HTN3

引言 在我们与病原体持续数百万年的军备竞赛中，我们可能始终握着一张从未察觉的王牌。3月5日《Nature》杂志的研究报道“Cell-autonomous innate immunity by proteasome-derived defence peptides”，揭示：人体细胞内默默运转的"蛋白质碎纸机"——蛋白酶体（proteasome），竟是一个隐藏的抗生素制造工厂！这项突破性发现，不仅改写了免疫学教科书，更可能为全球抗生素耐药危机带来终极解决方案。 传统认知中，蛋白酶体仅仅是分解废旧蛋白质的"回收站"，其产物主要用于抗原呈递。但研究人员通过人工智能分析3400万个人类蛋白质碎片，发现其中270,872个片段具有抗菌潜力——这相当于每个细胞都携带了一本"抗生素配方大全"。更惊人的是，当细菌入侵时，这些细胞器会立即启动"战时模式"：通过重组结构产生强效杀菌肽段，其杀伤效率堪比临床抗生素。动物实验显示，合成肽段能让致命感染的存活率提升3.6倍，且细菌极难对其产生耐药性。 这项发现解开了困扰学界30年的谜题：为何免疫缺陷患者仍能抵抗部分感染？答案就藏在每天被我们分解的200克蛋白质中——其中2.4克悄然转化为天然抗生素。当全球因耐药菌每年死亡70万人之际，这项研究不仅揭示了生命最精妙的防御智慧，更为开发永不失效的物理抗菌剂指明方向。你体内流淌的，或许正是破解后抗生素时代的终极密码。 碎纸机变身武器库：蛋白酶体的双重身份大揭秘 在细胞深处，直径仅11纳米的蛋白酶体（proteasome）如同精密运转的碎纸机，每天分解着数以万计的蛋白质。过去三十年，科学界一直认为它的核心使命就是为MHC-I类分子递送抗原片段，启动T细胞免疫应答。但这项研究彻底颠覆了传统认知——这些被"粉碎"的蛋白质碎片中，竟隐藏着对抗细菌的致命武器。 研究团队通过计算机模拟人类蛋白质组的蛋白酶体切割位点，发现了一个惊人的数字：人类基因组中92%的基因都能产生具有阳离子特性的防御肽（proteasome-derived defence peptides, PDDPs）。这些平均长度15-30个氨基酸的分子碎片，就像自然界最精妙的分子剪刀，能精准破坏细菌细胞膜。 更令人震撼的是，每个蛋白酶体每分钟可产生数百万个肽段。在正常生理状态下，约1.2%的降解产物（即34亿个潜在肽段中的412万个）具有抗菌活性。这相当于每个细胞都装备着微型抗生素生产线，持续制造广谱抗菌武器。 从实验室到活体实验：合成肽的杀菌威力 为了验证理论预测，研究人员从5万多个蛋白酶体降解肽段中筛选出10个高评分候选分子。其中PPP1CB蛋白来源的肽段（序列：GRKRKQLVKRAKAKTRNE）展现出惊人效果： 在体外实验中： 对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的最低杀菌浓度（MBC）仅8μg/ml 与临床常用抗生素托布霉素（tobramycin）联用时，杀菌效果提升3.2倍 30分钟内可使90%的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）膜破裂 动物实验结果更令人振奋： 肺炎模型小鼠静脉注射5mg/kg剂量，肺组织细菌载量降低4个数量级（P<0.0001） 败血症模型中，治疗组存活率从20%提升至73%（P<0.0001） 病理切片显示，肽段治疗显著减少多器官炎症浸润（损伤评分下降67%） 这些合成肽不仅对革兰氏阳性/阴性菌有效，更关键的是其作用机制——通过阳离子与细菌膜磷脂结合形成孔洞，这种物理破坏方式使细菌难以产生耐药性。透射电镜图像清晰显示，处理后的细菌呈现特征性膜破裂和胞质外溢。 细胞的自卫反击战：感染如何激活隐藏武器 当沙门氏菌（Salmonella enterica）入侵细胞时，一场精妙的分子改造随即展开。研究人员通过质谱分析发现： 感染1小时后，蛋白酶体β2亚基的胰蛋白酶样（tryptic-like）活性提升74% 带正电荷的C端肽段（赖氨酸/精氨酸）比例从17%激增至35% 同时，调控亚基PSME3的结合量增加3.8倍（P=0.0012） 这种"战时改造"使抗菌肽产量翻倍。通过基因敲除实验证实，PSME3缺失细胞对细菌感染的抵抗力下降81%（P=0.0006）。这种快速响应机制独立于NF-κB通路，形成了先于适应性免疫的"细胞自主防御系统"。 人体内的"变形金刚"：蛋白酶体的智能切换 正常状态下，蛋白酶体主要产生疏水性肽段用于抗原呈递。但在病原体入侵时，它会像变形金刚般重组结构： PSME3调控帽结合，打开20S核心颗粒的α环 β2催化口袋构象改变，增强对碱性残基的切割偏好 生成肽段的平均净电荷从+1.3升至+3.8 这种智能切换在进化上极为保守。研究发现，即使在没有适应性免疫系统的无脊椎动物中，蛋白酶体同样具备抗菌肽生成功能。这提示我们可能发现了一个比抗体更古老的防御体系。 从垃圾到黄金：蛋白质回收的医学革命 传统观点认为，蛋白质降解是单纯的废物处理。但这项研究揭示了一个精妙的资源循环： 核糖体合成功能蛋白 完成使命后被泛素化标记 蛋白酶体切割产生功能肽段 抗菌肽通过未知通道分泌至胞外 以组蛋白H3为例，其降解产生的histatin3肽段（序列：DSHAKRHHGYKR）在唾液中浓度达0.5-1.2mg/ml，这正是口腔第一道防线的物质基础。类似的，凝血酶抑制剂serpinA1的降解产物被发现具有抗真菌活性。 这种"变废为宝"的机制，使人体每天可回收利用约200克蛋白质，其中约2.4克转化为抗菌肽——相当于每天自主生产数亿剂"天然抗生素"。 破解耐药困局：新一代抗生素的曙光 面对全球每年70万人死于耐药菌的严峻形势，PDDPs展现出独特优势： 广谱性：单个肽段可同时对抗8种ESKAPE病原体 低毒性：治疗浓度下对哺乳细胞膜完整性无影响（PI染色阴性） 抗耐药：物理破膜机制使耐药突变率降低1000倍 协同性：5种肽段联用可使杀菌效果提升8.3倍 研究团队正在建立PDDPs数据库，包含27万种潜在抗菌序列。通过人工智能预测，89%的已知耐药菌存在PDDPs敏感靶点。首款基于PPP1CB肽段的吸入剂未来也将进入临床前试验，主要针对囊性纤维化患者的铜绿假单胞菌感染。 未来已来：改写医学史的生物暗物质 这项发现带来的启示远超预期： 重新定义先天免疫：蛋白酶体从"抗原加工厂"升级为"防御指挥中心" 革新感染治疗：开发不诱导耐药性的物理抗菌剂 破解自身免疫之谜：异常肽段生成可能导致免疫系统误攻 改写进化认知：抗菌防御可能早于抗原呈递出现 该研究发现的不是新分子，而是细胞运转了数十亿年的隐藏程序。