TLR3 x TLR7 x TLR8 x TNF-α

中文摘要 佐剂作为非特异性免疫增强剂，是灭活疫苗、亚单位疫苗和重组蛋白疫苗等多种疫苗不可或缺的辅助成分。佐剂通过激活和刺激固有免疫细胞，增强机体的适应性免疫应答，从而增强疫苗的免疫原性。佐剂按作用机制主要分为免疫刺激剂和递送系统。此文对目前部分已上市人用疫苗佐剂及新型疫苗佐剂的作用机制及研究进展进行综述，为合理使用现有佐剂及开发新型佐剂提供参考。 正文 佐剂是非特异性免疫增强剂，可显著增强并延长疫苗诱导的免疫应答或改变免疫应答的类型。作为疫苗的辅助成分，佐剂可减少疫苗中的抗原用量和接种次数，提高疫苗在新生儿、老年人等免疫功能低下人群中的免疫效果。根据作用机制，佐剂主要分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂作为病原体相关分子模式、损伤相关分子模式及其类似物，与APC上的模式识别受体相互作用，诱导APC的激活和成熟，活化的APC向适应性免疫细胞提呈抗原，提供共刺激信号及调控的细胞因子，增加适应性免疫应答。递送系统装载抗原或刺激因子，增加APC对抗原的摄取和提呈能力。本文总结部分已上市人用疫苗佐剂和新型疫苗佐剂增强抗原免疫原性、机体免疫应答的作用机制，以期为进一步研究佐剂的作用机制、合理使用现有佐剂以及设计和开发新型佐剂提供参考。 1 已上市的人用疫苗佐剂 除被广泛使用的铝佐剂外，目前已上市人用疫苗佐剂还包括乳剂型佐剂MF59、AS03；Toll样受体（toll-like receptor，TLR）激动剂型佐剂单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A，MPL）、CpG 1018和CpG 7909；皂苷类佐剂Matrix-M；复合佐剂AS04及AS01等。 1.1 铝佐剂 铝佐剂是使用时间最长、应用最广泛的佐剂，已上市的铝佐剂疫苗包括DTP、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎（乙肝）疫苗、HPV疫苗等。铝佐剂包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾等，常用的为氢氧化铝和磷酸铝。铝佐剂的作用机制复杂，可以作为递送系统发挥储存库效应，增加APC对抗原的摄取，也可以作为免疫刺激剂激活核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3 （nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3，NLRP3）炎性体，引起Th2型免疫应答，产生IL-1β等细胞因子。 1.1.1　储存库效应　大部分学者认为铝佐剂主要通过储存库效应发挥作用。储存库效应指佐剂吸附抗原后，在注射部位缓慢释放，持续刺激免疫系统，从而增强免疫应答。然而，Gupta等采用14C标记破伤风毒素后，将抗原吸附在磷酸铝佐剂并注入小鼠体内，注射部位的抗原在4 h内迅速消除。Hutchison等研究显示，在接种抗原-铝佐剂复合物2 h后，去除接种部位的铝佐剂，对机体产生特异性抗体和T细胞应答没有显著影响。储存库效应的作用机制仍需进一步探究。 1.1.2　增加APC对抗原的摄取　氢氧化铝和磷酸铝佐剂免疫小鼠后虽均可在免疫部位募集固有免疫细胞，然而这2种佐剂募集固有免疫细胞的种类有所不同，从而引发不同类型的免疫应答。小鼠实验显示，肌内注射氢氧化铝佐剂主要募集中性粒细胞，而磷酸铝佐剂可将单核细胞和巨噬细胞募集到注射部位，免疫细胞的募集为APC摄取抗原及适应性免疫应答提供了有利条件。铝佐剂还可以与树突状细胞（dendritic cell，DC）细胞膜相互作用。Flach等观察发现，铝佐剂可利用DC细胞膜上的鞘磷脂和胆固醇等脂质维持铝盐与细胞膜的结合，并在铝盐不进入细胞的情况下，将抗原以可溶性的形式递送到细胞中。部分研究提出，铝佐剂对抗原的吸附作用可以将可溶性抗原转化为颗粒形式，由于APC更倾向于摄取颗粒物质，因此铝佐剂可增加DC和巨噬细胞对抗原的摄取。 1.1.3　诱导NLRP3炎性体的激活　NLRP3受到刺激后，与凋亡相关斑点样蛋白质和胱天蛋白酶Ⅰ酶原结合，组装成NLRP3炎性体。激活的NLRP3炎性体促使凋亡相关斑点样蛋白质将胱天蛋白酶Ⅰ酶原裂解，裂解产物胱天蛋白酶Ⅰ促进巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18。这2种细胞因子可以促进CD4+ T细胞分化为Th2细胞，增强免疫应答。研究表明，铝佐剂诱导IL-1β分泌依赖于NLRP3炎性体。铝佐剂诱导宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸为内源性危险信号，该信号可以作为损伤相关分子模式激活NLRP3炎性体。 