XRCC5

前言在过去的几十年中，对DNA损伤反应（DDR）途径的理解不断加深，拓宽了肿瘤学的治疗领域。越来越清楚的是，DNA损伤反应缺陷导致的细胞基因组不稳定性导致了癌症的发生。另一方面，这些缺陷也可以作为一个治疗机会。越来越多的DDR靶向药物已迅速扩展到参与DDR途径的多个成员的抑制剂，包括PARP、ATM、ATR、CHK1、WEE1和DNA-PK。目前，这些DDR成分的抑制剂，其中一些正处于临床研究中。此外，新的证据表明DDR抑制剂对传统癌症治疗的敏感性，以及DDR途径和免疫检查点抑制剂（ICI）反应之间的相关性，这些都促进基于DDR抑制剂的联合治疗。靶向DNA修复途径的药物正在肿瘤治疗领域显示出越来越大的作用。DNA损伤与DNA损伤反应为了保持基因组的完整性，复杂的DNA修复系统被用来对抗各种形式的DNA损伤，这些机制被称为DNA损伤反应。DDR通路分为三个功能上相互交织的部分：检测DNA损伤的传感器、触发信号级联的信号转换器和阻碍DNA修复的效应器。这些途径不是相互排斥的过程，而是相互协调，形成DNA修复的精确调控网络。             碱基切除修复（BER）和核苷酸切除修复（NER）所有生物体的基因组都在不断地经历微妙的变化，这是由于内源性产生的各种基因毒物，如活性氧（ROS）、电离辐射以及烷基化剂等环境损伤所致。DNA中的大多数细微变化，如单链断裂（SSB），都是通过BER途径修复的。BER首先由受损的碱基启动，然后切除碱基并用新合成的DNA替换。然后，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE）切割AP位点，在损伤位点形成3′OH末端。最后，DNA聚合酶和DNA连接酶在去除损伤碱基产生的核苷酸缺口处被招募，从而封闭缺口。BER负责修复小损伤，而使DNA螺旋结构变形的较大的双链断裂（DSB）则需要NER途径修复。NER机制涉及一种关键蛋白质，即切除修复交叉互补蛋白1（ERCC1），它会清除断裂点附近的DNA，然后用正常的DNA复制进行替换。同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）在哺乳动物细胞中，HR和NHEJ是修复DSB的两条主要途径。由于同源姐妹染色单体是新DNA合成所需的模板，HR途径可以在S/G2细胞周期阶段修复DSB，而NHEJ在除M期外的所有细胞周期阶段都是活跃的。HR分析来自基因组其他部分的同源序列，收集断裂位点丢失的信息。HR首先切除断裂端，随后通过Brca2和Rad51形成Rad51核蛋白丝，开始检索同源序列，并促进断裂DNA和同源模板之间形成连接分子，完成修复。NHEJ比HR更简单一些，直接将断裂端重新连接在一起。NHEJ所需的基本因子是由Ku70/Ku80和DNA依赖性蛋白激酶的催化亚单位（DNA-PKcs）组成的异二聚体，其识别DSB并促进NHEJ的下游信号因子，如XRCC4、XLF和DNA连接酶IV。虽然NHEJ机制较为简单，但有时会导致重排，而HR被认为不会产生错误。除HR和NHEJ外，一种DSB修复途径与这两个主要DSB修复途径具有相似的机制，但在遗传上不同，称为替代末端连接（a-EJ）途径。a-EJ途径既可以与HR共享类似的起始过程，也可以与NHEJ一样组成无同源模板的DNA末端连接因子。目前，越来越多的研究开始关注a-EJ通路作为NHEJ或HR活性受损癌细胞的潜在治疗靶点。错配修复（MMR）除了暴露于基因毒素的细胞所产生的损伤外，DNA损伤也可能来自异常的DNA处理。针对复制相关错误的DNA修复途径称为MMR。在DNA合成过程中，MMR纠正核苷酸错误整合，从而防止分裂细胞中永久性的DNA改变。因此，基因突变或表观遗传沉默导致的MMR缺陷可能导致自发突变的发生率增加，这通常与遗传性和散发性癌症有关。跨损伤合成与模板置换DNA损伤耐受性（DDT）作为修复复制停滞DNA损伤的一种基本旁路机制，允许DNA复制穿过阻碍元件。跨损伤合成（TLS）是两种不同的DDT模式之一，取决于一种特殊的TLS聚合酶的功能，而不是复制性DNA聚合酶，其可以直接跨过损伤部位复制。由于TLS聚合酶的校对活性不足，TLS机制是容易出错的，这增加了突变的风险。毫不奇怪，TLS是细胞突变的主要来源。相反，DDT的另一种模式，即模板置换（TS），涉及在姐妹染色单体上重组到同源DNA模板，这类似于HR过程，被认为比TLS更准确。TLS和TS的修复活动开始于复制叉之后，这表明它们可能发生在DNA复制期间或之后，TS开始于S期早期，TLS开始于S期晚期。范可尼贫血（FA）途径范可尼贫血是一种罕见的遗传病，由范可尼基因的双等位基因突变引起，受影响的患者伴有对DNA损伤的反应不足。范科尼贫血已被确定为一种DNA修复途径，可清除阻碍DNA复制和转录的屏障，即DNA链间交联（ICL）。ICL可由醛类在多种代谢反应（如脂质过氧化和乙醇代谢）和化疗（如铂）期间形成。而链内交联通过NER途径修复，而ICL主要通过FA途径修复。通过UHRF1蛋白和FANCM–MHF1–MHF2复合物检测ICL后，FA核心复合物被招募到染色质中，并单泛素化底物FANCI和FANCD2。泛素化FANCD2-I为各种DNA内切酶招募支架蛋白，从而完成对交联处DNA的识别和核苷酸的切除，从而得到适合重组修复的DNA底物。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶途径众所周知，DNA甲基化剂能够抑制DNA甲基化并产生广泛的DNA加合物，如O6-甲基鸟嘌呤（O6MeG）和O4-甲基胸腺嘧啶，这可能导致碱基错配和随后的点突变。其中，O6MeG被认为是甲基化剂诱导的DNA加合物的主要来源，可导致突变和致癌。O6MeG可以通过O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（也称为MGMT）在单步自杀反应中修复。MGMT将受损鸟嘌呤O6位点的甲基转移到半胱氨酸残基，从而防止基因突变。可以想象，MGMT降低了烷化剂在癌细胞中的作用，可能导致化疗耐药。MGMT启动子的甲基化会阻碍其转录，因此可以用来提高细胞对烷化剂的敏感性。DDR治疗应用的机制与正常细胞相比，肿瘤细胞对DNA损伤敏感性增加的潜在机制在于三个主要方面：至少一条DDR途径的缺陷、复制应激的升高和内源性DNA损伤的增加。DDR缺陷尽管DDR缺陷与癌症的发生和发展有关，但DDR途径中的缺陷也为靶向肿瘤细胞提供了治疗机会。携带DDR缺陷的肿瘤细胞导致基因组不稳定性增强，并依赖剩余的DDR途径生存。作为一种治疗方法，剩余DNA修复途径的组合靶向产生了一种被称为“合成致死”的概念。合成致死的概念基于两个同时发生的功能丧失遗传事件，其中任何一个单独都不会导致损伤，而是共同作用导致细胞死亡。当癌细胞特有的DDR途径发生一种基因改变时，由DDR抑制剂引起的第二种功能丧失事件将在不影响正常细胞的情况下对癌细胞合成致死。复制应激真核细胞复杂的DNA复制系统在细胞分裂过程中受到细胞周期中各种蛋白质的严格调控。许多DNA核苷酸需要精确聚合以确保细胞内稳态。阻碍或终止复制叉进展的内源性或外源性障碍激活保守的细胞反应途径，称为复制应激。复制应激的分子机制是DNA聚合酶的进展停滞和随后DNA聚合与DNA解旋酶的解偶联。诱导复制应激的一个例子是G1/S细胞周期检查点缺陷，其原因可能是pRb功能丧失、CDKN2A缺失或细胞周期蛋白D1或细胞周期蛋白E扩增。 内源性DNA损伤一些内源性性DNA损伤是中性pH条件下低浓度氢离子和氢氧根离子的作用造成的，如脱嘌呤和脱嘧啶作用。细胞内环境对于染色体DNA来说，还具有其他危险，其中最严重的来自氧化过程，在线粒体产生的一些中间产物，如ROS，可能会从线粒体渗出，进入细胞质。这样的中间产物包括超氧离子、过氧化氢和羟自由基。在肿瘤代谢中，低PH值、缺氧和高水平的ROS在肿瘤微环境（TME）中普遍存在。靶向DNA修复途径的抑制剂目前利用DDR缺陷的抗癌策略在很大程度上是通过开发抑制DNA修复过程中分子的靶向药物来解决的。聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂PARP抑制剂的发展是合成致死的典型代表。PARP1和PARP2是关键的DDR酶，通过带负电荷的聚ADP-核糖（PAR）链修饰靶蛋白，感知DNA损伤并传递信号。PARP1与受损DNA结合后的结构变化激活其催化功能，促进DNA修复效应分子的招募和DNA损伤部位周围染色质的结构重塑，而染色质的动态重塑将在很大程度上影响DNA修复的效率。                        鉴于PARP在促进DNA有效修复中的关键作用，PARP抑制剂可以选择性地杀死同源重组缺陷的肿瘤细胞。PARP抑制剂是BRCA突变肿瘤的一种很有前途的治疗策略。聚ADP-核糖水解酶（PARG）抑制剂PARG通过在DNA损伤后水解PAR核糖键来逆转PARP酶的作用。同样，PARG在DNA复制和修复中的积极作用导致PARG缺陷细胞对DNA损伤剂的敏感性增加。尽管大量研究表明PARP抑制剂与合成致死率之间存在相关性，但对PARG抑制剂治疗机制的研究却相对滞后。据报道，乳腺癌细胞中HR蛋白（如BRCA1/2）的缺失可刺激PARG抑制细胞的合成致死性，PARG抑制剂COH34可诱导BRCA突变或对奥拉帕利耐药的卵巢癌和乳腺癌细胞死亡。然而，在其他癌细胞中报告了相互矛盾的结果。在六个测试的乳腺癌细胞系中，只有一个BRCA缺陷的细胞系对PARG抑制剂PDD00017273敏感，而五个细胞系对PDD00017273（包括BRCA突变的细胞系）无效。共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）抑制剂DDR信号级联由一系列蛋白磷酸化驱动，ATM、ATR和DNA-PKs是参与该过程的关键激酶。被DNA双链断裂激活，ATM被MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物招募到DSB位点。ATM底物包括p53、CHK1和CHK2，它们的磷酸化将导致S内或G2/M细胞周期阻滞。尽管ATM在DNA修复等多种分子过程中起着典型作用，但它也具有非典型功能，包括剪接体置换。ATM被认为是肿瘤抑制因子，ATM缺陷或突变在实体瘤和B细胞淋巴瘤中比较常见。ATM突变可能导致共济失调毛细血管扩张症，这是一种神经退行性疾病，其容易导致癌症。目前有几种ATM抑制剂正在研究用于癌症治疗。共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白（ATR）抑制剂与由DSB触发的ATM不同，ATR被复制蛋白A（RPA）包裹的单链DNA激活并被招募。