ATG14

为了应对生理条件的变化，细胞需要各种类型的细胞凋亡程序。近日，Developmental Cell 期刊以「Voices」专栏发表了题为 The story behind the emergence of different forms of cell death 的文章，并特别邀请了该研究领域的科学家讲述他们参与识别和解析细胞凋亡通路背后的故事，并讨论此类研究的未来方向。中国科学院外籍院士、美国国家科学院院士、中国科学院有机化学所生物与化学交叉研究中心主任袁钧瑛受邀采访。近 40 年来，袁钧瑛院士始终致力于细胞凋亡机制的研究，不仅世界细胞凋亡研究领域的开拓者之一，同时也是世界上第一个细胞凋亡基因的发现者！ 2024 年 1 月 4 日，袁钧瑛团队与中国科学院上海有机化学研究所许代超团队合作在 Nature Structural & Molecular Biology （IF = 12.5）上发表题为 Reduction of DHHC5-mediated beclin 1 S-palmitoylation underlies autophagy decline in aging 的文章。该文章研究了衰老如何导致自噬下降，以及蛋白质  S-棕榈酰化在此过程中的作用。该研究展示了蛋白 S-棕榈酰化在自噬中的作用。Beclin 1 是自噬的关键调节蛋白，其与 VPS34、ATG14L 和 VPS15 结合形成 PI3KC3-C1 复合物，促进自噬体的形成。该研究发现棕榈酰酰基转移酶 DHHC5 通过介导 beclin 1 的棕榈酰化来调节自噬，这反过来又通过促进 beclin 1 与适配器蛋白 ATG14L 和 VPS15 之间的疏水相互作用，来促进含有 ATG14L 的 III 类磷脂酰肌醇-3 激酶复合物 I 的形成及其脂激酶活性。进一步的研究表明，DHHC5 在衰老的人脑和非人灵长类动物脑中表达显著降低，这可能是导致自噬下降的原因之一。总的来说，这些研究结果揭示了衰老诱导自噬下降的一种潜在机制，并为开发治疗衰老相关疾病的药物提供了新的靶点。 图 1  相关研究（图源：Nature Structural & Molecular Biology） 2024 年 1 月 30 日，袁钧瑛团队与中国科学院上海有机化学研究所何凯雯团队合作在 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（IF = 9.58）上发表题为 RIPK1 activation in Mecp2-deficient microglia promotes inflammation and glutamate release in RTT 的文章。该文章研究了 Rett 综合征（RTT）中 Mecp2 缺失在小胶质细胞中的作用及其与神经功能障碍之间的关系。研究发现抑制受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1）激酶可改善 Mecp2 基因敲除小鼠发病后运动功能障碍的进展，并延长其生存期。研究发现，RIPK1 的激活促进了小胶质细胞中的氧化应激、细胞因子产生以及谷氨酸释放介导的兴奋性毒性相关基因的表达。此外，Mecp2 缺失的小胶质细胞释放高水平的谷氨酸，损害谷氨酸介导的兴奋性神经传递，并促进 GluA1 和 GluA2/3 蛋白的增加。总的来说，该研究揭示了  Mecp2 缺失在小胶质细胞中的作用机制，为 RTT 的治疗提供了新的思路。同时，该研究也强调了 RIPK1 抑制剂可能对其他神经炎症性疾病，如自闭症、精神分裂症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病也具有治疗潜力。 图 2  相关研究（图源：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America） 2024 年 3 月 7 日，袁钧瑛团队与中国科学院上海有机化学研究所许代超团队合作在 Molecular Cell（IF = 14.5）上发表题为 PARP5A and RNF146 phase separation restrains RIPK1-dependent necroptosis 的文章。该文章研究了程序性坏死，一种由 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 下游信号通路介导的细胞死亡形式，以及 PARP5A 和 RNF146 蛋白如何通过相分离机制抑制程序性坏死。研究发现，在程序性坏死激活和 TAX1BP1 蛋白的招募下，PARP5A 和 RNF146 蛋白会发生相分离，形成类似液滴的凝聚体，对激活的 RIPK1 进行多聚 ADP 核糖化（PAR）和 PAR 化依赖性泛素化（PARdU）。此外，文章还发现，PARP5A/RNF146 复合物与 TAX1BP1 蛋白相互作用，并被招募到激活的 RIPK1 上，发挥抑制程序性坏死的作用。总的来说，这项研究揭示了相分离机制在细胞死亡调控中的重要作用，并为开发新型抗坏死药物提供了新的思路。 