1.2 乳剂型佐剂 乳剂型佐剂根据组成可分为油包水佐剂和水包油佐剂。油包水佐剂以弗氏佐剂为代表，该佐剂在20世纪50、60年代被英国等国应用于流感疫苗中，后因严重的不良反应被撤销使用，目前主要用于动物免疫。水包油佐剂的安全性和耐受性优于油包水佐剂。目前上市的2种乳剂型佐剂MF59和AS03均为水包油佐剂。 1.2.1　MF59　MF59主要包含角鲨烯、柠檬酸、吐温80和司盘85。不同于铝佐剂在注射部位形成储存库的作用机制，MF59佐剂形成免疫微环境从而增强免疫应答。研究表明，对小鼠肌内注射MF59会激活注射部位的髓系细胞如巨噬细胞和DC，产生趋化因子，如CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL4、CCL5、CXC基序趋化因子配体（CXC motif chemokine ligand，CXCL）8。这些趋化因子可募集更多先天免疫细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和DC，增强免疫应答，并促使先天免疫细胞迁移到引流淋巴结，激活B细胞和T细胞。MF59不依赖NLRP3的凋亡相关斑点样蛋白质激活途径和TLR的髓样分化因子88激活途径发挥作用，其激活免疫系统的模式识别受体及信号通路尚待探究。MF59佐剂可诱导较高的Th2型免疫应答，表现出良好的安全性。 MF59是继铝佐剂之后第2个被批准用于人类疫苗的佐剂，自1997年MF59被欧洲批准用于流感疫苗后，相继有30个国家批准使用。目前上市的人用疫苗中只有流感疫苗使用MF59。研究显示，含MF59佐剂的不同季节性流感疫苗均具有良好的保护效力和安全性，未发现严重不良事件的风险增加。MF59除了被广泛用于流感疫苗，还被应用于带状疱疹疫苗和HIV疫苗等多种亚单位疫苗。 1.2.2　AS03　AS03由角鲨烯、PBS、α-生育酚和吐温80组成。相比于MF59，AS03中的α-生育酚可作为免疫增强成分增加免疫应答。α-生育酚通过参与调节趋化因子和细胞因子（如CCL2、CCL3、IL-6和CXCL1）的表达增强APC对抗原的摄取，并募集先天免疫细胞至引流淋巴结，提高抗体水平。与MF59相似，AS03可诱导小鼠注射部位肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的产生，并在注射部位募集单核细胞和巨噬细胞，增加抗原摄取。此外，AS03募集单核细胞、DC和粒细胞进入引流淋巴结，增强APC向CD4+ T细胞提呈抗原的能力，通过T-B细胞相互作用，促进B细胞增殖及分化。AS03通常诱导Th2型免疫应答，对Th1型免疫应答的影响较弱。 AS03在2009年甲型H1N1流感大流行期间获得欧盟许可被用于流感疫苗；2013年，AS03被FDA批准用于H5N1禽流感疫苗，展示出良好的安全性、反应原性和免疫原性。AS03还被应用于H7N9流感疫苗、乙肝疫苗、COVID-19疫苗等，目前在临床试验中H7N9疫苗的Ⅱ期临床试验（NCT03589807）结果显示，使用AS03佐剂并延长初次免疫-加强免疫间隔时间可显著增强疫苗的免疫应答。 1.3 TLR激动剂型佐剂 TLR是模式识别受体，包括位于细胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10和表达在内体膜上的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9。TLR识别微生物病原体，启动宿主对感染的免疫应答。MPL来自革兰阴性细菌细胞壁外壁的脂多糖，是TLR4激动剂，主要用于复合佐剂AS01及AS04。CpG 1018和CpG 7909是TLR9激动剂，分别是人工合成的22 bp和24 bp的寡核苷酸，具有硫代磷酸基骨架和未甲基化的CpG寡聚脱氧核苷酸。CpG寡聚脱氧核苷酸可促进MHC、CD40和CD86在浆细胞样DC上的表达，增强抗原加工和提呈。CpG激活TLR9信号通路后，可募集髓样分化因子88、IL-1受体相关激酶和TNF受体相关因子6，激活多种有丝分裂原激活激酶和转录因子，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和激活蛋白1，刺激B细胞活化并直接或间接诱导Th1型免疫应答和促炎细胞因子（IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α和IFN-γ）的产生。在特定情况下，CpG可诱导Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转换。总之，CpG可以刺激DC成熟，增强Th1型免疫应答并诱导IFN-γ和CD8+ T细胞的产生，还可以加速抗体产生以实现保护性免疫。 