NCOA2

高世勇*，吕凤，许东旭（哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）* 通讯作者：高世勇，研究员[摘要] 乳腺癌作为一种激素依赖性肿瘤，其发生、发展与雌激素受体的表达密切相关。雌激素可调节多种生理过程，例如细胞生长、增殖、发育和分化。而雌激素受体与雌激素结合可激活相关通路从而产生一系列生物学效应。对雌激素受体结构特征、雌激素受体与乳腺癌的相关性与信号转导途径，以及雌激素受体调节剂、雌激素受体拮抗剂研究进展进行综述，为进一步深入研究雌激素受体在乳腺癌发生发展中的作用及分子机制提供理论基础，并为设计新颖候选药物提供思路。雌激素信号在人类乳腺癌的发生发展中至关重要。在过去几十年中，人们致力于研究雌激素信号通路在乳腺癌中的潜在作用机制，并发展了抗雌激素疗法。研究发现，雌激素的多种活性由雌激素受体（estrogen receptor，ER）介导。雌激素能够上调c-Myc 和 cyclinD1 的表达和功能，激活细胞周期蛋白 E-Cdk2 复合物，并加快乳腺上皮细胞从 G1 期到S 期的细胞周期进程 [1]。因此普遍认为 ER 能够促进雌激素靶基因的表达，导致雌激素刺激的乳腺癌的发生发展。当前有 2 种已鉴定的 ER——ERα 和ERβ，它们都是刺激靶基因转录的配体激活的转录因子 [2]。但是，并不是所有由 ER 介导的活性都是通过对基因转录的直接作用来实现的。研究发现，还存在另一种信号转导途径，其涉及细胞质信号蛋白、生长因子受体和其他膜启动的信号转导途径， 被称为非经典信号转导途径。研究表明，G 蛋白偶联 ER（G protein-coupled estrogen receptor，GPER/GPR30）介导了对雌激素的快速、非基因组反应 [3]。乳腺癌细胞中非基因组雌激素信号转导也已被证实可促进细胞增殖和存活。快速的非基因组雌激素信号转导与乳腺癌细胞中雌激素诱导的增殖有关。因此，ER 与乳腺癌具有相关性。本文对 ER 结构、信号转导途径及 ER 与乳腺癌相关性研究进展进行重点介绍，以期为设计新颖的乳腺癌治疗候选药物提供思路。 1  雌激素简介雌激素是一类多效性类固醇，在多种组织生长和分化的过程中具有调节作用。雌激素家族包括雌酮（estrone，E1），雌二醇（17β-estradiol，E2）和雌三醇（estriol，E3）。E1 于 1929 年首次从妊娠马尿中以结晶状态被提制出来 [4]。E1 通常由特殊的腹部脂肪细胞产生，自然绝经的女性体内的雌激素主要为 E1。在怀孕期间，女性体内的 E1 含量较高， 此外，肾上腺皮质中 E1 含量也较高。E2 于 1935 年从妊娠马尿中首次被提取。有研究表明 E2 主要产生于乳房、大脑和脂肪组织，由细胞色素 P450 酶将睾丸激素和雄烯二酮转化为 E2。E3 主要在妊娠期间由硫酸 16-羟基脱氢表雄酮、17β-E2 或睾丸激素芳香化形成的 E2 产生，而 E1 则由雄烯二酮芳香化产生 [5]。雌激素周期性的生成与分泌对细胞生长和分化及人类第二特征的发育具有至关重要的作用。雌激素对女性的乳房、子宫内膜的发育及月经具有调节作用。E2 对女性生殖器官的形成以及骨骼、心血管和神经系统的发育均具有调控作用，且对胎儿大脑的形成与发育具有重要影响。同时，雌激素可促进男性精子的成熟 [6]。 2 雌激素受体及其结构特征ER 是配体依赖的转录调节因子，属于核受体超家族成员 [7]，雌激素可通过与 ER 特异性结合发挥作用。ER 作为一种古老的蛋白质，在所有脊椎动物及部分无脊椎动物体内均有表达 [8]。