图 3  相关研究（图源：Molecular Cell） 2024 年 3 月 27 日，袁钧瑛团队与中国科学院上海有机化学研究所许代超团队合作在 Nature Cell Biology（IF = 17.3）上发表题为 Defective prelamin A processing promotes unconventional necroptosis driven by nuclear RIPK1 的文章。ZMPSTE24 是一种锌金属蛋白酶，负责将前体层蛋白 A 切割成成熟的层蛋白 A，而层蛋白 A 是核纤层的重要组成部分。该篇文章研究了  ZMPSTE24 缺陷导致的前体层蛋白 A 处理异常，并揭示了其导致细胞坏死和炎症的机制。研究发现，当  ZMPSTE24 缺陷时，前体层蛋白 A 会积累，导致早衰症等疾病。研究发现，积累的前体层蛋白 A 会招募 RIPK1 到细胞核，并在肿瘤坏死因子刺激下促进其激活。激活的 RIPK1 进一步促进 RIPK3 介导的 MLKL 激活，导致核膜破坏和细胞坏死。除此之外，研究人员还发现，RIPK1 和细胞坏死在 Zmpste24-/- 小鼠的多个组织中都被激活，而遗传抑制 RIPK1 或敲除 Ripk3 或 Mlkl 可以显著改善 Zmpste24-/- 小鼠的疾病表型并延长其寿命。总的来说，该研究揭示了  ZMPSTE24 缺陷导致的前体层蛋白 A 处理异常会导致细胞坏死和炎症的机制，并强调了 RIPK1 可能是治疗与前体层蛋白 A 相关的早衰症的一个潜在靶点。 图 4  相关研究（图源：Nature Cell Biology） 2024 年 5 月 25 日，袁钧瑛团队和美国赛诺菲公司 Dimitry Ofengeim  合作在 Nature Reviews Molecular Cell Biology（IF = 81.3）上发表题为 A guide to cell death pathways 的文章。细胞死亡是机体发育和成人体内平衡的重要组成部分。消除发育过程中多余的细胞对于保证正常的形态发生和器官发生是非常重要的。在成人生活中，消除自身反应性免疫细胞、癌细胞和受损细胞对体内平衡至关重要。细胞凋亡、坏死和焦亡是三种程序性细胞死亡方式。半胱氨酸蛋白酶 caspase 家族是程序性细胞死亡的关键调控因子。该研究介绍了内源性凋亡和外源性凋亡的机制，重点讲解了 BCL-2 家族蛋白、caspase 家族蛋白以及死亡受体在凋亡中的作用。其中，在细胞凋亡过程中，caspase 激活的级联介导信号转导和细胞破坏，而当激活的 caspase 切割 Gasdermins 时发生焦亡，Gasdermins 随后可以在质膜上形成孔。此外，该研究也解释了 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 蛋白在坏死性凋亡中的作用，以及 TNF、FasL 和 TLR3 等配体如何激活坏死性凋亡。总的来说，该研究概述了主要的细胞死亡机制，重点介绍了它们复杂的调控和执行的最新见解，以及它们与人类疾病的相关性。 图 5  相关研究（图源：Nature Reviews Molecular Cell Biology） 2024 年 11 月 7 日，袁钧瑛团队和中国科学院上海有机化学研究所单冰、朱正江团队合作在 Nature Cell Biology（IF = 17.3）上发表题为 Spermidine mediates acetylhypusination of RIPK1 to suppress diabetes onset and progression 的文章。亚精胺一直以来被认为具有抗炎、抗衰老的保健作用，可以预防各种与衰老相关的疾病，但对其中的分子机制却尚不明晰。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1）是炎症和细胞死亡的关键调节因子，该研究发现 mNAT1 和 hNAT2 在受体相互作用 RIPK1 上可调节一种涉及乙酰化亚精胺的翻译后修饰，并将其命名为乙酰羟丁胺化（acetylhypusination）。该研究报道了亚精胺介导 RIPK1 acetylhypusination 修饰的分子机制，揭示了 NAT1 敲除可促进 RIPK1 激活及血管内皮细胞死亡而导致糖尿病的发生，进而认为运用亚精胺和 RIPK1 抑制剂能够抑制糖尿病的发生及其并发症的发展。研究结果表明，体内补充亚精胺可降低 RIPK1 介导的细胞死亡以及 NAT1 缺乏引起的糖尿病表型。此外，抑制 RIPK1 也可阻断 NAT1 缺陷小鼠血管病理介导的胰岛素抵抗和糖尿病肾病。该研究发现 RIPK1 介导的血管内皮细胞死亡和炎症对糖尿病的发生和发展起到了重要的作用，可以直接诱导 2 型糖尿病的发病，促进糖尿病血管并发症的发展以及难以治疗的肾损伤，这表明 RIPK1 是治疗代谢紊乱、糖尿病及终末期血管损伤并发症的重要靶点。总的来说，该研究强调了血管病理在糖尿病的发生和发展中起作用，并确定了 RIPK1 激酶的抑制是治疗 2 型糖尿病的潜在方法，为深入研究糖尿病的机理与开发新的治疗手段提供了重要的新思路。 图 6  相关研究（图源：Nature Cell Biology） 袁钧瑛院士四十年如一日将一生奉献给科学创新，为世界细胞凋亡研究领域奠定了研究基础，引发了全球众多的实验室从不同的角度开始对细胞凋亡进行系统的研究。