目前MPL、CpG 1018和CpG 7909均被FDA批准用于人用疫苗。其中，含CpG1018的乙肝疫苗Heplisav-B已在2017年被FDA批准使用，Heplisav-B仅需2剂次注射即可达到免疫效果，而其他已经获得许可并被广泛使用的乙肝疫苗通常需要注射3剂次。与以铝盐为佐剂的乙肝疫苗Engerix-B相比，CpG1018佐剂诱导的抗体应答更为快速和持久。CpG1018还被应用于HIV疫苗、寨卡病毒疫苗、鼠疫疫苗、COVID-19疫苗等，目前在临床试验中。含CpG 1018的COVID-19疫苗的Ⅱ期临床试验（NCT05313035）显示，该疫苗在健康人群中安全性良好、免疫原性较强，能够有效诱导高水平的中和抗体和IgG抗体，并在6个月随访中维持抗体水平。含CpG 7909的炭疽疫苗Cyfendus的Ⅱ期临床试验结果显示，该疫苗具有良好的耐受性和免疫原性，未报告与疫苗相关的严重不良事件。该疫苗于2023年获FDA批准上市。多种TLR激动剂也处于临床前或临床阶段，如TLR3激动剂多肌胞苷酸〔polyinosinic acid-polycytidylic acid， Poly（I：C）〕、TLR4激动剂吡喃葡萄糖脂A、TLR7激动剂咪喹莫特等。 1.4 皂苷类佐剂 皂苷是从多种植物中提取的具有复杂糖骨架的三萜分子。皂苷类佐剂包括从南美皂树的提取物中分离纯化得到的QS-21以及由皂苷、胆固醇、磷脂组成的Matrix-M等。其中，QS-21一般与胆固醇混合使用，以避免QS-21的溶血性、增加QS-21的稳定性，同时将佐剂靶向到吞噬细胞，使其更好发挥其免疫活性。皂苷类佐剂可通过增强抗原递送、增加引流淋巴结中细胞的募集、促进APC交叉提呈、激活炎性体等机制发挥作用。 1.4.1　增强抗原递送和增加引流淋巴结中细胞的募集　小鼠肌内单独注射皂苷后，会在注射部位和引流淋巴结中快速产生细胞因子，细胞因子水平在48 h内达到高峰后急剧下降，产生的细胞因子包括IFN-γ、CXCL1、CCL2、CXCL9、CXCL10等。IFN-γ可以促进Th1细胞分化和抗体类别转换，上调DC上MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达，从而促进细胞介导的免疫应答；CXCL1和CCL2募集单核细胞和粒细胞，CXCL9和CXCL10募集T细胞。细胞因子分泌后还会在注射部位和引流淋巴结中募集大量免疫细胞，主要包括单核细胞、DC、中性粒细胞等，对抗原进行摄取加工从而激活T细胞，启动适应性免疫应答。 1.4.2　促进APC交叉提呈　Welsby等发现QS-21可以促进单核细胞来源的DC的活化和成熟，增加细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8的分泌和CD86、HLA-DR在细胞膜表面的表达。分析表明，QS-21、Matrix-M等皂苷通过胆固醇依赖的内吞作用被单核细胞来源的DC摄取、转运到溶酶体；溶酶体的酸性环境引起Matrix-M中皂苷与胆固醇分离，释放的游离皂苷可使溶酶体膜不稳定；溶酶体中的酶及摄入的抗原被释放到APC的细胞质中，使外源性抗原在细胞质中被进一步处理，实现交叉提呈。交叉提呈使DC可将外源性抗原通过MHC Ⅰ类分子提呈给CD8+ T细胞，攻击和破坏被感染的宿主细胞，有助于抵御病毒和其他细胞内病原体。 1.4.3　激活炎性体　皂苷类佐剂会引起APC中溶酶体的破裂，将抗原及溶酶体中的成分释放到细胞质中，可能会诱导炎性体的激活。Marty-Roix等在体外使用QS-21与MPL共刺激巨噬细胞和DC后发现，QS-21与MPL联用引发NLRP3依赖性炎性体激活，分泌IL-1β和IL-18，介导Th17细胞的成熟或刺激IFN-γ的产生，从而诱导Th1型免疫应答。由于与野生型小鼠相比，使用含QS-21的疫苗免疫的NLRP3缺陷型小鼠的Th1和Th2型免疫应答水平及IgG1和IgG2c抗体滴度都更高，因此其作用可能还涉及其他信号通路。 目前，以 Matrix-M 为佐剂的COVID-19疫苗NVX-CoV2373及疟疾疫苗R21/Matrix-M已分别被FDA及WHO批准使用。NVX-CoV2373的Ⅲ期临床试验显示，在健康成年人中，接种2剂次对新型冠状病毒感染的保护率为89.7%，对Alpha变异株的保护率高达86.3%。R21/Matrix-M的临床试验结果显示，5~17月龄儿童3次免疫后1年内对疟疾的保护率为77%。除已上市的2种疫苗外，含Matrix-M佐剂的疫苗，如呼吸道合胞病毒疫苗，已进入临床试验阶段。 1.5 复合佐剂 复合佐剂是将2种及以上的免疫增强剂联合使用的佐剂，同时实现抗原递送和免疫刺激，在发挥各组分优点的同时，最大程度地发挥佐剂效应，增强免疫应答。开发复合佐剂是目前佐剂研究和发展的趋势。已上市的人用疫苗佐剂中，乳剂型佐剂MF59和AS03、皂苷类佐剂Matrix-M均为复合佐剂。