单链DNA可以通过DSB的核溶解处理以及复制DNA解旋酶与DNA聚合酶的解偶联产生。细胞内ATR信号涉及一系列下游分子的磷酸化，触发广泛的反应，包括阻断细胞周期检查点、DDR和细胞凋亡。与其他DDR蛋白如PARP相比，ATR抑制剂的开发相对滞后。原因可能包括ATR分子的大尺寸和对其晶体结构缺乏了解。此外，其在所有PIKK中的高度同源活性位点以及对共激活蛋白的需求进一步限制了其药物设计。CHK1抑制剂检查点激酶CHK1通过磷酸化和招募一系列调节蛋白，积极参与ATR和ATM启动的DNA损伤反应。CHK1通过磷酸化CDC25A来调节S期内检查点，导致CDC25A降解，随后S期细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）活性降低，CHK1对CDC25C和WEE1的磷酸化调节有丝分裂和G2/M检查点。此外，CHK1还磷酸化Thr-309上的RAD51，促进其在HR期间与BRCA2的相互作用。CHK1水平升高与更差的预后、疾病复发和治疗抵抗相关，这进一步支持CHK1抑制的治疗潜力。WEE1抑制剂作为对DNA损伤的反应，激活的ATR使Chk1磷酸化，Chk1又使WEE1和CDC25磷酸化。与活性被磷酸化抑制的CDC25相比，WEE1被激活，然后磷酸化下游CDK1上的Tyr15和Thr14以抑制其活性，导致G2/M周期阻滞，为DNA损伤修复留出时间。此外，通过磷酸化CDK1上的Tyr15，WEE1还可以在DNA复制完成之前阻止S期向G2期的进展。虽然WEE1抑制剂的原理是明确的，但其临床应用受到其治疗窗口的限制。目前，大多数临床研究集中于WEE1抑制与化疗药物的联合应用。DNA-PK抑制剂DNA依赖性蛋白激酶是一个由DNA激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，大量表达在几乎所有哺乳动物的细胞中。DNA-PK是DNA修复的关键蛋白激酶， 参与了NHEJ的过程 。在各种肿瘤类型（包括胃肠道癌、肺癌和肝细胞癌）中都观察到DNA-PK表达上调，并且与较高的肿瘤分级和不良预后相关。DNA-PK抑制剂的开发主要集中在DNA-PKcs的催化活性上，而新的抗DNA-PKcs方法，如DNA-PKcs抑制性microRNA或靶向Ku异二聚体的抑制剂，则基于ATP结合位点的同源模型。目前，大多数DNA-PK抑制剂的临床研究集中在与癌症化疗或放疗联合使用的效果。小结细胞对DNA损伤的反应是一个复杂的过程，涉及各种信号网络和蛋白质，它们在特定的癌症类型中被差异激活或失活。肿瘤中增加的复制应激和DNA修复缺陷为我们治疗癌症提供了机会，使得癌细胞比正常细胞更容易受到DDR抑制。目前，以PARP抑制剂为典型的靶向DDR途径的药物已经走向临床应用，并且在肿瘤治疗中展现出令人鼓舞的前景。进一步，确定这些DDR抑制剂的最佳剂量、组合和时间表，减少不良反应，更理想地提高疗效将是未来的方向。此外，对每一种肿瘤进行表征，以确定其失控的DDR成分的具体特征，将有助于癌症患者的个性化治疗。参考文献：1.  Targeting DNA repair pathway in cancer:Mechanisms and clinical application. MedComm (2020). 2021 Dec; 2(4):654–691.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

徐寒梅中国药科大学二级教授（博导），海洋药学专业负责人，江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心主任，国家药典委员会委员，国家级高层次人才项目入选者。主编出版 3 部论著（《新药非临床研究与开发》《抗肿瘤药物药理学实验指南》《酶类药物学》），发表学术论文 213 篇（SCI 收录 81 篇）， 申请国内专利 32 项（获授权 24 项），培养研究生 160 名（博士 29 名）。主办“第十四届中国国际多肽学术会议暨第五届亚太国际多肽学术会议”，多次受邀参加国内外学术会议报告。研究领域涉及多肽药物研发、全新微肽发现及机制研究、长链非编码 RNA 与疾病关系的分子机制。主持课题包括国家自然科学基金、国家 “863”计划、国家重大专项和重大横向课题等项目 30 余项。先后获中国药科大学“十三五”科技突出贡献奖，联合国教科文组织和平中心“2020 跨文化科技大使”，教育部技术发明奖一等奖，中国产学研合作创新成果 奖二等奖，江苏医药科技进步奖一等奖、二等奖各 1 次，中国发明创业成果奖一等奖，江苏省科学技术奖一等奖，江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人，内蒙古组织部 “草原英才”等奖励和荣誉。优化规律间隔成簇短回文重复序列相关核酸酶 9 敲入效率的研究进展 PPS 洪秀，李臣诚，徐寒梅 *（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）[ 摘要 ] 基因编辑技术可以通过在基因组 DNA 中精确插入、缺失或替换而人为地修饰靶位点的遗传物质。近年来，随着规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9, CRISPR/Cas9）系统的发展，研究人员对各种细胞基因组进行编辑的能力大大提高，但由于同源定向修复（homologous directed repair, HDR）效率低下，许多通过抑制非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）或增强 HDR 的方法，如化学调节、同步表达和同源臂优化等被开发出来用以提高基于 CRISPR/Cas9 系统的精确基因敲入效率，重点介绍这些方法如何优化 Cas9 敲入效率的最新进展。 基因编辑是针对靶基因进行插入、敲除和定点突变以完成精确修饰的基因工程技术 [1]，目前包括锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）技术、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）技术[2]。天然的CRISPR/Cas9 系统由Cas9，CRISPR 衍生 RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）3 部分组成，crRNA 和 tracrRNA 通过局部碱基配对形成引导RNA（guide RNA，gRNA），与 Cas9 蛋白结合并引导其识别和切割目标 DNA 序列 [3]。CRISPR 介导的基因编辑使研究人员能够使用 Cas9 和适当的 gRNA 在基因组特定位置有效地引入双链断裂，并且通过非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（homologous directed repair，HDR）2 种修复途径，实现突变或外源基因插入 [4]。NHEJ 修复方式通过在双链断裂处引入小的插入或缺失，造成基因移码突变；当外源模板存在时，可通过 HDR 实现基因的精准修复或片段插入 [5]。尽管 CRISPR/Cas9 可通过 HDR 介导基因敲入，但 HDR 仅在 G2 和 S 期细胞中活性较高，因此，对于神经元细胞等分裂缓慢或处于有丝分裂后期的细胞并不适用；此外，NHEJ途径是细胞中 DNA 修复的主要方式 [6]。因此，上述2 种因素导致 HDR 介导的基因修复效率较低，仅为0.1%~6.5%[7]。CRISPR 系统递送是实际应用的关键，目前它能通过 3 种形式被递送到细胞中，包括 DNA（质粒DNA）、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），不同的递送形式在病毒载体或非病毒载体的协助下进入细胞，从而完成靶标基因的编辑。第 1 种 DNA 递送需将 Cas9 蛋白、单向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）的 DNA 序列构建于质粒载体中，再对质粒进行病毒包装（如慢病毒、腺相关病毒等），最终 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列在病毒介导下进入细胞从而起始基因编辑。它操作简单且成本低，适用于基因功能的研究，但存在如下缺点：1）质粒载体过大，从而导致病毒包装效率和递送效率降低；2）DNA 序列需经转录、翻译形成 Cas9 蛋白、sgRNA 再起始编辑功能，降低了编辑效率；3）转染后的 Cas9 基因序列不易去除，导致 Cas9 蛋白长期存在细胞中，易引发更大的毒性和副作用 [8]。第2 种 mRNA 递送是将 Cas9 的 mRNA、sgRNA 序列在非病毒载体的介导下递送至靶细胞，起始基因编辑。这种递送形式的优点是由于 mRNA 无需转录，经翻译后即可启动基因编辑，使得编辑效率高于DNA 递送形式，且因 mRNA 不会长久维持在细胞中，从而降低了 CRISPR 系统的脱靶率。不过，由于 mRNA 的稳定性较差，对递送载体有较高要求。第 3 种 RNP 递送是将 Cas9 蛋 白、sgRNA 组装成RNP，然后通过非病毒载体直接递送于细胞中起始基因编辑，为目前最高效的 CRISPR/Cas9 基因编辑策略。该递送形式优势明显，递送至细胞后无需转录、翻译过程，直接起始基因编辑，从而能显著提高编辑效率，且 RNP 一般在细胞内 48 h 即可降解，不会在细胞中长期存在，从而降低了对细胞的毒性和不良影响，极大降低脱靶率，此外 RNP 递送不受细胞类型限制，使编辑更加精准、高效。但是 RNP转染的缺点是编辑时间较短，需在一段时间内提供足够的编辑工具，以便进行足够的编辑；并且，由于需要大量合成 Cas9 蛋白和 sgRNA，导致 RNP 转染的成本相对较高；在实验中选择RNP 转染还需要考虑 sgRNA 和 Cas9 蛋白的适配性。总之，CRISPR技术的快速发展提高了研究人员对细胞进行精确基因编辑的能力，但 CRISPR/Cas9 技术目前仍面临递送效率低、HDR 效率低、脱靶性，以及毒性和副作用等多种问题 [9]。鉴于 Cas9 诱导断裂的 HDR 效率相对较低，本文主要通过对供体模板及递送方式的优化，外源加入调控 NHEJ 或 HDR 相关信号通路、染色质开放或关闭状态、细胞周期的小分子化合物，构建敲除或过表达细胞系或利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）调控细胞信号通路关键蛋白的表达，以及对 Cas9 系统的优化等方法来优化Cas9 敲入效率，从而提高编辑的特异性和减少脱靶效应，提升基因编辑的传递效率和导入能力，并实现更大片段的精准编辑，加速了基因编辑技术向临床转化，对于解决基因编辑面临的主要难点具有重要意义。