这就像在自家后院发现了新大陆，而打开宝库的钥匙一直握在每个人手中。 当抗生素时代面临终结，这项发现为我们点亮了新的希望。或许在不远的将来，激活自身蛋白酶体将成为预防感染的标准疗法，而基于PDDPs的"智能抗生素"将重塑现代医学的版图。这场悄然的生物学革命，正在改写人类对抗病原体的游戏规则。 参考文献 Goldberg, K., Lobov, A., Antonello, P. et al. Cell-autonomous innate immunity by proteasome-derived defence peptides. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-08615-w 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Nature Biotechnology | 活细胞RNA追踪革命：CRISPR新技术首次实现天然RNA单分子实时成像 热文 Nature | "分子剪刀"失控催生癌症"通用抗原" 热文 Nature | 当"保安"变成"内鬼"：GABA能神经元如何滋养致命脑瘤 热文 Nature Biotechnology | 借菌造药：噬菌体巧用大肠杆菌打造活体药物车间 热文 Nature | 当癌细胞开始“抱团取暖”：破解肿瘤生存的致命同盟

一、原因分析 1.包材影响 注射剂的pH值升高可能与包装材料有关，特别是安瓿等玻璃容器。某些包材可能会释放OH-离子，导致成品中OH-浓度增加，从而引起pH值升高。不同厂家的安瓿对pH的影响存在差异，可以通过在安瓿中灌入注射用水并灭菌，观察灭菌前后pH值的变化来进行初步筛选。 注射剂中可能影响pH值的包材成分主要包括以下几类： l玻璃包装容器中的无机盐：玻璃包装容器中常见的无机盐成分，如Si、Na、K、Li、Al、Ba、Ca、Mg、B、Fe、Zn、Mn、Cd、Ti、Co、Cr、Pb、As、Sb等，这些离子在特定条件下可能会迁移进入注射液中，从而影响其pH值。 l聚丙烯和聚环烯烃（COP）注射器：研究表明，COP注射器在不同pH值下表现不同，尤其在高pH值（如pH 12）时，可能会显著增加某些物质的浓度，这可能会影响注射液的pH值。 l硅油（PDMS）：硅油常用于注射器的塞子和主体，以实现塞子沿主体平滑滑动。虽然硅油的毒性较低，但在某些pH条件下，其浓度变化可能对注射液的pH产生影响。 l橡胶塞：橡胶塞也可能影响药液的pH值，尤其是在制备过程或储存过程中，可能会导致药品pH的变化。 2.制剂工艺的影响 l灭菌过程：高压灭菌时的高温可能导致玻璃容器中的弱碱性成分分解释放到注射用水中，从而引起pH值升高。 这一现象在多项研究中得到了证实。例如，一项研究指出，在高压灭菌时，安瓿玻璃中的弱碱性成分会分解，导致灭菌注射用水的pH值升高。此外，青霉素瓶中注射用水的生产过程中也观察到类似的问题，即玻璃瓶内壁的氧化物与注射用水反应，导致pH值和电导率上升。 l缓冲剂的选择和使用：在注射剂中使用的缓冲剂，如碳酸氢钠等，可能在制备或储存过程中与空气中的二氧化碳反应，导致pH值升高。 碳酸氢钠在潮湿空气中会缓慢分解，释放出二氧化碳，但这通常不会导致溶液pH值的显著升高，反而可能因为碳酸氢钠的减少而略微降低pH值（尽管这种变化可能很小）。 然而，在实际应用中，更常见的是碳酸氢钠溶液吸收空气中的二氧化碳，导致碳酸氢根离子（HCO₃⁻）浓度的增加，从而可能使溶液的pH值升高。这是因为二氧化碳溶于水形成碳酸（H₂CO₃），碳酸进一步电离产生氢离子（H⁺）和碳酸氢根离子（HCO₃⁻），但在碳酸氢钠溶液中，氢离子会被碳酸氢根离子中和，形成碳酸根离子（尽管这个过程中的电离和中和反应是复杂的，但总体上可以理解为碳酸氢钠溶液吸收了二氧化碳后，其碱性增强，pH值升高）。 3.溶媒和附加剂 注射剂中的溶媒和附加剂也可能影响pH值。例如，使用某些缓冲溶液或pH调节剂（如盐酸、氢氧化钠等）时，如果添加不当，可能会导致pH值升高。 在注射剂制备中，溶媒和附加剂的选择对药物的pH值有显著影响。以下几种溶媒和附加剂最常导致pH值升高： ① 葡萄糖注射液：葡萄糖注射液的pH值通常在3.2到6.5之间，虽然其酸性范围较广，但某些情况下仍可能导致pH值升高。 ② 氯化钠注射液：0.9%氯化钠注射液的pH值范围为4.5到7.0，属于中性偏碱性，因此在某些情况下可能使pH值升高。 ③ 碳酸氢钠：作为pH调节剂，碳酸氢钠常用于提高溶液的pH值，以增加药物的稳定性和溶解度。 ④ 氢氧化钠：同样作为pH调节剂，氢氧化钠可以显著提高溶液的pH值，常用于需要碱性环境的药物制备。 ⑤ 表面活性剂：如聚山梨酯类（吐温类）、泊洛沙姆（普朗尼克）等，虽然主要用于增溶、润湿和乳化，但在某些配方中也可能间接影响pH值。 ⑥ 抗氧剂：例如硫代硫酸钠，这种碱性抗氧剂在调节pH值方面也有一定作用。 4.环境因素 环境中的水分渗透到注射剂中，也可能导致pH值的变化。例如，胶塞在干燥后仍可能含有残余水分，这些水分随时间推移可能会进入冻干块中，从而影响pH值。 5.药物配伍 注射剂与其他药物配伍时，由于pH值的差异，可能会引起药物的溶解度变化、化学稳定性降低，甚至产生沉淀。二、解决办法 1.选择合适的包材 在生产过程中，应选择对pH值影响较小的包材，并定期检测包材对pH值的影响，以确保成品的pH值稳定。 选择对pH值影响较小的注射剂包材需要考虑以下几个方面： 根据国家食品药品监督管理局《关于加强药用玻璃包装注射剂药品监督管理的通知》的规定，生物制品、偏酸偏碱及对pH敏感的注射剂由于风险较高，包材选择时应采用双1级药用玻璃或其他适宜的包材。为规范和指导化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究工作，保障试验研究的质量，国家食品药品监督管理局与2015年7月制定发布了《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》，旨在为注射剂药品更加合理地选择药用玻璃包材及评价药用玻璃包材的稳定性给出具有实际操作意义的指导性意见。这种玻璃具有较好的化学稳定性和耐水性，能够减少与药品成分的相互作用，从而保持药品的pH值稳定。 