此外，复合佐剂还包括含TLR激动剂的AS01、AS04。AS佐剂系统是由英国葛兰素史克公司于20世纪80年代末开发的复合佐剂系统，将经典佐剂分子如铝盐、乳剂等与免疫刺激分子合理组合，有效激活免疫应答。 1.5.1　AS04　AS04由MPL吸附至铝盐制成。小鼠实验显示，AS04可以激活表达TLR4的APC，快速引起注射部位肌肉和引流淋巴结中细胞因子的产生和免疫细胞的募集，接种24 h内可以观察到摄取抗原的单核细胞和DC数量显著增加，并引起T、B细胞活化，诱导强烈且持久的体液和细胞免疫应答。通过对比接种MPL和AS04组小鼠的结果发现，铝盐与MPL虽无协同作用，但铝盐的存在延长了MPL在注射部位诱导的细胞因子的反应时间。AS04的免疫刺激作用主要依赖TLR4，与其他TLR不同，TLR4可以激活2种信号通路，既可以通过髓样分化因子88途径激活NF-κB，诱导TNF-α和IL-6等促炎细胞因子分泌，刺激APC成熟，从而增强适应性免疫应答；也可以通过Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白传递信号，激活IFN调节因子（IFN regulatory factor，IRF）3，从而产生少量的IFN-γ，诱导Th1型免疫应答。相比铝佐剂，AS04可诱导更强的免疫应答，并使Th1/Th2型免疫应答更加平衡。 AS04已被FDA批准用于HPV疫苗和乙肝疫苗，其中，二价HPV吸附疫苗Cervarix是FDA在2009年批准的首个含AS04佐剂疫苗。长期随访数据显示，Cervarix对宫颈癌前病变具有较高且持久的预防效果，在初次免疫9年后，疫苗效力接近甚至达到了100%。 1.5.2　AS01　AS01是由QS-21、MPL、二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇组成的脂质体佐剂，含MPL和QS-21 2种免疫刺激剂，二者共存可消除QS-21的溶血活性。脂质体是安全有效的疫苗佐剂递送系统，具有低反应原性的特点，能够携带多种抗原及佐剂，保护抗原免受降解。同时，脂质体还能将抗原靶向至免疫细胞甚至细胞器，产生溶酶体逃逸，促进抗原交叉提呈，从而增强疫苗接种效果。MPL和QS-21之间具有协同效应，使AS01激活新的信号通路，而单一组分无法激活该信号通路。接种含AS01佐剂疫苗的数小时内，在IL-12、IL-18和巨噬细胞的参与下，MPL和QS-21的协同作用会引起引流淋巴结中的细胞（主要是自然杀伤细胞）快速产生IFN-γ，促进DC的活化及Th1型免疫应答。此外，接种AS01佐剂的小鼠分泌IFN-γ、IL-2的CD4+ T细胞的数量远高于接种仅含单独成分佐剂的小鼠，表明QS-21与MPL联合使用可促进抗体应答和抗原特异性CD4+ T细胞应答。 英国葛兰素史克公司研发的含有AS01的重组带状疱疹疫苗Shingrix于2017年获FDA批准。临床试验结果显示，AS01佐剂能够促进先天免疫应答，疫苗保护率高达97%。此外，以AS01为佐剂的RTS，S/AS01疟疾疫苗Mosquirix也被欧洲药品管理局批准使用。Ⅲ期临床试验（NCT00866619）结果显示，RTS，S/AS01对6~12周龄新生儿疟疾感染的有效性为26%，对5~17月龄儿童疟疾感染的有效性为36%。 2 新型疫苗佐剂 目前使用的佐剂虽能引起强烈的体液免疫应答，却很少能引起CTL应答，且现有佐剂不能引起机体对许多病原体，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等的保护作用。新型佐剂的开发至关重要。目前已有新型免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果，如Poly（I：C）、CF501、Mn2+、环二核苷酸（cyclic dinucleotide，CDN）等。 2.1 Poly（I：C） Poly（I：C）是人工合成的双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）类似物，主要作为TLR3激动剂，激活APC参与免疫应答。TLR3识别Poly（I：C）后会形成二聚化的TLR3-dsRNA复合物，TLR3二聚体募集接头蛋白Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白，激活NF-κB和IRF3等转录因子。由于TLR3主要位于内体膜，无法对细胞质中的Poly（I：C）进行识别，因此细胞质中dsRNA的应答主要依靠黑色素瘤分化相关基因5和维甲酸诱导基因Ⅰ。体外实验证明，Poly（I：C）可以诱导单核细胞来源的DC的成熟和活化，促进IFN-β、IL-6和IL-12p70的分泌。Poly（I：C）还可以促进外源性抗原向CD8+ T细胞交叉提呈，并诱导Th1型免疫应答。