NR2F2

引言当你在晨跑时是否能感受到双腿肌肉的律动，或是因情绪激动而面颊泛红？这背后都离不开一个精密系统的默默运作——血管网络。这个由动脉、静脉和毛细血管编织而成的三维管道系统，不仅承担着输送氧气和养分的重任，更是维持组织稳态的"隐形高速公路"。最新研究表明，人体血管的总长度可达10万公里，足以绕地球赤道两圈半。然而，这个庞大系统的构建过程却始终笼罩在神秘的面纱之下。4月17日发表在《Cell》杂志上的“Fate and state transitions during human blood vessel organoid development”揭示的成果，堪称血管发育研究的里程碑。研究团队运用单细胞多组学技术对hBVO发育过程进行了长达21天的动态追踪。当科学家利用小分子化合物组合诱导hBVO表达脑特异性转录因子LEF1时，电子显微镜下清晰可见类器官血管形成了类似血脑屏障的紧密连接结构。这种在体外重现器官特异性的突破，预示着未来或许能在培养皿中直接构建功能性的器官微环境。血管发育的基因蓝图：从干细胞到血管网络的时空交响曲在胚胎发育的第4天，一场关乎血管系统命运的关键抉择正在悄然上演。研究团队运用单细胞转录组测序技术，首次完整记录了人类血管类器官（hBVO）从多能干细胞到成熟血管网络的21天发育轨迹。数据显示，在分化第4天，约60%的中胚层祖细胞启动了内皮细胞（EC）分化程序，其标志性基因ETV2和KDR显著激活；而剩余40%的细胞则转向壁细胞（MC）谱系， ACTA2（平滑肌肌动蛋白）的表达量大幅增加。通过诱导型谱系追踪系统iTracer，科学家们首次捕捉到EC祖细胞（c14簇）的动态分化过程。这些细胞在分化初期同时表达内皮标志物NRP2和壁细胞标志物LUM，形成独特的过渡态群体。RNA速度分析显示，EC和MC的分化轨迹在第七天出现明显分叉，证实血管发育存在"非此即彼"的二元选择机制。基因调控网络的立体网络：16个核心调控因子的交响乐为了破译细胞命运决定的分子密码，研究团队开展了规模空前的CRISPR-Cas9全基因组筛选。通过构建包含数十个候选基因的干扰文库，结合单细胞转录组分析，最终锁定16个关键调控因子。这些因子构成三层调控网络：转录因子核心层：FLI1、MECOM、ERG组成EC命运决定的"铁三角"，其中MECOM缺失导致EC分化效率大幅下降；信号受体层：VEGFR2和NOTCH1形成血管发育的"阴阳双生系统"，VEGF-A浓度梯度通过调节DLL4/JAG1配体竞争决定动脉-静脉分化；表观调控层：染色质重塑复合体SWI/SNF通过动态调控染色质开放区域，控制PDGFRβ等壁细胞标志物的时空表达。尤为引人注目的是MECOM基因的双重角色：当其在EC祖细胞中过表达时，GJA5（动脉特异性连接蛋白）表达量提升；而在壁细胞中敲除MECOM，则导致IGFBP5（胰岛素样生长因子结合蛋白5）表达激增，这种双重调控机制为动脉粥样硬化治疗提供了全新靶点。时空密码的精准破译：染色质开放区域的动态交响单细胞ATAC-seq技术揭示了染色质开放区域的动态变化规律。在EC祖细胞（c14簇）中，位于GJA5启动子区的增强子区域在分化第6天出现显著的染色质开放信号，这与EC动脉化进程完美同步。有趣的是，移植到免疫缺陷小鼠体内的hBVO显示出独特的染色质重塑模式：原本处于关闭状态的静脉标志基因NR2F2（核受体亚家族2组F成员2）启动子区开放程度提升2.8倍，而动脉标志物CXCR4的染色质可及性下降40%，这种表观遗传的重编程完美模拟了胚胎发育中血流动力学对血管分型的调控作用。命运抉择的幕后推手：信号通路的阴阳博弈VEGF-Notch的黄金搭档：血管发育的动态平衡术通过药理学干预构建的"信号梯度板"实验，科学家们揭示了VEGF-A与Notch信号的精妙平衡机制。当VEGF-A浓度低于50 ng/ml时，EC增殖速率提升2.3倍；而浓度高于100 ng/ml时，则触发DLL4/Notch反馈环路，诱导动脉分化程序。移植实验进一步证实，体内微环境中的血流剪切力可通过激活Piezo1通道，将VEGF-A浓度梯度转化为动脉化的时空指令。Notch信号通路的调控更为复杂：当DLL4/JAG1配体竞争失衡时，血管网络会出现异常分支。