MNAT1

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。去年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。——背景——分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？——NEK7降解剂的发现——在前半部分中，作者通过计算方法发现了人类蛋白质组中存在大量G-loop蛋白，并明确了这些G-loop蛋白可被化合物诱导接近CRBN，但“接近（Proximity）”是蛋白降解的必要不充分条件：以本文中的Cpd1为例，Cpd1可诱导CK1α，NEK7，SCYL1，MNAT1，ASS1，CHD7，PPIL4等多种蛋白接近CRBN（Turbo-ID实验），但仅有CK1α，PDE6D和少量C2H2 ZFs的含量有明显下降。于是作者探究了一个问题：能否通过对分子胶进行化学改造，使得“接近”转变为“降解”。图1. 本文所用到的分子胶在此基础上，作者将目光投向NEK7（一种与 NIMA 相关的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在自身炎症性疾病中具有治疗相关性）。NEK7激酶结构域的N-lobe上存在一个β-hairpin G-loop，与CK1α具有较高相似性（图2）。在TR-FRET， NanoBRET和TurboID实验中，CRBN和Cpd1，NEK7能形成三元复合物，但在CAL51细胞中，Cpd1对NEK7水平无影响。图2. NEK7激酶结构域作者通过TR-FRET，NanoBRET实验筛选了内部化合物库，发现了Cpd5能诱导NEK7与CRBN形成三元络合物，其EC50值与Cpd1相当，但信号强度高于Cpd1。在CAL51细胞中，Cpd5选择性降解NEK7，且降解谱与Cpd1比相当干净（图3）。图3. A. Cpd1降解谱。B. Cpd5 NanoBRET信号强于Cpd1。C.Cpd5降解谱。作者解析了CRBN-Cpd5-NEK7的复合物晶体结构。首先Cpd5的二氢尿嘧啶片段插入CRBN三色氨酸笼中，咪唑并吡啶环以及后续的尾巴朝向溶剂暴露区，负责与NEK7相互作用。NEK7通过G-loop与CRBN/Cpd5复合物结合，其中G-loop位于咪唑并吡啶环附近，G-loop上的G57，L55，L54主链羰基分别与CRBN W386，H357，N351侧链形成氢键。此外G-loop G-5位的丙氨酸A52较小的侧链避免了与化合物形成冲突。最后，苯基磺酰胺部分更接近于NEK7残基的远端，并且与位于相邻的N-lobe上β-链上的R35和E37形成氢键（图4）。图4. 三元复合物晶体结构及详细互作——VAV1降解剂的发现——前面作者通过基于序列的方式，发现了一千多种CRBN潜在新底物。紧接着作者更换策略，通过基于表面的方式，又发现了新的CRBN底物，这些新发现的底物的degron序列与之前的G-loop完全不同。本公众号前文推送的“MaSIF相关工作”是近年来描述蛋白质表面的重要计算工具。值得注意的是，Monte Rosa这篇工作的共同第一作者正是MaSIF的第一作者。本工作采用的表面相似性算法来源于MaSIF。从CRBN-CC90009-GSPT1三元复合物结构出发，首先提取GSPT1中与参与复合物形成的界面，然后在蛋白质组中搜寻相似的界面。作者将已知的G-loop的蛋白排除在外，希望寻找到新颖的靶标（图5A）。VAV1是B细胞和T细胞受体信号传导的关键介质，且不含G-loop。VAV1表面可划分出27168个patch，将这些patch逐一与GSPT1 degron surface进行匹配，得到较为相似的patch。然后通过蛋白-蛋白对接，过滤掉与CRBN界面有冲突的patch，最后确定VAV1的C末端SH3结构域（SH3c），与GSPT1表面在与CC-90009形成的复合物中与CRBN接触的表面有极高的相似性，且SH3c结构域与GSPT1或其G-loop没有潜在的结构同源性。图5. A.基于表面的CRBN Neo-substrate发现过程 B.VAV1 SH3c表面与GSPT1 degron比较随后作者筛选了内部化合物库，发现Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物（图6）。图6. Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物最后，作者解析了VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构（图7）。VAV1 SH3c 结构域中的预测参与形成复合物的patch由两个色氨酸残基 W820 和 W831 以及 RT 环的顶端区域（aa797 – 801）形成。图7. VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构及关键相互作用——小结——通过计算工具，该工作系统性的发掘了1633种潜在的CRBN新底物，且在已知的β-hairpin G-loop motif之外，发现了新的helical G-loop。