目前，她带领团队发起了对科研「无人区」的挑战  - 开发通过调控细胞死亡，从而治疗某些神经退行性疾病的药物。最后，希望袁钧瑛院士及其团队能够取得丰硕的科研成果！ 专家介绍（上下滑动查阅） 袁钧瑛 博士，研究员，博士生导师。袁钧瑛院士于 1977 年以上海市应届生高考第一名的优异成绩考入上海复旦大学生物化学专业。1982 毕业，获学士学位。同年考入上海第一医科大学（现复旦大学医学院）研究生院，并以优异成绩考入 CUSBMBEA 项目赴美国哈佛大学医学院攻读博士学位。1989 年获哈佛大学博士学位，同年进入麻省理工学院进行博士后研究。1990 受聘于哈佛大学医学院，任助理教授。1996 年任哈佛大学医学院副教授。2000 年至今任哈佛大学医学院终生正教授。袁钧瑛教授的主要研究目标是揭示哺乳动物细胞中调控细胞死亡的分子机制。袁钧瑛教授为开创两个主要的细胞死亡研究领域，包括细胞凋亡（apoptosis）和细胞坏死（necroptosis），做出了里程碑式的贡献。她的工作阐明了一系列在这两种细胞死亡方式中的关键驱动分子, 分子机制以及与人类疾病的关系。袁钧瑛教授曾兼任  Bristol-Meyers Squibb, Pfizer, GlaxoSmithKline, Aventis, Merck, Millennium, Amgen 等众多国际大型药物公司的顾问以及 Journal of Cell Biology、 Current Biology 等多个国际著名期刊的编委。袁钧瑛教授在细胞凋亡领域取得了卓越成就，并先后当选为美国艺术和科学院院士（2007 年）、美国科学促进会会士（2010 年）、美国科学院院士（2017 年）、中国科学院外籍院士（2023 年）。 Reference Conradt B, Miao EA, Yuan J, et al The story behind the emergence of different forms of cell death. Dev Cell. 2024 Oct 7;59(19):2519-2522. Guo R, Liu J, Min X, et al. Reduction of DHHC5-mediated beclin 1 S-palmitoylation underlies autophagy decline in aging. Nat Struct Mol Biol. 2024 Feb;31(2):232-245. Cao Z, Min X, Xie X, et al. RIPK1 activation in Mecp2-deficient microglia promotes inflammation and glutamate release in RTT. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Feb 6;121(6):e2320383121. Hou S, Zhang J, Jiang X, et al. PARP5A and RNF146 phase separation restrains RIPK1-dependent necroptosis. Mol Cell. 2024 Mar 7;84(5):938-954.e8. Yang Y, Zhang J, Lv M, et al. Defective prelamin A processing promotes unconventional necroptosis driven by nuclear RIPK1. Nat Cell Biol. 2024 Apr;26(4):567-580. Yuan J, Ofengeim D. A guide to cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024 May;25(5):379-395. doi: 10.1038/s41580-023-00689-6. Epub 2023 Dec 18. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

导读 “自噬”是细胞的一个自我消化的过程，简单来说，自噬就像是细胞内的“清洁工”，负责清理不再需要或功能异常的“垃圾”。 日本学者大隅良典是这一领域的先驱，凭借自噬相关的研究，他斩获了2016年诺贝尔生理或医学奖。 出生在日本的大隅良典从小就对化学颇感兴趣，20世纪90年代，大隅良典从面包酵母中找到了与自噬有关的关键基因，自那以后，他开启了自噬研究之路，并将这项研究带到了人类细胞之中。 以下是大隅良典的自述。 早年经历与影响 1945年，也就是第二次世界大战结束前半年，我出生在日本福冈。我的父亲叫大雄，是九州大学采矿工程教授；母亲叫诗名。 当时，日本普遍贫穷，甚至经常食不果腹。我是一个体弱多病的孩子，再加上营养不良导致身体更为孱弱。我出生后，母亲患上了肺结核，在床上与病魔抗争了很长时间。我仍然记得她患上脊柱结核后打石膏的样子。 幸运的是，那时夏威夷的一位友人向我父母寄来了新研发的抗生素，正是这及时的援助让我的母亲得以康复。虽然当时的我对这些药物的具体意义并不完全理解，但“链霉素”、“青霉素”等名词却在我心中留下了深深的烙印。大约在我8岁那年，母亲终于能够重拾正常的生活。