GID4

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—各奖项申报陆续启动，欢迎关注—PROTAC通过招募E3泛素连接酶诱导目标蛋白的泛素化降解，为癌症治疗提供了新策略。然而，目前仅有少数E3连接酶（如CRBN、VHL）被成功应用于PROTAC开发，限制了其靶标范围。4月28日，天津医科大学董城、石磊、陈东星、谢松波团队合作，在Nature Structural & Molecular Biology杂志发表论文，首次将E3连接酶GID4（glucose-induced degradation deficient complex 4，葡萄糖诱导降解缺陷复合物4）应用于PROTAC分子设计。研究团队设计了基于GID4的PROTAC，实现了多个致病蛋白的靶向降解，并解析了GID4-PROTAC-BRD4三元复合物的晶体结构，系统阐明了GID4介导底物降解的分子机制。此外，他们据此开发出高效降解剂NEP162，成功实现BET家族蛋白BRD4的精准清除。研究人员先前已经开发出一种靶向GID4拮抗剂的PFI-7，于是他们假设PFI-7可作为E3连接酶的配体，应用在PROTAC分子中。于是他们将PFI-7与BRD4抑制剂JQ1连接，并通过改变连接链长度，设计了一系列PROTAC分子。通过细胞实验，研究人员发现PROTAC分子NEP108可以降解BRD4，而阴性对照则没有活性。这表明PFI-7可以有效地招募GID4，并促进BRD4的降解。图1. NEP108用于BRD4降解的设计和表征然后，研究人员解析了GID4-NEP108-BRD4三元复合物的晶体结构。其中NEP108分子夹在BRD4和GID4之间，JQ1和PFI-7部分分别与BRD4和GID4的结合位点结合。研究发现，BRD4的BC环和GID4的L3环相互作用，并形成氢键。这与之前报道的VHL基础PROTAC的作用机制有所不同。此外，连接链长度对PROTAC的活性有重要影响，较短的连接链会导致空间位阻，而较长的连接链则可能不利于三元复合物的形成。图2. GID4-NEP108-BRD4三元复合物的晶体结构接下来，研究人员在NEP108的基础上进行结构优化，设计了更有效的PROTAC分子NEP162。后续实验发现，NEP162可以更有效地降解BRD4，并具有更强的GID4结合亲和力。图3. NEP162对BRD4降解的设计和表征通过晶体结构解析，他们发现了GID4-PROTAC-BRD4三元复合物的动态结合模式：NEP162通过连接子将GID4的底物结合腔与BRD4的溴结构域桥接，诱导两者形成可变构象界面，这解释了其增强活性的原因。图4. GID4–NEP162–BRD4三元复合物的结构分析优化后的NEP162在体外展现出纳摩尔级降解效力（DC50=1.2μM），并通过泛素-蛋白酶体系统依赖的方式显著抑制癌细胞增殖。图5. NEP162通过GID4和UPS降解BRD4并抑制细胞增殖在异种移植瘤模型中，NEP162（10mg/kg）治疗显著降低肿瘤内BRD4水平，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长且无明显毒性。图6. NEP162抑制体内肿瘤生长此外，研究成功将GID4-PROTAC平台扩展至ERα和SMARCA2等其他靶标，证明其广泛适用性。图7. 基于GID4的PROTAC降解其他靶蛋白总结来说，该研究开发了新的E3连接酶GID4，并成功应用于PROTAC设计。该工作不仅丰富了PROTAC可用的E3连接酶库，为“不可成药”靶点提供新工具，同时通过结构驱动的设计策略，为开发高效降解剂奠定了分子基础。参考资料：Yanran Li et al. Design of PROTACs utilizing the E3 ligase GID4 for targeted protein degradation. Nature Structural & Molecular Biology（2025）https://www.nature.com/articles/s41594-025-01537-1推荐阅读Cell突破：全新VLP递送技术来了2024年，十大制药巨头看上的AI制药公司医药魔方Pro洞察全球生物医药前沿趋势赋能中国源头创新成果转化媒体合作：15895423126Copyright © 2025 PHARMCUBE. All Rights Reserved.欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