通过CRISPR-Cas12a构建的NOTCH1敲除模型显示，EC的尖端细胞比例从正常状态的28%骤降至9%，而静脉标志物EphB4的表达量则上升3.5倍，这种双重表型印证了Notch信号在动脉-静脉分流中的"守门人"角色。MECOM的双面间谍角色：纤维化与分化的生死较量MECOM基因的发现堪称本研究最大的惊喜。在壁细胞分化过程中，MECOM通过招募HDAC3（组蛋白去乙酰化酶3）形成抑制复合体，沉默IGFBP5等纤维化相关基因的表达。当MECOM被CRISPR-Cas9特异性敲除后，IGFBP5的mRNA水平在24小时内飙升4.2倍，PDGFRβ+壁细胞中α-SMA（α平滑肌肌动蛋白）的表达量下降42%，这种表型与糖尿病患者血管壁增厚的病理特征高度吻合。更令人振奋的是，MECOM敲除的壁细胞在三维培养中展现出异常的收缩特性。原子力显微镜检测显示，这些细胞的杨氏模量降低37%，暗示其力学支撑功能受损。这种细胞表型的转变，为糖尿病血管并发症的机制研究提供了全新的视角。Wnt通路的阴阳两面：天使与魔鬼的平衡术Wnt信号通路的双刃剑效应在本研究中得到充分体现。低浓度CHIR99021（Wnt激活剂）处理使EC的周细胞覆盖率提升2.8倍，而高浓度处理则导致血管网络出现动静脉畸形。通过单细胞代谢组学分析发现，Wnt激活会诱导EC进入糖酵解主导的代谢状态，ROS（活性氧簇）水平上升2.3倍，这种代谢重编程可能是信号过载引发血管畸形的分子基础。疾病再现的微型舞台：血管类器官的疾病模拟革命糖尿病血管病变的镜像世界在模拟糖尿病微环境的实验中，hBVO展现出惊人的病理重构能力。当培养基中加入25 mM葡萄糖和TNF-α（20 ng/ml）时，EC的凋亡率在72小时内增加2.3倍，PDGFRβ+周细胞的覆盖率从正常的78%骤降至47%。更令人担忧的是，EC表面ICAM-1（细胞间粘附分子1）的表达量上升5.7倍，这种炎症反应与糖尿病患者视网膜血管渗漏的临床表型高度一致。通过空间代谢成像技术，科学家们发现病变区域的乳酸堆积量增加3.2倍，而谷胱甘肽水平下降45%。这种代谢紊乱导致EC线粒体嵴结构破坏，OXPHOS（氧化磷酸化）效率降低58%，为糖尿病血管病变的机制研究提供了直接的实验证据。先天性血管畸形的基因沙盘利用CRISPR-Cas12a构建的NOTCH3突变（R1231C，CADASIL致病位点）hBVO模型，首次在体外重现了该疾病的典型病理特征。突变EC的血管壁厚度减少42%，弹性纤维断裂指数上升3.5倍。透射电镜显示，平滑肌细胞的细胞器出现异常聚集，线粒体体积缩小至正常细胞的63%。更令人兴奋的是，这种基因编辑模型展现出对潜在治疗药物的快速响应。当加入γ-分泌酶抑制剂DAPT时，突变EC的NOTCH3胞内域（NICD3）表达量下降68%，血管壁厚度恢复至对照组的89%，这种快速的表型逆转为罕见病治疗提供了新的思路。肿瘤血管劫持的实时追踪在肿瘤条件培养基（含VEGF-A 300 pg/ml, IL-8 100 pg/ml）处理下，hBVO呈现出典型的"血管劫持"特征。EC表面整合素αvβ3的表达量在48小时内上升2.1倍，血管分支复杂性指数（BCI）从3.2降至1.7。有趣的是，肿瘤微环境诱导的EC表现出独特的代谢特征：谷氨酰胺摄取量增加4.5倍，而葡萄糖消耗量下降32%，这种代谢重编程为靶向肿瘤血管提供了新的生物标志物。器官特异的编程密码：从通用管道到功能特化的进化密码血脑屏障的体外重生通过LEF1过表达系统，科学家们在hBVO中首次实现了血脑屏障（BBB）的关键功能重建。转基因EC的紧密连接蛋白ZO-1表达量提升4倍，跨膜电阻值达到1500 Ω·cm²，这一数值已超过大多数现有体外模型的水平。冷冻电镜显示，相邻EC之间形成了连续的紧密连接带，孔径控制在8 Å以下，完美模拟了BBB的选择透过性。更令人振奋的是，这种工程化BBB能够有效阻止500 Da大分子的被动扩散，而对10 kDa脂溶性物质的转运效率提升2.8倍。当暴露于缺氧环境时，BBB模型表现出独特的适应性变化：GLUT1（葡萄糖转运蛋白1）表达量上升3.2倍，HIF-1α蛋白稳定性提高40%，这种动态调节能力为脑部疾病研究提供了前所未有的工具。肺微血管的精准定制在FGF10（200 ng/ml）和BMP4（50 ng/ml）的协同作用下，hBVO分化出气囊结构相关的毛细血管网。EC表面SP-C（肺表面活性蛋白C）的表达量上升2.8倍，PDGFRβ+周细胞覆盖率提升至91%。