交叉提呈使DC在细胞外摄取外源性病原体后，通过MHC Ⅰ类分子提呈给CD8+ T细胞，启动CTL免疫，这对依赖细胞免疫的疫苗至关重要。Poly（I：C）除激活免疫细胞成熟、产生免疫应答外，还可以刺激一系列非造血细胞产生Ⅰ型IFN和促炎细胞因子，并上调MHC Ⅰ类分子在非造血细胞表面的表达。在病毒感染期间，非造血细胞MHC Ⅰ类分子表达的上调，可以增强细胞内抗原向病毒特异性CTL的提呈，有助于识别感染细胞和防止细胞内病原体的传播。总之，Poly（I：C）可以有效诱导多种APC成熟，分泌IL-12、IFN-β等Th1型细胞因子，诱导Th1型免疫应答和CTL的活化。 含QS-21和Poly（I：C）的脂质体佐剂MA105是成都迈科康生物科技有限公司自主研发的新型佐剂系统，被应用于重组带状疱疹疫苗 。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验（NCT05636436、NCT05856084）结果表明，该佐剂具有良好的安全性、耐受性和免疫原性。目前该MA105佐剂疫苗已进入Ⅲ期临床试验（NCT06447779）。 2.2 CF501 CF501是新型非核苷酸小分子IFN基因刺激因子（stimulator of IFN gene，STING）激动剂。STING信号通路的活化起始于胞内DNA与环鸟苷酸-磷-腺苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP）合酶（cGAMP synthase，cGAS）结合，cGAS构象变化并二聚化，活化的cGAS促进2'，3'-cGAMP合成，2'，3'-cGAMP作为STING二聚体的配体激活STING。CF501直接激活STING从内质网向高尔基体易位，释放C端尾部及聚合。被释放的C端尾部招募TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），TBK1自磷酸化并磷酸化STING，IRF3被磷酸化的STING募集并被TBK1活化，磷酸化的IRF3二聚体转移到细胞核中促进Ⅰ型IFN的表达。与传统的STING激动剂cGAMP相比，CF501在处理人单核细胞白血病细胞后，与STING信号通路有关的蛋白STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平更高，可以更有效地激活STING信号通路。体外及动物实验均证明，CF501可以快速有效地激活先天免疫应答，产生高水平的IFN-β、IL-6、CXCL10等细胞因子，肌内注射含CF501佐剂的疫苗可诱导高滴度的IgG2a，强烈激活Th1型免疫应答。CF501作为新型STING激动剂，在小鼠、家兔、恒河猴实验中均表现出良好的免疫增强效应，诱导产生高滴度交叉中和抗体，展现出良好的安全性。CF501为疫苗佐剂提供了新选择，目前该佐剂尚未进入临床试验阶段。 2.3 Mn2+ 锰在发育、繁殖、神经元功能、免疫调节和抗氧化防御等多种生理过程中起重要作用。Wang等研究发现Mn2+在宿主防御病毒时起着至关重要的作用。病毒感染机体后，Mn2+从细胞器中释放，与cGAS结合，增加cGAS的双链DNA敏感性和酶活性，并增强cGAMP-STING结合的亲和力，从而增强STING的活性。Zhang等发现Mn2+通过激活cGAS-STING信号通路促进DC成熟和活化，诱导小鼠骨髓来源DC产生IFN-β和IFN-α，并引起细胞表面CD80、CD86、CCL2等共刺激因子和趋化因子的显著上调。除激活DC外，Ouyang等开发的锰纳米颗粒可以激活多种APC亚群，包括1型经典DC、2型经典DC、浆细胞样DC、M1型巨噬细胞，保护小鼠免受高剂量鼠疫杆菌的侵袭。与铝佐剂相比，Mn2+对NLRP3炎性体的激活效应更为显著，并诱导产生IFN-β。Mn2+还可以促进抗原提呈及CD8+ T细胞和自然杀伤细胞活化。Lyu等的研究显示，小鼠经Mn2+处理后，CD8+ T细胞中TNF-α和IFN-γ的表达显著提升，CD44hiCD8+ T细胞数量显著提高，产生了更多的记忆CD8+ T细胞。锰及其衍生物具有潜在的佐剂活性，可通过增强cGAS-STING先天免疫通路，诱导Ⅰ型IFN的产生，增强抗原提呈和交叉提呈，增强CTL免疫应答，从而提高机体的免疫效果。目前，锰及其衍生物在临床试验中被用于多种肿瘤的免疫治疗，但尚未有单独以锰作为佐剂的预防型疫苗进入临床试验阶段。 2.4 CDN CDN是原核生物和真核生物中广泛存在的信号分子，分为天然CDN和合成CDN，天然CDN主要有4种，分别为c-di-GMP、c-di-AMP、2'，3'- cGAMP、3'，3'-cGAMP。CDN可以靶向并激活cGAS-STING通路，激活IRF3和NF-κB，参与调节和控制多种重要的生物过程。