侃言 蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异双功能分子，通过诱导泛素-蛋白酶体系统(UPS)对靶标蛋白质进行泛素化和降解。这是一种事件驱动的作用机制，相比于小分子抑制剂有诸多优势，比如：催化性质的低浓度低剂量需求、减少给药量和给药频率、减少毒副作用、更加长效持久、有效降低药物耐药、靶点适用自由度高等，具有非常高价值的治疗应用前景。 然而，由于可利用的E3配体的开发和应用有限，高频过度的使用仅有的如VHL(60.1%)、CRBN(30.1%)配体（数据来自iScience)，导致PROTACs耐药性问题成为困扰当前PROTACs治疗的一大难题。因此，开发肿瘤组织特异性E3配体就变得非常重要，依靠肿瘤自身癌蛋白(oncoprotein)，将极大地降低突变耐药的机率。 近日，PROTACs奠基人、Arvians创始人、耶鲁大学著名科学家Craig Crews教授在JACS上刊载了其团队最新研究成果，突出强调基于肿瘤组织，特异性E3连接酶底物衔接蛋白配体的开发，在解决PROTACs耐药性突变问题上的重要性。 文章的第一作者李科博士为我多年好友。许多关键性问题，也和李博士进行了探讨。 文章于2024年8月27日在线，地址如下： https://doi.org/10.1021/jacs.4c05393 1 PROTACs耐药性 与     肿瘤特异性E3复合体蛋白   PROTACs作为一种异双功能分子，有效地诱导靶蛋白和E3连接酶邻近，形成三元复合物，使靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别后降解。然而，由于过度依赖和高频使用VHL、CRBN等E3连接酶配体，也出现了PROTACs耐药性问题。 依赖肿瘤自身癌蛋白，开发肿瘤组织特异性E3连接酶配体，是解决当前PROTACs耐药性问题的关键。 E3连接酶底物衔接蛋白：MAGE-A3 黑色素瘤抗原A3型蛋白(MAGE-A3)，是一种组织特异性表达的蛋白，也是一种E3连接酶的底物衔接蛋白，与E3连接酶结合，通过改变亚细胞位置或靶向泛素化的独特底物，来调节E3连接酶的活性。 MAGE蛋白家族包括I型(AMGE-A/B/C)和II型(AMGE-D/E/F/G/H/L/Necdin)两种抗原类型、以及众多亚族。其中，I型为MAGE睾丸癌抗原，主要在生殖组织中表达，若启动子去甲基化异常表达则易导致癌症；而II型MAGE蛋白可在多种组织中表达。 MAGE同源结构域(MHD)在I/II型蛋白中都是高度保守的。然而，尽管结构相似，MHD底物结合间隙中的独特残基，被赋予了与不同蛋白伴侣特异性结合的能力。 MAGE-A3就是这种具有与E3连接酶结合能力的组织特异性衔接蛋白，因此，极具潜力作为开发肿瘤特异性PROTACs的靶点： 能够作为E3连接酶底物招募模块 在体细胞组织中极少表达 能够在多种肿瘤类型中发现 最近的研究发现，MAGE-A3与三重基序蛋白28(TRIM28)相互作用，并调节TRIM28。而TRIM28的表达无处不在，具有多种功能，包括E3连接酶激活。 因此，由MAGE-A3配体组成的PROTACs，可以在表达MAGE-A3的肿瘤组织中，特异性地招募由TRIM28介导的靶蛋白泛素化。 MAGE-A3在免疫治疗中的应用 此外，诱导MAGE-A3降解，可能对癌细胞具有抗增殖作用。而MAGE蛋白家族本身就是癌症免疫治疗的热门靶点，已有多项临床试验针对MAGE-A3抗原。 PROTACs介导的MAGE-A3降解有可能增加抗原在同源MHC复合物上的呈递，进而改善免疫治疗的结果。 2 DNA编码化合物库技术（DEL) 助力     E3连接酶衔接蛋白MAGE-A3配体发现    研究人员利用DEL技术，针对MAGE-A3的MHD进行亲和力筛选，如上图A，包含约109个DEL化合物。 DEL具有广泛的靶点适用性，也非常适合缺乏酶功能的靶标、以及非活性位点抑制剂类配体的发现。并以发现的苗头化合物为起点，指导靶标特异性异双功能小分子的设计。 DEL苗头化合物发现和类药性优化 从这个包含约十亿多种化合物的超级化合物库中，对MAGE-A3同源结构域进行筛选后数据分析，最终发现了两个来自不同文库的相似的“化学型”家族：苯甲醛支架、氨基嘧啶支架，如上图B。 在这两个相似的“化学型”富集中，通过对全长分子的富集度、物化特性、组成合成砌块、以及起始原料的综合考虑分析对比，最终选择了一些列分子进行off-DNA合成、验证。化合物KL346就是其中用于后续验证的代表，如下图。 通过对KL346和MAGE-A3 MHD进行ITC生物物理表征，发现了低微摩尔结合亲和力，如上图B，KD=8.1±2.3 μM。同时也发现了KL346:MAGE-A3复合体构成的化学计量比例为1：2（N~0.5)。 配体“成药性”也是PROTACs成功的关键，出于此考虑，研究人员根据采用常见的策略来截断DEL苗头化合物，获得化合物MJBIA9836(如上图A)：去除组成苗头化合物中靠近寡核苷酸标签的合成砌块，一般认为其多作为间隔而不是药效团，对配体亲和结合力贡献较小。 