1供体模板的优化策略常见供体模板有质粒、双链 DNA（double strand DNA，dsDNA）和单链 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）3 种。质粒作为基因敲入模板，不仅制备周期长，且高浓度导入会造成较强的细胞毒性 [10]。因此，研究者常使用 dsDNA 或 ssDNA 作为供体模板。对于小片段的插入，通常选用 ssDNA 供体；对于荧光蛋白或基因表达盒等大片段插入，则一般选择dsDNA 和质粒供体。值得注意的是，左右同源臂一般以待敲入的目的细胞基因组为模板扩增，以避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源而降低 HDR 效率。由于通过同源重组修复途径敲入大于 2 000 bp 的长基因片段很难成功实现，因此，供体模板的设计是基因敲入实验所面临的主要挑战之一。下面将对模板选取及设计过程中可能遇到的问题进行归类分析，如根据敲入目标片段的长度和靶标的类型选择合适的模板的类型及设计最佳的同源臂大小来提高敲入效率（见表 1）。1.1供体模板的设计在基因编辑实验中，当插入目标片段长度小于 2 000 bp 时，ssDNA 在包含较短同源臂的情况下可以产生比 dsDNA 更高的 HDR 效率；无论使用 ssDNA 或 dsDNA 供体，使用非前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）链供体的HDR效率略高于PAM链供体，Liang等[11]研究表明，最优ssDNA的总长度约为200个碱基，30个碱基的3'端短同源臂和 40 个碱基的 5' 端长同源臂组成的不对称同源臂供体 DNA 在诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）中可实现 45% 的敲入效率。此外，当 sgRNA 的切割位点位于敲入位点上游 5 bp 或下游 3 bp 时，基因的敲入效率最佳。值得注意的是，为了避免二次切割，可将对应 sgRNA 的PAM 或邻近 PAM 的序列进行同义突变。当目标片段长度大于 2 000 bp 时，选择同源臂长度为 600 ~ 2 000 bp 的质粒或 dsDNA 更加合适。然而哺乳动物细胞中对于长片段 DNA 的精准插入效率非常低，Gao 等 [12] 开发了简单的基因组编辑方法，称为转录偶联 Cas9 介导的编辑（transcription-coupled Cas9-mediated editing，TEd）， 当 插 入 大DNA 片段时它可以实现比传统 Cas9 介导的编辑更高的效率。首先研究者发现处于转录耦合状态的供体 DNA 能够显著提高绿色荧光蛋白（gene fluorescent protein，GFP）的精准插入效率，随后基于上述发现设计开发了一系列优化的 TEd 基因编辑系统，通过在同源供体 DNA 上引入启动子以形成 TC-donor（transcription-coupled HR-donor）， 并在其转录产物 TC-RNA 的 3' 端添加多个 MS2 茎环结构（MS2 binding loops）以及在 Cas9 上融合 MS2适配体的结合结构域，该团队发现优化后的 TEd 系统对于 GFP 的精准插入效率可以达到传统方法的 10倍左右，并在高达 10 000 bp 的 DNA 片段敲入方面也获得了很好的效果。总之，在 Cas9 实验中，当插入片段长度小于2 000 bp 时，ssDNA 供体可提供更短的同源臂，获得比 dsDNA 形式的模板更高的插入效率；当目标片段长度大于 2 000 bp 时，应选择同源臂长度为 600 ~2 000 bp 的质粒或 dsDNA。与相同长度的 ssDNA 供体相比，长 dsDNA 供体更有可能产生细胞毒性：供体越长，细胞毒性就越明显，且增加较长 dsDNA 供体的浓度也会导致毒性的产生。dsDNA 供体的另一问题是它们更倾向于插入整个供体序列，包括同源组。此外，在设计 HDR 供体 DNA 的时候，还应该注意以下 2 点：1）如果在 HDR 实验中使用 Cas9 核酸酶，最好使用与目标 DNA 的 2 条链匹配的同源序列检测 ssDNA 供体；2）当使用 Cas9 系统时，要避免在 HDR 修复后重新产生 PAM 位点。设计 ssDNA供体序列，应在 PAM 位点引入同义突变，这样 RNP就不能识别修复后的序列。否则，Cas 核酸酶可能会重新切割修复后的 DNA，除了所需的 HDR 突变外，还会形成 NHEJ 介导的插入缺失。因此，设计 HDR供体模板时，要注意区分短型插入和长型插入。对于较短或中等长度插入，建议使用 ssDNA 作为 HDR 供体模板。根据敲入目标片段的大小选择合适的供体类型及最佳长度的左右同源臂，并对 PAM 位点引入同义突变，同时，也要考虑敲入不同靶标的难易程度，从而不断提高 HDR 介导的敲入效率。1.2 供体模板的修饰对供体模板进行化学修饰或组蛋白修饰将提高其稳定性及基因编辑效率。考虑到 dsDNA 在细胞内极易被降解、敲入效率低，Akhmetzyanova 等 [13] 研究发现，双链模板的末端修饰能提高供体的稳定性，他们采用体外合成 Cas9-RNP 和 5' 端修饰的短同源臂dsDNA 供体进行结合，选择了 13 种化学基团对双链模板进行修饰，并选用 HCT116 细胞进行筛选和效率测试，结果发现所有修饰均能在不同程度上提高编辑效率，其中利用化学基团 C6-聚乙二醇 5' 端修饰的dsDNA 模板能够将敲入效率提高为未修饰模板的 5~6 倍，并且在 293T 细胞中将长度为 700 bp DNA 片段的敲入效率提高到 65%。此外，在短的 ssDNA 模板的5'端或3'端添加硫代磷酸二酯键能提高其稳定性，减少核酸外切酶的影响，从而提高在 iPSC 和 Jurkat细胞等核酸酶水平高的细胞中的编辑效率。另外，在基于 HDR 的基因编辑中，通常以纯化或“裸露”的 DNA 为供体模板。但细胞中的DNA 是被组蛋白包裹成染色质的天然形式存在的，而组蛋白 H3K36 三甲基化（H3K36me3）是人类细胞HDR 至关重要的修饰，Cruz-Becerra 等 [14] 发现，与裸 DNA 供体模板相比，组蛋白修饰的染色质供体模板能够更有效地发生同源链配对，其基因编辑效率是裸 DNA 供体模板的 2.3~7.4 倍。综上，利用 5' 端化学修饰的 dsDNA 作为模板，结合高稳定和低脱靶性的 Cas9-RNP 递送，能够实现比未修饰情况下高出 5 倍的敲入效率，并且在人类胚胎肾脏细胞中对长度为 700 bp 的 DNA 片段实现了效率达 65% 的敲入。通过用更稳定的硫代磷酸二酯键替代磷酸键，对 ssDNA 供体进行末端修饰，可以增强其稳定性。该策略不仅大幅度地提高了敲入效率，也极大地缩短了制备周期，给未来的基因编辑实验和基因治疗手段提供了更大的可能性。另一方面，H3K36me3 和 H3K4me3 甲基化修饰介导人类细胞中的同源重组与 Cas9 融合，使得 HDR 效率提高了 3 倍，且减少了脱靶效应，证明了组蛋白修饰提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。1.3 供体模板与 Cas9 的递送形式目前有以下几种方法可将 CRISPR/Cas9 及其组分递送到目标细胞，包括 Cas9-RNP，Cas9-mRNA和 Cas9 质粒形式以及病毒、非病毒等载体。1.3.1 Cas9-RNP Cas9-RNP 复合物由 Cas9 蛋白和sgRNA 组成，该形式递送 Cas9 蛋白和 sgRNA 是最直接简便的方法，无需转录和翻译过程，能直接快速启动基因编辑过程，脱靶率低且毒性小。但由于Cas9-RNP 复合物尺寸较大不易包封，该形式递送存在一定的难点 [15]。Chandrasekaran等[15]通过电转将 Cas9/sgRNA导入原代 T 细胞，成功实现了近 40% 的基因编辑效率；进一步引入 HDR 模板，产生了 20% 的基因敲入效率。Kim等[16] 通过电转的方式将 Cas9/sgRNA 递呈至人红白血病细胞系（K562），通过改变 sgRNA靶向不同的位点，分别获得 16%~72% 的编辑效率，平均效率为 44%。在其他方式难以转染的人成纤维细胞和多能干细胞中，通过电转也能分别得到 19%和 23% 的基因编辑效率。1.3.2 Cas9-mRNA RNA 水平递送编码 Cas9 蛋白的mRNA 和 sgRNA，mRNA 能较快启动基因编辑，但该递送方法的局限性在于 mRNA 本身稳定性差且在体内外都容易受到 RNA 酶的降解，限制了基因编辑的持续时间，降低了基因编辑效果 [17]。Liu 等 [18] 发现结合了二硫键的脂质纳米颗粒BAMEA-O16B可以高效地将 Cas9 mRNA 和 sgRNA传递到细胞中。研究表明，使用BAMEA-O16B同时递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA 可以抑制 293T 细胞的 GFP 表达，基因编辑效率高达 90%。 1.3.3 Cas9 质粒 由于稳定性高、操作简单、成本低等优点，从 DNA 水平递送编码 Cas9 蛋白和sgRNA 的质粒成为常用的递送形式。然而递送质粒会降低基因编辑效率，延长 Cas9 切割时间从而增加脱靶率 [18-19]。Liu 等 [18] 设计了基于聚合物/无机杂化纳米粒子的双重靶向递送系统，将 CRISPR/Cas9 质粒递送至人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞核中，基因编辑效率高达90%。Zhang 等 [19] 研发了基于聚乙二醇-b-聚乳酸-羟基乙酸二嵌段共聚物 [poly (ethylene glycol)-b-poly (lactic-co-glycolic acid)，PEG-b-PLGA] 纳米颗粒的递送系统，其能够将 CRISPR/Cas9 质粒 DNA 递送至多个器官的血管系统中，并实现了 80% 的基因编辑效率。1.3.4 病毒和非病毒载体 病毒载体是 CRISPR/Cas9系统最常用的递送载体，但病毒载体可能会导致宿主产生有害的免疫原性和突变，限制了其应用；非病毒载体具有免疫原性低、无内源病毒重组的优点，因而纳米粒子制剂载体受到广泛的关注 [20]。