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文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 一项发表在Cell Research的前沿研究Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal–distal patterning of the human lung at the embryonic stage，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组技术的强强联合，为人类肺脏早期发育提供了前所未有的精细视图。本文将为您揭示这项技术如何帮助科学家们洞察肺部近端-远端模式形成的关键机制，并探讨其对临床实践的重大意义。 研究背景 肺脏发育是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型的分化与互动。传统研究手段虽能提供部分信息，但在捕捉细胞层面动态变化方面显得力不从心。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的问世改变了这一局面，它使研究人员得以前所未有的精度观察细胞内部活动，尤其是那些在早期发育阶段发生的变化。 此外，空间转录组技术进一步增强了研究能力，它能够在保持细胞空间位置的同时分析其基因表达情况，这对于理解器官发育过程中细胞间的相互作用至关重要。 值得注意的是，此前对于早期发育阶段的数据相对匮乏，而本研究选取了从第4周到第8周的胚胎期乃至早期假腺期的人类样本进行单细胞测序分析。相比之下，已有较多研究关注于更晚发育阶段的单细胞测序。因此，本研究填补了这一领域的空白，提供了早期胚胎肺发育的重要数据支撑。 研究设计与结果 研究者使用了单细胞RNA测序技术对4-8周的人类胚胎肺组织进行分析，构建了一个包含超过16万个细胞的转录组图谱。通过这个图谱，研究者们不仅识别出了近端与远端上皮细胞之间明显的基因表达差异，而且还发现了多个调控近端-远端模式形成的转录因子，如THRB、EGR3、ETV1以及SOX6。 更重要的是，通过对早期胚胎基质细胞群的细致剖析，揭示了一个BDNF+的基质细胞群体，它们在近端-远端模式形成中扮演着重要角色，并具有空间特异性。 接着采用了空间转录组技术，对6周的肺组织切片进行了空间转录组学分析。将分子特征映射到了解剖尺度上，对细胞类型及其分子标志物在近端与远端上皮中的分布情况进行展示。 图1：主要的肺细胞类型出现在人类胚胎肺发育的开始 研究者选取了人类胚胎肺（4-8周）进行采样，涵盖了胚胎和早期假腺体阶段。通过单细胞转录组测序分析，鉴定了六种人类胚胎肺细胞类型：间质细胞、上皮祖细胞、神经嵴祖细胞、内皮祖细胞、原红细胞和巨噬细胞（图1b-d）。研究发现，在第4周时，所有六种细胞类型均已出现，表明肺器官发生始于复杂的细胞相互作用（图1e）。 图2：TFs调节早期上皮细胞的近端-远端模式 进一步分析发现，在4-8周，大多数近端（如基底细胞和纤毛细胞）和远端（如肺泡I型和II型细胞（AT1和AT2）祖细胞已经出现（图2a）。近端/远端祖细胞的异质性促使我们研究了转录因子的作用，这些转录因子是发育过程中细胞命运决定的主要驱动因素。研究表明，KLF5/SOX2调控近端细胞命运，而ETV5/SOX9则调控远端细胞命运（图2c）。 自第4周起，便观察到明显的近端-远端表达模式，直到第6周后SOX2hi/ETV5lo上皮细胞中远端因子显著下调，而SOX2和SOX9在这两个细胞群体中一直共表达（图2e-f），这表明近端特异性大约在第6周开始形成。由此得出结论，肺上皮细胞的近端-远端模式自第4周起就开始形成，并由不同的转录因子组合引导。 图3：多种基质细胞类型表现出近端-远端空间异质性 除了内在的转录因子，由中胚层衍生的间充质细胞所形成的微环境对于肺上皮形态发生至关重要。为了进一步了解间质细胞的空间特性，特别是它们与上皮层的距离，研究者利用空间转录组测序技术，将分子特征映射到解剖尺度上（图3d）。通过该技术，研究者观察到在近端和远端上皮中分布的不同上皮亚型，包括SOX2hi/ETV5lo和SOX9hi/ETV5hi及其分子标记物（图3e-f）。 通过计算间质亚型与近端/远端上皮之间的空间距离（图3g），研究者发现CRABP1+基质细胞密集地包围着气管管腔，而COL9A2+上皮细胞则位于左、右支气管附近。