如上图B，结果也证实，截取后的分子保留了相当的结合亲和力，但其类药性特性却获得了极大的改善。 如上图C，通过细胞热移试验(CETSA)，MJBIA9836相比于DMSO对照组，稳定了两个MAGE-A3阳性细胞系内源性MAGE-A3或增加了蛋白水平。这表明，改善后的化合物具有细胞渗透性。 靶标:配体相互作用的结构表征 如上图，研究人员利用分子对接技术，通过MAGE-A3晶体结构，评估了MJBIA9836的潜在结合位点，并对观察到的1:2结合化学计量进行了合理化。 单体与二聚体模型对接结果揭示了一个相似的结合位点。在没有变构的情况下，二聚体模型中的结合界面是位于预测的显示1：2结合化学计量的结合位点。因此，研究人员进行了进一步的结构表征以验证配体结合位点和辅助基于结构的配体优化。 然而，MJBIA9836的溶解度有限，研究人员获得了其吗啉类似物KL861，其结合亲和力与MJBIA9836相当，但溶解度提高，并用于单晶结构分析，如下图。 单晶衍射与分子对接结果一致，疏水作用是配体结合的驱动力。同时，也再次印证了单个配体分子与MAGE-A3二聚体结合。 为了确定MAGE-A3与配体的生物活性位点，研究人员利用靶标突变体进行进一步的研究。观察到R211A侧链靠近二聚体界面，并且位于配体羰基的氢键距离内，研究人员获得了R211A突变的MAGE-3A MHD，如上图B。 3    MAGE-A3配体驱动的PROTACs    在获得了MJBIA9836在体外、结构、以及细胞内均能够结合MAGE-A3的证实后，研究人员以此进行PROTACs设计，并验证MAGE-A3配体在靶向降解剂中的实用性。 PROTACs设计及验证 如上图，研究人员首先基于VHL和CRBN设计PROTACs，进行概念性验证（POC）。然而，仅基于VHL招募的PROTACs以剂量依赖性的方式降低MAGE-A3的水平，并观察到VHL蛋白水平升高，如下图B。 最有效的PROTAC为KL465，如上图A，装配有（rh)-VHL。有效降低HeLa细胞MAGE-A3水平，Dmax~60%，DC50~2μM。 VHL的重要性 为了进一步验证VHL在靶标降解中的重要性，研究人员设计了KL465的无活性版本——KL633，如下图B。在KL633组成中，对于VHL结合至关重要的羟基脯氨酸部分，其立体化学倒置，因此在保持了相当的物化特性的同时，不具有VHL招募活性。 在上图A中可以看出，两种浓度下，KL465能够诱导靶标有效降解；但KL633、MJBIA9836并不能显著降低MAGE-A3的蛋白水平。这表明，KL465降解靶标是VHL依赖性的。 如图C，KL465在MAGE-A3阳性细胞中，其对细胞增殖的抑制作用更大。这表明，与单独结合配体相比，MAGE-A3的降解显著降低了细胞活力。 总之，这些数据表明，使用KL465降解MAGE-A3可以降低癌细胞活力，并且这种观察到的效果不是由于脱靶毒性导致。 KL465不影响MAGE-A3:TRIM28相互作用 利用MAGE-A3配体作为肿瘤特异性TPD的E3招募元件，还需要小分子配体不破坏MAGE-A3:TRIM28的相互作用，验证如下图。 利用TR-FRET试验，最终表明，基于MAGE-A3的配体或基于配体设计的PROTAC都不能与TRIM28竞争性结合MAGE-A3，不影响其相互作用。 4       总结与展望     当前的PROTACs设计和应用，依然依赖于VHL和CRBN，两者都是Cullin-E3复合物的E3连接酶衔接蛋白。然而，它们的广泛表达限制了其组织和疾病特异性降解。而且，高频过度的使用，也出现了耐药性问题。这主要归因于E3连接酶机制的突变，而不是靶蛋白，因此，发现更多E3连接酶配体将势在必行。 而compartment-特异性降解在这个形势下将具有远大的前景。PROTACs开发的下一步逻辑必将是在特定组织或疾病状态中，利用E连接酶靶向降解。 然而，针对E3连接酶底物结合位点可能需要占据较浅的口袋或内源性蛋白质底物的竞争，这两种情况都为E3连接酶结合带来挑战。幸运的是DEL技术为此提供了一种快速高效的组合方法。DEL技术已经成功发现多种E3连接酶伙伴配体，如DCAF1、GID4、MAGE-A3等，助力PROTACs开发。 整合DEL筛选数据、与机器学习（ML）强大能力，可以增强可扩展性、结构多样性、总体命中率、效力和类药性。 本文中KL465对靶标适度降解，可能有以下几个因素： 在组织培养中观察到的MAGE-A3半衰期短，重合成速度快，这限制了观察到的最大降解； 开发PROTACs使用的配体仅表现出中等结合亲和力，减少了低效三元复合物的形成； PROTACs的连接子还没有进一步探索优化。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