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文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 在生物医学研究中，细胞特异性反式调控元件（cell-type-specific cis-regulatory element, CRE）的设计是一个热门研究领域。最近发表于《Nature》的一项研究《Machine-guided design of cell-type-targeting cis-regulatory elements》，利用机器学习模型指导合成具有高度细胞类型特异性的CRE，为精准医疗提供了全新的工具。这项技术不仅有望解决现有基因治疗中靶向递送不足的问题，还可能为基因编辑、报告基因开发等提供新的解决方案。 研究背景 基因表达是一个复杂的过程，受到多种因素的调控，其中CRE扮演着关键角色。这些DNA序列通过与特定转录因子结合来调节目标基因的活性。尽管近年来的研究已经鉴定了数百万个潜在的人类CRE，但这些自然进化的序列仅仅是所有可能性的一小部分，并不一定符合临床应用中的最佳表达需求。理论上，一段200碱基对的DNA可以包含超过2.58×10120种不同的组合——比可观测宇宙中的原子数量还要多。这些DNA序列组成了一个尚未被充分发掘的DNA序列空间，也是挖掘具有临床和生物技术应用潜力的CRE的储备库。 研究设计与结果 为了克服传统方法在识别和验证CRE时遇到的挑战，Gosai团队引入了三项关键技术： 1)大规模平行报告基因检测（Massively Parallel Reporter Assay，MPRA）：能够同时评估成千上万个CRE的功能，从而获得关于调节语法（regulatory grammar）的广泛认识。 2)深度学习算法（Malinois）：用于预测不同细胞类型中遗传序列如何影响CRE活性，构建出精确的“调控语法”模型。 3)基于预测模型的定向CRE生成（CODA）：基于上述CRE序列评分算法，对随机序列进行迭代，允许研究人员根据所需功能和特定细胞定制合成CRE。 实验结果显示，使用这些合成的CRE可以在斑马鱼和小鼠中实现细胞类型特异性的驱动效能。此外，该研究也展示了如何利用CODA软件库及Malinois模型来生产合成序列，并通过体外和体内实验验证了其效能。 图1：Malonis模型的开发流程及其预测CRE的能力 为了建立精确的CRE活性模型，研究人员首先在K562（红系前体细胞）、HepG2（肝细胞）和SK-N-SH（神经母细胞瘤）三种人类细胞类型中通过MPRA分别分析了超过77万段200 nt长的DNA序列，筛选具有细胞特异性CRE活性的基因组序列信息（图1a）。 使用这些数据，研究人员借鉴了Basset模型（一个用于预测染色质可及性的模型），构建了基于卷积神经网络（Convolutional Neural Network，CNN）的深度学习模型Malonis（图1b）用以预测DNA序列的细胞特异性CRE活性。Malonis在K562、HepG2和SK-N-SH细胞中的预测值与实际测量值之间显示出高度相关性（Pearson’s r=0.88–0.89；Spearman’s ρ=0.81−0.83；P < 10-300；图1c）。这意味着Malonis不仅能够很好地拟合已知数据，而且还能准确预测新序列的CRE活性。 Malinois预测重现了MPRA筛选的重叠片段，这些片段来自以GATA1基因为中心的2.1 Mb窗口（图1d）。此外，在K562细胞中，Malonis预测的CRE区域与DNaseI超敏感位点（DHS）、H3K27乙酰化（H3K27ac）和STARR-seq峰均有很好的一致性（图1e）。这些结果说明Malonis具有良好的CRE活性预测功能。 图2：CODA有效地设计了细胞类型特异性的CRE 接着，研究人员又设计了一个名为CODA的模型，用以从头设计新CRE序列。CODA遵循一个迭代循环：预测序列的活性（通过上文提到的Malonis）、量化序列是否符合设计目标，并更新序列以增加目标值（图2a）。