相反，BDNF+上皮细胞主要分布在边界区域，暗示其在建立远端上皮微环境中的关键作用。气道 平滑肌细胞（ASMC）围绕上皮分布，而血管平滑肌细胞（VSMC）则分散，没有典型的模式。单分子荧光原位杂交（smiFISH）技术验证了COL9A2+细胞和ASMC的定位（图3h）。 值得注意的是，LIMS2被鉴定为新的ASMC标志物。这些结果揭示了间质亚型在空间上的特异性分布及其在胚胎肺器官发生过程中作为上皮形态发生微环境提供者的多样性作用。 图4：SC_BDNF+基质细胞为早期肺上皮细胞的发育提供信号 进一步的研究发现，BDNF+基质细胞亚型是上皮受体相关的间质来源配体（图4a）。这类细胞在胚胎第4周出现，并随肺发育逐渐减少（图4b）。BDNF+细胞的标志基因BDNF和FGF10在器官形成期间下调（图4c），显示出其在早期发育中的特殊作用。配体-受体分析表明，BDNF+间质亚型主要表达BDNF、FGF9/10、WNT2/2B等配体，这些配体的受体主要由上皮细胞表达，提示BDNF+间质细胞与上皮细胞之间存在特异性通信（图4d）。 smiFISH验证了这一结果（图4e）。此外，向肺上皮祖细胞类器官中添加BDNF可以改善其存活、生长和分支（图4g-h）。这些结果表明，SC_BDNF+间质细胞作为一种胚胎特异性亚型，在早期肺发育中对上皮分支形态发生具有重要作用。 图5：ASMC和VSMC的发展轨迹推断 为了进一步推断了ASMC和VSMC的分化调控程序，作者对SMC细胞进行了拟时序分析（图5a-b），在4周时就发现SMC向ASMC或VSMC分化的偏向性，早于之前研究解剖学的观察（6周时）。间充质细胞中的核心转录因子如MEIS2、SHOX2、TWIST1在SMC发育过程中逐渐下调，而SMC标记物ACTA2和TAGLN在两类SMC中均逐步上调，ASMC和VSMC各自的标记物MYH11和MEF2C也随着发育时序在各自亚型中上调（图5c）。 进一步研究还发现了一系列具有有高调控子活性和特定的转录模式的调控SMC向VSMC和ASMC分化的新型转录因子，如EBF1对VSMC，FOXF1对ASMC（图5d），并通过smiFISH验证了这一结果（图5e）。 此外，ASMC特异性表达IGF1、CXCL14、SSC5D和ENPP作为与上皮受体相互作用的配体（图5f）。这些发现揭示了ASMC在肺发育中的关键作用，表明表达这些配体的SMCs可以建立支持上皮发育的微环境，有助于改进体外肺器官模型的生成。 拓展延伸 单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组技术在其他许多科研领域也有广泛的应用前景。下面我们将探讨这两种技术如何在不同的生物学研究中产生深远影响。 ●癌症研究 单细胞RNA测序技术能够帮助科学家们识别肿瘤微环境中的细胞异质性，这对于理解癌症的发生发展机制至关重要。通过分析肿瘤细胞及其周围非肿瘤细胞（如免疫细胞、成纤维细胞等）的基因表达谱，研究人员可以发现肿瘤细胞如何逃避免疫监视，以及它们是如何与周围的微环境相互作用以促进肿瘤生长。此外，空间转录组技术还能提供这些细胞在肿瘤组织中的精确位置信息，进一步揭示细胞间复杂的相互作用，从而为制定更有效的个性化治疗方案提供理论依据。 ●免疫学应用 免疫系统是一个复杂的网络，包含了多种多样的细胞类型。单细胞RNA测序技术使得研究人员能够详细分析免疫细胞的多样性，了解不同免疫细胞亚群的功能特性。例如，在病毒感染或自身免疫性疾病中，通过比较健康个体与患病个体的免疫细胞组成差异，可以发现新的免疫反应机制。空间转录组技术则有助于理解免疫细胞在感染部位的分布情况，这对于研究免疫应答的局部化效应具有重要意义。 ●神经科学应用 大脑是人体中最复杂的器官之一，其功能依赖于高度异质化的神经元和其他支持细胞的协调工作。单细胞RNA测序技术使神经科学家能够对不同类型的神经元进行分类，并研究它们之间的功能差异。特别是在发育神经生物学领域，这些技术帮助揭示了神经元如何从前体细胞分化而来，以及它们如何形成复杂的神经网络。空间转录组技术则允许研究者在保留细胞空间位置的情况下分析基因表达模式，这对于理解大脑发育过程中细胞排列规律及功能区划分具有不可替代的价值。 ●发育生物学应用 除了肺发育之外，单细胞RNA测序和空间转录组技术也被广泛应用于其他器官系统的发育研究中。例如，在心脏发育研究中，这些技术有助于鉴定参与心肌细胞分化和心脏形态发生的转录因子；在肝脏发育研究中，则可以用来追踪肝细胞的起源和成熟过程。通过整合这些数据，研究人员能够构建出更加完整的器官发育图谱，为理解各种发育缺陷提供新的线索。 ●再生医学应用 再生医学致力于通过细胞疗法或组织工程手段修复受损组织和器官。单细胞RNA测序技术能够帮助鉴定具有再生潜能的干细胞群体，并揭示它们在特定生理或病理条件下的行为变化。空间转录组技术则有助于确定这些细胞在体内的确切位置，这对于指导细胞移植和组织重建具有实际意义。 临床应用与展望 从临床角度看，单细胞RNA测序与空间转录组技术通过精确定位基因表达变化，促进了肺疾病如先天性肺发育不良和慢性阻塞性肺病的深入理解，有望催生更精准的诊断与治疗方案。这两项技术不仅推进了基础科学研究，也为临床医学带来了革新机遇，预期未来将有更多基于这些技术的新疗法出现，改善患者的生活质量。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Cao S, Feng H, Yi H, Pan M, Lin L, Zhang YS, Feng Z, Liang W, Cai B, Li Q, Xiong Z, Shen Q, Ke M, Zhao X, Chen H, He Q, Min M, Cai Q, Liu H, Wang J, Pei D, Chen J, Ma Y. Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal-distal patterning of the human lung at the embryonic stage. Cell Res. 2023 Jun;33(6):421-433. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多实验技术服务支持~

T细胞耗竭受多因素影响，是多种状态叠加的结果，表现为效应功能和增殖能力降低、免疫检查点受体表达。(T细胞耗竭，三类免疫细胞耗竭表型异同）。CD8+T细胞通过TCR接触抗原时，效应功能相关基因Prf1、Gzmb被去甲基化，并获得染色质可及性改变(转录和翻译时的染色质开放程度)，同时初始表型(naive)相关基因被抑制。如TCR在抗原持续刺激，CD8+T细胞会逐渐转变为耗竭T细胞(Tex)。调控耗竭的基因保守性非常高，表观遗传调控(包括转录因子、组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质可及性发生改变)扮演核心角色。TCR信号塑造Tex细胞表观遗传特征T细胞耗竭是一种进行性状态，随着接触抗原的时间和强度的增加，效应功能和增殖能力逐渐降低。1. 耗竭程度随抗原接触时间加重在慢性抗原接触早期，T细胞向Tex祖细胞转化，并会在持续的抗原刺激下继续转化为其他两种Tex细胞亚群。对LCMV感染的Tex细胞进行的ATAC-seq分析表明，每种Tex细胞亚群表达d 不同转录因子基序，可能是Tex各状态转化的基础。耗竭初期的Tex祖细胞：    TCF-1、BACH2活性增强。    具有接触抗原后产生增殖和自我更新的能力，耗竭中期的暂时性Tex细胞：    富含转录因子T-bet、RUNX基序。    表达PD-1、CX3CR1，具有显著的增殖和效应功能耗竭晚期的终末Tex细胞：富含转录因子NR4A、Eome基序。       表达PD-1、TIM3、LAG3、CD38、CD39和CD101多种耗竭标志物，表现出严重的功能缺陷。将初始T细胞转移到TME不同时间后再移出，处于早期的Tex细胞可以恢复功能，且获得的表观遗传修饰可逆，而终末期Tex细胞则不能。2. 耗竭随TCR强度加重构建不同亲和力TCR的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL-N4、F6、D4)，在接触抗原一段时间后TCR亲和力较高的T细胞会转化为终末Tex细胞，效应功能降低；而亲和力较弱的则转化为过渡Tex，相比终末期Tex仍具有一定的效应功能。亲和力：N4>F6>D4同时伴有相当多的基因差异表达：J Exp Med. 2022 Feb 7;219(2):e20201966.功能障碍、耗竭相关转录因子表达上调：TOX、Mafb、Tcf4、 Etv1分化相关转录因子表达下调：Tcf7(TCF1)、Runx1、Klf2、Stab6TOXTex的关键转录因子通过对肿瘤基因差异表达分析中发现，与Teff和Tmem细胞相比，Tex中转录因子TOX的表达差异最大，而且其染色质可及性增加。Nature. 2019 Jul;571(7764):211-218. fig2通过诱导Tex的转录程序，导致多种抑制性受体和耗竭相关基因表达增加，Teme表型基因被沉默。