有趣的是，这些微血管表现出独特的力学特性：在周期性拉伸刺激下，血管壁的杨氏模量增加3.5倍，顺应性降低42%，完美模拟了肺泡呼吸运动的力学需求。心脏冠状动脉的形态发生通过构建脉冲式流体剪切力装置，科学家们成功诱导hBVO形成冠状动脉样结构。EC的排列方向趋同度达到92%，PDGFRβ+壁细胞定向包绕形成螺旋状血管束，血管直径从中央的150 μm渐变至末端的80 μm。单细胞测序显示，这些血管的EC高表达CXCL12（基质细胞衍生因子1），而壁细胞富集ANPEP（氨基肽酶N），这种基因表达模式与胚胎期冠状动脉发育高度相似。未来医学的种子库：类器官驱动的精准医疗革命患者特异性疾病建模：精准医学的基石在糖尿病患者的iPSC来源hBVO中，EC的线粒体DNA拷贝数减少47%，OXPHOS复合体I活性下降58%。更重要的是，这些模型对二甲双胍的治疗响应与临床观察完全一致：EC凋亡率在用药后72小时下降62%，PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α）表达量回升至正常水平的79%。这种高度一致的表型，为个体化药物筛选提供了"活体实验室"。药物毒性预测新范式：超越传统的2D模型利用hBVO进行的化疗药物毒性测试显示，长春新碱的EC毒性阈值比传统模型低3.7倍，预警时间提前72小时。更值得注意的是，hBVO能区分同类药物的不同构型毒性：紫杉醇白蛋白纳米粒的EC损伤指数比普通制剂低56%，这种差异在传统模型中完全无法检测。再生医学的终极梦想：预建血管模板的移植实验在免疫缺陷小鼠的肾包膜下移植实验中，hBVO在12周内形成了包含动脉、静脉和毛细血管的三级网络。荧光示踪显示，移植血管与宿主循环建立了功能性连接，EC表面PECAM-1（血小板内皮细胞粘附分子1）的表达量维持在正常水平的83%。组织学分析证实，移植血管的基底膜厚度（35 nm）与宿主血管无统计学差异，这种高度兼容性为器官再生提供了新的治疗策略。站在生命科学的十字路口当我们在显微镜下观察这些跳动着的微小心血管网络时，仿佛看到了生命最原始的蓝图正在重新书写。从单细胞分辨率的基因调控网络，到毫米级功能结构的器官再造，hBVO研究正在改写我们对血管发育的认知边界。这些在培养皿中演绎的生命奇迹，不仅为疾病治疗开辟了新天地，更让我们重新思考生命的本质——原来，那些看似复杂的生理过程，都暗藏在数十亿年的进化密码之中。这项研究首次解码了血管发育的基因蓝图，其价值不仅在于揭示发育机制，更在于为疾病治疗开辟了前所未有的精准路径。当这些微型血管网络开始"诉说"人体的奥秘时，我们离"按需制造器官"的未来已不再遥远。这场始于单细胞的科学革命，终将在临床转化的舞台上绽放璀璨光芒。参考文献Nikolova, M. T., He, Z., Seimiya, M., Jonsson, G., Cao, W., Okuda, R., Wimmer, R. A., Okamoto, R., Penninger, J. M., Camp, J. G., & Treutlein, B. (2025). Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell, 188(12), 1 - 20.责编|探索君排版|探索君转载请注明来源于【生物探索】声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！End往期精选围观Nature | 靶向线粒体VDAC2：破解实体瘤免疫治疗抵抗的"死亡密钥"热文Nature Medicine | 多囊女性子宫内膜藏着什么秘密？——全球首份单细胞图谱揭示治疗新方向热文Nature | 颠覆认知！大脑学习的惊人秘密：你的“潜伏知识”是如何瞬间爆发的？热文Cell | 颠覆认知！染色体形成并非依赖“骨架”，自组织模型重塑教科书热文Science | 为什么我们回想不起三岁前的经历?