ER 位于细胞膜、细胞质或细胞核，根据 ER 所在位置的不同可分为两大类：一类是位于细胞核内的 ER，其被称为经典的核受体，包括 ERα 和 ERβ，它们可通过对特异性靶基因的转录的调控发挥生物学效应；第二类为位于质膜的膜性受体，包括经典核受体的膜性成分及G 蛋白偶联受体家族的 GPR30（GPER-1）、Gαq-ER 和质膜相关的 ER（ER-X），它们可通过第二信使调控基因转录，间接地发挥生物学效应。2.1  ERα 和 ERβ1986 年，Greene 等 [9] 克隆出雌激素受体，这是第一个雌激素结合蛋白受体，现在被称为 ERα。1996 年，Kuiper 等 [10] 发现并克隆出一种新的 ER， 并将其命名为 ERβ。ERα 和 ERβ 基因位于不同的染色体上，分别位于 6q25.1 和 14q23.2 上。ERα 与ERβ 具有相同的结构体系，两者均由 3 个独立但相互作用的功能结构域组成：NH2 末端域（NTD）、DNA 结合域（DBD）和 COOH 末端配体结合域（LBD）。除在 NTD 外， 这 2 个受体具有高度的氨基酸序列同源性。NTD 包含一个与靶基因转录激活有关且不依赖配体的激活功能（AF1）域，NTD 在 ERα 和 ERβ 之间只有 16 ％的相似性。而 DBD 在 ERα 与 ERβ 之间的相似性极高，具有 97％的氨基酸同一性 LBD 在 ERα 与 ERβ 之间具有 59% 的氨基酸序列同一性，但两个亚型的 LBD 仅在结构上有细微差别，而这微小的结构差异使得其所结合配体有所不同。LBD 中含有激素依赖的激活功能区2（activation function 2，AF2），其对配体结合和受体二聚化具有重要意义。共激活因子 NCOA1、NCOA2、NCOA3、CREBBP、PPARBP、P68 和SRA 等与共抑制因子 NCOR1、NRIP 等的蛋白质可以与配体结合的 ERα 或 ERβ 相互作用，影响 ER 的激活或激活 ER 抑制基因[11]。ERα 与 ERβ 通过募集不同的转录共调节因子（CoR）调节转录，这些 CoR 对基因的活化或抑制发挥着重要作用。但是这些 CoR 中只有不到 50% 是 ERα 与 ERβ 所共有的，表明 ERα 与 ERβ 之间的差异可能有利于两种受体亚型发挥不同作用 [12]。对激动剂E2 与拮抗剂他莫昔芬（Tam）、雷洛昔芬（Ral）、氟维司群（ICI 182780，ICI）分别与 ERα 结合所形成的复合物进行的比较分析表明，ER 配体之间存在显著差异，这与它们的生物学活性有关。特别是具有 E2 依赖性的核 ERα 与 E2 形成的复合物和 Tam、Ral 或 ICI 与E2 结合形成的复合物不同且更为复杂，Tam、Ral 或 ICI 与 E2 形成的复合物彼此之间又存在显著差异[13]。2.2  GPR30GPR30 是 20 世纪 90 年代发现的一种 ER，但是直到 2005 年才被确定为一种新的 ER。最初，人们观察到雌激素可刺激乳腺癌 MCF-7 细胞（ERα 阳性） 产生 cAMP，于是将这种现象归因于 ERα 的活化。但雌激素的刺激并不能使 MDA-MB-231 细胞（ERα 阴性）产生 cAMP，所以人们认为 GPR30 是与内质网相关的非核 ER 蛋白。现已知产生这种现象的原因是 MCF-7 细胞表达 GPR30，而 MDA-MB-231 细胞不表达。GPR30 既与 ERα 和 ERβ 有很大的不同，又与其有一定的相似性。例如 GPR30 在分子结构、配体特异性、作用方式以及介导效应等方面与 ERα 和ERβ 均有较大的差异。但是，上述受体都能与E2 结合， 这可能是因为它们的配体结构域相同。GPR30 是一种G 蛋白偶联的七跨膜受体，位于 7p22.3 染色体上， 由 3 个外显子组成。不同物种间的 GPR30 蛋白结构具有差异性，其中人的 GPR30 包含 375 个氨基酸， 理论相对分子质量约为 41 000。有报道称，GPR30 定位于内质网和高尔基体，并且存在于质膜中 [14-15]。