设计目标是获得在模型细胞系中驱动特定细胞类型报告基因转录的CRE序列。通过计算序列在目标细胞类型中预测MPRA活性值与两个非目标细胞类型中预测MPRA活性最大值之间的最小差距（MinGap）来衡量成功程度。迭代方法则分别尝试了进化式的AdaLead、基于概率的模拟退火以及基于梯度的Fast SeqProp。 通过使用不同迭代方法的CODA，研究人员设计了36000个细胞特异性CRE序列，却发现CODA对某些最大化细胞特异性的特定序列具有偏好性。为此，研究人员通过在目标函数中引入惩罚机制来减少这种偏好性的产生，尽管这会牺牲细胞特异性，但极大丰富了序列的多样性。 通过MPRA，对Malonis预测的天然CRE序列、CODA设计（惩罚/非惩罚）的CRE序列以及基于DHS（结合H3K9ac和染色质可及性）预测的天然CRE序列（统称为MPRA测试库）的活性进行验证，进一步证明了Malonis的CRE活性预测能力（图2b&c）。并且Malonis对CRE细胞特异性的预测能力显著强于基于DHS的预测（图2d&e）。 此外，CODA设计的CRE序列对比天然序列展现出更高的细胞特异性（图2d&e）。并且，基于Fast SeqProp的CODA方法所设计的CRE序列具有更好的稳定性和更高的MinGap。而惩罚模式会降低设计序列的细胞特异性但仍显著优于天然CRE序列（图2d&e）。 图3：解释功能序列的内容 为了将序列内容与对应的转录因子（TF）联系起来，研究人员通过Malinois和改良的集成梯度方法，分别预测每个序列在三种细胞类型中单核苷酸分辨率的活性贡献分数（contribution score），并基于贡献分数筛选出66种DNA基序（motif）序列模式。 然后通过TF-MoDISco方法，从中提取出在MPRA测试库中富集的36种非冗余的核心基序模式（7-18 bp），其中31种与已知的人类TF结合位点高度吻合。在36个核心基序中，28个对序列活性具有阳性预测贡献，而其余8个具有抑制作用（图3b）。这包括众所周知的激活因子，如GATA63，GATA63是在K562细胞中表达的必需TF， Malinois预测其仅在K562细胞中驱动活性。 使用贡献分数为基础的模式扫描，发现所有36个核心基序模式在算法设计和天然序列中都至少出现一次，表明这两种类型的序列共享TF库（图3b）。词法分析表明，算法设计序列通常包含更多的独特基序模式以及模式类型数，而惩罚性设计则显示出比非惩罚性设计更高的非冗余基序使用。 此外，合成序列中特定的基序组合使用频率更高（图3c），大多数非惩罚性和Malinois天然序列中都存在不同的激活-激活基序对（95.7％和93.4％），而激活-抑制和抑制-抑制基序对在天然序列中出现的比例较低。 除了单个TF基序和成对的使用外，细胞类型特异性还被认为通过更高阶的基序语义产生。这些基序语义可以介导许多转录因子之间的复杂相互作用，并赋予CRE活性。研究人员采用非负矩阵分解（NMF）将序列库中每一条序列分解由12种功能程序组成的基序组合。NMF鉴定出5种细胞特异性的程序，1种出现于K562细胞，2种出现于HepG2细胞，2种出现于SK-N-SH细胞中（图3d）。 与天然的CRE相比，算法设计的CRE包含更多程序，这与较多的基序使用一致。此外，自然序列主要依赖激活程序，而合成序列也经常使用非目标细胞类型中具有抑制作用的程序。这些结果提示，算法设计序列性能的提高是由于细胞特异性激活和非目标细胞特异性抑制基序的结合。 图4：合成元素的体内验证 为了CODA序列在更多细胞类型中的特异性，研究人员针对A549细胞（肺上皮癌细胞）和HCT116（结直肠上皮癌细胞）也进行了训练，依旧发现CODA设计序列在特定细胞类型中展现出最高的预测活性。 接着，研究人员尝试在体内验证这种CODA设计序列的特异性。他们首先通过Enformer筛选计算了人工序列的表观调控能力，并证明组织特异性的Enformer评分与MPRA验证的细胞特异性CRE活性相关。接着，基于MPRA实验结果、Malinois贡献分数、Enformer评分以及基序构成的人工检查，研究人员筛选出3个HepG2细胞和3个SK-N-SH细胞特异性的CRE，并认为他们可能分别具有肝脏和神经组织特异性（图4a）。 