CDN可诱导中性粒细胞和巨噬细胞在局部快速和短暂地募集，并诱导趋化因子CXCL1、CCL2、CCL3、CXCL2和CCL5的产生。除募集固有免疫细胞外，CDN还可通过胞饮作用和受体介导的内吞作用增强CD11c+细胞对抗原的摄取，诱导DC激活和成熟，提高共刺激分子（CD80、CD86）及成熟标志物（CD83和MHC Ⅱ类分子）的表达，促进IL-12、IFN-γ、IL-8、CCL2、CXCL10等细胞因子的产生。此外，CDN独立于STING信号通路，通过细胞内感染识别相关途径激活NLRP3炎性体，刺激IL-1β的产生。研究表明，CDN可诱导DC交叉提呈，诱导CTL应答，诱导机体产生平衡的Th1/Th2/Th17型免疫应答。CDN可以诱导平衡且持久的体液、细胞免疫应答，是用于疫苗广泛保护机体免受病原体感染的潜在理想佐剂。目前，以c-di-AMP为佐剂的HPV疫苗正在进行Ⅰ期临床试验（NCT05208710）。 3 总结及展望 免疫刺激剂通过靶向特异性模式识别受体激活APC，增强抗原提呈和共刺激信号，从而增强适应性免疫。已获批的TLR9激动剂CpG 1018、CpG 7909与TLR4激动剂MPL，均可通过信号转导激活多种转录因子，诱导细胞因子及调控因子产生。递送系统则主要增加机体对抗原的利用，如乳剂型佐剂MF59和AS03可以促进固有免疫细胞向淋巴结转移，增强APC向T细胞提呈抗原的能力；皂苷类佐剂还可以促进抗原的交叉提呈，诱导CTL应答。 联合免疫刺激剂与递送系统是当前佐剂开发较有前景的策略之一。递送系统不仅可以保护免疫刺激剂和抗原免受降解，还可以将其直接递送到靶细胞。除已获批的AS01和AS04采取联合使用外，还有多种联合佐剂配方处于临床前和临床研究阶段。免疫增强剂的联合使用不仅可以发挥各自的功能，还有可能产生协同作用。基于此，在设计和使用疫苗佐剂时，可以通过合理地联合使用多种免疫增强剂，同时激活多个受体及信号通路，在减少佐剂不良反应的情况下，诱导固有免疫细胞、适应性免疫细胞等多种细胞参与免疫应答，并形成长久的免疫记忆。 综上所述，深入研究佐剂的作用机制，全面了解其对免疫系统的影响，可为安全有效地使用佐剂增强机体免疫应答、新型高效佐剂的开发及其临床应用提供理论基础。使用佐剂时，应综合考虑佐剂的安全性、有效性、可及性、可控性以及稳定性，减少不良反应的发生，便于生产和使用。此外，基于佐剂研究多学科交叉特性，系统融合不同学科知识，扬长避短，可为开发更为安全有效的新型佐剂提供指导。 作者 孙佳  李树香 国药中生生物技术研究院有限公司第三研究室， 北京 101111  通信作者：李树香， Email：lishuxiang@sinopharm.com 引用本文：孙佳, 李树香. 疫苗佐剂的作用机制及研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 291-299.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241105-00069 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

撰文 | 风 RNA感知是一种重要的先天免疫监视程序以防护病原体入侵。模式识别受体监测内体和胞质外源RNA。在内体中，TLR3感知双链RNA（dsRNA），TLR7/8感知单链RNA（ssRNA）【1】。RIG-I样受体包括RIG-I和MDA5监测胞质外源RNA【2,3】。RNA识别后开启NF-κB依赖的促炎因子表达和IRF3或IRF7依赖的I型干扰素表达【4,5】。RNA并非病原相关分子模式，因此机体需要防止自身RNA的感知，涉及的机制包括空间隔离、RNA酶降解以及RNA修饰。N-糖基化是最近鉴定一种RNA新型修饰（详见BioArt报道：Cell | 细胞膜表面RNA结合蛋白和糖基化RNA: 介导细胞肽进入细胞的密钥；Cell | tRNAs中糖基化辫苷修饰与功能；Cell | Jun Lu/Dianqing Wu合作揭示细胞表面RNA的功能——糖基化RNA调控中性粒细胞炎症反应；专家点评Cell | 改写教科书：糖基化修饰的新载体，glycoRNA；糖RNA发现者Flynn教授《细胞表面糖基化RNA生物学》课程最全笔记）。RNA糖基化的直接位点是修饰碱基3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷（acp3U），主要发生在tRNA的D-loop中（详见BioArt报道：Cell | 谢一轩/柴培远等揭示修饰的RNA碱基acp3U是糖RNA中N-聚糖的结合位点）。在内质网，糖基化的RNA通过内质网-高尔基体网络转运至细胞表面，随后在不刺激免疫情况下被内吞。然而，糖基化RNA如何阻止被自我感知以及其具体功能仍不清楚。