（之前的工作已经发现含C2H2锌指结构域是CRBN的潜在底物）该工作进一步拓宽了CRBN底物范围，包含不同功能、结构的蛋白质。通过实验验证，该工作确证了21种含有β-hairpin G-loop或 helical G-loop的新底物，大大拓宽了CRBN底物。不同的CELMoDS，可实现对底物的精准降解，表明基于CRBN的分子胶降解剂大有可为。G-loop motif的发现是基于序列的发掘方法的胜利。回归本质，CELMoDs诱导三元复合物形成这一过程事实上是Neo-substrate的界面与CELMoD-CRBN二元复合物新界面之间的电荷、形状、亲/疏水等的匹配。因此，基于表面的方法使作者成功发现了VAV1也是CRBN的底物，尽管VAV1与GSPT1序列相似性或结构同源性上都很低。该发现同样凸显了CRBN参与PPI相互作用的界面的非凡可塑性（N351、H357、W400），这些位点既能与G-loop相容，也与VAV1的RT-loop相容。最后，Monte Rosa的工作展示了计算工具在分子胶开发中的非凡潜力。参考文献：[1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933.作者：任宇浩审稿：王瀚平  编辑：郭   政版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。往期推荐乐威医药亮相2025 DCAT Week乐威医药公益3.12植树行动乐威医药获2024年度EcoVadis承诺奖牌

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。去年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。——背景——分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？——NEK7降解剂的发现——在前半部分中，作者通过计算方法发现了人类蛋白质组中存在大量G-loop蛋白，并明确了这些G-loop蛋白可被化合物诱导接近CRBN，但“接近（Proximity）”是蛋白降解的必要不充分条件：以本文中的Cpd1为例，Cpd1可诱导CK1α，NEK7，SCYL1，MNAT1，ASS1，CHD7，PPIL4等多种蛋白接近CRBN（Turbo-ID实验），但仅有CK1α，PDE6D和少量C2H2 ZFs的含量有明显下降。于是作者探究了一个问题：能否通过对分子胶进行化学改造，使得“接近”转变为“降解”。图1. 本文所用到的分子胶在此基础上，作者将目光投向NEK7（一种与 NIMA 相关的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在自身炎症性疾病中具有治疗相关性）。NEK7激酶结构域的N-lobe上存在一个β-hairpin G-loop，与CK1α具有较高相似性（图2）。在TR-FRET， NanoBRET和TurboID实验中，CRBN和Cpd1，NEK7能形成三元复合物，但在CAL51细胞中，Cpd1对NEK7水平无影响。图2. NEK7激酶结构域作者通过TR-FRET，NanoBRET实验筛选了内部化合物库，发现了Cpd5能诱导NEK7与CRBN形成三元络合物，其EC50值与Cpd1相当，但信号强度高于Cpd1。在CAL51细胞中，Cpd5选择性降解NEK7，且降解谱与Cpd1比相当干净（图3）。图3. A. Cpd1降解谱。B. Cpd5 NanoBRET信号强于Cpd1。C.Cpd5降解谱。作者解析了CRBN-Cpd5-NEK7的复合物晶体结构。首先Cpd5的二氢尿嘧啶片段插入CRBN三色氨酸笼中，咪唑并吡啶环以及后续的尾巴朝向溶剂暴露区，负责与NEK7相互作用。NEK7通过G-loop与CRBN/Cpd5复合物结合，其中G-loop位于咪唑并吡啶环附近，G-loop上的G57，L55，L54主链羰基分别与CRBN W386，H357，N351侧链形成氢键。此外G-loop G-5位的丙氨酸A52较小的侧链避免了与化合物形成冲突。最后，苯基磺酰胺部分更接近于NEK7残基的远端，并且与位于相邻的N-lobe上β-链上的R35和E37形成氢键（图4）。图4. 三元复合物晶体结构及详细互作——VAV1降解剂的发现——前面作者通过基于序列的方式，发现了一千多种CRBN潜在新底物。紧接着作者更换策略，通过基于表面的方式，又发现了新的CRBN底物，这些新发现的底物的degron序列与之前的G-loop完全不同。本公众号前文推送的“MaSIF相关工作”是近年来描述蛋白质表面的重要计算工具。值得注意的是，Monte Rosa这篇工作的共同第一作者正是MaSIF的第一作者。本工作采用的表面相似性算法来源于MaSIF。从CRBN-CC90009-GSPT1三元复合物结构出发，首先提取GSPT1中与参与复合物形成的界面，然后在蛋白质组中搜寻相似的界面。作者将已知的G-loop的蛋白排除在外，希望寻找到新颖的靶标（图5A）。VAV1是B细胞和T细胞受体信号传导的关键介质，且不含G-loop。VAV1表面可划分出27168个patch，将这些patch逐一与GSPT1 degron surface进行匹配，得到较为相似的patch。