SALL4

引言 2024年10月22日，北京大学邓宏魁和关景洋课题组合作在Cell Stem Cell杂志在线发表题为Generation of Human Expandable Limb-Bud-like Progenitors via Chemically Induced Dedifferentiation 的研究论文。该研究进一步证明了化学重编程技术可诱导人体细胞去分化(Chemically induced dedifferentiation)，并成功制备可大规模扩增的胚胎肢芽样前体细胞。这一创新成果利用化学小分子精准调控细胞命运的特点，模拟低等动物的再生规律，为制备具有再生潜能和大规模扩增能力的人前体细胞开辟了新途径。 邓宏魁团队多年来一直致力于化学重编程调控细胞命运的研究。2013年在国际上首次报道仅使用化学小分子逆转细胞发育时钟，将小鼠体细胞重编程为多能干细胞。这一原创性成果开辟了一条全新的体细胞重编程的路径（Science，2013；Cell, 2015; Cell Stem Cell, 2018）。2022年该团队又首次实现了利用化学小分子诱导人体细胞成为多能干细胞的技术体系，为人多能干细胞的制备提供了全新的途径，是干细胞领域底层技术的重要突破（Nature，2022）。在此基础上，2023年建立了更加快速、高效、满足临床应用需求的人体细胞化学重编程体系（Cell Stem Cell，2023）。以糖尿病治疗为切入点，邓宏魁团队证明了化学重编程诱导的人多能干细胞可以高效分化为胰岛细胞，并显著改善糖尿病猴的血糖控制 (Nature Medicine, 2022; Nature Metabolism, 2023)。更令人振奋的是,该团队近期首次报道了利用化学重编程诱导多能干细胞制备的胰岛细胞移植, 患者初步实现了1型糖尿病的临床功能性治愈 (Cell | 沈中阳/邓宏魁/王树森团队合作报道首例移植化学重编程多能干细胞制备的胰岛实现1型糖尿病患者功能性治愈，Cell, 2024)。这一系列的研究成果，证明了化学重编程技术在再生医学领域治疗重大疾病方面的巨大潜力和重要应用价值。目前，该团队还成功将化学重编程诱导的人多能干细胞分化为肝脏细胞，iTNK细胞等功能细胞，展现了人化学重编程的广泛应用前景（Cell Proliferation, 2024; Cell Reports Methods, 2024）。 图1. 化学重编程诱导人多能干细胞的广阔应用前景（Credit: Cell Stem Cell） 邓宏魁团队研究发现化学重编程技术与传统重编程技术存在本质的区别。传统的转基因重编程技术依赖于细胞内源的转录因子过表达，直接驱动细胞性质转变，难以实现细胞命运的精准调控。而化学重编程技术则利用化学小分子模拟外界信号刺激，类似自然发育中的细胞命运调控原理，以更加灵活可控的方式，促进细胞命运分阶段有序的调控。2015年的研究中，该团队发现化学重编程诱导小鼠多能干细胞过程中会经历独特的中间阶段 (Cell，2015)。之后，通过单细胞组学技术又构建了小鼠化学重编程体系的完整分子路径（Cell Stem Cell，2018），揭示了化学重编程体系完全不同于转录因子介导的重编程的独特原理和路径。 该团队在2022年的研究中发现，人化学重编程的早期阶段会产生一种独特的高可塑性的中间态细胞，其染色质可及性增强，早期胚胎发育基因激活等特点。有趣的是，通过和低等动物再生去分化过程中的细胞性质比较，发现该阶段激活了与蝾螈断肢再生早期类似的基因表达特征（Nature，2022）。随后，该团队通过表观组学的系统解析，又发现类再生可塑性状态的建立过程与生物体发育成熟过程中再生能力丧失的逆向过程极为相似（Cell Reports，2023）。这一系列的发现提示通过化学重编程技术精准调控细胞的命运，有望实现人体细胞逆向发育，将其诱导回前体细胞状态，从而重启人体细胞的再生潜能。 图2. 左图：蝾螈断肢再生过程中体细胞去分化产生前体细胞(Gerber et al ., Science, 2018）；右图：Waddington model展示细胞分化与去分化过程（Granados et al., Int. J. Mol. Sci. 2020）（Credit: Cell Stem Cell） 在自然界中，部分低等动物如蝾螈等，展现出了惊人的再生能力，其四肢、心脏、大脑等重要组织器官在损伤后可实现完美再生修复。这一神奇的能力主要归功于其体细胞具有的重要潜能——去分化（dedifferentiation），即分化的体细胞可以在损伤等信号刺激下，重新逆转发育为可快速增殖的类胚胎期的前体细胞状态，从而重新分化为功能细胞，修复损伤的组织器官。然而，哺乳动物，尤其是人类，由于其体细胞的命运更加稳固，可塑性下降，导致其再生能力非常有限。组织器官损伤后，人体细胞难以有效启动去分化程序，从而大大限制了受损组织或器官的再生。因此，如何模拟低等动物，有效诱导人体细胞的去分化以重新获得前体细胞，是干细胞与再生医学研究的重要科学问题之一。 