基于阳离子脂质体的纳米颗粒常用于递送CRISPR/Cas9 系统，Zhang 等 [21] 合成了新型聚乙二醇磷脂修饰的阳离子脂质纳米粒子递送系统，从而使体外 A375 细胞的转染效率达 47.7%，且含有酯基的可生物降解的脂质样化合物在体内外均表现出有效的 Cas9 mRNA 递送。壳聚糖也是良好的聚合物载体，Qiao 等 [22] 将红色荧光蛋白包封在壳聚糖中形成带正电荷的纳米颗粒，将 Cas9-RNP 和 ssDNA 供体同时递送到细胞质中，具有很高的基因组编辑效率且无细胞毒性。目前，基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的与递送载体相关的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对 Cas9 或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。与长期表达的递送方式相比，瞬时递送的优势就在于能够降低脱靶的概率，这在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期表达时也可能导致癌变。Cas9-mRNA 为快速、稳定性差且在体内外都易受到降解的递送形式，适用于周期短的实验研究；Cas9 质粒稳定性高、操作简单、成本低，是常用的体外递送形式，但由于各类转染试剂存在细胞毒性，并且切割时间长，容易引起脱靶效应；与以 DNA/RNA 为基础的递送技术相比，RNP 体系直接在体外将 Cas9 蛋白和 gRNA 组装形成 RNP 复合物，通过电转法等方式导入靶细胞，实现 Cas9 的瞬时表达。该递送形式使细胞毒性更低，半衰期更短，同时采用其进行基因编辑可带来更低的脱靶效应。由于 RNP 在血液中易被蛋白酶降解，RNP 介导的CRISPR 基因编辑更多用于体外实验 [23]。目前病毒载体仍然是临床试验的常用载体。病毒载体可实现高转染效率，但是存在包装外源片段长度有限、免疫原性强和具有潜在脱靶效应等局限性。其中，慢病毒宿主范围广，基因容量大，感染效率高，能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，具有多种血清型，体内扩散能力强，常用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。非病毒载体的原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移，包括脂质纳米颗粒、电穿孔、细胞穿透肽等作为递送方式。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，但实验耗材成本高，存在细胞毒性，部分细胞类型递送效率低 [24-25]。因此，研究人员可根据实验需求选取合适的递送方式，例如 Cas9-RNP，Cas9-mRNA，Cas9 质粒以及通过病毒和非病毒载体包装的递送系统，包括阳离子脂质体的纳米颗粒、壳聚糖等，从而能在体内外有效提高基因编辑效率。2 调控 DNA 双链断裂修复的小分子化合物 如前所述，自然界中 HDR 的频率非常低，哺乳动物细胞通过多种机制优先使用 NHEJ 进行 DNA 双链断裂（double-strand break，DSB）修复，除了有丝分裂外，NHEJ 在整个细胞周期中都是活跃的，而 HDR 仅限于 S 期和 G2 期活跃。研究表明，NHEJ小分子抑制剂、HDR 激活剂和细胞周期抑制剂可影响 DSB 修复的不同方面，使 DSB 修复平衡转向HDR，有利于提高 CRISPR/Cas9 系统的基因敲入效率（见图 1），如细胞周期抑制剂可通过延长细胞周期的 S 期和 G2 期的长度以提高 HDR 的效率 [26]。目前开发的小分子化合物已被用于提高 HEK 293细胞、人类 iPSCs、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和小鼠胚胎中的 HDR 效率（见表 2）。2.1 调控 HDR 与 NHEJ 相关信号通路的小分子 参与双链断裂 DNA 修复途径的某些小分子通过作用于 DNA 修复过程中的关键蛋白以有效提高敲入效率（见图 1）。DNA 修复途径包括 HDR和 NHEJ。HDR 激活剂或 NHEJ 抑制剂可有效提高 HDR 敲 入 效 率。 其 中 HDR 激活剂有 RS-1 和brefeldinA；NHEJ 抑制剂包括 SCR7，L755507，NU7026，白藜芦醇，NU7441 和 KU-0060648。RAD51 是有丝分裂细胞中催化 DNA 同源重组修复过程中同源配对的唯一蛋白，其通过介导 DNA链配对和交换而参与 DNA 同源重组修复。Song 等[27]研究表明，RS-1 可激活 RAD51 蛋白，使 RAD51 蛋白与 DNA 的结合更稳定，从而将 HDR 修复效率提高 3 倍，值得注意的是，高浓度 RS-1 具有较强的细胞毒性。胞内蛋白运输抑制剂能抑制物质从内质网向高尔基体的运输，Hong 等 [28] 研究发现，使用胞内蛋白运输抑制剂 brefeldinA，可将 HDR 效率提高 2 倍。DNA 连接酶Ⅳ（DNA ligase IV，LIG4）是 NHEJ途径的关键酶，Ray 等[29] 发现 SCR7 是 LIG4 的抑制剂，能抑制 NHEJ 活性，在 A549 细胞中，相较于未处理的对照组，SCR7 使靶位点的插入效率提高约 3 倍。β3-肾上腺素能受体是一类 G 蛋白偶联受体，Murakami等 [30] 研究发现 L755507 和 NU7026 是β3-肾上腺素能受体激动剂，可增强 CRISPR 介导的HDR 效率，最佳使用剂量为 5 μmol·L-1，并且在 24 h以内效果最佳，可将敲入效率提高 3 倍。为了研究DNA 依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）对 DSB的 NHEJ 修复途径的影响，Sak 等 [31] 评估了 DNAPKcs 特异性抑制剂 NU7441 对不同状态的非小细胞肺癌细胞株 DSB 修复的细胞周期特异性作用，结果显示 NU7441 以细胞周期依赖性的方式抑制 NHEJ的效率。Robert 等 [32] 研究显示，DNA 蛋白激酶抑制剂 NU7441 和 KU-0060648 能抑制 NEHJ 活性，将 HDR 效率提高 3 倍。Li 等 [33] 研究发现，白藜芦醇可抑制 LIG4 的表达，使猪胎儿成纤维细胞的 HDR 效率提高 2~3 倍。此外，他们还发现白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制 S 期猪胎儿成纤维细胞，而 HDR 相关基因如RAD51 和 RAD52 的表达与白藜芦醇呈剂量依赖性增加。因此，白藜芦醇通过与多个 DNA 损伤相关蛋白相互作用，增加了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率。综上，为了提高 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率，研究人员可选择性使用小分子化合物，如 HDR 激活剂 RS-1 和 brefeldinA 分别作用于靶标 RAD51 和高尔基体，将敲入效率提高 2~ 3 倍；NHEJ 抑制剂包括SCR7，L755507，NU7026，NU7441，KU-0060648和白藜芦醇等，通过作用于不同的靶标，主要有LIG4，DNA 蛋白激酶和 β3-肾上腺素能受体，抑制NHEJ 修复途径，从而使 HDR 修复效率提高 2~5 倍。2.2 调控染色质开放或关闭状态的小分子靶向 DSB 的可及性主要取决于染色质状态，并且 DNA 有效修复的第一步是允许修复途径相关的蛋白质结合，HDR 与 NHEJ 的修复平衡与染色质结构的状态相关。染色质结构的开放或关闭状态主要由组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡控制，而组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）严格调控。乙酰化导致开放活跃的染色质状态，HDAC 使组蛋白去乙酰化，实现染色质致密卷曲。HDAC 抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化水平，促进开放染色质位点，从而调控CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 [34]。HDAC 抑制剂能抑制 NHEJ 关键因子的去乙酰化，显著增加 G2/M 期的细胞百分比，并相应减少了 G1/S 期的细胞数量，从而促进HDR 修复途径。Li 等 [35] 通过评估组蛋白修饰剂如 HDAC 抑制剂和HAT（靶点包括 p300/CBP，Tip60 和 MOZ）抑制剂对 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑效率的影响，证明了抑制 HDAC1 和 HDAC2 的活性，能够增强 HDR介导的基因敲入效率；相反，抑制 HDAC3 会降低基因编辑效率。因此，HDAC 抑制剂作为内源性途径调控因子，能抑制 NHEJ 修复途径，提高 HDR 修复效率，为细胞自身修复途径的基因编辑提供有力条件。2.3 调控细胞周期的小分子由于 HDR 发生在细胞周期的 S 期和 G2 期，所以一些研究将细胞周期抑制剂与基因编辑相配对，使细胞周期同步化并将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或G2 期从而提高 HDR 效率（见图 2）。细胞周期抑制剂通过抑制微管聚合来使细胞停滞在 G2/M 期。Lin 等 [36] 对 6 种可逆化学细胞周期抑制剂进行了评估，包括 4 种 G1/S 阻滞剂（阿菲迪霉素、羟基脲、含羞草素和胸腺嘧啶），1 种 G2/M阻滞剂（诺考达唑）和 1 种 M/G1 阻滞剂（洛伐他汀），该研究发现诺考达唑和另一 G2/M 阻滞剂（ABT-751）可通过作用于 β 微管蛋白来增强 CRISPR/Cas9 活性，将 HDR 修复效率提高 3~6 倍。周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是调节细胞周期进程的异二聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在 S 期阶段该酶的活性增加激活了 HDR修复通路的关键标志，如激活 DNA 末端切除过程。