与其他G 蛋白偶联受体相同，GPR30 的N 末端位于细胞外，而羧基末端位于细胞内。配体可能与 N- 末端结构域缔合以激活受体。GPR30 对 E2 具有高亲和力，GPR30 与 E2 结合可迅速而短暂地激活许多细胞内信号通路。雌激素激活该受体信号转导途径导致cAMP 产生增加、细胞内钙和磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸酯的合成增加、表皮生长因子受体（EGFR）反式激活以及诸如胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）- 蛋白激酶 B（Akt）和细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号转导通路的下游活化。E2 刺激细胞后，在快速非基因组信号传递中，GPR30 起主要作用。2.3  ER-X 和 Gαq-ERER-X 既不属于经典的核受体，也不是核受体的变异体，它与 ERα 有相同的 DBD 区域，但它不是ERα 的剪切体，可能是由一种新的基因转录而来。高表达的 ER-X 见于野生型与 ERα 基因敲除鼠、出生 1 ~ 7 d 后的转基因阿尔茨海默病模型鼠的新皮质、下丘脑及小脑，缺血性脑损伤或可诱导 ER-X 的表达。ER-X 可能具有引导脑自分泌和旁分泌的功能， 有保护神经元的作用。在稳态条件下，ER-X 主要存在于核内，并且在功能域、结合亲和力和配体特异性方面与 ERα 和 ERβ 存在差异。E2 作用于乳腺癌细胞产生的某些反应，如雌激素对不含雌激素共有应答元件（ERE）细胞的调节能力，以及雌激素的快速作用，可以通过 ER-X 来解释。虽然雌激素快速反应似乎与经由核内受体的直接转录调节不一致， 但是 ER-X 可能与信号转导途径偶联，与生长因子的快速活化有关 [16]。用全细胞记录方法在 GPR30 敲除豚鼠的弓状核实验中发现了一种依赖 Gαq 蛋白的膜性受体 [17]，其不同于其他膜性受体而是一种调节 B 型 γ-氨基丁酸受体（GABAB 受体）去敏感化的 ER，主要通过 Gαq 蛋白激活磷脂酶 C 升高环磷酸腺苷（cAMP）、调控蛋白激酶 A（PKA）， 并最终改变基因的转录活性 [18]。这是 2 种新的 ER， 目前对 ER-X 和 Gαq-ER 的研究并不多，有待进一步探索。 3 雌激素受体的信号转导途径 3.1  ERα 和 ERβ 的信号转导途径 ER 介导 2 种不同类型的信号转导途径，通常称为基因组途径和非基因组途径。ERα 和 ERβ 是控制各种生理过程的核受体超家族的成员，而它们的调控作用通常被认为是通过调节基因转录来完成的[19]。ER 能够利用多种机制激活或抑制其靶基因的转录。这些机制包括：1）配体同受体结合与 DNA 在雌激素应答元件上的直接相互作用，然后募集转录共调节因子或介体复合物 [20]。2）与配体结合的 ER 与其他转录因子如激活蛋白-1（AP-1）、特异性蛋白 1（Sp1）或核因子 κB（NF-κB）之间相互作用 [21-22]。许多雌激素反应性基因的启动子可能只包含 ERE 的一半位点序列，而不是完整的 ERE，与配体结合的ERα 或ERβ 可以与 AP-1、Sp1 或 NF-κB 形成蛋白质- 蛋白质复合物，然后与ERα 或ERβ 的反应元件结合在调控基因的启动子中。3）通过隔离常见转录成分间接调节基因转录 [23]。4）通过 MAPK/ERK 途径直接磷酸化和活化未结合的ER 受体 [24]。此外，ER 通过这些机制调节转录的能力似乎是细胞类型特异性的，这可能是由于每种细胞类型中可用的转录共调节因子的补体差异所致 [25-26]。同样，转录调控取决于配体的性质，各种天然和合成的选择性 ER 调节剂 （selective estrogen receptor modulator，SERM） 通过这些机制充当 ER 的激动剂或拮抗剂。 