对于一些特殊药品，如喹诺酮类注射液，由于其含有卤素元素，对玻璃的要求较高。若处理不当，玻璃中的元素会迁移到药液中，导致pH值升高。因此，可以在玻璃内壁进行覆膜处理，以降低玻璃表面的碱度，减少药液与包材的相互作用。 在选择包材时，应进行充分的相容性研究，确保所选包材不会与药品发生化学反应，影响药品质量。例如，《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》提供了相关的研究方法和标准。 2.对包材进行预处理 在灭菌前对玻璃容器进行预处理，如煮沸或浸泡在特定的溶液中，以去除或减少其中的弱碱性成分，是一种常见的实验室操作步骤。这种预处理的主要目的是去除玻璃器面的皿表游离碱性物质，这些物质可能会影响实验结果或灭菌效果。 根据多项证据，新购入的玻璃器皿通常含有游离碱性物质，因此需要进行预处理。例如，可以将新购的玻璃器皿浸泡在2%的盐酸溶液中数小时，以中和这些游离碱性物质。之后，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗多次，以确保没有残留的酸性物质。 此外，对于反复使用的玻璃器皿，如平皿、试管等，在高压灭菌前也需要进行类似的预处理步骤。例如，可以先用肥皂水煮沸，再用蒸馏水冲洗干净。这一步骤有助于去除器皿表面的油脂和其他有机物，从而提高灭菌效果。 煮沸法也是一种常用的预处理方法，尤其适用于不耐高温高压的玻璃器皿。煮沸可以有效地杀死大部分细菌和病毒，但需要注意的是，玻璃器皿在煮沸过程中应完全浸没在水中，并逐渐加热以避免因骤热而导致玻璃器皿破裂。 在进行灭菌之前对玻璃容器进行适当的预处理是确保实验结果准确性和灭菌效果的重步骤要。通过使用酸性溶液浸泡和煮沸等方法，可以有效去除玻璃器皿表面的杂质和游离碱性物质，为后续的灭菌操作打下良好的基础。 3.优化高压灭菌的条件 高温可能会对热敏感材料造成损害。因此，可以尝试将灭菌温度降低至接近121°C，这样既能保证有效的灭菌效果，又能减少对玻璃容器中弱碱性成分的热分解风险。 对于一些热敏感的材料，可以考虑使用过滤灭菌或其他非热灭菌方法，以避免高温对材料的破坏。 4.为了防止碳酸氢钠等缓冲剂在制备或储存过程中与空气中的二氧化碳反应导致pH值升高，可以采取以下措施： ① 密封储存：将注射剂密封储存在干燥、阴凉、避光的环境中，以减少与空气中二氧化碳的接触。 ② 使用惰性气体：在制备过程中，可以使用惰性气体（如氮气）对注射剂进行充气，以排除空气中的二氧化碳。 ③ 控制湿度和温度：保持适宜的湿度和温度条件，以减少碳酸氢钠的分解和与二氧化碳的反应。 ④ 选择合适的缓冲剂：根据药物的性质和稳定性要求，选择合适的缓冲剂类型和浓度，以确保注射剂的pH值在适宜的范围内。 5.优化溶媒和附加剂的选择 在制备注射剂时，应选择合适的溶媒和附加剂，并严格控制其用量。例如，使用磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等来调节pH值，同时避免使用可能导致pH值升高的附加剂。 在注射剂制备过程中，如何有效避免因溶媒和附加剂使用不当而导致的pH值异常，从以下几点进行考虑： ① 选择合适的溶媒：根据药物的性质选择适宜的溶媒是关键。例如，青霉素的稳定pH为6.0-6.8，因此不宜用含葡萄糖的输液做溶媒，而应使用生理盐水（pH 4.5-7.0）。奥美拉唑则需要专用溶媒以保持其稳定性。 ② 严格遵循药品说明书：药品说明书通常会明确指出推荐使用的溶媒类型及其用量。例如，某些抗菌药物只能用盐水或糖水配制，因为这些溶媒的pH值与药物本身的pH相近，有助于保持药物的稳定性。 ③ 注意溶媒的pH范围：不同溶媒的pH范围可能有所不同。例如，《中华人民共和国药典》规定葡萄糖注射液的pH范围为3.2～6.5，而0.9%氯化钠注射液的pH范围为4.5～7.0。制药企业在生产时通常会控制在特定范围内，如葡萄糖注射液通常控制在4左右，氯化钠注射液通常控制在6左右。 ④ 监测和调整pH值：在制备过程中，可以通过加入碳酸氢钠等调节剂来调节溶液的pH值，以确保其在适宜范围内。例如，奥美拉唑粉针的配制溶媒为酸性(pH4.5)，而重组溶液的pH在8.8-9.2时最稳定。 ⑤ 考虑患者病情和特殊需求：对于糖尿病患者或心衰、肾功能不全等需要水钠限制的患者，应优先选择葡萄糖注射液作为溶媒，并控制氯化钠注射液的摄入量和输液速度。 ⑥ 避免使用非专用溶媒：非专用溶媒可能导致溶液pH值偏离正常范围，从而增加不良反应的风险。例如，右雷佐生使用非专用溶媒溶解后，其配伍液的pH值会显著降低至3.1左右，而使用专用溶媒溶解后，pH值可保持在4.7左右。 6.控制环境条件 在生产过程中，应尽量减少环境水分对注射剂的影响，例如通过改善生产环境的湿度控制和定期检查设备密封性。 要有效减少注射剂中胶塞的残余水分，可以采取以下几种措施： ① 高温烘干：将胶塞在105°C至120°C的温度下进行高温烘干2-4小时，这不仅能够去除胶塞表面的水分，还能去除大部分内部的结晶水，从而降低水分迁移的可能性。 ② 氮气充填：在胶塞烘干后，充填氮气并压塞，这样可以防止瓶中高真空将胶塞中的水分吸进瓶中，从而避免水分增加。 ③ 清洗和灭菌：采用全自动湿法气冲胶塞清洗机对胶塞进行批量清洗，并通过目测观察确认清洗后的胶塞表面无明显水滴，从而确保其含水量符合要求。此外，清洗后的胶塞需要进行灭菌和干燥处理，以进一步降低水分含量。 ④ 真空干燥和热空气干燥：蒸汽灭菌后的胶塞可以通过真空干燥8小时或在110℃的循环热空气中干燥8小时来降低其含水量。研究表明，经过真空干燥和热空气干燥处理的胶塞在存储过程中水分增长较慢。 ⑤ 选择合适的胶塞材料和配方：不同配方的胶塞其残留水分含量不同，选择合适的胶塞材料和配方可以有效减少水分迁移。例如，丁基橡胶塞（无氯化）的残留水分含量较低。 ⑥ 控制储存条件：在储存过程中，应尽量控制温度和湿度，以减缓水分的吸收和迁移。例如，在较低温度（如5℃）下储存可以显著延长水分达到平衡状态的时间。 7.合理配伍 在注射剂与其他药物配伍使用时，应仔细考虑药物间的pH值差异，避免配伍不当导致的pH变化和药物降解。三、小结 在注射剂的研发过程中，pH值的变化是一个关键因素，因为它直接影响药物的稳定性、溶解度以及临床应用的安全性和有效性。