然后，他们构建了一个报告基因质粒，在驱动GFP表达的最小启动子上游插入了人工合成序列，并导入斑马鱼胚胎，发现三个预测肝脏特异性CRE中的两个能够诱导GFP在斑马鱼胚胎发育过程中肝细胞的强烈表达，而在非目标细胞中仅有较低的非特异性表达（图4b），神经特异性CRE也展现出类似的结果（图4c）。 在小鼠胚胎上的进一步验证，发现神经特异性的CRE（synN1 CRE）能够驱动报告基因在发育的皮层中表达，而这种皮层特异性的表达在出生后的小鼠中也存在（图4d），主要是新皮质第6层的神经元和板下神经元（图4e-g）。 基于Malinois贡献分数，在synN1 CRE中发现一个ETS GGA (A/T) 结合域和四个CREB样TGACGCA结合域，提示ETS因子与CREB形成异源二聚体的可能性，而在SK-N-SH细胞上的饱和突变MPRA研究验证了ETS和CREB结合区域的作用。 拓展延伸 人工设计CRE具有广泛的应用前景。 ● 个性化医疗与精准医学 1.基因治疗和药物开发 合成CRE的应用可以直接改善现有基因疗法中存在的主要障碍之一——即缺乏有效的细胞类型特异性递送机制。通过创建高度组织特异性的合成CRE，我们可以更好地控制治疗性基因的表达模式，减少脱靶效应的风险，提高疗效的同时降低副作用的发生几率。这对于治疗那些由单基因突变引起的罕见病尤其重要，因为这类疾病往往需要非常精确地修复或替换受影响的基因。此外，借助机器学习的力量，我们还可以针对不同类型的癌症细胞设计专门的CRE，使其仅在肿瘤细胞内激活特定的治疗性基因，而不影响正常细胞。这种策略不仅可以增强抗癌药物的效果，还能显著减少传统化疗所带来的全身性毒性反应。 2.疾病模型构建 利用合成CRE可以更精细地模拟人类疾病中的基因表达变化，从而建立更加真实的动物模型。例如，在神经系统疾病的研究中，科学家们可以使用这些工具来驱动神经元特异性基因的表达，以研究帕金森病、阿尔茨海默病等复杂病症背后的分子机制。同样地，在心血管疾病领域，合成CRE可以帮助研究人员探索心脏发育过程中关键信号通路的作用，进而找到新的治疗方法。 基础生物学研究 3.发育生物学 在发育生物学中，理解细胞命运决定过程是核心问题之一。合成CRE使得科学家能够以前所未有的精度操纵特定细胞群体中的基因表达，揭示出哪些因子在胚胎形成早期阶段起着决定性作用。比如，通过在斑马鱼胚胎中引入合成CRE，研究者可以观察到不同器官原基形成时的关键事件，深入了解多能干细胞向各种成熟细胞类型分化的过程。 4.进化生物学 从进化的角度来看，合成CRE提供了一个全新的视角去探讨物种间基因调控网络的变化。由于这些序列不是自然界存在的产物，而是基于对已知调控语法的理解人工设计出来的，因此它们可以作为“实验探针”，帮助我们检验关于遗传变异如何塑造生物多样性的假设。例如，比较两种亲缘关系较近但表型差异明显的物种之间的合成CRE活性，可能有助于识别出导致二者分化的关键调控变化。 ● 农业与环境科学 1.作物改良 农业领域同样可以从这项新技术中受益匪浅。通过设计能够响应环境信号（如光照强度、水分含量等）的合成CRE，科学家们可以培育出适应性强的新品种植物。这些改良后的农作物不仅能在恶劣条件下保持产量稳定，还可能具备更好的营养品质或抗病虫害能力。例如，合成光敏型CRE可以让作物在低光照环境下依然维持高效的光合作用；而干旱耐受型CRE则可以使植物在缺水期间关闭不必要的代谢活动，节省资源。 2.生态工程 合成生物学原理也被应用于构建人工生态系统，其中合成CRE扮演着至关重要的角色。例如，在污水处理厂中，工程师可以利用合成微生物群落来降解有害物质。为了确保这些有益菌能够在特定条件下发挥最佳性能，科学家们可以通过合成CRE精确调节其基因表达水平，保证整个系统的高效运行。类似的方法也可以用于土壤修复、空气净化等多个方面，促进可持续发展。 临床应用与展望 对于临床医生而言，这项新技术带来的最大益处在于它有可能改善目前基因疗法中存在的主要障碍之一——即缺乏有效的细胞类型特异性递送和表达机制。通过创建高度组织特异性的合成CRE，我们可以更好地控制治疗性基因的表达模式，减少脱靶效应的风险，提高疗效的同时降低副作用的发生几率。