3.2  GPR30 信号转导途径 GPR30 信号转导途径为非基因组信号转导系统。非基因组信号转导系统，在雌激素刺激后几分钟之内即可在细胞质或细胞膜上启动，又被称为快速信号转导途径。快速信号转导途径由与质膜相关的雌激素结合蛋白介导，并通过各种细胞质信号转导蛋白，如通过生长因子受体和 G 蛋白偶联受体信号通路转导蛋白 [27]。此外，在子宫和卵巢细胞以及骨、血管内皮细胞和神经细胞中也发现了这种雌激素信号，表明快速、非基因组的雌激素信号转导参与了各种生理和病理活动 [28]。目前已证实乳腺癌细胞中的非基因组信号转导对乳腺癌细胞具有增殖促进作用 [29]。 E2 可与膜受体 GPR30 结合，导致乳腺癌细胞系中三聚体 G 蛋白活化，活化的三聚体 G 蛋白中的α 亚基诱导腺苷酸环化酶活化，并使α5β1 整联蛋白活化，从而释放细胞内金属蛋白酶以及结合肝素的EGF 样生长因子（HB-EGF）[30]。HB-EGF 可引起EGFR 的反式激活，激活ERK1/2 MAPK 和Akt 途径。GPR30/EGFR 信号转导介导乳腺癌患者癌症相关成纤维细胞（CAF）中细胞周期调控基因的表达，表明乳腺癌细胞与 CAF 之间存在功能性相互作用。此外，GPR30 信号级联反应的激活触发了低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和依赖性血管内皮生长因子（VEGF） 表达，表明 GPR30 参与乳腺癌的血管生成和进一步发展。另一方面，Broselid 等 [31] 认为，GPR30 可以通过与膜相关鸟苷酸激酶和蛋白激酶 A- 锚定蛋白 5 形成膜复合物来抑制 cAMP 的产生，同时，乳腺癌细胞内的钙离子水平也会发生改变，表明 E2 可与膜受体 GPR30 结合，激活相关通路，从而促进乳腺癌细胞的增殖，同时，这些途径的激活也可能激活与肿瘤细胞存活有关的基因，使肿瘤细胞的活性增强。在 ERα 阴性且 GPR30 阳性的 SKBR-3 细胞中，E2 通过激活 GPR30/EGFR/MAPK 信号级联反应诱导c-Fos（参与细胞增殖、分化的转录因子）的表达。MAPK 可激活转录因子，如血清反应因子（SRF）。由 GPR30 信号转导引起的cAMP 的增加，可能会激活环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）。这些因子进而激活转录因子（例如 c-Fos、FosB、c-Jun、EGR1、ATF3、C/EBPd 和 NR4A2）的表达 [32]，进而促进乳腺癌细胞增殖。 4 雌激素受体与乳腺癌的相关性 4.1  ERα 与乳腺癌的相关性 ERα 在正常乳腺上皮中的表达率不超过 10％， 但在乳腺肿瘤中约占 50% ~ 80%[33]。ERα 敲除小鼠实验已经证明了 ERα 在乳腺发育中具有促进乳腺肿瘤形成的作用 [34]。人类 ERα 基因的转录至少发生于2 个不同的启动子，其中远端启动子（启动子 B） 位于近端启动子（ 启动子 A） 上游 2 kb 处。来自2 个启动子的所得转录仅在 5' 端的非编码区不同， 且 2 种类型的 ERα mRNA 均编码相同的蛋白质。总ERα mRNA 的表达水平和启动子 B 的转录水平与人原发性乳腺癌中 ERα 蛋白的含量密切相关。其中启动子 B 会导致 ERα 蛋白的过度表达，表明启动子 B 在调控人乳腺癌 ERα 基因表达中起着促进作用 [35]。研究人员还发现了一种新型的反式作用因子，即 ER 启动子 B 相关因子 1（ERBF-1），ERBF-1 可降低ERα 阳性乳腺癌细胞系中启动子 B 的转录活性。尽管对乳腺癌发展的机制了解甚少，但 ERα 基因功能的丧失是抵抗激素的最重要步骤之一。