在本研究中，邓宏魁团队证实了在化学重编程早期阶段，化学小分子可诱导体细胞去分化为类人胚胎肢芽前体细胞（human Chemically induced Limb Bud-like Progenitors，简称人CiLBP细胞），并在此基础上建立了人CiLBP细胞长期稳定扩增的条件。通过单细胞转录组分析，研究团队发现人CiLBP细胞的转录组与人胚胎肢芽细胞相似。去分化相关基因LIN28A、SALL4等在人CiLBP细胞中高表达，同时体细胞相关基因表达降低，表明体细胞相关特征被擦除并启动再生相关基因网络。人CiLBP细胞高表达MSX1、HOXA9和MEIS2等肢芽发育相关基因，与人类胚胎发育30天左右的肢芽细胞群状态非常类似。 肢芽细胞作为软骨细胞和骨细胞的祖细胞，最终能发育成四肢。相较于未经过化学重编程处理的亲代体细胞，人CiLBP细胞的成软骨和成骨能力显著提升。在成软骨条件诱导下，可高表达软骨相关基因，分泌相关蛋白，并可以形成软骨结节。体内移植实验表明，人CiLBP细胞能在体内自发分化产生软骨和骨样细胞，并在兔股骨髁缺损模型中促进骨损伤修复。重要的是，起始的人脂肪间质细胞或者人皮肤成纤维细胞扩增能力有限，而诱导获得的人CiLBP细胞可以在长达32次传代后，仍保留肢芽前体细胞特性，并保持良好的分化能力。这些特性证明，通过化学重编程诱导体细胞去分化获得的前体样细胞，不仅增强了分化能力，还具备大规模扩增的潜能，为其后续应用于骨和软骨相关疾病的治疗提供了新的细胞来源，具有重要的临床应用价值。 图3.  化学重编程技术诱导体细胞去分化为可大量稳定扩增的肢芽前体细胞（Credit: Cell Stem Cell） 综上所述，邓宏魁团队在本研究中利用化学重编程技术精准调控细胞命运，成功模拟低等动物组织再生中的去分化过程，实现了人体细胞向前体细胞的逆转，这一成果具有重要意义。（1）该研究进一步证明了化学重编程技术不同于传统转基因重编程技术，可通过分阶段有序的调控细胞性质，实现细胞命运的可控逆转，为实现人体细胞的去分化提供了全新的途径；（2）该研究为体外制备可大规模扩增的人前体细胞提供了新的方法，通过诱导去分化获得的人前体细胞具备了更强的分化能力及增殖能力，从而为受损组织和器官的细胞替代治疗提供了更理想的细胞来源；（3）利用化学重编程精准诱导人体细胞去分化的独特优势，有望直接激发体内组织和器官的再生潜能，模拟低等动物在组织和器官完美再生修复方面的神奇能力，为再生医学的发展提供新的可能性。 参考文献 https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(24)00363-1 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言 人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。 图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法 由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。 因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。 国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。 图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。 为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。 第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。 第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。 第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。 第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。 大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗  在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源 造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。 图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞 基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞 从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞 从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞 人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。 