与此同时，比我大12岁的哥哥大助顺利考入东京大学文学系，他在我上小学时已经是个大学生了。在父亲、两位姐姐礼子和文子，以及众多亲友的支持下，我顺利度过了那段充满挑战的日子。倘若那时我能遇到一位出类拔萃的医生，或许我会走上医学的道路。然而，我心中始终燃烧着成为科学家的梦想，这梦想在父母的期望中得到了鼓舞。 我在一个充满自然气息的环境中成长，我的家四周环绕着稻田、溪流、山丘和大海。我的童年时光大多在户外度过，捕捉鱼类、采摘野果。在小学期间，我对昆虫的收集产生了浓厚的兴趣，花费大量的时间去寻找各种奇特的昆虫标本。夜晚，我会仰望星空，尝试记住每一颗星星和星座的名字。然而，这些兴趣并未得到专业的培养，最终只成为了我童年时期的美好回忆，而非终身热爱的追求。每当哥哥从东京大学放假回家，他总会带回一些书籍，其中不乏精心挑选的科学类读物。这些书籍大大拓宽了我对学校之外世界的认知。尽管我体质较弱，既无运动天赋，也不擅长文学，但我仍然努力在学校取得优异的成绩。 图1. 1951年在福冈拍摄的全家福（父母、哥哥和两个姐姐）。 在高中期间，我加入了化学俱乐部，我们会在其中混合各种化学物质，并喜欢观察它们之间的反应。我清楚地记得琼脂中“列桑格现象”（Liesegang phenomenon）的美，但当时我并不知道如何分析它。由于我希望成为一名化学家，因此选择了以化学见长的东京大学就读。 然而，化学课程却并没有激发我的兴趣，我经历了一段不确定的时期，甚至为我的未来感到苦恼。幸运的是，当时分子生物学领域刚刚兴起，于是我决定专攻这一领域。本科毕业后我加入了今堀和男（Kazutomo Imahori）的实验室，他是当时日本少数几个拥有分子生物学实验室的科学家之一。 今堀和男的研究领域是物理化学，用于评估蛋白质与核酸之间的相互作用。在前田昭（Akio Maeda）的指导下，我开始研究核糖体亚基在蛋白质合成中的作用。尽管我无法得出特别有趣的结果，但我在今堀实验室的时光令人兴奋，因为我们参与了快速发展领域的工作，我第一次体验到了实验工作的乐趣。这段经历还让我对细胞内蛋白质合成的连续性有了深刻的认识。    图2. 1967年高中化学俱乐部。 在我研究生学习期间，大学学生抗议活动非常多，而东京大学在这一时期正处于社会辩论和社会变革的中心。我在这段时间里意识到，我们必须关注社会发展和社会的方向，为了参加讨论和示威活动，我也因此无法完全专注于实验室工作。 从攻读博士学位第二年开始，我决定转到京都大学，前田昭此时已经是副教授，他加入了新成立的生物物理系。京都大学提供了一个非常自由的环境，我在化学系生物化学实验室中遇到了一群才华横溢的新学生和朋友。在研究过程中，我对大肠杆菌素E3产生了兴趣，它能够穿过细菌细胞膜并立即抑制蛋白质合成。这一时期，我对生物膜的兴趣不断增长。 一年后的1971年，我与中泽麻里子（Mariko Nakazawa）结婚，她在我之后两年加入了今堀实验室。我们结婚后在京都度过了非常令人难忘的一年。然而不久后，中泽麻里子意外地怀孕了，她也因此返回了东京。为了支持我们的新家庭，她成功申请加入了新成立的三菱生命科学研究所。我也回到东京，选择跟随今堀和男，此时他已经转到了东京大学的农学院，我在那之后勉强完成了论文，获得了博士学位。    图3.（a）今堀和男和（b）安良浩二。 当时，要获得一个良好的学术职位并不容易。由于细胞生物学领域刚刚开始兴起，今堀和男建议我前往洛克菲勒大学的G. M. 埃德尔曼（G. M. Edelman）实验室工作。当时，今堀和男以前的学生伊原一朗（Ichiro Yahara）在那里表现很好，也因此我很快就获得了一个岗位。这是我第一次离开日本，而且与我之前的工作领域大不相同，所以我一度非常迷茫。我的妻子在获知后决定离开研究所，和我一起去纽约。幸运的是，中泽麻里子很快在同一所大学的诺顿·辛德（Norton Zinder）实验室找到了一个研究职位。 最初，我研究的是淋巴细胞的丝裂原，但埃德尔曼决定将实验室的重点转向小鼠发育，于是我参与了建立体外小鼠受精系统的工作。我之前只处理过大肠杆菌，因此我每天都会为如何用少量卵子捕捉早期发育过程而苦恼。不久之后，迈克·贾兹温斯基（Mike Jazwinski）从亚瑟·科尔伯格（Arthur Kornberg）的实验室转到我们的实验室。受哈特韦尔（Hartwell）发现cdc突变体的启发，我们开始了一个项目，旨在揭示酵母中DNA复制起始的机制，我加入了这个项目。我们原计划使用密度梯度离心法在这个项目中使用分离的细胞核，但很难获得未受损的细胞核。我注意到试管顶部有一层白色物质，当我出于好奇在显微镜下观察这层物质时，我意识到我们还在分离高度纯化的液泡。这给我留下了深刻的印象，并是我走向今天这个位置的众多偶然环节之一。    图4. 大隅良典和中泽麻里子于1971年和2015年。 1977年秋天，东京大学理学院的安良浩二（Yasuhiro Anraku）教授邀请我回到日本担任他的实验室的助理教授，尽管我刚开始研究酵母DNA复制起始的工作，但还是决定尽快回到日本。1977年12月，我带着当时即将满6岁的儿子回到了日本，而中泽麻里子则和我们在纽约刚出生的第二个儿子一起多待了几个月，以完成她在辛德实验室的工作。 安良浩二实验室以其在E. coli中的转运蛋白和呼吸机制方面的工作而闻名，但安良浩二允许我开始一个关于酵母的项目。回想起来，我真的很感激安良浩二给我的这个机会。 