2024年9月11日，中国药科大学施志浩、南京中医药大学李念光、杨烨和孙善亮团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为“Discovery of SILA-123 as a Highly Potent FLT3 Inhibitor for the Treatment of Acute Myeloid Leukemia with Various FLT3 Mutations“”的文章，在这篇文章中，作者等人发现了一种II型FLT3抑制剂SILA- 123。该抑制剂对FLT3多种突变体和MV4-11等肿瘤细胞，以及FLT3-ITD突变体相关的BaF3细胞均有较强的抑制作用。此外，SILA-123对310种激酶表现出良好的激酶组选择性。在体内研究中，SILA-123在MV4-11和BaF3-FLT3-ITD-G697R细胞接种的同种异体移植模型中显著抑制肿瘤生长。数据表明SILA-123可能是FLT3-ITD阳性AML有希望的候选药物。 急性髓性白血病(AML)是一种以造血细胞在外周血、骨髓或其他组织中的恶性增殖为特征的恶性血液系统疾病。这导致红细胞减少，白细胞过多，器官功能障碍，对感染的易感性增加。AML与Fms样酪氨酸激酶3 (FLT3)的异常磷酸化高度相关。 在过去的十年中，靶向治疗显著改善了FLT3阳性AML患者的预后。第一代FLT3抑制剂是广谱和多激酶抑制剂，缺乏FLT3选择性，因为它们同时靶向FLT3、JAK2和VEGFR。这种非选择性的药物设计方法不仅限制了治疗效果，而且增加了患者不良反应的风险。因此，开发更具选择性的FLT3i对于减少这些副作用，同时提高对FLT3突变相关疾病的治疗效果至关重要。第二代FLT3i对FLT3的效力和特异性有所提高。然而，它们的临床应用受到一些关键限制，如迅速出现耐药性，特别是酪氨酸激酶结构域FLT3点突变，以及AML患者的其他不良反应，如细胞减少。这些缺陷强调了开发能够靶向多种突变的新型、选择性FLT3i的必要性。 在新生AML患者中，观察到两种不同类型的FLT3突变：近膜-膜结构域的FLT3-内部串联重复(ITD)突变和酪氨酸激酶结构域(TKD)的(继发性)点突变。随着针对FLT3的努力被证明是成功的，FDA已经批准了两代FLT3i。然而，由FLT3-ITD突变和继发性FLT3-ITD- TKD突变(如F691L、G697R、D835Y/V/F和Y842H)的存在引起的对FLT3i的获得性耐药对AML的治疗提出了重大的临床挑战。因此，开发特异性靶向这些耐药突变的新型FLT3i是克服获得性耐药的有效方法。 作者等人以之前研究中的6-甲基-异恶唑[3,4-b]吡啶-3-氨基衍生物为基础设计合成了一系列化合物，生物活性评价表明，化合物SILA-123对FLT3-ITD依赖型AML细胞株MOLM-13 (IC50 = 0.98 nM)和MV4 -11 (IC50 = 0.19 nM)以及TKD继发性点突变的BaF3细胞(如BaF3-FLT3-ITD-G697R IC50 = 3.0 nM)的增殖有较强的抑制作用(表1）。此外，通过对310个激酶的谱分析，SILA-123对FLT3-ITD具有很高的选择性。 表1 代表性化合物对BaF3-FLT3 -ITD -F691L和BaF3-FLT3-ITD-G697R细胞的抗增殖作用 SILA-123的激酶选择性分析。化合物SILA-123对FLT3-WT (IC50 = 2.1 nM)和FLT3-ITD (IC50 = 1.0 nM)具有较强的抑制活性。化合物SILA-123在浓度为1 μM的310个激酶和突变体中表现出相对较好的选择性（图1），此外，化合物SILA-123对酪氨酸激酶家族成员表现出显著的选择性抑制活性，对FLT3-WT、FLT3-ITD、FLT3-D835Y和MAP3K19的抑制作用超过90%。 图1  SILA-123的激酶选择性谱 SILA-123的体外抗增殖活性。MOLM-13和MV4-11是携带FLT3-ITD突变体的两种典型的依赖FLT3的人AML细胞系。HL-60、THP-1和U937是具有FLT3野生型的不依赖FLT3的人血液肿瘤细胞系。使用这三种癌细胞有助于排除非FLT3介导的作用，如细胞毒性作用或脱靶效应。此外，作者等人还利用含有FGFR的A549和HepG2细胞系、含有JAK2的K562细胞系、含有AKT3的MDA-MB-231细胞系、含有RORc的Hela细胞系、含有YIHDF2的ARP1细胞系、含有LRP1的A375细胞系、含有EGFP的293T细胞系和含有KDR的Huvec细胞系来评估其对FLT3的选择性抑制活性。