已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集 为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。 研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。 还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞 在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。 为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递  用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略 慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。 工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变 自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。 图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导 有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。 优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默 像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略 已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战 重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。 许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增 根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。 转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入  HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案 在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。 由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择 为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。 一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展 提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验  如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验 最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验 早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。 核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究 在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。 另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。 在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。 这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。 为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验  采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。 目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论  长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024年7月8日，Kymera Therapeutics宣布与赛诺菲合作扩大PROTAC分子 KT-474治疗化脓性汗腺炎、特应性皮炎两项二期临床试验，以求更快推进到关键临床。 近期，Kymera Therapeutics团队在JMC药化杂志公布了KT-474分子设计。 Interleukin-1 受体相关激酶 4 (IRAK4) 是 IL-1R 和 TLR 信号通路的重要基因，这两种信号通路与多种自身免疫性疾病有关。因此，阻断 IRAK4 的活性代表了治疗自身免疫性疾病的一种有吸引力的方法。该丝氨酸/苏氨酸激酶的活性取决于其激酶和支架活性；因此，降解是一种潜在的更好的抑制方法。 1. 背景介绍 背景介绍 白细胞介素 1 受体相关激酶 4 (IRAK4) 是白细胞介素 1 受体 (IL-1R) 和 Toll 样受体 (TLR) 信号通路的关键基因。TLR 和 IL-1R 通过其同源配体激活会导致信号级联，从招募接头蛋白 MyD88 开始，随后招募和磷酸化 IRAK4 和其他家族成员（如 IRAK2），形成称为 myddosome 的大型多蛋白复合物。IRAK4 在 myddosome 的信号转导中发挥关键作用，因为其激酶和支架功能都是适当的 myddosome 组装和信号转导所必需的。myddosome 复合体触发下游通路的激活，例如 NFkB 和干扰素反应因子 5/7 (IRF 5/7)，最终释放促炎细胞因子和趋化因子，例如 TNF-α、IL-6 IL- 1β、IL-33 和 IL-36。这些细胞因子与多种自身免疫性疾病的发病机制有关，例如化脓性汗腺炎、牛皮癣和特应性皮炎。因此，IRAK4 是减轻 TLR/IL-1R 介导的炎症的有前景的治疗靶点。然而，作为慢性炎症和自身免疫性疾病治疗药物而开发的 IRAK4 激酶抑制剂在临床上取得的成功有限，这可能是由于无法靶向 IRAK4 的关键支架功能（图 1）。有鉴于此，IRAK4 非常适合靶向蛋白质降解技术。 图1. IRAK4 生物学机制和降解剂示意图。  靶向蛋白质降解的一种方法利用异双功能分子将 E3 连接酶与目标蛋白质结合在一起，介导目标蛋白质的泛素化以及随后由蛋白酶体进行的降解。因此，异双功能降解剂提供了解决多功能治疗靶标（如同时具有激酶和支架功能的 IRAK4）的机会，其中降解有助于消除治疗靶标的所有活性，并且可能优于小分子抑制剂。 本文描述的有效和选择性IRAK4降解剂的设计，发现了KT-474蛋白降解剂，对PROTAC分子设计具有重要的参考意义。  2. 新型 CRBN 粘合剂的发现 此前，文献中报道了对 IRAK4 降解剂的描述有限。这些降解剂通常利用 von Hippel-Lindau 蛋白 (VHL) 或 cereblon 蛋白 (CRBN) 作为 E3 连接酶，并且只能实现中等强度的 IRAK4 降解。本文讨论的工作重点是 CRBN 的利用。 许多基于CRBN的第一代异双功能降解剂采用CRBN配体，例如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺(POM， 1 )，它们也被称为免疫调节药物(IMiD)。众所周知，IMiD 有降解多种转录因子的倾向，包括但不限于 Ikaros、Aiolos 和 SALL4。这类化合物，尤其是来那度胺，已在许多肿瘤适应症中取得了成功。然而，此类转录因子（例如，Ikaros 和 Aiolos）的降解表现为许多不良反应，例如中性粒细胞减少症和血小板减少症，这些影响将限制 IMiD 在非肿瘤学适应症中的应用。此外，SALL4 的降解与致畸毒性有关。IMiD 通过充当分子胶来诱导这些转录因子的降解。这些是单价分子，就 IMiD 而言，与 CRBN 结合并促进 E3 连接酶、靶蛋白（例如 Ikaros）和分子胶之间的新界面。这种三元复合物随后导致蛋白酶体介导的靶蛋白降解。IMiD 招募这些新底物的机制已得到很好的表征，并且是由于对包含关键甘氨酸残基（G 环）的常见结构降解决定子的识别而产生的。 为了消除与 IMiD 相关的不良反应的风险，我们采用了基于结构的药物设计方法来识别没有 IMiD 底物降解的新型 CRBN 粘合剂。对 CRBN:POM:Aiolos 三元复合物结构的评估表明，POM 中邻苯二甲酰亚胺基团的苯环可能通过同时与降解决定子基序的 Gly151 和 CRBN 的 Pro352 相互作用，通过 CH/π 相互作用在复合物的结合和稳定中发挥关键作用（图 2 A）。基于这些观察，设计重点是减轻 Gly151 残基的参与，同时保持与 Pro352 的相互作用。为了实现这一目标，作者设计了配体芳香环与 CRBN 更接近的分子。这种修饰反过来需要将琥珀酰亚胺基序转化为环状脲，以保留与 CRBN 的关键相互作用。这项工作最终鉴定了化合物2 （图 2B ），该化合物相对于 POM 表现出提升的 CRBN 结合亲和力（IC 50：0.25 μM vs. 1.51 μM），更重要的是，不会诱导 Ikaros 或 Aiolos降解(浓度高达 10 μM)。除了保持对 CRBN 的亲和力而不具有 IMiD 活性外，还保留母体 IMiD 良好的药物代谢和药代动力学 (DMPK) 特性也很重要。