这对于治疗那些由单基因突变引起的罕见病尤其重要，因为这类疾病往往需要非常精确地修复或替换受影响的基因。 总之，Sager J. Gosai及其同事的工作标志着我们正站在一个新时代的门槛上，在这个时代里，借助先进的人工智能技术和生物学知识，我们将能够书写出前所未有的生命密码，为人类健康事业开辟新天地。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献 Gosai SJ, Castro RI, Fuentes N, Butts JC, Mouri K, Alasoadura M, Kales S, Nguyen TTL, Noche RR, Rao AS, Joy MT, Sabeti PC, Reilly SK, Tewhey R. Machine-guided design of cell-type-targeting cis-regulatory elements.Nature.2024 Oct;634(8036):1211-1220.  点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~

肤色差异是不同人群最显著的表型特征之一。肤色是人类适应太阳的紫外线辐射而自然选择形成的，也是人类在不同纬度长期生活适应性进化的一个重要标志。现代人类起源于非洲，目前非洲人群具有世界上最丰富的遗传多样性和表型多样性。不同地区的非洲人群，肤色差异很大。特别是居住在非洲南部的桑人（KhoeSan）,他们具有人类最古老的遗传成分，而且肤色最浅，但其浅肤色的遗传学基础以及适应性进化的机制尚缺乏研究。研究人类肤色多样性的遗传机制及其生物学基础，不仅可以增进对人类表型进化的理解，还可以为皮肤相关疾病的诊治提供指导。2024年1月10日，宾夕法尼亚大学Sarah A. Tishkoff教授团队（冯园庆博士为第一作者，谢宁博士为第二作者）与合作者在Nature Genetics在线发表题为“Integrative functional genomic analyses identify genetic variants influencing skin pigmentation in Africans”的研究论文，该研究运用整合基因组学和功能基因组学对非洲人群肤色进行研究，揭示了人类肤色多样性和适应性进化的遗传机制。肤色是具有高度遗传性的复杂性状，受到数百个基因位点的影响。全基因组关联分析表明人类肤色相关突变中，90%以上都是位于非编码区，如何研究非编码区突变的功能是一个挑战。研究者运用了两种方法寻找与皮肤色素相关的候选单核苷酸突变（SNP），一种是通过对多个种族的非洲人群进行肤色相关的全基因组关联分析（GWAS）获得GWAS-SNP，一种是通过自然选择扫描（natural selection scan）对浅肤色的桑人群与其他深肤色的非洲人群进行比较获得显著差异的Di-SNP。大规模平行报告基因检测技术(massively parallel reporter assays, MPRA)可以同时检测基因组数千个调控元件及突变的调控活性。研究者挑选出位于黑色素细胞的开放染色质区域中的候选SNP，使用MPRA检测了这些候选SNP的调控活性。为了识别这些SNP的潜在靶基因，使用 Hi-C和H3K27ac HiChIP技术，构建了高分辨率的染色质相互作用图谱。最后，结合荧光素酶报告基因检测、CRISPR介导的基因组编辑、转录组分析和黑色素丰度检测，发现了多个显著影响黑素细胞中黑色素水平的新突变、增强子和新基因，揭示了调控人类皮肤色素的遗传机制。从20,000多个通过全基因组关联分析和自然选择扫描得到的候选SNP中，研究者选择了1,157个 SNP用于MPRA，鉴定出165个可以改变调控活性的功能性SNP(MFV)（图1）。进一步验证了其中16个MFV可以调控增强子活性，并使用功能基因组方法鉴定了它们的靶基因。图1. 大规模筛选与非洲人肤色相关的遗传突变。左图，筛选候选SNP示意图。右图，MPRA流程图。与其他非洲人群相比，非洲南部的桑人群肤色最浅，并且拥有人类最古老的遗传谱系。