我最终决定不去研究质膜，而是液泡的膜，这是一种细胞器。当时，液泡被认为是细胞的“垃圾场”，因此很少有科学家对它感兴趣，但我在植物学系的位置以及毗邻马益泽正志（Masashi Tazawa）实验室的位置使我相信液泡是一个被低估的、迷人的细胞器。我相信许多酵母研究人员都认为这是一个奇怪的项目选择。    很快，我开发了一种从高度纯化的液泡中分离液泡膜囊泡的程序。虽然液泡占细胞体积的大约四分之一，但我只能获得少量液泡膜，但这足以证明液泡膜上氨基酸和钙的主动转运。此外，我们是第一个展示新型质子泵V型ATP酶的团队，它为液泡转运提供了驱动力，这些工作是与已故的嘉数嘉美和日本田内悦子合作的成果。此后，V型ATP酶的结构和功能研究成为了一个活跃的研究领域，一直持续到今天。 搬到小田原并发现自噬 在对液泡膜进行了10年的研究之后，我获得了东京大学文理学院（小田原校区）的副教授职位，并建立了自己的实验室——只有我一个人。 我的实验室设备非常简陋，只有一台摇床、一个培养箱、一个分光光度计、一台基础光学显微镜和几个其他仪器。我意识到这是一个开始全新课题的难得机会，于是在我们部门的第一次会议上宣布我将研究液泡的溶解功能。然而，我并没有精心策划的策略来研究这个问题。 由于液泡是一个包含多种溶解酶的酸性区室，我推测这个细胞器将发挥与哺乳动物溶酶体类似的作用。将可能有害的降解过程隔离在膜区室中是有生物学意义的，但当时我知道，如果这是真的，那么需要降解的物质必须穿过液泡膜，这表明这需要细胞生物学的方法，并不容易解决。那时候，我关于蛋白质降解的研究源于对液泡的研究，那一年我43岁。 图5. 东京大学实验室的首批成员 溶酶体是克里斯蒂安·德迪夫（Christian de Duve）于1955年发现的，不久后，洛克菲勒大学的研究人员通过电子显微镜观察到溶酶体接收来自细胞外和细胞质的物质。德迪夫用希腊语“self-eating”一词来描述这种现象，意为“自我吞噬”。虽然像格伦·莫蒂莫尔（Glenn Mortimore）和佩尔·塞格伦（Per Seglen），对自噬的调节和复杂的膜动力学进行了深入的分析，但当我加入这一领域时，问题比答案多得多。哺乳动物细胞中溶酶体和膜动力学的复杂性阻碍了自噬机制的揭示。德迪夫的实验室与埃德尔曼的实验室在同一座大楼里，虽然我有来自他实验室的朋友，但我从未有机会在洛克菲勒大学与这位伟大的科学家见面。 今天的光学显微镜，包括荧光显微镜，都是先进的仪器，但在那个时代，光学显微镜的功率有限，很难获得关于细胞内的信息，特别是在对于微小的酵母细胞研究的时候。然而，可以在相差显微镜下清晰地观察到酵母液泡。液泡内部有点像低蛋白浓度的盐溶液，因此我知道由于折射率的不同，很容易检测到液泡内的结构。之后我每天都会在显微镜下观察液泡，我想我可能在这些年里比任何人都更长时间地观察酵母细胞！ 首先，我寻找了一种条件，使酵母能够分解自己的蛋白质，并确定了孢子形成是最佳候选。这种从营养生长细胞到通过减数分裂产生四个孢子的戏剧性变化是由氮的环境耗竭引起的。由于氮是蛋白质的主要成分，我推测这种剧烈的细胞重塑所需的蛋白质合成必须依赖于细胞自身蛋白质的周转。因此，我密切观察了孢子形成过程中的液泡形态，但没有观察到任何明显的变化。    有一天，我突然设想，如果我使用一种缺乏液泡蛋白酶的细胞，那么被输送到液泡中进行降解的结构将保留在这个细胞器中，并可能可见。幸运的是，伊丽莎白·琼斯（Elizabeth Jones）已经构建了缺乏液泡蛋白酶的菌株，并且作为酵母社区共享精神的典范，将它们存放在了加州大学伯克利分校的酵母遗传种质中心，因此我立即请求将它们送到我的实验室。当它们到达时，我使它们处于氮饥饿状态并在显微镜下观察。我观察到液泡内有小的球形结构在剧烈移动。这些结构在氮饥饿开始后30分钟内出现，并在几小时内完全填充了液泡。在这个原本平静的酵母细胞中，这种明显的表型真的打动了我，我清晰地记得盯着显微镜看了好几个小时，甚至于无法移开视线。这些结构在野生型细胞中会立即降解，这就是为什么它们从未被正确记录的原因。 我很幸运有两个原因：首先，液泡内的结构，我们现在称之为自噬体，足够大，可以在显微镜下看到； 其次，自噬体通过布朗运动产生的强烈运动使得它们在液泡中的积累很容易被注意到，即使使用基础光学显微镜也是如此。这一现象的发现决定了我职业生涯的剩余部分。 我决定立即通过电子显微镜确定这一现象的原因，并寻求了美寿巴（Misuzu Baba）以及大须美佐子（Masako Osumi）的帮助。他们拍摄的图像美得令人惊叹，为酵母自噬的特征性膜现象提供了确凿的证据。这些图像显示，自噬体与细胞质具有相同的核糖体密度，以及各种细胞质结构和细胞器，这表明自噬是一个非选择性的降解过程。这些实验为我们提供了当前对与自噬相关的膜动力学的理解。虽然液泡比哺乳动物的溶酶体大得多，但我们观察到的整个过程在拓扑结构上与哺乳动物细胞中的巨自噬相同，证实了酵母可以作为研究自噬的模式生物。    酵母作为模式生物最吸引人的特点是其遗传可操作性，这使它在解析复杂的生物现象方面具有巨大的优势。对我影响很大的两个重要例子是李·哈特韦尔（Lee Hartwell）的cdc突变体鉴定及其在细胞周期中的作用，以及兰迪·谢克曼的sec突变体分离及其在膜转运中的作用。 由于我们对参与自噬的基因和蛋白质一无所知，因此第一步是分离出自噬缺陷突变体。