最近的研究报道，在人类乳腺癌细胞系中，ERα 基因启动子 A 和外显子 1 的甲基化与 ERα 基因表达呈负相关。体外实验中 ERα 基因启动子的特异性甲基化直接降低了 ERα 基因的转录水平 [36]。因此促进启动子的甲基化，从而使 ERα 基因表达降低，可能是研制新型抗雌激素药物的一个新方向。目前尚无对导致肿瘤组织中ERα 蛋白过度表达的启动子B 区甲基化的研究。 4.2  ERβ 与乳腺癌的相关性 ERβ 的表达与人类乳腺肿瘤中细胞增殖标志物Ki67 和细胞周期蛋白 A 升高有关 [37]。ERβ 的水平在正常乳腺组织中较高，并且随着肿瘤从浸润前肿瘤发展为肿瘤而降低。ERβ 的表达与孕激素受体表达升高和乳腺肿瘤细胞的增殖具有很强的关联性。接受 Tam 治疗的女性中，ERβ 蛋白的表达升高使肿瘤细胞的增殖率明显下降 [38]。这些研究表明，ERβ 可能起到抑癌作用，而 ERβ 的丢失会促进乳腺癌的发生。然而，由于乳腺肿瘤同时表达 ERα 和 ERβ， 因此 ERβ 在乳腺癌中的作用尚不清楚。目前仅在含有 ERα 和 ERβ 的 MCF-7 细胞中研究了 ERβ 对细胞增殖和肿瘤形成的影响。 4.3  GPR30 与乳腺癌的相关性 有研究认为，GPR30 可能通过诱导 ER 阴性乳腺癌细胞停滞于 G2/M 期，G2 检查点调节细胞周期蛋白 B 的下调以及诱导线粒体相关凋亡来抑制癌细胞的生长。此外，GPR30 激动剂 G1 可诱导由GPR30/EGFR 信号介导的 ERK1/2 的持续激活和核易位 [39]。而三阴性乳腺癌常常过度表达 EGFR 和GPR30，提示可能是 E2 通过刺激 GPR30 引起乳腺癌细胞的增殖。有研究认为，可通过降低 GPR30 的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖 [40]。Marjon 等 [41] 采用 GPR30 基因敲除小鼠和正常小鼠构建了乳腺癌模型，发现在第 12 ~ 13 周时，敲除 GPR30 基因的小鼠乳腺癌肿块显著小于对照组小鼠，且其乳腺癌细胞增殖率及转移率亦显著低于对照组小鼠。 5 雌激素受体调节剂 SERM 是一类新的治疗剂，可用于预防和治疗子宫癌和乳腺癌。其对 ER 具有高亲和力，但对任何其他类固醇激素受体没有特异性亲和力。目前， 常用的 SERM 有 Tam、Ral、巴多昔芬（BZA）等。SERM 会刺激骨骼、肝脏和心血管系统等产生雌激素作用，但会阻断乳房和子宫等其他组织器官的雌激素作用。SERM 具有下调 ER 的能力，ER 在乳房和子宫中均具有重要意义 [42-43]。Tam 是一种非甾体三苯乙烯衍生物，对不同的 DNA 调控元件（例如特定的雌激素反应元件、Sp1 位点和 AP-1 位点） 起部分或全部激动剂的作用。NH2 末端 AF1 可影响Tam 的激动剂活性。另一方面，AF1 和 AF2 两者的协同作用对于雌激素诱导的受体活性具有较大影响。但是，目前 Tam 的作用机制尚未完全明确。Tam 能够使乳腺癌患者复发率降低 50%，但同时其具有显著的不良反应，其中包括造成患者死亡率上升。因此，研究人员开发了基于 Tam 非甾体三苯乙烯结构的托瑞米芬、屈洛昔芬和伊多昔芬之类的药物，但其疗效不及 Tam。Ral 为一种具有苯并噻吩核心的多羟基化非甾体化合物，是一种抗雌激素药。该药可显著降低患 ER 阳性乳腺癌的风险，用于预防和治疗骨质疏松症和乳腺癌。基于非甾体吲哚的雌激素激动剂 / 拮抗剂 BZA， 对 ERα 和 ERβ 均显示出亲和力，而对 ERα 的亲和力稍高，且在任一受体上均是 E2 的竞争性抑制剂。BZA 不会促进乳腺细胞的增殖，在E2 的存在下也不会促进乳腺细胞的增殖， 并可抑制乳腺癌细胞对E2 剂量依赖性的增殖。