研究发现MITF附近的rs111969762、LEF1附近的rs17038630和TRPS1附近的 rs11985280，这三个Di-SNP均能显著影响增强子活性及其靶基因的表达，可能对桑人皮肤色素的适应性进化发挥了作用。MITF、LEF1和TRPS1参与调节黑色素细胞的分化和毛发的发育，这表明在桑人中观察到的影响肤色的突变也可能影响其独特的头发形态。值得注意的是，TRPS1附近的突变rs11985280，与浅肤色相关的突变频率在桑人和大多数非洲以外人群中接近100%，而与深肤色相关的突变频率在大多数深肤色的非洲人群和深肤色的美拉尼西亚人群中很高，这是一个全球对紫外线照射的适应的典型例子。研究发现OCA2（一种与白化病相关的基因）增强子的突变rs6497271可导致黑色素细胞里的黑色素水平降低75%。并且，在同一个OCA2增强子中，有两个位置相邻很近的突变均可显著影响调控活性，这两个突变分别有120万年和5.7万年的历史，后者与人类迁出非洲的时期很巧合的一致。这个研究说明人类的肤色在不断演变，并且这样的演变在不同的时期发生在同一个重要基因的同一个增强子上。研究还发现GWAS-SNP rs7948623的主要靶基因是CYB561A3和TMEM138（图2）。重要的是，通过功能实验，进一步发现了CYB561A3是一个影响人类皮肤色素的新基因，它能够调控线粒体呼吸和黑素生成相关的基因表达。图2. GWAS-SNP rs7948623 的主要靶基因是CYB561A3和TMEM138。左图，MPRA 在 DDB1 基因座附近鉴定出的3个调控突变。右图，Hi-C 和 H3K27ac HiChIP 鉴定 DDB1基因座附近的染色质相互作用。本研究综合群体遗传学和功能基因组学，GWAS和进化分析，MPRA技术，结合Hi-C、CRISPR基因编辑等实验技术，一次性检测成千上万个非编码突变的功能，鉴定了功能突变的靶基因，发现了调控色素的新基因。这种整合基因组学方法，可广泛推广应用于高通量地研究人类疾病或复杂性状的遗传因素，鉴定功能性突变以及新的致病基因，为精准医疗和药物靶点鉴定提供指导。人类肤色的差异变化是一种复杂的适应性特征，受到众多遗传位点的影响。本研究发现了非编码突变在决定人类肤色上发挥着重要作用，强调了影响肤色的遗传因素的复杂性，也凸显出研究具有高度的遗传多样性和表型多样性的人群，对确定复杂性状的遗传基础十分重要。同时，研究提供了肤色多样性的历史进化的新信息，有助于更清晰地描述人类进化。参考文献：Feng Y, Xie N, Inoue F, Fan S, Saskin J, et al. Integrative functional genomic analyses identify genetic variants influencing skin pigmentation in Africans. Nat Genet. 2024 Jan 10. doi: 10.1038/s41588-023-01626-1. Epub ahead of print. PMID: 38200130.                 责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观王晓红教授团队：绘制单次冷冻囊胚移植成功的女性植入期外周血microRNA动态表达谱，开拓领域创新研究热文维生素B12在细胞重编程与组织再生中发挥关键作用！热文不孕症治疗新方向！又一导致女性不孕的关键因素被发现热文Let-7家族miRNA或为癌症潜在免疫治疗靶点热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发点击“阅读原文”，了解更多~