为此，在 Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞系中进行评估时，发现化合物2相对于 POM 显著降低了被动渗透性 (Papp)（Papp：4.0 vs. 25.4 × 10 –6 cm/s）。当大鼠口服给药时，相对于 POM，这种渗透性的降低导致暴露量显著下降。假设被动渗透性降低是由于添加了环脲上的游离 NH。通过在脲上添加甲基来除去该额外的氢键供体（HBD）设计出 化合物3 。该化合物保持了对 CRBN 的高亲和力 (IC50 = 0.20 μM)，并且相对于2表现出显著改善的被动渗透性。这种被动渗透性的改善伴随着大鼠口服给药后暴露的显著增加（表1）。作者消除 IMiD 相关不良反应风险的设计策略，在随后的 化合物3与 CRBN 的 X 射线共晶结构中得到了进一步证实。有趣的是，最初用于去除环脲中游离 NH 的甲基与降解决定子发生空间冲突（图 2C），可能有助于进一步消除 G 环降解决定子的招募。 图 2. 新型 CRBN 粘合剂的发现。(A) CRBN:泊马度胺( 1 ):IKZF1(6H0F)的X射线结构。(B) CRBN: 2与 IKZF1 重叠的结合模型。(C) 3和 CRBN (9CUO) 的 X 射线共晶结构并覆盖 IKZF1。 表 1. 新型 CRBN 粘合剂的概况 使用蛋白质组学评估了化合物3的降解选择性。用 1 μM 3 处理人外周血单核细胞 (PBMC) 24 小时不会影响任何 IMiD 底物的蛋白质水平（图 3）。为了确定3是否诱导转录因子 SALL4 的降解，在 SKNDZ 细胞系中的 SALL4 HiBiT 测定中评估了 3 ，发现没有观察到该转录因子的降解（DC50 >10 μM ）。鉴于3缺乏 IMiD 活性、提高了与 CRBN 的结合亲和力以及有利的 DMPK 特性，研究人员利用该配体来制备 IRAK4 的后续异双功能降解剂（表 1）。此外，该配体在戊二酰亚胺环的3位上含有手性中心。该部分易于外消旋化，下面将更详细地讨论。 图 3. 人类 PBMC 中化合物3的整体蛋白质组学。来自n = 3 名供体的细胞以 1 μM 剂量给药 24 小时。SALL4 在 hPBMC 中不表达。 3. IRAK4 配体优化 随着这种新型 CRBN 配体的发现，接下来需鉴定 IRAK4 配体作为降解剂设计的起点。研究人员利用大量不同的 IRAK4 配体制备了降解剂，包括文献中报道的结合物以及 Kymera 设计的新型 IRAK4 配体。首先，利用化合物4作为 IRAK4 配体的起点。该化合物表现出与 IRAK4 的有效结合和良好的激酶组选择性（% of kinases > 100X, >95% over 101 kinases）。如图4 B 和 C 所示，IRAK4 ATP 结合口袋中的化合物4的建模表明，吡唑环上的N-甲基提供了一个潜在的退出方向(exit vector)，可以在该方向上附加连接子以实现异双功能降解剂。在此模型中，化合物4与 IRAK4 形成了几个有利的接触，包括与铰链残基 Met265 的氢键、盐桥以及分别与 Asp329 和 Ala315 的主链羰基的氢键。化合物4 还通过 π-π 相互作用与看门人 Tyr264 残基结合（图 4 B 和 D）。准备了一组初始降解剂以确定该退出方向是否可以诱导 IRAK4 降解（表 2）。 图 4. (A) 化合物4 ；(B) 4个IRAK4模型；(C) 4的退出方向的图示；(D) 4和 IRAK4 之间的关键相互作用。 4. 降解剂连接子优化 制备了一系列含有不同长度的柔性连接体的降解剂，其中代表性的例子如 表2 所示。经确定，11-12 Å 的连接基最适合降解（化合物5和6 ），因为具有较短连接基的化合物 ( 7 ) 不会引起降解。这些化合物降解活性的差异还体现在这些化合物诱导与 CRBN 和 IRAK4 形成三元复合物的倾向上。 5和6都表现出稳定的三元复合物形成，而7没有诱导与CRBN和IRAK4的三元复合物。之前已经证明，在 IRAK4 异双功能降解剂的背景下，在目标蛋白配体上立即掺入环己基部分以及在接头中适当放置碱性胺可以显著提高对 IRAK4 的亲和力。这种亲和力的提高是由这些基序分别与 Ile185 和 Asp278 结合的能力驱动的（图 4D）。与 化合物5相比，化合物6 对 IRAK4 的亲和力增强，导致降解效率比化合物5显著提高（10 倍）。 表 2. 连接子距离对 IRAK4 降解的影响 6. 降解剂类药性优化 在实现个位数纳摩尔降解效力后，下一步将集中于改善降解剂的类药特性，目标是实现口服生物利用度。最初侧重于修饰 IRAK4 配体以实现口服吸收。在体外，该化合物6被发现表现出适度的被动渗透性（Papp = 4.8 × 10 –6 cm/s），并且在表达 MDR1 的 MDCK 细胞系中进行评估时，发现其表现出高流出率（ER = 35）。当对大鼠给药时，该化合物表现出非常高的体内清除率并且不能口服吸收（表3）。 表 3. 