Smirnikhina 等 [37] 利用 CDK 抑制剂靛红素，通过在S 期或 G2 期阻滞靶细胞，提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。细胞分裂周期7 相关蛋白激酶（cell division cycle seven associated protein kinase，CDC7）属于丝氨酸-苏氨酸激酶，可被 Dbf4 依赖性激酶（Dbf4-dependent kinase，DDK）激活，是细胞进入 S 期的必要因子，抑制 CDC7 蛋白可导致细胞周期停滞在 G1/S 期。CDC7/DDK 复合体使微小染色体维持蛋白（minichromosome mantenance protein，MCM） 维 持 磷 酸 化， 从 而 启动 G1/S 期的过渡。Wienert 等 [38] 研究发现 XL413 为CDC7 抑制剂，能够可逆地阻断 MCM 的磷酸化，并在 S 期早期阻滞细胞。在 K562 细胞中，XL413将增强型蓝色荧光蛋白（enhanced blue fluorescence protein，EBFP）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的基因编辑效率分别提高了1.4 和 1.8 倍。此外，敲低蛋白 CDC7 能在可逆的 S 期减缓过程中激活 HDR 途径，使许多情况下（包括原代 T 细胞）的 HDR 修复效率提高 3.5 倍。综上，使用不同细胞周期蛋白抑制剂将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或 G2 期可针对性地提高 HDR 修复效率。不过，细胞周期抑制剂可能引起部分细胞凋亡，研究者需要进行预实验探索最适浓度。3调控 DNA 双链断裂修复的关键蛋白表达 除了 NHEJ 抑制剂或 HDR 激活剂，还可通过构建敲除细胞系或利用 siRNA/ 短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低或过表达修复通路关键蛋白来提高 CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 效率，如敲低 Ku70，Ku80，DNA-PKcs，p53 结合蛋白 1（p53-binding protein 1，53BP1），以及过表达 RAD51 和RAD52（见表 3[39-48]），具体作用机制如图 3 所示。Chu 等 [39] 发现，在 HEK293/TLR 细胞中，Ad4蛋白处理能降低 LIG4 的表达，显著抑制了 NHEJ的效率。该研究还发现利用 siRNA 降低 LIG4 的表达可使 HDR 效率提高 2.8 倍。Li 等 [40] 利用 siRNA减少 NHEJ 通路中关键因子 Ku70 和 Ku80 的表达，增加了多个 HDR 效率，包括同源重组、单链退火和单链寡核苷酸介导的 DNA 修复。DNA-PKcs 是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶（phosphoinositide 3-kinase-related kinase，PIKK）家族的成员，该家族包括具有高度同源的催化结构域的蛋白质，如 PI3K，毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated protein，ATM），ATR（ATM and Rad3 related）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[41]。DNA-PKcs 的激酶活性在 NHEJ 启动步骤中起着重要作用，Liu 等 [41] 研究表明 DNA-PKcs表达下调可使 HDR 效率增加 2.8 倍。53BP1 是真核细胞中 DSB 修复途径选择的关键调控因子，通过抑制末端切除导致 NHEJ 优先于HDR，使得 HDR 启动受限。Canny 等 [42] 通过阻断53BP1 在 DNA 损伤位点的积累，发现53BP1 抑制剂可以提高人类和小鼠细胞中 HDR 依赖基因组编辑的效率，最高可提高 5.6 倍，并提高了基因靶向性和与 dsDNA 或 ssDNA 供体的染色体基因转换。RAD51 和 RAD52 是 HDR 过程中的关键蛋白，Kurihara 等 [43] 研究发现在神经元细胞中共转染过表达 RAD51，敲入效率提高了 2.5 倍。Shao 等 [44] 研究显示，RAD52 在 293T 细胞中的过表达，使 HDR修复效率增加 3 倍。该课题组还发现 RAD52 和SCR7 的联合使用将 HDR 效率提高约 40%。CtBP相互作用蛋白（CtBP-interacting protein，CtIP） 是 同 源 重 组 早 期 步 骤 的 关 键 蛋 白， 主 要作为辅因子诱导减数分裂重组蛋白 11（meiotic recombination 11，MRE11）核酸内切酶对 DNA 末端切割，激活 HDR 途径 [45]。Charpentier 等 [46] 研究发现，CtIP 最小的 N 端片段可激活 HDR 修复，从而提高了靶位点的基因编辑效率。Engeland 等 [47] 研究显示，P21 蛋白与许多转录因子相互作用，P21 蛋白能抑制 CDK4 的活性，使周期抑制蛋白 Rb 不能发生磷酸化，细胞周期相关转录因子 E2F 不能释放，进而使细胞周期停滞在 S/G1 期，从而增加 HDR 效率。Gutshner 等 [48] 试图通过直接同步 Cas9 的表达与细胞周期进展来激活 HDR 修复活性，结果发现将人 Geminin 蛋白的 N 端区域与 Cas9 融合，诱导Cas9 在 G1 期降解，使目标 DNA 切割限制在 S/G2 期，HDR 效率增加至 87%。综上，干扰或过表达 DSB 修复途径关键蛋白的策略有利于生成精确基因修饰的细胞系和生物体，研究者可通过 siRNA 减 少 Ku70，Ku80，LIG4，DNA-PKcs，53BP1，CDK，CtIP 等表达或对蛋白RAD51 和 RAD52 过表达从而提高 HDR 修复效率，抑制 NHEJ 修复活性。除了通过调控 DSB 修复的关键蛋白表达的策略之外，Ye 等[49] 开发了新的方法，用 CRISPR 激活（CRISPRa） 或 CRISPR 沉 默（CRISPRi）来调节NHEJ 和 HDR 通 路，CRISPRi 或 CRISPRa 复合物能抑制 NHEJ 修复途径并激活 HDR 修复，显著提高CRISPR 介导的基因编辑的 HDR 效率。4优化 Cas9 系统从 Cas9 蛋白的性质出发，如表面电荷、末端残基及拓扑结构，可以对其进行修饰或改造，使其更适配于不同载体系统的体内递送，促进 Cas9-RNP的基因编辑。具体包括如下方法：1）Cas9 核酸酶的末端修饰，如添加标签蛋白或融合蛋白结构域；2）基于 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理对其进行工程化改造，从而筛选出优异的 Cas9 突变体；3）对 Cas9 拓扑结构进行调整，如与特定蛋白功能域融合，或同时表达多个 sgRNAs 或 Cas9 实现 CRISPR/Cas9 系统的多重编辑及调控 [50]。4.1 Cas9 的修饰 CRISPR/Cas9 介导的同源重组修复是由 Cas9在 gRNA 介导的双链断裂后，在切割位点利用供体DNA 进行的修复途径。供体 DNA 在切割位点的富集程度将决定同源重组能否发生，供体 DNA 在切割区域的低浓度是同源重组的限速步骤。基于此问题，Ling 等 [51] 采用非天然氨基酸偶联技术实现 Cas9 蛋白与供体 DNA 的直接或间接偶联，将其共递送进入体内，实现切割区域供体 DNA 的有效富集，在细胞水平实现同源重组水平大幅提升10~20 倍。此外，使用含叠氮基的氨基酸对 Cas9 蛋白进行化学修饰，通过加成反应缀合供体 ssDNA 或DNA 衔接子，从而将修饰的或未修饰的供体 DNA模板募集到 RNP 复合物中，结果显示用 G1367-AeF（苯丙氨酸突变位点 G1367）RNP 和二苄基环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）修饰的 ssDNA 共转染细胞的 HDR 效率增加了1.6 倍。Huang 等[52] 开发了 Cas9 ProSNA-sgRNA 核糖核蛋白递送系统，通过在 Cas9 蛋白 N 端修饰 3 个连续的 GALA 肽促进核递送效率。结果显示 Cas9 ProSNA RNP 在 4 种不同的细胞中的基因编辑效率为 32%~47%。4.2 Cas9 突变体 CRISPR/Cas9 推动了基因编辑技术的发展，但PAM 要求限制了精确基因编辑方法的适用性，使目标编辑发生在 PAM 的特定距离或特定范围内 [53]。不过，随着人们对 Cas9 蛋白三维结构和作用机制的深入认识，通过对 Cas9 蛋白进行工程化改造就逐渐成为优化提升 CRISPR/Cas9 系统的有力手段。该方法以 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理为指引，对Cas9 蛋白相应的结构域进行设计改造，来筛选性能更为优异的 Cas9 突变体。Huang 等 [54] 研究发现通过定向进化生成的 4 种Cas9 突变体能够共同靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。结果显示 Nme2Cas9 突变体成功突破了传统 PAM 的限制，并实现高效的基因编辑。Wang 等 [55] 研究发现将微生物单链退火蛋白（single chain annealing protein，SSAP）与催化失活的 dCas9结合形成无切割的基因编辑器 dCas9-SSAP 具有较低的目标误差和最小的脱靶效应，可有效插入千碱基的序列，效率约达 20%。4.3 Cas9 蛋白与特定功能蛋白融合目前通过将特定蛋白或功能域与 Cas9 融合，可以有效提高 HDR 敲入效率。单碱基编辑和引导编辑器（prime editor，PE）编辑可实现精准的碱基替换和片段的插入而无需 DSB过程。该系统通过对靶位点的“搜索”和“替换”，可实现 4 种碱基之间的任意替换及小片段的精准插入和删除，克服了 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率低和碱基编辑系统不能实现碱基颠换的困难 [56]。 