值得注意的是，机体凋亡细胞被组织驻留巨噬细胞清除且并不引发炎症，该过程称为胞葬作用（efferocytosis）。在这种情况下，细胞表面的糖基化RNA增加细胞内体中RNA感受器的暴露风险。因此，糖基化RNA的细胞表面定位对清除死亡细胞的免疫静默提出新的挑战，但其机制不明。 近日，美国康涅狄格大学法明顿分校健康医学院免疫系Vijay A. Rathinam团队和波士顿儿童医院Ryan A. Flynn团队在Nature上发表了题为RNA N-glycosylation enables immuneevasion and homeostatic efferocytosis的研究文章。该研究揭示小RNA的N-糖基化修饰阻止内体中内源性小RNA的感知以避免炎症反应，为自身RNA耐受以及凋亡细胞清除稳态提供新的机制。 团队分离HeLa细胞（富集糖基化RNA）小RNA，并使用PNGase F处理去除糖基化基团。实验发现天然小RNA并不能诱导RAW细胞产生IFNβ。相反，PNGase F处理的小RNA却可以诱导明显的IFNβ产生，但这种表型可以被 RNA酶处理废除。然而，PNGase F处理的长链RNA（无糖基化RNA）并不能在巨噬细胞产生IFNβ。Western blot实验发现去糖基化小RNA促进巨噬细胞TBK1和IRF3，以及JNK、ERK1/2、p38和NF-κB的磷酸化。此外，考虑到细胞膜表面的糖基化RNA持续性内吞，作者使用9倍浓度的PNGase F直接处理RAW细胞也能引起RNA依赖的炎症反应。上述结果表明RNA的N糖基化抑制免疫活化。随后，作者检测到人和小鼠血清中也存在糖基化小RNA，且这些血清去糖基化RNA也具有免疫刺激能力。 紧接着，团队检测糖基化RNA对于巨噬细胞胞葬作用的影响。阿霉素诱导Hela细胞凋亡后与巨噬细胞孵育，发现经PNGase F处理的凋亡细胞明显诱导炎症反应，而活细胞和正常凋亡细胞以及经PNGase F+RNA酶处理的凋亡细胞经均不能引起类似的IFNβ产生。与此同时，肌动蛋白聚合抑制剂松孢菌素D抑制胞葬作用则可以显著降低IFNβ水平，表明胞葬作用是含有去糖基化RNA的凋亡细胞诱导炎症反应的前提。总之，RNA的N-糖基化促进凋亡细胞清除的免疫静默。 作者前期鉴定acp3U是RNA糖基化位点（详见BioArt报道：Cell | 谢一轩/柴培远等揭示修饰的RNA碱基acp3U是糖RNA中N-聚糖的结合位点）。acp3U是由DTWD1/2催化尿嘧啶形成。因此，作者猜测DTWD2缺失可以通过阻止acp3U形成抑制RNA的N-糖基化，进而促进RNA依赖的炎症反应。意外的是，作者观察到相反的表型，从DTWD2缺失的细胞中分离的小RNA并不能诱导巨噬细胞的IFNβ产生。类似地，DTWD2缺失的凋亡细胞也不能诱导胞葬作用介导的IFNβ炎症反应。一个解释是小RNA的acp3U是其免疫刺激能力所必须的，但其N-糖基化可以封闭此位点。为此，作者先使用Endo-F2/F3处理小RNA去除糖链但保留单个N-葡糖胺封闭acp3U位点，发现其并不能引起炎症反应。随后，直接人工合成18个核苷酸的包含U以及acp3U的tRNA，发现acp3U的tRNA相比于非修饰tRNA刺激巨噬细胞产生更高水平的IL-6和TNFα。RNA-seq分析证实含有acp3U的tRNA诱导RNA感知和固有免疫应答，如TLR和IRF通路。这些数据支持一种模型，即acp3U修饰的RNA是一种固有免疫激活剂，但acp3U的N-糖基化可以封闭其活性基团。 最后，团队探索acp3U的适配性受体。作者从对照、TRIF KO（TLR3适配器）、MyD88 KO（TLR7适配器）小鼠分离骨髓来源巨噬细胞，并使用去糖基化小RNA刺激发现TRIF和MyD88敲除显著降低IFNβ产生。随后，作者直接从从对照、TLR3 KO、TLR7 KO小鼠分离骨髓来源巨噬细胞，同样使用去糖基化小RNA刺激发现TLR3和TLR7敲除也能显著降低IFNβ产生。类似的炎症降低表型也见于凋亡细胞胞葬作用实验。这些实验结果表明内体TLR3和TLR7感知acp3U 小RNA并诱导炎症反应。此外，相比于经典TLR3/7激动剂poly（I:C）（TLR3）、CL097（TLR7和TLR8）、R837（TLR7）、2′,3′-cGMP（TLR7）和ssRNA40（TLR7和TLR8），去糖基化小RNA具有类似的炎症刺激能力。总之，这些结果进一步支持RNA的N-糖基化作为化学屏障基团防止RNA在内体的感知以避免炎症反应。 综上所述，这项研究揭示小RNA中acp3U位点N-糖基化修饰的生物意义，去糖基化小RNA的acp3U可以在巨噬细胞内体中经TLR3/7识别引发RNA依赖的炎症反应，而N-糖基化修饰作为封闭基团阻止acp3U暴露进而避免自身RNA识别引发炎症反应，为自身RNA耐受和凋亡细胞清除稳态提供新的生物机制。 