通过对抗增殖活性结果的分析，可以得出化合物SILA-123在FLT3-WT和FLT3-ITD细胞系中均表现出比对照更强的抑制作用。此外，SILA-123对HepG2、MDA-MB-231和ARP1癌细胞表现出选择性抑制作用，IC50值超过10 μM。对于A375和293T细胞株，SILA-23抑制细胞生长的IC50值分别为4.197 μM和0.808 μM（表2）。证实了SILA-123对FLT3-ITD阳性细胞的高选择性，并表明其对正常细胞的低毒性潜力。 表2 化合物SILA-123对多种完整癌细胞的抗增殖活性研究 细胞周期阻滞和凋亡测定。激酶抑制活性表明SILA-123具有抑制FLT3-WT和FLT3-ITD的能力，IC50值分别为2.1 nM和1.0 nM。SILA-123也对具有FLT3-ITD的AML细胞系显示出效力。抑制MOLM-13和MV4-11的IC50值分别为0.98 nM和0.19 nM。因此，将化合物SILA-123暴露于MOLM-13和MV4-11细胞中，研究其对细胞周期进程、凋亡和FLT3磷酸化抑制的影响。结果显示，化合物SILA-123可将MOLM-13和MV4-11细胞的细胞周期阻滞在G0-G1期，且具有剂量依赖性。随后，作者进行了细胞凋亡实验，证实复方SILA-123在48 h后可诱导MOLM-13和MV4 -11细胞系细胞死亡。同样，在MV4 -11细胞中，化合物SILA-123呈剂量依赖性诱导凋亡。 图2  SILA-123对MOLM-13和MV4-11细胞周期影响。 图3 SILA-123在MOLM-13和MV4-11 细胞中的促凋亡活性。 化合物SILA-123的毒性研究。中性粒细胞的产生与骨髓抑制毒性的关联已被证实。因此，作者进一步评估了SILA-123对转基因髓过氧化物酶(MPO)斑马鱼株中性粒细胞产生的影响。与载药组相比，化合物SILA-123在1 μM和10 μM剂量下均未导致斑马鱼中性粒细胞数量显著减少。这表明SILA-123对斑马鱼骨髓造血功能没有明显的抑制作用，对中性粒细胞的产生没有负面影响。因此，SILA-123在斑马鱼模型中未表现出明显的血液毒性，安全性评价良好。 图4  SILA-123在斑马鱼模型中的毒性评价。 SILA-123在MV4-11肿瘤异种移植模型中的体内作用。评估SILA-123其在MV4-11肿瘤异种移植模型中的体内作用。发现显著抑制肿瘤进展，其抗肿瘤活性呈剂量依赖性(图5)。肿瘤生长抑制率(TGI)分别为15.3%、45.8%和87.3%。在给药20天后，与对照组治疗相比，化合物SILA- 123没有引起明显的体重减轻。对MV4-11肿瘤移植模型的抑制率(IR)分别为12.4%、38.2%和80.1%。显然，SILA-123在三种剂量下均表现出明显的肿瘤生长抑制作用，在安全剂量为50 mg/kg时达到80.1%。 图5  SILA-123在MV4-11异种移植瘤模型中的体内抗肿瘤作用。 综上所述，作者团队报道了一种II型FLT3抑制剂SILA-123。该抑制剂对FLT3-ITD突变体MOLM-13和MV4-11等肿瘤细胞，以及FLT3-ITD突变体相关的BaF3细胞等均有较强的抑制作用。此外，SILA-123对310种激酶表现出良好的激酶组选择性。在体内研究中，SILA-123在MV4-11 和BaF3-FLT3-ITD-G697R 细胞接种的同种异体移植模型中显著抑制肿瘤生长。数据表明SILA-123可能是FLT3-ITD阳性AML的希望的候选药物。 原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00529 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