因此， 与 Ral 相似，BZA 在乳腺组织中可能是拮抗剂 [44]。 Tam 可延长乳腺癌患者生存期，降低复发率， 但其具有较大毒副作用，且患者易对 Tam 产生耐药性。因此，研究人员开发了基于 Tam 的非甾体三苯乙烯结构的托瑞米芬（Tor）、屈洛昔芬（Drl）等药物 [45]。然而，这些药物对一般患者与耐药患者的疗效与 Tam 相比均无明显优势 [46-47]，与 Tam 相比，Tor 具有相似功效，但激动剂的活性较低。此后， 研究人员还开发了具有独特结构的第 2 代和第 3 代SERM[“固定环”苯并噻吩衍生物，如 Ral、阿佐昔芬（Arz）和 ERA-923]。Ral 能够显著降低患 ER 阳性乳腺癌的风险，该药的不良反应包括引起潮热和腿抽筋等 [48]。EM-800 为第 4 代 SERM，对乳腺癌和子宫内膜癌细胞增殖具有极强的抑制作用 [49]。 香豆素类 SERM 可产生与一般 SERM 类似的作用。香豆素广泛存在于植物体内，数十年来，研究人员已通过合成技术合成了许多香豆素衍生物，如呋喃香豆素、吡喃香豆素和香豆素磺酸盐等，它们具有广泛的生物活性，如抗肿瘤和抗 HIV 作用，以及兴奋神经中枢、抗菌、抗炎、抗凝等作用 [50]。香豆素类 SERM 与一般的 SERM（如 Tam）的结构特征有所不同，可能诱导 ER 发生不同的构象变化， 导致不同的辅因子募集；此外，香豆素类 SERM 不通过 ERE 激活基因，而通过以高亲和力结合 ERα 达到有效拮抗雌激素的作用。香豆素类 SERM 通过抑制白细胞介素（IL）-6 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的表达，在 ERα 阳性的乳腺癌细胞中发挥有效的抗雌激素作用[51]。 6 雌激素受体拮抗剂 在临床研究中，防止雌激素合成和发挥作用是治疗乳腺癌的有效手段。ER 拮抗剂即具有防止雌激素合成和发挥作用的功效。ER 拮抗剂是治疗绝经后妇女激素依赖性乳腺肿瘤的有效途径 [52]。原位合成导致的高水平雌激素与内分泌依赖性组织中肿瘤的生长有关。雌激素仅在周围组织中形成，在此类组织中与雌激素合成有关的途径有 2 种，即芳香化酶（AR）途径和 E1 硫酸酯酶途径（E1-STS）。AR 途径是通过 AR 复合物将雄激素前体、雄烯二酮（主要由肾上腺皮质分泌）转化为 E1，而 E1-STS 是通过硫基转移酶将 E1（通过 AR 途径形成）转化为硫酸 E1（E1S）[53]。在乳腺肿瘤中，硫酸酯酶的活性高于 AR，导致预后不良。E1-STS 通路被认为是雌激素形成的主要来源，导致 ER 表达阳性的乳腺肿瘤患者对高效 AR 抑制剂的应答率低。此外，研究表明，抑制类固醇生物合成级联酶的内分泌治疗可能是治疗该疾病的一种可能途径[54]。 7 结语 雌激素通过 ER 在各种生理过程中发挥重要作用，例如雌激素信号转导异常会促使癌症及一些代谢性疾病的发生。通常，在癌症早期ERα 及 GPR30的表达会增加，并充当肿瘤启动子。相反，ERβ 的存在可抑制乳腺癌细胞的增殖，因此，ERβ 是潜在的癌症治疗靶标。但是，目前已报道了一些关于ERβ 在癌症中的表达与功能相矛盾的发现，这种差异可能反映了患者群体的异质性。因此，需要进一步探索 ERα、GPR30 和 ERβ 在癌症中的作用机制。同时，ER-X 和 Gαq-ER 的作用机制尚不明确，有待进一步研究，以期为进一步研制乳腺癌治疗药物提供新的思路和方向。虽然目前已有多种乳腺癌治疗药物，但耐药性的产生是临床上面临的另一个巨大挑战，设计与发现新颖的具有选择性抗雌激素潜能的候选药物仍是该领域的研究热点。 8 参考文献 Frasor J, Danes J M, Komm B, et al. 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