代表性类似物在大鼠体内的药代动力学特征 表2 中的化合物中包含的IRAK4配体的关键基序是锚定到哌啶上的氨基。该部分与 IRAK4 的 Asp329 和 Ala315 残基相互作用，对于维持有效的亲和力至关重要（图 4B）。由于异双功能降解剂的口服吸收会受到 HBD 数量的显著影响。 因此，重点是去除氨基哌啶中包含的一种或两种 HBD，但这可能会对与 IRAK4 的结合产生潜在的负面影响。首先，作者尝试完全去除该氨基哌啶基或用更小的二甲氨基取代，分别得到化合物8和9 。事实上，除去氨基哌啶中包含的两个HBD会导致对IRAK4的亲和力显著降低，反过来，两种化合物都不会在浓度高达10μM时表现出IRAK4的降解（表4）。然而，这些变化导致被动渗透率显着提高并减少外流。在对 IRAK4 配体的这一部分进行广泛探索后，发现10内含有的哌嗪是一种独特的基序，相对于6而言，其含有较少的 HBD，但仍保持良好的亲和力并表现出强大的降解能力。尽管该化合物含有较少的 HBD 供体，但遗憾的是，与6相比，这并没有显著影响被动渗透性或外排，两者均未达到最佳状态。哌嗪 NH 的甲基化产生11 ，这确实证明了渗透性的改善和外排的减少；然而，与6相比，对 IRAK4 的结合亲和力降低了 120 倍以上。受到11的渗透性和外排以及10的效力的启发，将哌嗪修饰为相应的桥联吗啉12和13 。尽管这种变化导致对 IRAK4 的亲和力下降，但这两种化合物都表现出有效的降解以及渗透性和外排性。有趣的是，虽然11对 IRAK4 和 CRBN 的亲和力与12和13相当，但当测试浓度高达 10 μM 时，该化合物并未诱导 IRAK4 显著降解。缺乏降解的原因尚不清楚，但这凸显了与降解剂优化相关的一些挑战。化合物13比12的效力稍强，并且表现出稍好的渗透性和较低的外排，因此进行13的大鼠药代动力学实验。结果发现，虽然该化合物表现出较高的静脉清除率，但它表现出可测量的口服吸收水平（3.2% F；表 3）。 表 4. IRAK4 Binder 的优化 在成功设计出能够具有令人鼓舞的效力和渗透性的异双功能降解剂的 IRAK4 配体后，工作重点转向改善此类降解剂的整体 DMPK 特征（表 5）。特别是提高代谢稳定性，其中采取的方法之一涉及连接体的刚性化。将13的 1,3 氨基烷氧基转化为烷氧基哌啶生成14 ，该化合物保留了降解效力，并且在人和大鼠肝微粒体中的代谢稳定性略有改善。有趣的是，这种变化导致被动渗透性降低和外流降低。当进行体内评估时， 14表现出静脉清除率略有改善，但口服吸收仍与13相当。 表 5. 链接子优化 去除14中的乙醚得到15 ，这表明人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性得到进一步改善；然而，这种改进伴随着效力的 5 倍损失。 三元复合物模型表明，接头中的氧原子可能与 CRBN 中的 His353 形成氢键（图 5），并且这种相互作用的丧失导致15的降解效力降低。这种 SAR 存在于许多化合物中，反过来又有助于优先考虑在连接子中保留该氧原子的连接子。随后的工作集中于接头的进一步刚性化，如16所示。它保留了 IRAK4 的有效降解作用，但在人肝微粒体中表现出高周转率，并且流出率略有增加。为了减弱连接子中氧原子的极性，将乙炔部分掺入连接子中，生成炔丙基醚17 。它能够在人肝微粒体中融合效力和良好的稳定性，同时还减轻多药耐药性 [MDR1] 介导的外排的可能性，在大鼠中进行评估时产生良好的口服生物利用度（F = 12%；表 3 ） 。为了进一步屏蔽连接体中氧原子的极性，在醚氧附近掺入了甲基，形成19 。虽然这种修饰确实导致 MDR1 缓解外排的可能性进一步降低，但它也导致效力损失 10 倍。这一系列异双功能降解剂的效力对 CRBN 配体上的连接点非常敏感，如当连接体附加到咪唑啉酮环（化合物18 ）的 5 位时效力损失。 图 5. 14 :IRAK4 的三元复合物模型。使用 Rosetta 软件，将 IRAK4/抑制剂X 射线结构（内部，未公开）与 CRBN/化合物2 (PDB: 9CUO) 的已发表结构进行约束蛋白质-蛋白质对接，构建三元复合物模型。Linker 使用 MMFF94 力场构建。  乙炔减少外排的独特能力是一种普遍现象，也可以在18和19中观察到。根据化合物17的总体概况，选择该化合物进行额外的概况分析。该化合物的跨物种 DMPK 概况如 表 6 所示。化合物17在不同物种中表现出中等至较高的血浆清除率、高稳态分布体积 (Vss) 以及中等的终末半衰期 ( t 1/2 )。 17 在大鼠、狗和猴中的口服生物利用度分别为12%、35%和13%（表6 ）。 表 6. 17的体外/体内概况 7. 非对映异构体构效分析 如前所述，迄今为止讨论的所有化合物都是戊二酰亚胺环 3 位的 (R) 和 (S) 异构体的混合物。各个异构体的分离提供非对映异构体20和21 。有充分证据表明该中心可能容易发生外消旋化。因此，需要努力了解体外和体内外消旋化的倾向。 20和21的绝对立体化学是根据大量文献确定的，这表明基于戊二酰亚胺的CRBN结合剂的(S)-对映体与CRBN的结合更有效。