本文作者结合文献报道和自身经历，从注射剂研发过程中pH升高原因及解决办法两大方面进行了探讨，旨在为相关研究人员和生产人员提供思路。在注射剂的pH研究和生产过程中，研究人员和生产人员需要考虑多个方面以确保产品的质量和安全性。本文不足之处，还望广大同行批评指正！ 参考文献 1.Karin Larmené-Beld, Wijnsma, R. , Kuiper, A. , Berkel, S. V. , & Frijlink, H. . (2021). Science- and risk-based strategy to qualify prefillable autoclavable syringes as primary packaging material. European Journal of Hospital Pharmacy, ejhpharm-2020-002333. 2.高玲, 何海涛, 刘文学, 郑科, 王强, & 蒋德席. (2021). 稳定小容量玻璃容器装液体制剂的pH值和/或电导率的方法. CN202010548647.3. 3.张亚兰,陈艳,石可欣,等.注射剂一致性评价关键技术要点[J].流程工业, 2020(4):5. 4.《药用玻璃包装容器影响药品质量的相关问题浅析》 5.《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》 ------------THE END------------

MALDI-MS和MALDI-MSI，但看着两个名词是不是有点傻傻分不清楚？ 线下课程中众多医药机构以及其中的学员今年都在考虑转型，或者是学习一些前沿的新知识！ 目前行业的增长热点主要集中在中药和生物药方向，中药学方向的基源鉴定也成为了大热门，而生物药这边对蛋白质、肽类物质的研究也“跑”的飞快！而在这些领域中MALDI-MS便成为了质谱鉴定的一种有效手段，应周边同仁的建议，今天一起来学习一下MALDI-MS和MALDI-MSI最近迅速火热起来的技术。 MALDI熟悉的同学们或许能够立马反应过来，这不是一个陌生的东西，最早可能都能够追溯到1988年！可不就是质谱的一种电离方式嘛！与其同步出现的或许还有这么一个单词DESI。“东拼西凑”MALDI-MSI（基质辅助激光/解吸电离质谱成像）、DESI-MSI（解吸电喷雾电离质谱成像），是不是有点熟悉的感觉了？ MALDI-MS全称Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass, 基质辅助激光解吸电离质谱技术，1988 年Tanaka 等人首次利用含有金属微粒的甘油作为基质对分子量高达2200Da的PEG(聚乙二醇)实现了分子量监测从而开启了MALDI这种软电离技术的大门，其中MALDI它使用激光撞击小分子基质使分析物分子进入气相而不会被碎裂或分解。MALDI其实也可以将其理解成一种离子源，即我们通常意义上所说的ESI离子源(液质)、APCI离子源（液质）、EI离子源（气相法）、CI离子源（气相法）。 ▲图1-MALDI-MS原理示意图（图片源自于网络，侵删） MALDI-MSI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging, 基质辅助激光解吸电离质谱成像技术，其由范德堡大学的Richard Caprioli等在1997年提出，且将MALDI-MSI的技术应用到了生物学组织成像上，并且成功实现大鼠脑垂体中激素肽的成像监测，从而使得MSI技术受到生物学研究人员的广泛关注。 ▲图2-MALDI-MSI的技术原理示意图（图片源自于网络，侵删） 本文主要从如下几个方面来介绍质谱和质谱呈像技术： 1、什么是质谱，质谱如何工作？ 2、MALDI-TOF-MS原理； 3、MALDI-MSI技术原理及展望； 4、质谱仪与其他仪器联用。 一 什么是质谱，质谱是如何工作的？ 我相信深耕分析领域的各位老师们对《质谱学简史》这本书应该多少都有一定的了解，质谱学的发展本身就充满了故事和趣味性！1907年一篇《论正电》论文的出现也标志着MS的诞生。 ▲图3-三重四级杆原理示意图 如今社会的发展，MS在我们日常生活中各个方面均发挥着重要的作用，食品、环境、药物等领域MS起到举足轻重的作用，食品风味成分分析与识别、环境残留物代谢物的定性定量分析、药物基础物质研究及其杂质解析和逆向工程等均依赖气质和液质仪器的精准测定。 我想大家伙或许都跟我一样，最早接触质谱基本都是单四级杆的质谱仪，往后开始逐步使用三重四级杆的仪器，这些都是常见的质量分析仪器。除去这些质量分析仪还有其他哪些种类呢？离子源又有哪些？质量分析仪之后的离子检测器又有哪些类型？等等~ MS是一种化学分析的形式和手段，其核心在于对样品中的分子和原子的m/z（质荷比）进行分离和测量，依据这一原理，质谱很显然也能够有效的对同位素进行合理区分！因此质谱仪不仅用于确切样品组分的定量研究分析，其在未知组分的定性研究及未知成分鉴别中亦是能够发挥出重大的作用。 质谱仪有许多不同的类型，但是它们共有三个共同的特征： 第一：是可以使样品中的原子或分子离子化的方法。质谱仪中使用的电场无法控制中性物质，因此有必要产生离子。有许多不同的方法可以完成此操作，这些方法统称为离子源。 第二：便是组件质量分析仪。有几种不同的方法可以测量离子的m/z比。飞行时间（ToF）、磁区和四极质量分析仪是最常见的分析仪，每种分析仪都有其自身的优点和局限性。 第三：是一种检测或计数特定m/z值离子数的设备。这些设备被称为探测器，它们也有几种不同的形式，最常见的是电子倍增器、法拉第杯、通道加速器和通道板。同样，每种仪器都有其自身的优势和劣势。 三个特征具体如图4中所示，离子源、质量分析器、检测器共同构成质谱部分。 ▲图4-质谱仪系统构成示意图 质谱检测过程中由于质谱系统是处于真空运行的环境中，因此如何让样品产生可以用于测量的离子成为了关键因素。在实际应用过程中用于测试的供试品可以被置于真空条件下，也可处于大气压条件下（大气压质谱技术），并且某些样品可能在引入电离室之前采用其他形式的分离技术。接下来将会对上述质谱仪器的三个关键组成部分进行详细的介绍。 1）质谱常用离子源类型介绍 当前技术条件下任何质谱分析过程都离不开对供试品物质的电离，因此离子源在质谱分析过程中的地位是举足轻重的，为了匹配不同类型的样品，离子源类别也大体分为气相法离子源、解析法离子源和喷雾法离子源。 