Peterka 等[57]将逆转录酶和野生型 SpCas9 进行融合构建了 PEn 蛋白，利用常规的先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA，pegRNA），PEn可通过同源依赖性 DSB 修复机制实现小 DNA 插入，效率达 50%。Jiang 等 [58] 将具有双链切割活性的 Cas9 与逆转录酶融合，并结合 2 条靶向互补 DNA链 pegRNA，开发出了 PEDAR 系统，它可以高效地诱导 20 ~ 700 bp 片段的缺失和 30 bp 片段的插入。Adikusuma 等 [59] 同样利用野生型 SpCas9 构建了新的PE 系统，并且将蛋白、pegRNA 和 nicking sgRNA 整合在同一质粒中进行表达，该系统在 293T 细胞中平均编辑效率可达 67%。此外，将该系统注射小鼠胚胎，在新生小鼠中最高可以实现 100% 的编辑效率。Aird等[60]将HUH核酸内切酶与Cas9融合表达，实现了稳定的共价 RNP-ssDNA 复合体，结果显示通过 HUH-Cas9 融合蛋白与 ssDNA 共价结合可使HDR 效率增强 30 倍。Ma 等 [61] 将最小基元 Brex27与 spCas9 融合构建成 miCas9，研究发现以 Cas9-mRNA 形式递送时，miCas9 的编辑效率提高了 2.5倍；此外，Ma 等 [62] 将 Cas9 与全长睡美人（sleeping beauty，SB）转座子（Cas9- SB）、SB 的 RED 结构域（Cas9-N123） 和 SB 的 PAI 结 构 域（Cas9-N57）融合，经流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析显示，Cas9-N57 融合蛋白将 HDR 编辑效率提高了 1.5 倍。由于 HDR 增强子（HDR-enhancer，HE）是同源重组早期阶段的关键蛋白 CtIP 发挥活性所必需的最小 N 末端多聚化结构域，因此 HE 可通过增强HDR 提高Cas9 基因敲入效率。Charpentier 等 [63] 将HE 与 Cas9 融合，结果显示 Cas9-HE 融合物在包括人类细胞系、iPSCs 和大鼠受精卵中获得的基因编辑效率为仅用 Cas9 的 2 倍或更高。如前所述，Cas9-HE 融合物允许在若干实验系统中获得更高的转基因整合效率。此外，使用 Cas9-HE 非常简单且不需要使用基因修饰的细胞或药理学试剂，极大地提高了基因编辑应用的靶向范围，从而有利于提高 HDR 效率。HDR 和 NHEJ 之间的平衡与位点特异性的染色质状态相关。研究发现 CRISPR/Cas9 诱导 DSB的 NHEJ 修复效率在常染色区域较高，而微同源末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）和 HDR 偏向异染色质 [64]。因此可通过染色质重塑因子来调控染色质状态，使平衡偏向 HDR。Chen 等 [65] 将染色质重塑因子 PRDM9 与 Cas9 融合，将 HDR 效率提高了 3 倍，且未增加脱靶效应。 综上所述，将 Cas9 蛋白与特定功能蛋白，包括逆转录酶、内切酶、同源重组关键蛋白以及染色质重塑因子，融合表达的策略具有较高的基因组特异性，是未来基因组工程应用的有效工具。4.4 gRNA 优化和表达策略多重编辑CRISPR/Cas9系统与 TALEN 和 ZFN等核酸酶相比具有很大优势，其意味着多个 sgRNAs或 Cas9 能够同时表达从而极大地提高了 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑或转录调控的效率和靶向范围，多重编辑性使该系统在生物工程领域得到极大应用和发展。Hsieh-Feng 等 [66] 研究表明，高效表达多个 sgRNAs 在实现优化或多重基因组编辑中起着关键作用，研究发现各种 CRISPR/Cas9 的表达盒配置、转录本处理过程和传递策略都优化 sgRNA 的表达。此外，通过修饰或改变 sgRNA 识别区长度，可实现 CRISPR 系统的多重编辑或调控。CRISPR/Cas9 系统的特异性主要体现在 sgRNA对 Cas9 切割位点的特异性识别与结合，增强细胞内sgRNAs 的稳定性和特异性有助于提高基因组编辑效率，减少脱靶效应。基于 sgRNA 的骨架结构，可在特定位点进行修饰或改造，例如截短或延长 sgRNA 的 5'端或 3' 端来增减其长度；引入 2' 核糖化学修饰 sgRNA的骨架。此外，sgRNA 含有保守的核酸序列，可合理设计与之碱基互补配对的序列，复合成双链连接到载体上，从而提高递送效率 [67]。Wang 等 [68] 针对 sgRNA种子区核糖 2'-OH 与 Cas9 蛋白之间的相互作用位点，发现可利用特定位点的化学修饰来调节Cas9蛋白活性，通过在这些特定的位点引入 1 个发光性基团，实现了Cas9 活性的光学控制，从而间接调控基因编辑效率。综 上， 研 究 人 员 通 过 工 程 化 Cas9 蛋白或sgRNA 等方式，使 CRISPR/Cas9 系统的靶向范围、靶向特异性和保真性均得到了拓展和提高。当然，无论是通过针对 Cas 蛋白自身结构的优化改造，还是采用优化设计 sgRNA 等方式，均能在一定程度上提升 CRISPR/Cas9 系统的应用性能。5总结与展望CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 是精确可控的基因组 DNA 编辑工具 [69]。然而，由于哺乳动物细胞对NHEJ 的偏好性大于 HDR，基于 HDR 的精准基因敲入效率很低，因此，综合考虑细胞周期和 DSB 修复的关系对于提高基因敲入效率至关重要。目前，可采用在 ssDNA 或 dsDNA 供体末端引入化学修饰以增强供体稳定性，供体共价连接到CRISPR/Cas9 系统上提高切割位点局部浓度的方法提高基因敲入效率。但这些方法存在操作困难、成本高等问题。因此，需要进一步优化供体模板，以促进 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入在临床治疗中的应用。此外，该系统还受限于 PAM 序列的依赖性和脱靶效应，应用在人类疾病基因治疗时需要提高其保真性、安全性等因素。例如通过优化 Cas9 蛋白或gRNA 从而拓宽 PAM 序列识别范围并提高靶向特异性，通过融合效应结构域或进行转录调控。CRISPR/Cas9 系统在临床试验中的递送主要依赖于物理途径和病毒载体，这受到细胞损伤和安全性问题的严重阻碍。非病毒纳米载体的开发将有助于拓展 CRISPR/Cas9 系统的医学应用。有效和安全的递送策略仍然是 CRISPR/Cas9 系统临床应用的主要挑战。研究人员需根据每种 CRISPR/Cas9 模式的作用机制和理化性质，合理设计载体，使基因组编辑效率最大化，脱靶风险最小化。尽管研究人员已对 CRISPR/Cas9 技术进行了广泛的探索，但该技术的特异性还有待进一步提高，以减少脱靶风险，确保安全性。此外，CRISPR/Cas9系统具有多重编辑的优势，可应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行筛选，极大促进了基因编辑技术在生物工程领域的发展和应用。然而，对于 sgRNA 在细胞内的机制及其对Cas9 竞争作用的了解仍有待加强。参考文献 ：[1] Cong L, Zhang F. 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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注PARP抑制剂联合应用抗肿瘤临床前研究进展来源《中国药房》 2022年第33卷第12期作者张成勇，李玥，杨颖，朱日然山东中医药大学附属医院药学部摘要多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）是一类 DNA 损伤修复酶。PARP 抑制剂包括奥拉帕利（AZD2281）、尼拉帕利（MK-4827）、Rucaparib、Veliparib（ABT-888）、Fluzoparib和Talazoparib（BMN-673）等。本文通过检索相关文献，就PARP抑制剂联合应用抗肿瘤的临床前研究进行综述。通过合成致死模式，PARP抑制剂对具有同源重组修复缺陷的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，但对于DNA损伤修复功能完好的肿瘤细胞，PARP抑制剂往往需要与放疗或其他药物联合发挥作用，联合应用的药物包括抗血管生成药物、热休克蛋白90抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶12抑制剂、免疫检查点抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂等。PARP抑制剂的联合应用有望增强抗肿瘤药物的疗效，实现增敏增效和逆转耐药的目标，值得进一步开展深入研究并探索新的联合治疗方案。关键词多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂；药物联用；抗肿瘤；临床前研究_正文_多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）poly-merase，PARP]在细胞 DNA 损伤修复中具有重要作用， 即当细胞 DNA 发生断裂时，PARP 可结合到断裂处，寡集包括组蛋白在内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的腺苷二磷酸核糖聚合酶以及其他 DNA 修复酶，完成受损 DNA的修复[1]。2005年，科学家首次发现了一种可抑制 PARP功能的小分子化合物，并将其命名为PARP抑制剂 [2]。有研究表明，该化合物可与突变的乳腺癌易感基因 BRCA相互影响，从而导致肿瘤细胞死亡，最终首次实现了PARP抑制剂介导的合成致死[2]。作为具有革新意义的新型抗肿瘤药，目前已上市的常用PARP抑制剂包括奥拉帕利（AZD2281）、尼拉帕利（MK-4827）、Rucaparib、Ve-liparib（ABT-888）、Fluzoparib 和 Talazoparib（BMN-673） 等，主要适应证包括乳腺癌、卵巢癌和原发性腹膜癌等，且上述药物针对前列腺癌、胃癌、肺癌的研究也正在进行中[3]。 