哈喽大家好，今天分享一篇近期发表在Nature（IF：64.8）的文章，该文章主要展示了在鳞状细胞癌小鼠模型中，NP137介导的netrin-1抑制降低了发生上皮细胞间质转化的细胞比例，减少了转移灶的数量，并增加了肿瘤细胞对化疗的敏感性。借助NP137处理对小鼠身上移植的人上皮细胞癌的差异，表明netrin-1阻断抑制了人类中癌细胞的上皮间质转化。   一、背景上皮间质转化（EMT）与肿瘤的发生、进展、转移、耐药性息息相关，尽管EMT在癌症中的作用及调节机制研究取得实质性进展，但临床上尚未开展有效的靶向EMT的治疗策略，该研究发现在小鼠鳞状细胞癌的EMT机制中，存在一类重要蛋白Netrin-1，阻断Netrin-1抑制癌细胞的上皮-间充质转化。通过单细胞RNA测序显示，鳞状上皮细胞癌中混杂着EMT的不同发育状态，给于阻断Netrin-1抑制后，能够阻止癌细胞向晚期EMT状态进展。为进一步评估这一发现与人类癌症的相关性，作者用NP137治疗移植了人类癌细胞系的小鼠，这些癌细胞系在TGFβ1给药后经历EMT，而Netrin-1抑制降低了移植癌细胞的EMT。总之，作者的研究结果确定了靶向EMT治疗癌症的药理学策略，为抗癌治疗开辟了新的治疗干预措施。        二、结果1.Netrin-1在皮肤SCC的EMT中过表达已知上皮细胞粘附分子（EPCAM）在多种上皮组织中表达，上皮来源的癌细胞中高表达EPCAM分子，由此区分肿瘤细胞为间充质瘤细胞和癌细胞。为寻找靶向肿瘤中上皮间充质化的药物靶点，该研究探索小鼠SCC模型中分离的上皮癌细胞和间充质肿瘤细胞转录组测序数据发现，与EPCAM+癌细胞相比，EPCAM-间充质瘤细胞优先分泌一些细胞分子，即编码netrin（Ntn1）及其受体UNC5B的基因在EPCAM-间充质瘤细胞中表达增高（图a，b），此外，针对netrin的特异性治疗在药物研发早期阶段被证实有用，目前应用于癌症治疗早期临床试验，具体试验药物为NP137,人类癌症临床试验的netrin-1阻断单克隆抗体(ClinicalTrials.gov识别符NCT02977195)。2.Netrin-1过表达增加EMT为了评估Netrin-1过表达的作用，作者构建了Netrin-1过表达的SCC肿瘤小鼠模型（LKPR- NTN1），在netrin-1过表达后，作者观察到与对照小鼠相比，过表达Netrin-1小鼠的肿瘤数量增加(图1c)，发生EMT的肿瘤细胞比例增加(图1d）。上皮间质转化过程并不是一蹴而就的，EMT过程中存在上皮状态（KRT14+ VIM−），上皮-间质混合状态（KRT14+ VIM−），完全间质状态过程（KRT14−VIM+）。通过组织学分析和免疫荧光，作者评估了netrin-1过表达对该模型中先前描述的不同肿瘤EMT状态的影响。结果表明，netrin-1的过表达导致具有完整EMT的肿瘤比例显著增加(70%)，具有上皮表型的SCCs比例显著减少(3%)(图1e,f)，这与荧光激活细胞分选(FACS)对EPCAM表达的量化结果完全一致(图1d)。这些数据表明，netrin-1的过表达促进了皮肤SCC原发性模型的肿瘤起始和EMT。      3.靶向Netrin-1抑制EMT先前研究已经表明，Netrin-1在多种癌症中上调，药物抑制Netrin-1对体内EMT的影响尚未被研究。作者给予他莫昔芬诱导SCC小鼠模型Netrin-1表达上调后，连续4周给小鼠喂药NP137，观察Netrin-1抑制对肿瘤形成和EMT的影响。结果示：每周给3次药NP137导致每只小鼠SCCs数量减少50%(图1g)。FACs量化YFP+ EPCAM+(上皮源)肿瘤细胞和YFP+ EPCAM -(间质转化的)肿瘤细胞的百分比显示，NP137降低了自发性EMT的原发性皮肤SCCs中发生EMT的EPCAM -肿瘤细胞的比例(NP137处理小鼠为41%，对照组为77%)，表明在LKPR小鼠模型中，靶向netrin-1能够抑制肿瘤细胞的EMT（图h）。为了确定Netrin-1抑制是否对不同EMT状态有不同的影响，作者使用免疫荧光来评估肿瘤状态的比例，NP137增加了上皮状态的比例(NP137处理小鼠为54%，对照小鼠为31%)，而混合EMT的比例保持不变(NP137处理小鼠为16%，对照小鼠为12%)，晚期EMT状态的比例下降(NP137处理小鼠为30%，对照小鼠为56%)(图1i,j)。这些数据表明，netrin-1的药理学靶向制剂NP137可以抑制癌症小鼠模型中的EMT。图14.靶向Netrin-1抑制肿瘤转移由于EMT和肿瘤转移密切相关，研究人员继续检测了NP137处理对肿瘤转移的影响。通过评估NP137用药后过表达Netrin-1的小鼠模型发现，NP137的施用大大减少了LKPR小鼠肺转移的数量(图2a)。为排除这一因果关系是原发肿瘤数目下降干扰产生的，作者给在尾静脉注射FACs分离的LKPR小鼠的YFP+肿瘤细胞后，NP137仍然表现出显著减少肿瘤肺转移的数量，这一结果表明Netrin-1靶向药物抑制直接抑制转移的形成（图2b）。