气相法离子源 ①EI源（Electron Ionization），又称电子电离源 ▲图5-电子冲击离子源示意图（图片源自于R.M.Silverstein研究论文，侵删） ▲图6-电子冲击离子源简化示意图（图片源自于网络，侵删） EI离子源作为气相色谱研究系统中最为常见的一种离子源，其示意图如图5~图6中所示。 分析物分子必须处于气相中，才能在真空环境中与加热的灯丝所产生的高能电子发生有效相互作用。样品分子收到高能电子束的轰击产生多种离子碎片，M+e（10~70eV，高速）生成M·+（分子离子）+2e（低速）。一般为70 eV的电子束，远大于大多数有机化合物的电离电位（7~15 eV），会使相当多的分子离子进一步裂解，产生广义的碎片离子。EI的离子源常被认为是一种较为严苛的离子化方式，通常用作于易挥发小分子量组分的研究过程中。 通常EI源由于其简单的结构和稳定高效的离子化效率而被大规模推广，并且其能够产生大量的离子碎片在解析的过程中亦是能够提供较多的分子结构信息，且由于其稳定的离子束能够表现出更为优良的质谱图重现性，有利于NIST库的建立的检索，最终被广泛科研工作者所接受和使用。 但同样，EI源下不适用于低稳定性或者极小分子量目标物的处理，在强离子束轰击下低稳定的分子往往难以形成分子离子或是形成的分子离子小于28（氮气作为碰撞气时就会出现干扰，岛津为氩气作为碰撞器Ar的m/z为18），从而对检测精度产生影响。通常来说EI源广泛的适用于分子量低于1000的供试品。 ②CI源（Chemical Ionization）又称化学电离源 通常来说化学电离源中会发生离子-分子反应，从而来完成分析物的离子化，其反应气体一般是甲烷、异丁烷、氨等。反应气体以高于分析物的浓度引入CI电离室，与供试品分子间产生碰撞使之电离，其硬件结构同EI离子源相类似，因此一般GC-MS系统的EI和CI离子源可以良好的兼容和切换，仅需调整碰撞气路即可实现。 在此过程中气体与电子的相互作用将产生几个分子离子；随后它们将与过量的碰撞气进一步反应并形成不同的分子离子；然后，这些离子将通过几种不同的机制与分析物分子发生反应，从而形成分析物分子离子。 CI是一种非常柔软的电离技术，不会导致广泛的碎片化，因此其能够提供较强的准分子离子峰信号（M+1、M+2、M-1等），便于分析物分子量的推算，且在应用过程中载气亦是可以直接作为反应气进行离子化反应。但同样，由于分子离子峰强度高，且电离程度较“软”，最终形成的离子碎片总量相较于EI源就会大幅度减少，因此CI源的分析过程不利于未知物的解析，未知组分的解析当下主流依旧是使用EI源所构建的NIST库。 ▲图7-CI源离子-分子反应示意图（图片源自于网络，侵删） ③DART源（Direct Analysis in Real Time）又称实时直接分析源 DART 是一种非表面接触型解析/离子化质谱分析离子源技术。其原理是在大气压条件下，中性或惰性气体（如氮气或氦气）如He、Ar或N2等气体进入DART内部时，通过高压放电针产生辉光放电形成分析物离子体（离子、电子、亚稳态分子、原子等），然后气体通过电极进入陶瓷加热管获得动能，再经过栅网电极除去亚稳态物质与异电荷，最后产生的样品离子进入质谱经放电产生激发态原子，对该激发态原子进行快速加热和电场加速，使其对供试品表面的标志性化合物或待测化合物瞬间离子化，进而进行质谱或串联质谱检测，从而实现样品的实时直接分析（图8）。 ▲图8-DART离子源示意图（图片源自于胡双飞等人论文，侵删） 其工作过程包含了创建等离子体，产生离子，电子和激发态物质；然后，激发态物质与供试品（固体、液体或气体）的相互作用导致分析物分子的电离。因此DART拥有快速、简便、高效的特点。 快速：DART能在几秒钟内分析存在于气体、液体、固体或材料表面的化合物，从而对样品无损耗定性和定量分析。 简便：样品再也无需冗繁的样品处理和制备。对块状样品和形状怪异的固体样本的分析特别有效，再无需关注样本的几何形状。 高效：在多种物体表面的低剂量目标物如：化学药剂、毒品药物、体液(血液、唾液以及尿) 、代谢物、肽、低聚糖等均可以进行实时、无接触检测。 DART无需事先准备样品就可以在环境条件下分析不同形状和大小的材料，但在应用DART离子源时，解析气体温度、栅网电极电压、进样速度、解析气体类型等对离子源检测灵敏度具有重要作用，其中解析气体温度对DART的离子化性能影响最大。在DART离子源中，解析气温度是影响其分析的首要因素，其温度高低可影响解析气原子动能，导致DART的离子转化率受到影响，正负离子模式的选择确定其是否检出。 ④ICP源（Inductively Coupled Plasma）又称电感耦合等离子体源 含有待分析物的制备液体被雾化并使用等离子体转化为气相离子。ICP能够电离几乎所有元素。 解吸法离子源 ①MALDI源（Matrix-assisted laser desorption/ionization）基质辅助激光解吸电离源 将被分析化合物的溶液和某种基质溶液相混合；蒸发掉溶剂，被分析物质与基质形成晶体或半晶体；用一定波长的脉冲式激光进行照射目标基质，从而使得基质分子能有效地吸收激光的能量，并间接地传给样品分子，从而得到电离。在一个微小的区域内，在极短的时间间隔，激光可对靶物提供高的能量，对它们进行极快的加热，可以避免热敏感的化合物加热分解，因此MALDI是主要的“软”电离方法之一，特别适用于分析大分子或不稳定分子。 ②FAB源（Fast atom bombardment）快速原子轰击源 也是一种软电离技术，其应用范围较为广泛。与离子轰击电离相似，原子轰击电离也是利用轰击溅射使样品电离的，所不同的是用于轰击的粒子不是带电离子，而是高速的中性原子。一束加速离子化的原子聚焦在要分析的样品上，喷射并电离目标分析物。其利用的重原子一般为Xe或Ar。 其优点在于在得到较强的分子离子或准分子离子的同时可以产生较多的离子碎片，因此再进行化合物结构分析的过程中能够拥有更丰富的信息获取和匹配。同时，也有一定的不足，因为存在基质混合的要求，因此在测试过程中基质（一般采用甘油）在400质量范围内会存在较多的干扰峰，从而会造成对样品峰识别产生干扰；其次，在非极性化合物方面不占优势，其灵敏度会有所降低；再者，FAB源相较于喷雾法和气相法离子源更容易污染。 FAB可完成连Field Desorption（场解吸）都有困难的高极性、难汽化的化合物的电离。