但是当时，我们监测自噬的唯一方法就是观察液泡内自噬体的积累。我第一位硕士生塚田美纪（Miki Tsukada）在我们工作的这个阶段发挥了核心作用。她取出了数千个诱变细胞，分别使它们处于饥饿状态，然后检查液泡内是否存在缺少自噬体的突变体。这种方法使我们发现了第一个自噬突变菌株，我们将其命名为apg1。在这个菌株中无法诱导蛋白质降解，这使我们确信自噬体确实是饥饿期间负责降解的。正如我们所预料的，我们还发现，纯合二倍体突变体不能产生孢子。然而，在营养丰富的条件下，apg1菌株与野生型细胞之间并没有观察到差异，液泡功能或分泌也没有明显的缺陷。 很快我们就发现，与野生型细胞相比，apg1细胞在氮饥饿期间迅速失去活力。我们假设这一表型是由自噬缺陷引起的，因此我们接下来进行了一项初步的活力评估筛选。通过分离活力降低的菌株，然后检查这些菌株在自噬方面的形态缺陷，我们能够在一次筛选中鉴定出大约100个自噬缺陷菌株。进一步的遗传分析表明，这些菌株中有14个是互补组。根据我们目前对自噬的理解，这一筛选非常有效。我们最初预测这些突变体将在自噬过程的不同阶段表现出缺陷，但令人惊讶的是，它们都对自噬体的形成至关重要，这是自噬过程中最重要的一步。    接下来，我们着手克隆并鉴定筛选中观察到的突变表型所涉及的基因。塚田首先成功克隆了APG1基因，这使我们了解到该基因编码一种蛋白激酶。然而，我们还发现，剩余的基因编码对自噬至关重要的未表征蛋白质，但在营养丰富条件下对生长不是必需的。因此，我们无法推断出它们的功能，并经历了一段无法发表我们激动人心的发现的困难时期。尽管我们取得了快速的进展，但自噬基因仍然逃脱了全世界酵母遗传综合分析中其他研究人员的关注。我怀疑这是因为研究人员对必需基因感兴趣，这些基因通常被定义为在营养丰富培养基中无法存活的基因。此时，武田信司也开发了一种自噬活性的定量测定方法，即至今仍广泛使用的Pho8Li60测定法。这些发展共同为我们后续的自噬分子机制研究奠定了基础。 这就是我在东京大学那个小实验室里开始自噬研究的经历。从发现自噬到开始表征Atg基因，整个过程在八年内在驹场（日本东京都目黑区的一个町）完成。 国家基础生物学研究所 下一个阶段开始于1996年。 当时我被选为位于冈崎的国家基础生物学研究所（NIBB）的教授。该机构为基础生物学提供了非常有利的环境，我选择了三名研究人员加入我们的团队：来自关西医学院的吉本大蔵（Tamotsu Yoshimori），他在哺乳动物细胞中整合我们在酵母中的发现；野田武司（Takeshi Noda），他是我们在駒場实验室的第一个博士生；以及在美国约翰·霍普金斯大学学习过的河村良明（Yoshiaki Kamada）。第二年，前东京医科大学临床医生水岛伸（Noboru Mizushima）也加入实验室，成为日本学术振兴会（JSPS）的博士后研究员，后来成为助理教授。从那时起，来自日本各地的研究生和博士后加入了我们的实验室，我们进入了研究的最富有成果的时期。在NIBB，我们能够创造出一个真正独特的研究环境，将我们的工作扩展到包括哺乳动物细胞和植物细胞，这对该领域的发展非常重要。我们实验室的大多数成员都住在NIBB附近，由于吉本大蔵和我在这段时间都在外工作，我们经常工作到深夜，边喝啤酒边讨论科学。    我原本预计分离自噬所需的所有基因将需要很长时间，但感谢我妻子实验室的合作，该实验室在东京理科大学帮助我们进行克隆，以及1996年对整个酵母基因组的测序，我们能够在相对较短的时间内阐明几乎所有APG基因的遗传背景           图6. 2003年国家基础生物学研究所的大隅实验室。 之后，我们着手鉴定已表征的Apg蛋白的相互作用蛋白，并能够在氮饥饿条件下自信地鉴定出对自噬至关重要的所有18个基因。由迈克尔·图姆（Michael Thumm）领导的一个团队正在研究在饥饿条件下使用抗体降低蛋白质水平，并紧跟在我们团队之后，使用“aut”别名命名他们发现的基因。与此同时，丹·克利翁斯基（Dan Klionsky）的团队正在研究氨基肽酶Ape1从细胞质到液泡靶向的传递，现在被称为Cvt途径，他们使用“cvt”别名来识别基因。该途径实际上是负责Ape1成熟的生物合成途径。通过我们团队的协作，我们确定这一过程是通过类似膜的现象发生的，这些现象依赖于核心自噬机制和非常有选择性地隔离Ape1以传递到液泡。因此，克利翁斯基的团队发现了Cvt途径，这成为选择性自噬这一主要领域的重要模型。    随着多个团队在酵母中继续分离出具有自噬缺陷的突变菌株，我们集体决定在ATG别名下统一基因名称，以简化该领域的命名。由于我们团队鉴定了大多数关键的自噬相关基因，因此在我们团队为APG基因命名时使用的基因编号在这一系统中得到了保留。随着进一步鉴定自噬相关基因，其中大多数涉及选择性自噬，ATG基因的数量现已达到41个。 在我们在NIBB任职期间，随着我们开始研究ATG基因产物以深入了解其功能，重要的发现接踵而至。水岛伸在他的研究中取得了第一个重要突破，研究对象是最近克隆的Atg12蛋白。他发现了一个复杂的共轭系统，它以泛素样的方式起作用，产生Atg12-Atg5-Atg16复合物二聚体，这对自噬至关重要。另外两名研究生，高义切里佐（Takayoshi Kirisako）和一村吉信（Yoshinobu Ichimura），也发现了另一个泛素样共轭系统，该系统不同寻常地导致Atg8与膜磷脂磷脂酰乙醇胺结合。