗机制，Manguso团队将CD19 CAR-T细胞分别与IFNγ刺激的对照和Jak1（IFN-γ感应基因）敲除CD19+KPC细胞的混合物1:1共培养。结果显示，CAR-T细胞对于这2类细胞的杀伤能力没有显著差异，这表示CAR-T细胞消除了Jak1敲除肿瘤细胞的生存优势。 为了探究IFN诱导的PD-L1上调是否抑制CAR-T的杀伤能力，他们检测了CAR-T联合抗PD-1单抗时两组细胞的存活情况。结果显示当CAR-T联合抗PD-1单抗时，Jak1敲除肿瘤细胞存活增多，这提示PD-L1上调对T细胞杀伤能力发挥抑制作用，联用抗PD-1单抗能够杀伤更多对照组肿瘤。 当Manguso团队使用Qa-1b缺陷型KPC细胞或联用抗NKG2A抗体时，结果显示Jak1敲除肿瘤细胞存活显著增多。这些结果提示CD8+T细胞优先杀死具有完整IFN感应能力的肿瘤细胞，而Qa-1b的上调抑制这种杀伤能力。至于背后的机制，Manguso团队认为这可能是因为IFN能够诱导粘附分子（如ICAM-1）的表达[11]，进而促进CD8+T细胞的杀伤。 在体内实验模型中，Manguso团队发现CAR-T对Jak1缺陷型肿瘤杀伤作用明显，而这种杀伤能力在Qa-1b缺陷的肿瘤中消失。这些结果提示IFN信号可以通过上调Qa-1b来抑制CAR-T细胞毒性。 IFN信号通过上调 Qa-1b来抑制 CAR-T 细胞毒性 最后，Manguso团队探讨了IFN信号对于免疫治疗响应预测的能力。 他们分析了一组接受抗PD-1单抗治疗的黑色素瘤患者队列（6p21.3两倍性），发现ISG的表达与更好的响应相关，这一结果与前述的ccRCC患者队列中的结果相反。 这提示利用IFN特征预测ICB响应需要考虑CD8+T细胞和NK细胞的响应优势，在NK细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗差的响应相关；而在CD8+T细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗好的响应相关。 高IFN特征在不同肿瘤微环境中与不同的ICB响应相关 Manguso团队还评估了1个接受ICB治疗的202名黑色素瘤患者的队列，分别在基线、治疗后6周和治疗后6个月时间点取样，检测血清中ISG蛋白的水平。 结果显示，在治疗后6周时，响应和无响应患者血清ISG蛋白含量都会增加。而治疗后6个月时，无响应患者血清ISG蛋白含量显著增加。并且，在这2个时间点，血清ISG的变化都与患者更差的无进展生存相关。因此，接受ICB治疗过程中，对于ICB的抵抗可能与IFN和ISG的水平升高有关。 ICB治疗后血清ISG蛋白水平升高与治疗抵抗有关 总的来说，这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过NKG2A/CD94抑制CD8+T细胞。 既往研究往往关注IFN感应性的丧失会引起对ICB的抵抗，这项研究提示了IFN感应性功能的复杂性，IFN介导的MHC-I类分子上调可以发挥促进对CD8+T细胞抗原呈递和抑制NK细胞的双重作用。在高表达NK配体（MICA和MICB）的肿瘤中，由于IFN驱动的MHC-I类分子上调可以抑制NK细胞，高ISG特征与差的响应相关。而在T细胞高度克隆扩增的肿瘤中，由于IFN能够促进对T细胞的抗原呈递，高ISG特征与好的响应相关。因此，ISG特征在肿瘤中的作用可能取决于肿瘤中的免疫效应主要由NK细胞还是CD8+T细胞介导。 除此之外，这项研究中发现非经典MHC-I类分子Qa-1b（HLA-E）可以发挥免疫抑制作用，非经典MHC-I类分子如HLA-F、HLA-G可能发挥的免疫抑制作用也值得进一步探索。