样品多调匀于基质（一般为甘油等）中，基质应具有流动性、低蒸气压、化学惰性、电解质性和好的溶解性。 ③热电离离子源 ▲图9-热电离离子源示意图（图片源自于网络，侵删） 热电离离子源是分析固体样品的常用离子源之一。在样品测试过程中将样品涂覆在高熔点的金属带表面装入离子源，在真空状态下通过调节流过金属带的电流强度使样品加热蒸发，部分中性粒子在蒸发过程中电离形成离子。热电离效率依赖于所用金属带的功函数、金属带的表面温度和分析物质的第一电离电位。通常金属带的功函数越大、表面温度越高、分析物质的第一电离电位越低，热电离源的电离效率就越高。因此具有相对较低电离电位的碱金属、碱土金属和稀土元素均适合使用热电离源进行质谱分析。而一些高电离电位元素，如Cu、Ni、Zn、Mo、Cd、Sb、Pb等过渡元素，在改进涂样技术和使用电离增强剂后，也能得到较好的质谱分析结果。 ④LMIS源（Liquid Metal Ion Source）液态金属离子源 ▲图10-LMIS源——铯源的基本结构示意图（图片源自于网络，侵删） 液态金属场致电离离子源通常使用的金属有镓、铟、铯等低熔点金属，通过施加热量和电场在小点源产生离子，使金属离子轰击固体样品表面产生负的二次离子，多用于氧、硫、碳等非金属元素的分析。LIMS产生的离子束的特点是光斑尺寸最小，亮度最高，特别适合需要高空间分辨率的MS成像。 大气压电离离子源 ①ESI源（Electrospray Ionization）电喷雾电离离子源 ▲图11-ESI源结构示意图（图片源自于网络，侵删） 主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴，最内层是液相色谱流动相，将被分析物分子通过毛细管带入离子源；外层是喷射气，常采用大流量的氮气，使从毛细管喷出的液体高度雾化，在3–5KV的强静电场中形成带有电荷的高度雾状细微液滴。此外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷嘴，其作用是使细微液滴溶剂快速蒸发。在蒸发过程中细微液滴表面电荷密度逐渐增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来，产生离子。单一分子形式的雾态分子可以有几种电荷形态，经历离子分子间碰撞后，产生多重质子化离子，也就是通常观察到的多电荷离子，这是ESI源的最大特点。 即样品先带电再喷雾，从雾化器套管的毛细管端喷出的带电液滴，随着溶剂的不断快速蒸发，液滴迅速变小，表面电荷密度不断增大，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测。由于电荷间的排斥作用，就会排出溶剂分子，得到样品的准分子离子。通常小分子得到带单电荷的准分子离子，而大分子则得到多种多电荷离子。检测质量可提高几十倍。ESI是很软的电离方法，通常无碎片离子峰，只有整体分子的峰，十分有利于生物大分子的质谱测定。 ②APCI源（Atmospheric pressure ion source）大气压化学电离源 ▲图12-APCI源原理示意图（图片源自于中国科学院宁波材料技术与工程研究所，侵删） 其结构与ESI源基本相同，主要部件也是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴，不同之处是APCI喷嘴下游的加热管末端放置了一个针状放电电极（电晕针）。处于多层套管最内层的液相色谱流动相在流经毛细管后进入离子源，被套管外层的氮气流雾化后，经过加热管时被汽化。随后，被雾化的流动相中的溶剂在加热管末端被电晕针电离。这些被电离的溶剂分子与空气中某些弱极性、中性分子电离后产生的H3O+，N2+，O2+和O+等一起充当反应气，与雾化流动相中的被分析物气态分子发生碰撞（碰撞反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等），使被分析物分子离子化，形成离子束，随后经过锥孔被转移至质量分析器中进行分析。 即APCI离子源是由ESI派生出来的API系列源，常压下电晕放电；喷出的液滴先汽化，随后溶剂分子被电离，发生化学电离的过程；要样品汽化，适用于弱极性的小分子化合物(M<1000)。 ③APPI源（Atmospheric Pressure Photo-Ionization)大气压光致电离源 光子电离样品分子，应用于电离能更高的样品分子，对于低极性化合物，有非常高的灵敏度，其适用于弱极性的化合物，如多环芳烃等。 APPI源是一种比较新的电离方法。该技术可用于电离不易被ESI和APCI电离的分析物。APPI的应用范围与APCI相似，但略向非极性化合物倾斜。APPI离子源与APCI离子源非常相似，只是APCI的电晕放电针被光离子灯取代。根据分析物相对于流动相组成的质子亲和性，可获得自由基分子离子（通常用于非极性化合物）或质子化分子离子（通常用于极性化合物）。APPI在药物代谢物分析的应用中具体潜力，但仍需要更多的研究来充分了解影响电离效率的重要参数和因素。此外，APPI还有一个优点，即其受表面活性剂和磷酸缓冲盐的影响很小。 小结： ESI适用于极性、半极性的化合物，能产生多电荷。例如：蛋白质、多肽 APCI适用于热稳定，非极性或半极性的小分子化合物，不产生多电荷。例如：甾体类化合物、氨基甲酸酯类。 APPI适用于非极性的化合物，例如：多芳烃类、米诺地尔、降压定、莫米松等。 2）质谱常用质量分析器简介 样品电离后，必须将离子分离，这会在质量分析器中发生。 ①四级杆分析器： 最常见的质谱分析器之一，其由四根棒状电极，相对两根电极相连从而形成四级场。 ▲图13-四级杆分析器示意图（图片源自于网络，侵删） 因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化，可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。 ②飞行时间分析器（ToF） 离子根据其m/z比率进行分离，该比率基于它们穿过已知长度的飞行管到达检测器所花费的时间长度。 ▲图14-ToF分析器示意图（图片源自于网络，侵删） ▲图15-正交加速反射TOF质谱仪示意图（图片源自于网络，侵删） 具有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪，这样可以统一飞行的起点，依次测量飞行时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生，但只在一特定的时间引入飞行管。