然后通过蛋白-蛋白对接，过滤掉与CRBN界面有冲突的patch，最后确定VAV1的C末端SH3结构域（SH3c），与GSPT1表面在与CC-90009形成的复合物中与CRBN接触的表面有极高的相似性，且SH3c结构域与GSPT1或其G-loop没有潜在的结构同源性。图5. A.基于表面的CRBN Neo-substrate发现过程 B.VAV1 SH3c表面与GSPT1 degron比较随后作者筛选了内部化合物库，发现Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物（图6）。图6. Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物最后，作者解析了VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构（图7）。VAV1 SH3c 结构域中的预测参与形成复合物的patch由两个色氨酸残基 W820 和 W831 以及 RT 环的顶端区域（aa797 – 801）形成。图7. VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构及关键相互作用——小结——通过计算工具，该工作系统性的发掘了1633种潜在的CRBN新底物，且在已知的β-hairpin G-loop motif之外，发现了新的helical G-loop。（之前的工作已经发现含C2H2锌指结构域是CRBN的潜在底物）该工作进一步拓宽了CRBN底物范围，包含不同功能、结构的蛋白质。通过实验验证，该工作确证了21种含有β-hairpin G-loop或 helical G-loop的新底物，大大拓宽了CRBN底物。不同的CELMoDS，可实现对底物的精准降解，表明基于CRBN的分子胶降解剂大有可为。G-loop motif的发现是基于序列的发掘方法的胜利。回归本质，CELMoDs诱导三元复合物形成这一过程事实上是Neo-substrate的界面与CELMoD-CRBN二元复合物新界面之间的电荷、形状、亲/疏水等的匹配。因此，基于表面的方法使作者成功发现了VAV1也是CRBN的底物，尽管VAV1与GSPT1序列相似性或结构同源性上都很低。该发现同样凸显了CRBN参与PPI相互作用的界面的非凡可塑性（N351、H357、W400），这些位点既能与G-loop相容，也与VAV1的RT-loop相容。最后，Monte Rosa的工作展示了计算工具在分子胶开发中的非凡潜力。参考文献：[1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933.作者：任宇浩审稿：王瀚平  编辑：郭   政

细胞周期蛋白依赖性激酶7 (CDK7) 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，与Cyclin H和CDK激活激酶 (MAT1) 的MNAT1组分形成三聚体CDK激活激酶 (CAK) 复合物，磷酸化下游细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1、2、4和6。CDK1/2/4/6激活直接促进细胞周期进程。此外，CAK复合物作为转录因子IIH (TFIIH) 复合物的一部分发挥作用，并在Ser5和Ser7位点磷酸化RNA Pol II的C末端结构域 (CTD) ，这是转录起始和延伸的重要步骤。CDK7还可以直接磷酸化或调节几种关键致癌因子（如c-Myc）的表达。因此，这些功能使CDK7成为肿瘤适应症中具有吸引力的靶标。目前，几种CDK7抑制剂已进入临床试验阶段。正在进行的I/II期临床试验包括ICEC0942 (CT7001) 、SY-1365/SY-5609系列和LY3405105。其中SY-1365因静脉给药时临床活性和耐受性不佳而被停用；而SY-5609表现出较强烈的胃肠道反应和血液毒性。 为了改善上述问题，英矽智能公司以化合物SY-5609为先导化合物，经过广泛的构效关系研究和ADME优化，成功获得了强效大环非共价CDK7抑制剂化合物13，在异种移植模型中表现出优越的体外活性、良好的ADME特性和出色的体内抗肿瘤活性。更重要的是，化合物13表现出较好的Caco-2通透性，降低了大鼠的肠道分布和血液/血浆比率；从而减轻胃肠道影响和血液毒性副作用。 研究内容 1. 化合物设计及构效关系研究 作者以选择性高，药效显著但具有胃肠道反应和血液毒性等副作用的SY-5609为先导化合物，基于公开获得的来自PDB (PDB ID: 7B5O) 的CDK7晶体结构重建了同源模型。通过CDK7与SY-5609的结合模式（图1A）发现，SY-5609的氨基嘧啶和吲哚之间的二面角稳定分布在30°和40°之间。然而，SY-5609本身在其最低能量构象中具有90°的二面角。因此，作者构建了大环分子以实现与结合构象一致的低能量构象。通过大环化策略用酰胺将SY-5609的氰基位置和哌啶基连接，通过改变linker类型，形成了一系列大环化合物（图1B-D），其中化合物2和3的最低能量构象的二面角分别为38.6°和41.7°，与它们的结合模式构象的二面角分别为22.9°和41.0°相当（图1E-F）。