Atg8的同源物很快被吉本大蔵在哺乳动物中和我们的团队在植物中鉴定出来，它在整个自噬过程中的所有阶段都与自噬体相关，因此被广泛用作自噬进展的标记。因此，我们了解到近一半的必需Atg蛋白仅参与两个共轭反应。这些反应所涉及的复合物的重要结构细节得益于我们与稻垣冬彦（Fuyuhiko Inagaki）和野田伸生（Nobuo Noda）的团队之间的紧密合作而得以解决。 随着自噬特异性PI3激酶复合物的鉴定，我们将其命名为PI3激酶复合物I，从而获得了更多详细信息。木原明生（Akio Kihara）的研究表明，Atg6实际上只是斯科特·埃姆尔（Scott Emr）的团队最近鉴定出的Vps30蛋白，即液泡蛋白分选途径中的蛋白。Vps30是PI3激酶复合物的一个组成部分，我们随后发现Atg14使该复合物在自噬中发挥了特定作用。PI3激酶复合物I的另一个特定成分Atg38最近被荒木康弘（Yasuhiro Araki）发现。同时，我们还发现了Atg13在激活Atg1激酶功能方面的重要作用，并确定了Atg17、Atg29和Atg31是形成自噬诱导所必需的复合物，这在饥饿条件下尤为重要。随着我们对Atg9、Atg18和Atg2的研究，我们很快将饥饿条件下对自噬至关重要的所有18个基因分为六个功能组。铃木久仁里（Kuninori Suzuki）进一步探索了这一点，他使用荧光显微镜发现了前自噬体结构（PAS），这是一种动态结构，所有Atg蛋白至少部分组装于此，并精细协调自噬体的形成。铃木久仁里的工作还表明，Atg蛋白以分层的方式与PAS结合，以在自噬中发挥其重要作用，这进一步揭示了自噬的机制。    ATG基因的鉴定彻底改变了自噬研究。其中一个重要例子是水岛伸使用带有GFP标记的LC3转基因小鼠展示哺乳动物中自噬的进展，以及他成功生成了首个Atg5自噬敲除小鼠。加上小松正明（Masaaki Komatsu）在小鼠中敲除Atg7的研究，这些研究改变了我们对哺乳动物细胞中自噬的理解，并推动了世界各地对各种细胞、组织、器官和整个生物体中ATG基因的广泛遗传操作。这一运动有助于揭示自噬的多种生理功能。其中，自噬的回收功能是细胞中最基本的，有助于应对常见的营养限制挑战。但自噬不仅对营养回收很重要：它还涉及经常选择性地清除不必要的或有害的细胞内成分，这对于维持细胞内环境非常重要。最近，蛋白质、超分子结构和细胞器的选择性消除已成为核心自噬机制在生理上重要的应用。其中特别突出的一个例子是备受关注的选择性线粒体自噬或线粒体自噬领域。通过自噬清除老化和可能受损的线粒体可确保高效的能量产生和健康的细胞内环境，这强调了自噬与细胞的精细整合。 在东京工业大学我最后一个实验室 即使在像酵母细胞这样看似简单的生物体中，仍有许多谜团尚未解开。因此，自从吉本大蔵和水岛伸成立自己的研究小组以来，我的实验室一直专注于酵母研究，已有13年之久。 2009年，我的职业生涯又发生了另一个重要变化。东京工业大学向我提供了一个拥有先进设施的特聘教授职位，于是我决定返回东京地区。与小林仁志（Hitoshi Nakatogawa）和铃木教授担任助理教授，以及后来的山下早苗（Hayashi Yamomoto），我们成立了一个新的实验室。我带了很多来自冈崎的同事到这个新设施。我们专注于一个主题，即通过Atg蛋白的功能分析，研究自噬体的形成过程。最近，我们发现了PAS形成的早期步骤是如何组织的。另一个让我们感兴趣的研究领域是酵母的选择性自噬机制。在这个领域，我们也能够识别出各种目标选择的受体。小林仁志发现了内质网和细胞核降解的新型受体。 图7. 2015年东京大学大隅良典研究组成员 现在，我的实验室已经将研究重点转移到自噬的生理意义上。为了回到我职业生涯开始时让我着迷的原始问题——自噬降解是什么、何时、如何以及为什么——我们需要系统地考虑细胞在各种环境条件下的存在。今年，我们在东京工业大学成立了一个研究单位，并与川又友子（Tomoko Kawamata）担任助理教授，我们现在正在运行一个主要由博士后研究人员组成的实验室，这将是我最后一个实验室。在这里，我们正在努力解决那些我认为对深化我们对自噬的理解非常重要的原始问题。酵母仍然是一个极其强大的模式生物，随着新的生物化学技术的不断发展，我相信我们仍然可以做出许多开创性的贡献，特别是在确定自噬的诱导条件和各种模式方面。这些贡献将不可避免地评估自噬降解产生的产物，它们从液泡中导出的机制，以及它们对细胞代谢的影响。作为一种基本的细胞过程，自噬直接和间接地与一系列细胞通路相关联，而开发能够让我们掌握这种机制微妙特征的定量方法至关重要。对自噬的更好理解有望帮助我们阐明遗传学、表型和疾病之间的模糊关系。    自噬研究仍处于初级阶段，特别是我们对自噬生理作用的理解还处在起步阶段。当然，我很高兴我们能够揭示出有关自噬及其相关表型的如此复杂的细节，该领域吸引了世界各地的关注，这非常令人兴奋。但我最感激的是多年来与我一起工作的许多优秀的同事。我始终受好奇心驱使，而不是追求立即的实际成果，我很幸运能与欣赏基础研究重要性的博士后研究人员和研究生一起工作。他们中的许多人分享了我对研究困难项目的热情，这些项目并不总是能立即得出结果，而令人欣慰的是，他们中的许多人继续在各大学作为研究人员推动这一领域的发展。