相对于21 ，化合物20对CRBN具有显着更大的亲和力，因此，该化合物的绝对立体化学指定为(S)。有趣的是，虽然20和21与CRBN的结合亲和力存在很大差异，但两种非对映异构体之间的细胞降解效力差异较小（3倍；表7）。为了探讨结合亲和力和细胞活性之间的差异是否是由体外外消旋作用驱动的，在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中评估了差向异构化率。从20到21的转换半衰期为5.3小时，而从21到20的转换半衰期为5.2小时。降解效力没有显着变化可能是由于该测定的时间范围（4 小时）相对于 CRBN 结合测定（15 分钟）更长。 表 7. 17的非对映异构体的效力 对20和21进行了额外的测定，以进一步表征它们的外消旋倾向，因为这可能对17的进一步开发产生影响。将两种化合物分别与大鼠、狗、食蟹猴和人血浆一起孵育，其中在人、大鼠、狗和猴血浆中从20转化为21的半衰期分别为 1.2、1.2、1.0 和 1.2 h 。在人、大鼠、狗和猴血浆中，从21到20的转化半衰期分别为 1.6、1.7、1.2 和 1.9 小时。此外，当以17或单独的非对映体形式给药时，两种非对映体在大鼠和狗中表现出相似的药代动力学特性。在大鼠和狗中静脉内或口服施用任一非对映体后，观察到从20到21以及从21到20的显著地相互转化，使得所得转化的非对映体与施用的非对映体的AUC比率在21%至46%的范围内。服用17后，每个单独的非对映异构体表现出与单独给药各个非对映异构体时观察到的相似的 PK 特性。这些数据清楚地表明17的外消旋化在体外和体内均是快速的。由于上述原因， 17被开发为S、R和R以及R、R和R非对映异构体的混合物。 17的结构通过电子衍射得到证实，这表明该分子采用了扩展构象，IRAK4配体内有一个分子内氢键（图 6）。 图 6. 17的晶体结构。 8. PCC 分子体内外PK/PD结果 化合物17 被发现是一种高度选择性的异双功能分子。使用 KINOMEscan 筛选平台对激酶组进行分析后，它对测试的 468 种激酶具有极高的选择性（1 μM 时的 S(10) = 0.007）。通过定量蛋白质组学评估了17在整个蛋白质组中的降解选择性。用 300 nM 的17 (10 × DC 90 ) 处理人 PBMC 24 小时后，观察到 IRAK4 是唯一显显著下调的蛋白质，这表明17在整个蛋白质组中具有高水平的选择性。还在诱导多能干细胞 (iPSC) 中评估了整体选择性，以将蛋白质组覆盖范围扩大到 PBMC 中表达的蛋白质之外。另外四种 IMiD 底物，包括 SALL4，其中均没有被17降解（图 7 A 和 B）。 图 7. (A) 人 PBMC 和 (B) 人诱导多能干细胞中17的整体蛋白质组谱。 通过使用靶向质谱法，在小鼠和大鼠原代脾细胞以及狗、猴子和人 PBMC 中评估了17对 IRAK4 降解的跨物种体外效力。化合物17在啮齿动物、犬科动物和食蟹猴原代细胞中表现出相当的跨物种效力；DC 50和D max值报告于 表8 中。 表 8. 化合物17跨物种 IRAK4 降解效力 用 TLR7/8 激动剂 R848 刺激 PBMC 后，在体外评估化合物17的功能活性，其中化合物 17 有效抑制 IL-8 释放，IC 50 = 3 nM，Imax = 91%。与高选择性 IRAK4 小分子抑制剂 PF-06550833 相比，这明显更有效，后者的 IC 50为 24 nM，Imax 仅 51%（图 8）。 图 8. 抑制人外周血单核细胞中 R848 刺激的 IL-8 释放。 有了这些令人鼓舞的体外数据，随后评估了咪喹莫特(Imiquimod)诱导的牛皮癣小鼠模型中17 的体内活性。结果证明了化合物17有效的抗炎功效，与局部类固醇给药相当（图 9）。在皮肤和脾脏中观察到与单剂量小鼠药代动力学/药效学研究一致的17和IRAK4降解的剂量依赖性暴露（表9 ；图9）。 表9. 皮肤和脾脏中的17和 IRAK4 水平。 图 9. 17在咪喹莫特小鼠模型中有效。BID，每天两次；IMQ、咪喹莫特。 基于上述特点和良好的临床前安全性， 17被选为候选药物（KT-474）并进入I期临床试验（NCT04772885）——KT-474的单次递增剂量和多次递增剂量试验在健康成年志愿者和患有特应性皮炎或化脓性汗腺炎的患者中进行。 在此 1 期临床试验中，剂量依赖性暴露增加，并且 PBMC 中观察到剂量依赖性 IRAK4 降解。PBMC 中 IRAK4 的强烈降解导致这些患者的离体刺激 PBMC 中疾病相关细胞因子显著减少，其中化脓性汗腺炎和特应性皮炎患者的评估与初步临床活性相关。 KT-474 的I期临床结果见报道： 【Nature Medicine】PROTAC在临床治疗自身免疫性皮肤病中的应用 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01305 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