新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分析。 ToF分析器简单耐用，无质量范围的限制，且其具备快速取样的条件，能够很好的适用于快速GC-MS分析，对MALDI等方式的大分子量、多肽类的物质具有很好的分析能力。 ③离子阱分析器 类似于四极杆，但电极呈环形，并且通过将不稳定振荡的离子从系统中排放到检测器中，而不是检测稳定振荡的离子，从而分离并检测离子。总体来看离子阱可以看作是四级杆分析器的三维展开形式。 ▲图16-离子阱分析器示意图（图片源自于网络，侵删） 由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压(RF)，通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子，离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。 ④Orbitrap（静电场轨道阱）分析器 Orbitrap是一种拥有超高分辨率的质量分析器，目前属于赛默飞专利独有的高分辨质谱技术。 ▲图17-高分辨质谱Orbitrap结构示意图（图片源自于网络，侵删） 许多其他类型的质量分析器的借用技术。两个电绝缘的环状外部电极与心轴状的中心电极相对，该中心电极周围具有特定质荷比的离子扩散到轨道环中。电极的圆锥形将离子推向阱的最宽部分，然后将外部电极用于电流检测。 ⑤傅里叶变换分析器 ▲图18-傅里叶变换分析器示意图（图片源自于网络，侵删） 在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。其优点为分辨率很高，质荷比可以精确到千分之一道尔顿。 ⑥串联质谱分析器 指涉及不止一种类型的质谱仪以提高特异性或质谱分离能力的混合方法。它们通常被称为MS/MS技术，常见的是三重四级杆质量分析器。 3）质谱常用离子检测器简介 所有MS系统的关键要素是用于将质量分离离子流转换成可测量信号的检测器类型。根据包括动态范围，空间信息保留，噪声和对质量分析仪的适用性在内的因素，使用不同类型的检测器。 常用的探测器包括： ①电子倍增器（EM） 一种灵敏，响应快的检测器系统，它是由光束落在阴极上产生光电子通过级联放大，在光学探测仪中，用于极微弱光强度的检测，可将离子电流放大约104~108倍从而得到可测量的电子电流。 当离子电流<10-15A时需要用二次电子倍增器检测。其原理大致为：由质量分析器引入具有一定能量的离子束，轰击多级Cu-Be电极活性表面时，可发射出大量的二次电子，在加速电压的驱使下依次撞击其他倍增电极片，由于撞击和发射位置不是在同一个点，所以这些二次电子连续地倍增，并将离子流转化为电子流。 ②法拉第杯（FC） 是一种设计成杯状的金属制真空侦测器，主要用于测量带电粒子（如电子或离子）的入射强度。它通过捕捉进入其中的带电粒子并产生电流来实现这一功能。法拉第杯的工作原理是基于电荷守恒定律，即当一个带电粒子撞击法拉第杯的内表面时，会释放出一定的净电荷，这个电荷量可以通过测量电路中的电流来计算。 当一束离子撞击杯的金属体时，该装置获得少量净电荷，而当电荷转移到金属壁时离子被中和。然后可以对金属部件进行放电，以测量与撞击离子数量成正比的小电流。法拉第杯本质上是电路的一部分，其中离子是真空中的电荷载体，它是与电子充当电荷载体的固体金属的界面（与大多数电路一样）。通过测量电路金属部分中的电流（每秒流过电路的电子数），可以确定电路真空部分中离子携带的电荷数。 ③光电倍增电极 由光阴极、次阴极(倍增电极)以及阳极三部分组成，光阴极是由半导体光电材料锑铯做成；次阴极是在镍或铜-铍的衬底上涂上锑铯材料而形成的，次阴极多的可达30级；阳极是最后用来收集电子的，收集到的电子数是阴极发射电子数的105~106倍。即光电倍增管的放大倍数可达几万倍到几百万倍。光电倍增管的灵敏度就比普通光电管高几万倍到几百万倍。因此在很微弱的光照时，它就能产生很大的光电流。 离子最初撞击光电阴极，导致电子发射。然后产生的电子撞击荧光屏，荧光屏又释放出光子。然后，光子进入倍增器，在倍增器中以级联的方式进行放大-就像EM一样。 二 MALDI-TOF-MS原理 小伙伴们在了解上述质谱工作原理后是不是能够轻松认识到MALDI-TOF-MS的工作原理了呢？ 其实就是MALDI源（Matrix-assisted laser desorption/ionization）基质辅助激光解吸电离源+ToF质量分析系联用从而进行样品分析的一套仪器。 ▲图19-MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤示意图（图片源自于“辉骏生物”培训课件，侵删） 通常我们研究人员也会将其戏称为微生物质谱，其在临床上主要是应用于细菌、真菌等微生物的鉴定，具有检测速度快、操作简单、成本低等优势。 MALDI-TOF质谱主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。其原理是不同的生物样品与过量的基质溶液点在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样本吸附，基质与样本之间发生电荷转移使得样本分子电离，样本离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析，检测器检测到不同质荷比（m/z）的离子，并以离子质荷比为横坐标，以离子峰为纵坐标形成特异性的蛋白质组指纹图谱，进而与图谱库中进行对比，得到鉴定结果并最终确定生物样品种类。 ▲表1-MALDI-TOF常用基质及选择 三 MALDI-MSI技术原理及展望 MSI（Mass Spectrometry Imaging, MSI），质谱成像技术，在上文中也有所介绍。其是从MS的基础上衍生而来，MS没有提供有关生物样品中代谢物的时空分布信息，而MSI能够提供生物组织或样品表面分子的空间分布信息。通过将定性和定量分子信息与时空信息相结合，对传统的代谢组学和化学分析进行了补充，能够将特定分子映射到原始样品的2D或3D坐标上。 