早期关于PARP抑制剂的研究主要集中在单药治疗领域，但有研究指出，PARP 抑制剂单独使用具有毒性高、易产生耐药等问题，同时其适应证较为狭窄，临床应用受限[4]；PARP抑制剂对具有同源重组修复缺陷的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，但对 DNA 损伤修复功能完好的肿瘤细胞杀伤力弱。2010年以来，PARP抑制剂联合应用受到学界越来越多的关注。为了解PARP抑制剂与放疗或其他药物联合应用抗肿瘤的研究进展，笔者综 述了PARP抑制剂联合应用的临床前研究现状，以期为该药在恶性肿瘤治疗领域中的应用提供参考。1PARP抑制剂联合放疗放疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，其作用靶点正是肿瘤细胞的DNA。大量研究表明，PARP抑制剂联合放疗具有良好的协同抗肿瘤效果。Zhan 等[4] 研究发现，奥拉帕利联合放疗可诱导人食管腺鳞癌细胞的凋亡并抑制细胞的增殖，且这种抑制效果在乏氧状态下更加显著，其相关机制与乏氧状态下细胞同源重组修复（ho-mologous recombination repair，HRR）功能受到抑制以及 重组蛋白A（recombination protein A，Rad51）表达下调有关；在裸鼠移植瘤模型实验中，奥拉帕利联合放疗同样具有协同抗肿瘤作用。Park等[5]在ARID1A基因缺失的人子宫内膜癌细胞中发现，奥拉帕利联合低剂量放疗具有体内外协同抗肿瘤作用。在人肺癌和人胰腺癌细胞中，Hastak 等[6] 联用 PARP 抑制剂 LT626 和放疗后发现， 细胞中γH2AX和P53蛋白的表达上调，磷酸化毛细血管扩张性共济失调突变蛋白激酶（ataxia-telangiectasia mu-tated kinase，ATM）、共济失调性毛细血管扩张和 RAD3 相关蛋白（recombinant ataxia telangiectasia and RAD3 re-lated protein，ATR）的表达增多，提示两者发挥了协同肿瘤作用。Wang等[7] 建立了肺癌和乳腺癌小鼠移植瘤模型，发现相较于单纯放疗，尼拉帕利联合放疗可显著抑制肿瘤细胞的生长。尽管PARP抑制剂联合放疗在恶性肿瘤治疗领域已经取得了一些进展，但目前仍然存在许多问题，主要包括以下几点：（1）PARP抑制剂作为放疗增敏剂的合理剂量范围仍有待确定。已有研究表明，PARP抑制剂结合放疗虽可减少所需的射线剂量，但当前二者的具体结合剂量仍在摸索中[3] 。（2）在临床实际中，是同时进行PARP 抑制剂+放疗联合治疗还是经PARP抑制剂治疗后再进行放疗仍有待确定[4] 。（3）迄今为止，用于PARP抑制剂联合放疗疗效判定的生物标志物仍需继续挖掘[5]。内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷公众号。2PARP抑制剂联合其他药物2.1 PARP抑制剂联合抗血管生成药物血管生成是肿瘤生长和转移过程中不可或缺的环 节，抑制肿瘤血管生成，可使肿瘤细胞因缺乏生存所必需的氧气和营养而死亡，而缺氧本身与 HRR 功能受损有关[8-10]。在使用 PARP 抑制剂治疗的过程中，由于 BRCA基因的继发性突变使得HRR功能恢复，从而导致肿瘤细胞对PARP抑制剂耐药[11]。在BRCA2基因继发性耐药突变的背景下，血管内皮生长因子受体3抑制剂可通过抑制BRCA1和BRCA2基因的表达来恢复人卵巢癌细胞对PARP抑制剂的敏感性[11]。在鼠类肉瘤病毒癌基因突变型结直肠癌动物模型中，研究者通过联合使用血管内皮生长因子抑制剂贝伐珠单抗与奥拉帕利进行干预后发现，联合干预能够有效地抑制肿瘤细胞生长，其作用机制与贝伐珠单抗致肿瘤微环境内乏氧水平升高和HRR功能受损有关[12]。Kaplan等[13]在无BRCA基因缺失的人乳腺癌和人卵巢癌细胞中发现，一方面，抗血管生成药物西地尼布可诱导缺氧，从而抑制 BRCA 和 Rad51 的表达；另一方面，西地尼布可直接作用于 HRR 而不依赖肿瘤细胞的乏氧状态，这种直接作用可能与抑制血小板源性生长因子受体、激活蛋白磷酸酶2A、抑制 E2F4转录因子介导的BRCA和Rad51表达有关。2.2 PARP抑制剂联合热休克蛋白90抑制剂热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）是一种腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依赖性分子，可以与BRCA1、BRCA2基因和细胞周期检查点激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）、Rad51、减数分裂重组11 蛋白等相互作用，进而影响细胞 DNA 损伤的修复和细胞周期的调节[14-15]。可见，HSP90 抑制剂可通过影响 HRR和非同源末端连接功能来抑制DNA双链的损伤修复，联合PARP抑制剂可对恶性肿瘤细胞产生合成致死作用[14]。Lin等[16] 合成了一系列可抑制HSP90的新化合物，发现这些新化合物可抑制人乳腺癌和人胰腺癌细胞的增殖，且联合PARP 抑制剂具有更强的细胞毒性作用。Gabbasov 等[17] 发现，HSP90 抑制剂 Ganetespib 可增强非 BRCA基因突变的人卵巢癌细胞对 PARP 抑制剂 Talazoparib的敏感性，且Ganetespib对DNA修复和细胞周期检查点相关蛋白表达的抑制作用呈剂量和时间依赖性。2.3 PARP抑制剂联合磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕毒素 靶蛋白（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mam-malian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）是细胞内的重要信号通路之一，可参与细胞周期调控、增殖、凋亡和糖原代谢等[18]。据报道，在人子宫内膜癌细胞中，抑制PI3K的表达可下调BRCA1、BRCA2基因的表达，诱导肿瘤细胞 HRR 功能受损，从而增强子宫内膜癌细胞对 PARP 抑制剂奥拉帕利的敏感性[19]。研究表明，联合使用PI3K抑制剂BKM120和奥拉帕利能够显著抑制人胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡和DNA损伤，其作用可能与胃癌细胞中缺乏的染色质重塑基因 ARID1A 有关[20]。Bian 等[21]发现，PTEN 基因缺失的子宫内膜癌细胞对奥拉帕利并不敏感，而当奥拉帕利与BKM120联用后，前者对肿瘤细胞的敏感性有所增加，其相关机制为 BKM120 可下调 Rad51 和 BRCA1的表达，抑制 HRR 功能并诱导DNA损伤累积。De等[22] 发现，PI3K与mTOR 双重抑制剂 GDC-0980 可抑制人三阴性乳腺癌细胞 DNA损伤的修复，GDC-0980联合Veliparib、卡铂可抑制裸鼠体内移植瘤的生长，其作用机制与Ki67、CD31、磷酸化的血管内皮生长因子受体表达降低有关。2.4 PARP 抑制剂联合丝裂原活化的细胞外信号调节 蛋白激酶抑制剂丝裂原活化的细胞外信号调节蛋白激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）属于有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路的一部分，对细胞凋亡、细胞周期调控、细胞增殖和迁移等具有重要作用 [23]。Sun 等[24] 研究发现，与单用药相比，PARP 抑制剂与 MEK抑制剂联用对RAS基因突变相关肿瘤具有更强的抑制作用，其作用机制主要包括以下几点：（1）可通过下调 B 细胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的表达来促进细胞凋亡；（2）可抑制HRR功能，从而诱导DNA损伤累积；（3）可抑制 DNA 损伤检查点相关蛋白的表达；（4）可通过诱导缺氧来降低血管密度，从而增强肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性。Ethier等[23] 发现，在人宫颈癌 HeLa 细胞中，PARP 抑制剂 PJ34 联合 MEK 抑制剂 U0126可增强甲基硝基亚硝基胍的细胞毒性作用，其机制可能与抑制MEK/细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）通路诱导的细胞凋亡有关。2.5 PARP抑制剂与ATR、CHK1和WEE1抑制剂联用抑制ATR/CHK1/WEE1信号轴可影响HRR功能，破坏复制叉的稳定性[25]。ATR抑制剂可在DNA修复时干扰BRCA2和Rad51的寡集，重构同源重组缺陷状态，增强DNA损伤类药物对肿瘤细胞的杀伤性[25-26]。Kim等 [27]对PARP抑制剂和铂类双重耐药型人卵巢癌细胞进行研究发现，奥拉帕利联合 ATR 抑制剂 AZD6738 具有协同抗肿瘤作用，且与复制叉堆积、DNA双链损伤和细胞凋亡有关。Southgate等[28]以ATR抑制剂VE-821和奥拉 帕利联合处理人高危神经母细胞瘤，发现两者联合增强 了H2AXS129的表达，抑制了奥拉帕利致Rad51焦点的形成，从而增强了高危神经母细胞瘤对奥拉帕利的敏感性。Burgess 等[29]对 PARP 抑制剂敏感型和耐药型胚系 BRCA1基因突变人卵巢癌细胞进行研究发现，奥拉帕利联合VE-821对两种人卵巢癌细胞均表现出协同抗肿瘤作用，其协同评分高于奥拉帕利与 CHK1 抑制剂 MK- 8776 联用。在 ATM 缺失型人肺癌细胞中，奥拉帕利单用对细胞活性并无明显影响，而联用 VE-821 会产生细胞毒性作用，这种作用与两者将细胞周期阻滞在G2期有关[30]。在人黑色素瘤细胞中，奥拉帕利联合ATR抑制剂 AZD6738 同样具有协同抗肿瘤效果[31]。Schoonen 等[32] 在基于BRCA2基因缺失的人宫颈癌HeLa细胞的研究中 发现，ATR抑制剂可诱导细胞过早地进行有丝分裂，导致染色质桥形成和染色体滞后，从而增强肿瘤细胞对奥拉帕利的敏感性，其协同作用与基因组不稳定性、环状鸟苷一磷酸-腺苷一磷酸合成酶/干扰素基因刺激因子 （cyclic GMP-AMP synthase/stimulator of interferon genes，cGAS/STING）介导的炎症信号通路有关。