化合物2和3均显示出有效的CDK7酶抑制活性（IC50为11 nM和4.6 nM，表1）和HCC70细胞抗增殖活性（IC50为1821 nM和207 nM），但均比SY-5609活性差。 图1 (A) SY-5609与CDK7复合物的结合方式；(B) 构建大环的连接位点; (C) linker结构；(D) 大环骨架具有最短的连接子；(E) 化合物2的最低能构象与结合构象的比较；(F) 化合物3的最低能构象与结合构象的比较[1] 为进一步提高抑制活性，在化合物3上引入二甲基氧化膦作为非典型氢键受体设计并合成化合物4（表1）。与化合物3相比，化合物4表现出高结合亲和力 (CDK7 Kd= 0.16 nM) 和更优的细胞活性 (HCC70 IC50= 33 nM) 。随后，进一步探索大环linker长度和类型。相较于化合物4，具有醚链的化合物7表现出更高的结合亲和力 (SPR Kd= 0.06 nM) 和相当的抗增殖活性 (HCC70 IC50= 29 nM) 。 表1  CDK7抑制剂的体外酶活性、结合亲和力和细胞活性[1] 进一步评估化合物4和7的体外ADME和体内小鼠PK特性（表2）。化合物4在小鼠体内的清除率中等 (49.3 mL/min/kg) ，而化合物7在小鼠体内的清除率要高得多 (95.9 mL/min/kg) ，表明它们有可能发生肝外代谢。在小鼠口服PK分析中，化合物4和7的口服生物利用度都很低（分别为0.7%和23%），可能是由于亲脂性不理想（cLogD = -0.29和0.08）、氢键供体过多以及碱性胺的pKa过高导致口服渗透性低，影响口服后的肠道吸收。 表2  化合物4和7的体外ADME和体内小鼠PK特性[1] 为了进一步优化体外ADME和体内PK特性，设计了一系列具有较高亲脂性、更少氢键供体 (HBD) 和碱性胺pKa更低的化合物（表3）。其中二氟化合物13显示出更好的Caco-2的渗透性 (3.69 × 10-6 cm/s，ER = 5.1) ，在HCC70细胞中表现出有效的细胞抑制作用（IC50= 24.6 nM）和OVCAR3 (IC50= 57.0 nM) 。 表3  CDK7抑制剂的体外结合亲和力、细胞活性和Caco-2通透性[1] 2. 体内外PK研究 与化合物1相比，化合物13表现出较低的分布容积 (VSS= 0.24 – 2.6 L/kg) 以及较短的T1/2 (0.6 ~ 3.4 h) ，且化合物13的碱度降低会降低肠道分布、保留时间和血浆比率。这些特征可以防止潜在的胃肠道副作用和血液毒性（图2A）。在多个不同物种（大鼠、狗和小鼠）中，化合物13也显示出良好的血浆暴露和口服生物利用度（图2C）。此外，化合物13的肠道和血浆浓度下降速度比化合物1快很多，这可能是由于其T1/2 较短，可能有利于减轻药物不良反应（图2D）。在体外ADME和安全性方面（图2B），化合物13表现出良好的理化特性，具有足够的PBS溶解度 (917 μg/mL) 。体外微粒体代谢稳定性表明，化合物13在人、小鼠和大鼠的清除率相对较高，人的血浆稳定性良好 (T1/2 > 289 min) 。体外安全性分析表明，在所有测试的CYP同工酶中，都没有强效的CYP抑制作用，且hERG风险较低 (IC50= 9.94 μM) 。与此相反，化合物1对CYP2D6有强效抑制作用 (IC50= 0.075 μM) ，表明可能存在药物间相互作用 (DDI) 风险。 图2  化合物13的体内外ADME及安全性[1] 此外，激酶谱显示，化合物13表现出16-3034倍的选择性抑制作用 (Kd= 0.18 nM) ，具有良好的选择性。在OVCAR3卵巢癌异种移植模型小鼠中，2、5、10和20 mg/kg剂量的化合物13能明显抑制肿瘤生长，相对于用vehicle治疗的小鼠，TGI（肿瘤生长抑制率）约为110%；在三阴性乳腺癌 (TNBC) HCC70异种移植模型中，化合物13具有剂量依赖性抗肿瘤活性，其终点TGI分别为36% (1 mg/kg) 、120% (3 mg/kg) 和175% (10 mg/kg) 。 总结 这项研究利用大环化策略，开发了一系列新型大环化合物作为非共价CDK7抑制剂，发现化合物13具有良好的体外活性、选择性、ADME特性和Caco-2渗透性，同时表现出较短的T1/2、较高的口服暴露量和良好的生物利用度，并且由于化合物碱性降低，分布容积变小，导致大鼠肠道分布减少，血液/血浆比率降低。这些特性可能会减轻现有CDK7抑制剂的胃肠道和血液毒性副作用。此外，化合物13作为单药在OVACR3和HCC70异种移植模型中表现出了强大的抗肿瘤活性，治疗耐受性良好。 参考文献  [1] Lu H, Zhang Y, Liu J, et al. Discovery of a Novel Macrocyclic Noncovalent CDK7 Inhibitor for Cancer Therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 2024, 67(22):20580-20594 供稿：冷利敏 校稿：陈娜/耿小菊 编辑：汤荣凡 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