MSI技术的核心在于将样品表面的分子进行解吸和离子化，然后通过质量分析器对这些离子进行分离和检测。这一过程通常涉及到使用激光或高能离子束扫描样品表面，使表面的分子解吸并带上电荷，形成分子离子。这些分子离子随后被质量分析器按照质荷比（m/z）进行分离，最后由检测器检测离子的强度，从而获得样品表面各像素点的质谱数据。 MSI依赖于多种技术和方法来实现样品的分子成像。例如，MALDI（基质辅助激光解吸/电离）是一种常用的离子化技术，它使用特定波长的激光和基质来促进分子的解吸和电离。此外，还有其他离子化技术如SELDI（表面增强激光解吸/电离）等。质量分析器的选择也至关重要，常见的有飞行时间（TOF）、四极杆（Quadropole）、离子阱（Ion Trap）等。 在MSI中，分子离子化是将样品表面的分子转化为可以进入质量分析器的带电粒子的过程。质量分析器的作用是将这些离子按照它们的质荷比进行分离，以便检测器可以检测到不同离子的信号。检测器则用于测量离子的信号强度，这些数据随后被用来构建分子的空间分布图像。 通过将质谱数据与样品表面的位置信息相结合，MSI可以实现分子的空间分布可视化。这意味着科学家可以直观地看到不同分子在组织中的分布情况，这对于生物标志物的发现、疾病机理研究以及药物开发等领域具有重要意义。 近年来研究工作者对MSI技术广泛的关注，这项技术的精妙之处在于，它能够揭示生物组织中分子的空间分布信息，为临床诊断、药物开发、生物标志物发现以及疾病机理研究提供了一种全新的视角。 同时，MALDI-MSI技术的发展也面临着诸多的挑战。目前成像分辨率和灵敏度尚有进一步优化的空间，且成像效率和datebase的存储空间占用亦是关键的优化领域，这些节点对实验推进和项目总体效率有着至关重要的影响。 四 质谱仪与其他仪器联用 前文所述了有关MALDI-MS和MALDI-MSI联用的种种情况，那么当前科学进程上还存在哪些质谱联用的形式呢？ ①气相色谱质谱法（GC-MS） GC是一种分析/分离技术，其中将复杂的化合物混合物注入色谱柱中，并根据其相对沸点和对色谱柱的亲和力进行分离。 GC中使用的高温使其不适合用于高分子量热不稳定的化合物（例如蛋白质），因为它们会使热量变性。它非常适合用于石化，环境监测和修复领域，工业化学品及药品杂质分析领域，其对样品性质无特定的要求，样品可以是固体，液体或气体形式。 分离后，可以通过质谱技术（例如MS/MS）分析化合物以进行鉴定，或使用EI或CI将其离子化，然后在ToF质量分析器中进行分析。GC具体的分离流程可见色谱柱的分离原理及选择方案系列文章——气相色谱柱选型或是参考气相色谱分析方法开发简析两篇文章。 ②液相色谱质谱法（LC-MS） LC与GC色谱相似，不同之处在于样品现在处于液体状态。将样品溶解在溶剂中，然后注入到色谱柱中，该色谱柱由可溶化合物（流动相）和固相（固定相）组成。 样品成分与色谱柱固定相之间的相对亲和力导致样品成分分离，然后可以通过质谱检测。由于流出物处于液相状态，因此这种分离技术非常适合与APCI-MS和ESI-MS方法使用，当需要高分辨率分析时，其亦是可以和ToF、离子阱和Orbitrap等质谱仪联用。 LC具体的分离流程可见色谱柱的分离原理及选择方案系列文章——液相色谱柱选型或是参考液相色谱分析方法开发简析两篇文章。 ③交联质谱（XL-MS） XL-MS是一种结合了化学交联和质谱技术的方法，用于研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用、蛋白质的结构和功能以及生物学过程。对多蛋白复合物的结构和组织的解析对于了解细胞功能至关重要。化学交联与质谱联用（XL-MS）是一种方法，其可以使用化学交联剂将空间距离足够接近的两个氨基酸通过共价键连接起来。交联剂通常由一个主体和两个反应基团组成，反应基团可以与蛋白质的不同氨基酸侧链发生反应，再将发生交联后的蛋白质酶切后进行质谱分析，对被交联的氨基酸残基鉴定，实现蛋白质（复合物）三维构象以及相互作用解析。能够与低温电子显微镜（cryo-EM）和X射线晶体学之类的结构生物学技术互补，从而提供较低分辨率的结构信息。 由于交联剂臂长的限制，只有空间距离在臂长范围内的氨基酸才可以发生交联作用，该距离信息也是解析蛋白质结构和相互作用的重要条件。由于对蛋白样品含量和纯度没有过高要求，且不需要进行特殊的化学标记，检测速度快，通量高，化学交联质谱技术已成为蛋白质动态结构、功能和相互作用研究的重要工具。 ④氢氘交换质谱（HDX-MS） HDX-MS是一种在生物大分子研究领域中常用的技术，通过将样品中的氢原子与氘原子进行交换，再结合质谱检测手段，实现对生物大分子的结构与相互作用的研究。 HDX-MS是一项研究蛋白质空间构象的质谱技术。这项技术的主要原理是将蛋白质置于重水溶液中，蛋白质表面的氢原子与重水里的氘原子发生互换，发生互换后的蛋白质经过酶切产生多肽片段，质谱鉴定肽段的质量：位于蛋白表面的多肽相比位于蛋白内部的多肽更容易发生氢氚原子交换因而质量增加，由此来推测蛋白质表位构象。此外，氢氘交换质谱还可用于研究蛋白结构动态变化、蛋白间相互作用位点、以及鉴别蛋白表面活性位点等应用。 HDX-MS利用化学反应，使蛋白质中的某些H原子与溶液中的D原子连续交换。如果将H2O水溶液用重水（D2O）代替，则可以进行此交换过程。其与氨基酸主链N原子键合的H（也称为主链酰胺H）可用于探测蛋白质结构，H与D的交换完成后，可以通过MS分析样品，以提供有关具有小分子结合，蛋白质折叠的蛋白质结构变化的信息，或有关未结晶或不适合其他结构生物学的蛋白质结构的信息方法。 HDX-MS能够快速研究溶液中天然蛋白中位于蛋白表面的氨基酸序列，所以在研究蛋白动态表位活性位点上有着广泛的应用。由于氢氘交换质谱借助氢氘原子交换的原理，氢氘原子回交会对实验结果的精准性造成很大的影响，因此避免氢氘原子回交至关重要。目前控制氢氘原子回交主要通过缩短液质分析时间以及把温度和pH始终控制在最低回交反应系数的范围内。 版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。 免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。 往期推荐 乐威医药顺利通过CNAS复评审及扩项评审 中国矿业大学（北京）师生走进乐威医药 乐威医药成功开展“安全生产月”活动