在 BRCA 突变型和野生型人卵巢癌细胞中，抑制 ATR下游效应蛋白CHK1的表达已被证实可协同PARP 抑制剂发挥抗肿瘤作用[33-34]。Kim等[33] 以人源性卵巢癌异种移植瘤为模型进行研究，发现PARP抑制剂单用可抑制肿瘤细胞增殖，但最大可耐受剂量却不能抑制裸鼠移植瘤的生长，其原因可能与PARP抑制剂通过上调磷酸化 ATR 和 CHK1 的表达来破坏基因组稳定性有关。该研究分别将 ATR 抑制剂、CHK1 抑制剂与 PARP 抑制剂联合使用，发现联用可将肿瘤细胞从G2期释放出来， 使其提前进入有丝分裂进而导致染色体畸变和细胞凋亡增加，从而使肿瘤细胞的生长受到明显抑制。Brill等 [34] 以奥拉帕利和CHK1抑制剂Prexasertib联合处理人高级别浆液性卵巢癌细胞系，发现与对照组或单药组相比，两药联用具有更强的抑癌活性，其作用可能与Prexa-sertib可消除奥拉帕利所导致的 Rad51 表达上调有关。Smith等[35] 通过对BRCA2突变型V-C8细胞和BRCA2野生型V-C8.B2细胞进行研究发现，V-C8细胞对PARP抑制剂 Rucaparib 具有更强的敏感性；而对于本不敏感的 V-C8.B2 细胞，联用 CHK1 抑制剂 PF-477736 可增强 V-C8.B2细胞对Rucaparib的敏感性。Jin 等[36] 对人三阴性乳腺癌细胞进行研究发现， WEE1抑制剂AZD1775联合ATR抑制剂AZD6738具有更强的抗肿瘤活性，其协同作用机制与 DNA 损伤累积有关；此外，WEE1 与 ATR 的双重抑制使 Rad51 表达下调，增强了肿瘤细胞对顺铂和PARP抑制剂的敏感性。2.6 PARP抑制剂联合溴结构域和超末端结构域/溴结构域蛋白4抑制剂溴结构域和超末端结构域（bromodomain and extra-terminal，BET）蛋白家族对细胞生长和细胞周期具有重要的调控作用，溴结构域蛋白 4（bromodomain-contain-ing protein 4，BRD4）属于BET蛋白家族成员之一，可通过调控MYC、CDK、BCL2等下游基因来影响肿瘤的发生与发展[37]。Miller 等[38] 研究发现，BET 抑制剂 JQ-1 可诱导DNA损伤标志物γH2AX的高表达，同时抑制DNA损伤修复蛋白Ku80和Rad51的表达；与单用药相比，JQ-1 联合PARP抑制剂奥拉帕利对胰腺癌小鼠移植瘤表现出更强的抑癌作用，其作用与Ku80、Rad51表达受到抑制有关，而 Ku80、Rad51 的表达受 BRD4、BRD2 调控。在去势耐药性前列腺癌动物模型中，BET 抑制剂联合 PARP 抑制剂也表现出了协同抗肿瘤作用[39]。在 BRCA 野生型人卵巢癌细胞中，BET抑制剂JQ-1可以下调G2/ M期细胞周期检查点调节因子WEE1和DNA损伤反应因子TOPBP1的表达；当JQ-1与奥拉帕利联用时，可使肿瘤细胞在 DNA 损伤累积的情况下进入有丝分裂，从而导致有丝分裂障碍和细胞死亡，该协同作用效果在动物实验中得到了验证[40]。在小细胞肺癌动物模型中， PARP抑制剂联合BET抑制剂可通过靶向MYC/PARP1 轴发挥抗癌作用[41]。2.7 PARP抑制剂联合细胞周期蛋白依赖性激酶12抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶 12（cyclin-dependent ki-nase 12，CDK12）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，可调节基因转录、DNA 损伤反应以及细胞增殖和分化等 [42]。尽管PARP抑制剂对于HRR功能缺失的肿瘤细胞是有效的，但该功能恢复所导致的获得性耐药极大限制了PARP 抑制剂的使用[43]。Johnson 等[43] 发现，在 BRCA 突变型人三阴性乳腺癌细胞和人源异种移植瘤中，CDK12 抑制剂Dinaciclib可呈时间和剂量依赖性地抑制BRCA1 和Rad51的表达，与Veliparib联用后可协同抑制乳腺癌细胞和裸鼠移植瘤的生长。Joshi等[44] 发现，在卵巢癌细胞中，敲除CDK12基因可以抑制BRCA1基因的表达，导致HRR功能丧失，从而增强卵巢癌细胞对Veliparib和顺铂的敏感性。2.8 PARP抑制剂联合免疫检查点抑制剂肿瘤的发生发展与人体免疫功能失常密切相关，免疫检查点在正常情况下可抑制T细胞功能，但在肿瘤组织中却可被利用而形成免疫逃逸[45]。目前，研究者发现的免疫检查点包括程序性死亡蛋白-1（programmed-death protein-1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4和程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1， PD-L1）[45]。通过免疫检查点抑制剂可抑制上述分子的活性，激活T细胞对肿瘤的免疫应答反应，从而发挥抗肿瘤作用。在人结肠癌、人肺鳞状细胞癌、人乳腺癌、人肉瘤和人膀胱癌细胞中，Wang等[46] 发现，尼拉帕利联合 PD-1抑制剂可增加免疫细胞的浸润并延缓肿瘤细胞的生长，这种联用效果与BRCA的基因分型无关。Ding等 [47] 发现，在BRCA1缺失卵巢癌小鼠中，奥拉帕利可触发其局部和全身的抗肿瘤免疫反应，激活STING通路并上调PD-L1的表达；而当奥拉帕利与PD-1抑制剂联用时， 这种免疫触发效果进一步增强，使裸鼠体内肿瘤细胞的生长受到更强的抑制，小鼠生存期得以明显延长。2.9 PARP抑制剂联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases，HDAC）在 DNA双链损伤修复中具有重要作用[48]。Wiegmans等[48] 分别研究了3种HDAC抑制剂SAHA、VPA、ROMI对人三阴性乳腺癌细胞的抑制作用，发现SAHA和ROMI可抑制细胞的 HRR 功能，使 Rad51、BRAD1和 FANCD2 基 因的表达显著下调，从而与PARP抑制剂Veliparib产生合成致死作用。在人卵巢癌细胞中，奥拉帕利联合 HDAC抑制剂SAHA可通过靶向HRR功能来发挥协同抑癌作用[49]。Yin 等[50] 以人前列腺癌细胞为对象，发现 Veliparib协同SAHA可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和 DNA 损伤，而对正常前列腺上皮细胞 RWPE-1 没有影响，其协同作用可能与靶向泛素样含 PHD 和环指域 1 （ubiquitin-like PHD and ring finger domains 1，UHRF1）/ BRCA1 蛋白复合物、抑制 BRCA1 的表达有关；此外，Rad51基因沉默可增强前列腺癌细胞对SAHA和奥拉帕利联用的敏感性。Liang等[51] 以人肝癌细胞为研究对象，发现PARP抑制剂PJ34联合SAHA可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤的生长。Baldan等[52] 对人间变性甲状腺癌进行的研究结果显示，SAHA与PJ34联 用可发挥协同抗肿瘤作用，其协同作用可能与上调TSHR基因的表达有关。Hegde等[53] 研究了新型PARP抑制剂P10联合SAHA对白血病细胞的作用，发现P10可协同SAHA诱发内源性凋亡途径，引起DNA损伤和S期细胞周期阻滞，从而发挥协同抗癌作用。2.10 PARP抑制剂与中药单体联用近年来，天然产物由于毒性小、安全性高等优势，在治疗恶性肿瘤领域受到了越来越多学者的关注。Hou 等[54] 以人卵巢癌细胞为研究对象，发现小檗碱可诱导 DNA氧化损伤并抑制HRR功能，与尼拉帕利联用可发挥协同抗肿瘤作用，这种作用与小檗碱抑制Rad51表达和激活PARP，从而使卵巢癌细胞对尼拉帕利更加敏感有关。Wang 等[55] 在研究土木香内酯（alantolactone， ATL）与PARP抑制剂的协同抗肿瘤作用时发现，人前列腺癌PC-3细胞会对非细胞毒性剂量（10 μmol/L）的ATL 产生耐药性，这可能与激活DNA损伤修复蛋白PARP的表达有关；而非细胞毒性剂量的ATL联合非细胞毒性剂量（10 μmol/L）的奥拉帕利可对肿瘤细胞产生致死作用，对包括人前列腺癌、人肺癌和人结直肠癌等多种肿瘤细胞均展现出广谱抗癌作用，这种作用与ATL诱导的 DNA 氧化损伤和 PARP 抑制剂形成的 PARP 捕获直接相关。除上述研究外，在人结肠癌细胞体内外实验中， PARP 抑制剂联合糖原合成酶激酶 3β（glycogen syn-thase kinase-3β，GSK3β）抑制剂具有明显的协同作用，GSK3β抑制剂可通过下调BRCA1的表达而抑制HRR功能，使结肠癌细胞对PARP抑制剂更加敏感[56]。3结语PARP 抑制剂对于 HRR 功能缺陷的肿瘤细胞具有独特的细胞毒性作用。然而，并不是所有 HRR 功能缺陷的肿瘤细胞均对PARP抑制剂敏感，部分肿瘤细胞还会产生获得性耐药[57]。可见，寻求具有增敏增效或克服耐药效果的PARP抑制剂与其他药物的联合干预方案显得尤为重要。近年来，越来越多的研究聚焦在PARP抑制剂与放疗或者化疗等药物的联合治疗上，研究结果显示，联合干预既可以减轻药物的不良反应，又能提高药物的干预效果。随着研究的不断深入，PARP抑制剂联合其他药物所产生的诸多问题和困惑也有待进一步探索与理清。因此，笔者认为后续研究方向可从以下几个方面展开：（1）关于药物长期使用的安全性问题，尽管 PARP抑制剂的主要作用基础为肿瘤细胞DNA损伤，但在长期使用的情况下，药物是否会对人体正常组织和功能产生影响、其安全性能否得到保障还有待检验。（2）关于PARP抑制剂联合治疗的使用剂量问题，一方面需要确定化疗药物的适宜剂量，确保患者在可耐受的情况下获得较好的疗效；另一方面，作为放化疗增敏剂的PARP 抑制剂使用剂量也需要慎重考察。（3）关于PARP抑制剂治疗的耐药性问题，包括 HRR 相关基因的二次突变、HRR与非同源末端连接的失衡以及复制叉的保护作用等[57-59]。通过上述联合用药研究结果来看，PARP 抑制剂与放疗或其他药物的结合或许可以克服这种局限。通过相关的临床试验，比如定期进行液体活检取样等， 及时发现耐药机制并优化靶向药物组合依然是十分必要的[59]。相信随着研究的不断深入，会有更多安全且有效的PARP抑制剂联合干预方案得以应用，从而使更多的患者获益。参考文献详见《中国药房》 2022年第33卷第12期学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读