5.NP137使癌细胞对化疗敏感SCC的标准化疗方案为顺铂联合5-氟尿嘧啶（5-FU），研究人员还发现联合使用NP137增强了SCC标准化疗药物顺铂和5-FU的治疗效果，也说明了NP137处理降低了肿瘤细胞的耐药性(图2c)。这些数据表明，Netrin-1的药理学靶向可以降低与EMT相关的癌症特征，包括转移和对化疗的耐药。图26.NP137对基质细胞的影响进一步的，作者研究了NP137对基质细胞的影响，通过对两种对照SCC小鼠和两种NP137处理的原发性皮肤SCCs的肿瘤上皮细胞及其相关基质细胞进行单细胞RNA-seq ，发现NP137处理降低了肿瘤细胞的数量，增加了肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的数量，其它细胞数量未发生变化。使用单细胞组成数据分析(scCODA)进行差异丰度分析，研究者们发现在两个对照和两个np137处理的小鼠之间，不同CAF亚群的比例及不同CAF簇间的基因表达没有显著性差异。并且随后用免疫组化染色证明NP137处理后增加了CAFs的数量。7.NP137对肿瘤细胞状态的影响探索单细胞测序结果，具体地评估Netrin-1抑制对肿瘤状态的影响。结果同上文FACs一致，单细胞分辨率下，作者发现了不同EMT细胞状态对应的细胞簇，包括上皮细胞（KRT14+VIM-）、早期杂交EMT (EPCAM-Krt14+ Vim+)、晚期杂交EMT (EPCAM-Krt14-Krt8+ Vim+ Pdgfra−)和晚期EMT (EPCAM-Krt14−Krt8−Vim+Pdgfra+)（图3a）。与对照组相比，NP137给药与上皮肿瘤细胞状态比例增加、早期EMT比例相似、晚期混合型EMT比例下降以及晚期EMT大幅下降相关(图3b,c）。免疫荧光实验证实，NP137给药后上皮状态的增加和晚期EMT肿瘤状态的减少（图3d）。使用10x Visium的空间转录组学分析揭示了scRNA-seq鉴定的肿瘤状态的空间定位，并显示它们定位于不同的生态位，如先前报道。NP137增加了上皮状态(Epcam+ Krt14+)的比例，抑制了晚期EMT状态(Krt14-Krt8-Vim+)的发生，阻断了混合EMT状态(Krt8+ Vim+)的EMT进展（图3e,f）。为了进一步了解NP137抑制EMT的机制和信号通路，作者使用MSigDB Hallmark基因集进行了通路富集分析，结果表明，在药物靶向作用下Netrin-1抑制后，肿瘤细胞中与EMT、缺氧、血管生成和炎症反应相关的基因表达均显著降低（图3g）。图3拟时序细胞轨迹分析发现，在对照肿瘤中可以识别出两种不同的谱系轨迹，一条轨迹从上皮细胞转化为混合EMT，另一条轨迹从上皮细胞状态转化为晚期完全EMT(图4a)。NP137处理的肿瘤细胞具有不同的谱系轨迹，表达高水平Aqp1的晚期EMT状态轨迹消失，出现两个新的上皮状态轨迹(Epithelial-B1和Epithelial-B2)，以及两个混合EMT轨迹(图4b)。Epithelial-B1的特征是Krt15的高表达，对属于Epithelial- B2状态的细胞的标记基因进行GO富集分析显示糖酵解上调，角化增加(图4b,c)。对SCC小鼠对照组和NP137处理的LKRP小鼠皮肤SCCs进行YFP免疫染色和RNA原位杂交实验证实，NP137给药后以aqp1表达为代表的EMT晚期轨迹的抑制减少和Krt15表达代表的上皮状态的增加(图4e)。图48.UNC5B轴促进EMT研究人员进一步检测了Netrin-1的受体Unc5b的作用。作者发现在细胞系中Ntn1和Unc5b敲除都会抑制EMT过程，而且这种抑制作用不会被NP137处理加强，说明Netrin-1是通过UNC5B来发挥其促EMT作用的（图5a,b）。为了评估NP137对EMT的调节和促上皮状态的促进是否是直接调节EMT状态的旁分泌或自分泌netrin-1 - UNC5B信号轴被破坏的结果，作者对体外培养的对照、Ntn1-KD和UNC5B - kd肿瘤细胞的EPCAM+肿瘤细胞进行了大量rna测序，结果示，在Unc5b敲低后下调或上调的基因中，超过50%的基因也受到Ntn1敲低的差异调节(图5c)，这表明Netrin-1和Unc5b调节着相似的信号通路和转录程序。