来自北卡罗来纳大学等机构的科学家们通过研究揭示了到底是哪些突变会对机体患精神分裂症产生因果关系的影响，他们发现，一些基因突变会调节或改变参与精神分裂症有关的基因表达。 从遗传学角度来讲，我们每个人都是彼此不同的个体，这是因为我们机体的DNA序列中存在着微小的变异，即所谓的遗传突变，其中一些突变会产生我们能看到和理解的巨大影响，从我们眼睛的颜色到患精神分裂症的风险等。多年来，科学家们研究了成千上万人机体的整个基因组（全基因组关联性研究，GWAS），发现了近5000个遗传突变或与人类精神分裂症发生有关。 近日，一篇发表在国际杂志Cell Genomics上题为“Systematic investigation of allelic regulatory activity of schizophrenia-associated common variants”的研究报告中，来自北卡罗来纳大学等机构的科学家们通过研究揭示了到底是哪些突变会对机体患精神分裂症产生因果关系的影响，他们发现，一些基因突变会调节或改变参与精神分裂症有关的基因表达；这项研究也标志着科学家们在理解人类精神分裂症的遗传基础方面迈出了重大的一步。 研究者Hyejung Won教授说道，我们的研究结果不仅深入揭示了基因错综复杂的调节蓝图，还提出了一种突破性的方法来解析遗传突变对精神分裂症个体机体中基因调节的累积效应。这一理解或能潜在为未来更精确的干预和疗法的开发铺平道路，如今精神分裂症的治疗方案非常有限，而且有些人对现有的药物也并没有反应。文章中，研究人员通过进行GWAS研究探索了已经与人类精神分裂症风险相关的基因突变。 研究者的目的在于寻找一种方法将无意义的突变与那些有可能对精神分裂症发病有重要影响的生物活性的突变区分开来，这一点并不容易，其中原因有几个，其中之一就是遗传变异通常遗传自父母亲那里，因此，紧挨着的两个遗传突变或许就与精神分裂症的发生有关，一个可能对于在精神分裂症中扮演重要角色的基因表达非常重要，而另一个突变则可能在精神分裂症发生过程中并没有发挥任何作用。为了解决这一问题，研究人员使用了一种名为大规模平行报告试验（MPRA，massively parallel reporter assay）的特殊技术，该技术从本质上来讲就是一种基因测序技术，其能解析哪些突变会诱导基因表达，哪些则不会；为了使用这些方法，研究人员将5000个突变引入到了培养皿中的人类脑细胞中，这些细胞对于早期的大脑发育至关重要。 科学家在理解人类精神分裂症遗传特征上取得重大进展。 图片来源：Cell Genomics (2023). DOI:10.1016/j.xgen.2023.100404 这些突变体可能也不可能会引起下游基因和遗传条形码的表达，一种拥有20bp DNA序列的条形码对于每一个突变体都是独一无二的，而且研究人员就是利用其来区分变异序列的；MPRA能揭示具有实际生物学效应的439个遗传突变，这就意味着其能够改变基因的表达。从传统上来讲，科学家们就能利用其它表观遗传学数据，比如转录因子结合和生化定义增强子，从而来识别出具有生物学效应的变异。然而，这些传统方法无法预测研究人员所识别出的具有生物学效应的大部分遗传突变，研究者的工作揭示了大量尚未开发的具有生物学效应的突变体。为了理解这些突变是如何共同影响基因活性的，研究者Won等人开发了一种新型模型，其能将来自MPRA的数据与脑细胞中的染色质结构（对于脑细胞DNA组装方式非常重要的遗传信息）结合在一起，通过使用这种方法，研究人员就能将这些439个突变体与基因如何开启或关闭表达联系起来。 研究者表示，精神分裂症是一种高度遗传的复杂疾病，找到这439个潜在的致病性突变或许就是一大进步，但研究人员后期还有大量工作需要去完成，从而阐明导致个体患上精神分裂症的复杂遗传结构；有了这些信息，研究人员就能开始理解这种复杂疾病背后的生物学机制，从而最终开发出新型靶向性疗法了。综上，本文研究中，研究人员提出了一种接触无障碍的模型，其能将MPRA测定的等位基因活性与机体的神经元染色质结构相结合。（生物谷Bioon.com） 原始出处： Jessica C. McAfee, Sool Lee, Jiseok Lee, et al. Systematic investigation of allelic regulatory activity of schizophrenia-associated common variants, Cell Genomics (2023). DOI:10.1016/j.xgen.2023.100404