多年来，我也非常幸运能与许多合作者一起工作，他们在我们的研究过程中给予了帮助。特别是我想提到两位与我们合作了十多年，对Atg蛋白进行系统性结构分析的研究人员的贡献：目前在日本微生物化学研究所工作的野节伸吾（Nobuo Noda）和令人遗憾的是在2016年去世的稻垣文彦（Fuyuhiko Inagaki）。我非常感谢他们多年来的合作。 图8. 2016年大隅良典一家 我对自噬研究所表现出的兴趣深感感动，对我来说，这代表了过去28年不可思议的旅程。这一切要归功于对我们基础研究的资助支持，这对我们的事业至关重要。如果我们的工作能够触发人们对生命的理解，那么作为基础科学家，这将是我最大的快乐和荣幸。我满怀期待地期待着该领域在未来的持续发展。 参考资料 Yoshinori Ohsumi Biographical.The Nobel Prize.      封面图来源：正文 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 「K药」新增的 “潜在” 业绩 再试一次！辉瑞“复活”其口服GLP-1RA “神药” 罗沙司他的前世今生 点击这里，发现价值信息！

*仅供医学专业人士阅读参考众所周知，癌细胞在很多方面都“不择手段”，为了存活、增殖和侵袭想出了各种各样的怪招，比如设法在营养物质不足的情况下存活，不过这些怪招也往往是双刃剑，为可能的抗癌策略提供切入点。近日，中国科学技术大学附属第一医院（即安徽省立医院）尹大龙、孙雪丹、刘连新团队及郑州大学人民医院吴缅团队在《细胞发现》（Cell Discovery）期刊发表最新研究成果，揭示了肝细胞癌（HCC）细胞可在谷氨酰胺剥夺环境下，依靠干扰素相关发育调节因子1（IFRD1）来抑制自噬，实现适应性存活，而靶向IFRD1则可有效诱导癌细胞死亡，凸显了它作为抗癌靶点的价值[1]。论文首页截图癌细胞对谷氨酰胺的高度依赖性，让最近几年学界开始争相探索抑制谷氨酰胺代谢是否可行[2]，不过想要实现对癌细胞“一招制敌”总是很难，自噬就是癌细胞的反制手段之一，癌细胞可以由此暂时性补充谷氨酰胺缺乏导致的氮和碳不足，但自噬也不会一直持续下去，所以研究者们推测，癌细胞肯定有个能让自噬刹车的“开关”。研究者们选定了HCC细胞作为实验对象，将它置于谷氨酰胺剥夺环境中，并借助多组学分析技术筛选最有可能的“开关”基因，在初筛出的19个基因中，只有IFRD1等3个基因与HCC患者生存预后显著相关，而IFRD1又是唯一一个在多种HCC细胞系中，都在谷氨酰胺剥夺环境下表达显著上调的基因，调控其表达上调的是转录因子MAFG。在谷氨酰胺剥夺环境中，HCC细胞的IFRD1基因表达显著上调敲除HCC细胞的IFRD1基因，会使癌细胞在谷氨酰胺剥夺环境下的死亡概率大增，但在普通环境中并无明显影响，下一步就该探索敲除IFRD1为什么如此致命了：研究者们用抑制细胞凋亡、细胞铁死亡和自噬性细胞死亡的药物分别处理，发现只有抑制自噬性细胞死亡的氯喹能保全一部分癌细胞的性命，说明IFRD1确实能在谷氨酰胺不足时调控癌细胞自噬。对癌细胞自噬标志物和自噬体/自噬溶酶体的分析都证实，IFRD1能承担自噬“调控开关”的角色，受IFRD1下游调控的则是PI3KC3复合体中的关键亚基ATG14，在外界谷氨酰胺不足时，IFRD1可介导ATG14经TRIM21调控的泛素化-蛋白酶体途径降解。但IFRD1的影响还不止于此，研究者们回顾了先前的多组学分析数据，发现在谷氨酰胺剥夺环境下，癌细胞的组蛋白H1.0水平也显著上升，而敲除IFRD1则呈现相反的结果；进一步分析显示，IFRD1可抑制组蛋白H1.0的核自噬降解（nucleophagic degradation）。保全更多的组蛋白H1.0，也是IFRD1能让癌细胞在谷氨酰胺剥夺环境中，更有可能存活的重要原因，具体来说，组蛋白H1.0是表观遗传、基因转录和染色质重塑等过程的重要参与者，它在谷氨酰胺剥夺时会沦为癌细胞蛋白和核糖体生物合成的底料，但这也会使癌细胞更容易发生自噬性死亡，所以IFRD1的存在，能让癌细胞以更小的代价（low-cost）存活。IFRD1可抑制组蛋白H1.0的核自噬降解当然从抗癌治疗的角度来说，抑制IFRD1对癌细胞就是釜底抽薪了，而且研究者们还发现，敲除IFRD1能够与现有的谷氨酰胺代谢通路抑制剂，如谷氨酰胺酶1 (GLS1) 抑制剂GB-839实现协同增效，而且敲除IFRD1对正常细胞影响并不大，这就为联合治疗奠定了理论基础，或许IFRD1就是让谷氨酰胺代谢通路抑癌药物，向前迈进一步的关键呢。参考文献：[1] Huang Y, Meng F, Zeng T, et al. IFRD1 promotes tumor cells “low-cost” survival under glutamine starvation via inhibiting histone H1. 0 nucleophagy[J]. Cell Discovery, 2024, 10: 57.[2] Cluntun A A, Lukey M J, Cerione R A, et al. Glutamine metabolism in cancer: understanding the heterogeneity[J]. Trends in Cancer, 2017, 3(3): 169-180.本文作者丨谭硕