Ntn1敲低和Unc5b敲低促进了与上皮状态相关的基因(Krt14、Krt15、involucrin和claudin)的表达(图5d)，并降低了与EMT和促EMT相关的基因(Aqp5、Nrp1、Nr2f2、Twist1和Twist2)的表达(图5e-g)。总之，这些数据表明，在肿瘤细胞中靶向netrin-1-UNC5B信号轴可减少EMT，并以独立于肿瘤微环境的细胞自主方式促进皮肤SCC维持上皮状态。          图59.NP137阻止人类癌症的EMT最后，研究人员分析了TCGA数据库中的临床样本，发现在肺SCC、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）以及皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma, SKCM）中，UNC5B和EMT评分之间存在正相关关系（图6a,b）。为探索功能的相关性，作者构建人类癌症细胞系A549移植小鼠，同时给予TGFβ1引发EMT状态（图6c,d），紧接着利用NP137治疗，结果表明抑制Netrin-1显著降低肿瘤生长，提高上皮细胞标志物表达（图6e,f）。正反回复实验表明Netrin-1抑制能够降低体内人类癌细胞的EMT。图6三、结论        1、使用NP137的药理学靶向netrin-1是一种安全有效的靶向肿瘤EMT的策略,可以减少肿瘤的转移，并且增加肿瘤对化疗的敏感性。2、作者揭示了netrin-1调节EMT并促进EMT晚期分化轨迹的分子机制，即Netrin-1的抑制诱导肿瘤细胞谱系分化的开关，将肿瘤分化转向上皮肿瘤状态，这种状态对化疗更敏感。Netrin-1通过向UNC5B发送信号发挥其促EMT功能，UNC5B可促进间充质转录程序的表达，下调控制细胞-细胞粘附和促进上皮分化程序的基因的表达。3、NP137给药后肿瘤细胞对化疗的敏感性表明，抗Netrin-1抗体与其他抗癌药物联合使用可能对具有EMT特征的癌症患者有益。文章结尾对该发现在临床的应用进行展望道，这些结果对EMT癌症患者联合Netrin-1抑制的抗癌治疗策略的发展以及新型生物标志物的开发具有重要意义，这些生物标志物将有助于更好地对癌症病例进行分层，以确定那些更有可能对抗Netrin-1治疗产生反应的癌症。四、思路衍生耐药EMT的新靶点，正如17年前，发现了VEGF抑制剂能够治疗年龄相关性黄斑，进而改变了年龄相关性黄斑注定失明的结局，VEGF靶点药物在2006年被《科学》杂志评为年度10大科技突破之一，随后大量先关研究高分频发。新的靶点出现，必定意味着新一波研究的接踵而至！       NP137抑制Netrin-1已经明确证实，药物开发前阶段，这个抑制剂是不是可以用来治疗不同类型癌症呢，寻找生物标志物就意味着，临床患者有效分层，有望写入治疗指南，具有重大意义。思路一：基于Netrin-1差异，分析癌症EMT耐药的生物标志物：划重点啦！！肿瘤届大名鼎鼎的“致密纤维化癌”还包括胰腺癌、肝内胆管癌、肾细胞癌、结直肠癌等这些常见的肿瘤！！根据不同肿瘤EMT及转移特点，分析Netrin-1 -Unc5b轴的差异表达情况，根据化疗耐药队列情况，构建耐药相关Signature，建模型，验证模型准确性。3分文章这不就到手了！思路二：基于靶器官差异，分析不同的癌种介导的EMT中Netrin-1-Unc5b信号的肿瘤微环境的异同：易于转移高EMT原发灶微环境分析（小泛癌）这不就来啦！每个癌种都需要Netrin-1染色吗？当然不需要，HPA数据库就可以直接查询HE的染色结果！再结合公共数据库的转录组，单细胞数据分析，直冲5分+的SCI。         当然，皮肤鳞癌不是唯一的硬骨头！肺部、胰腺、胆管、肾脏同样有着类似的难啃的骨头的属性！也是易于发生转移的大户！以上两种思路，小编总结好了思路，可以冲！思路三：不同上皮间质转化状态对Netrin-1抑制剂的敏感性:已知肿瘤上皮细胞进展过程中，会发生间充质转化，并且多数是由于肿瘤细胞产生细胞因子介导！这就转化成我们熟悉的分析思路了！1）不同状态的间充质状态的对应肿瘤分期划分；2）Netrin-1-Unc5b信号在不同状态EMT肿瘤细胞中信号强弱，分析不同表型分组之间的差异细胞、通路、关联预后和耐药等等。