Nature. 2019 Jul;571(7764):211-218. fig5并且在移除抗原刺激后TOX的表达未来能完全逆转：Tex和移除抗原的REC-Tex细胞中TOX呈现高表达Nat Immunol. 2021 Aug;22(8):1008-1019.表观遗传改变具有持久性Tex的表观遗传改变具有相当高的稳定性，这种改变是一个持久的“伤痕”。即使在使用PD-1阻断剂或在消除抗原刺激后，Tex只能恢复部分功能，T细胞的功能受损仍持续存在，甚至在接触到新抗原刺激后受损程度加重。使用PD-1抑制剂后细胞毒性物质分泌仍减少Science. 2016 Dec 2;354(6316):1160-1165.相较于记忆T细胞，REC-Tex细胞毒性作用仍有所降低Nat Immunol. 2021 Aug;22(8):1008-1019.ATAC-seq分析显示在去除抗原刺激的REC-Tex细胞中开放染色质区域的改变并未完全恢复，仍与Tex细胞高度相似。开放染色质区域(OCR)Nat Immunol. 2021 Aug;22(8):1008-1019.Tex的表观遗传改变部分由DNMT3A介导，虽不受PD-1阻断剂影响，但PD-1阻断剂与DNMT3A抑制剂联用却能改善Tex细胞增殖能力。同时，DNMT3A敲除的CAR-T表现出一定的抗肿瘤效应。基于表观遗传调控，DNMT3A应该会是是CAR-T肿瘤治疗的很有希望的靶点。临床应用通过CRISPR-CAS9技术、单细胞或多基因组图谱方法，能够表征免疫细胞功能和T细胞耗竭时的表观遗传改变。通过靶向表观遗传高通量技术进行基因组工程靶点筛选，结合细胞和基因层面的工程化技术对T细胞进行改造将会是未来临床药物研发的趋势。特别是在TCR-T和CAR-T的细胞治疗领域，对患者的个体化分析能够为其量身定做工程T细胞，极大改善个性化治疗的效果。小结T细胞发生耗竭时有多种表观遗传层面的改变，部分改变具有持久性，很难以单一变化作为针对T细胞耗竭的治疗手段。但在多种新兴技术的联合使用有望推动从表观遗传层面对肿瘤治疗的进展。参考资料Shakiba M et al. TCR signal strength defines distinct mechanisms of T cell dysfunction and cancer evasion. J Exp Med. 2022 Feb 7;219(2):e20201966. Beltra JC et al. Developmental Relationships of Four Exhausted CD8+ T Cell Subsets Reveals Underlying Transcriptional and Epigenetic Landscape Control Mechanisms. Immunity. 2020 May 19;52(5):825-841.e8. Yao C et al. BACH2 enforces the transcriptional and epigenetic programs of stem-like CD8+ T cells. Nat Immunol. 2021 Mar;22(3):370-380.Utzschneider DT et al. Early precursor T cells establish and propagate T cell exhaustion in chronic infection. Nat Immunol. 2020 Oct;21(10):1256-1266.Khan O et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 2019 Jul;571(7764):211-218.Pauken KE et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science. 2016 Dec 2;354(6316):1160-1165.Abdel-Hakeem MS et al. Epigenetic scarring of exhausted T cells hinders memory differentiation upon eliminating chronic antigenic stimulation. Nat Immunol. 2021 Aug;22(8):1008-1019.