原文链接： https://doi.org/10.1038/s41586-025-09310-6 制版人： 十一 参考文献 1. Katherine A, Fitzgerald., Jonathan C, Kagan.(2020). Toll-like Receptors and the Control of Immunity. Cell, 180(6), 0. doi:10.1016/j.cell.2020.02.041 2. Mitsutoshi, Yoneyama., Mika, Kikuchi., Takashi, Natsukawa., Noriaki, Shinobu., Tadaatsu, Imaizumi., Makoto, Miyagishi., Kazunari, Taira., Shizuo, Akira., Takashi, Fujita.(2004). The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat Immunol, 5(7), 0. doi:10.1038/ni1087 3. Hiroki, Kato., Osamu, Takeuchi., Eriko, Mikamo-Satoh., Reiko, Hirai., Tomoji, Kawai., Kazufumi, Matsushita., Akane, Hiiragi., Terence S, Dermody., Takashi, Fujita., Shizuo, Akira.(2008). Length-dependent recognition of double-stranded ribonucleic acids by retinoic acid-inducible gene-I and melanoma differentiation-associated gene 5. J Exp Med, 205(7), 0. doi:10.1084/jem.20080091 4. Y T, Juang., W, Lowther., M, Kellum., W C, Au., R, Lin., J, Hiscott., P M, Pitha.(1998). Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factor 3. Proc Natl Acad Sci U S A, 95(17), 0. doi:10.1073/pnas.95.17.9837 5. Yaqun, Huang., Da, Liu., Mengting, Chen., San, Xu., Qinqin, Peng., Yan, Zhu., Juan, Long., Tangxiele, Liu., Zhili, Deng., Hongfu, Xie., Ji, Li., Fangfen, Liu., Wenqin, Xiao.(2023). TLR7 promotes skin inflammation via activating NFκB-mTORC1 axis in rosacea. PeerJ, 11(0), 0. doi:10.7717/peerj.15976 学术合作组织 （*排名不分先后） 战略合作伙伴 （*排名不分先后） · 转载须知 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。 BioArt Med Plants 人才招聘 近期直播推荐 点击主页推荐活动 关注更多最新活动！

IRAK4（IL-1 受体相关激酶 4）是免疫系统中的关键信号分子，作为 TLR/IL-1R 信号通路的 “分子开关”，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。2025 年 6 月 25 日， Kymera宣布更新与赛诺菲的 IRAK4 合作伙伴关系。赛诺菲将选定口服、高效且选择性靶向 IRAK4 的候选药物 KT-485（代号 SAR447971），进行临床研究。IRAK4简介一、IRAK4 的结构与功能结构特点IRAK4 是丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族成员，包含 N 端死亡结构域（DD）和 C 端激酶结构域。死亡结构域可与 MyD88等接头蛋白结合，激酶结构域则参与下游信号传导。核心功能信号传导枢纽作为 TLR/IL-1R 信号通路的 “分子开关”，介导天然免疫应答。支架作用参与形成 Myddosome 复合物（含 MyD88、IRAK1、IRAK4 等），促进 NF-κB、MAPK 等通路激活。激酶活性磷酸化 IRAK1 等底物，放大炎症信号，诱导促炎细胞因子（如 IL-6、TNF-α）和 I 型干扰素产生。二、IRAK4 参与的免疫信号通路TLR（ toll 样受体）通路TLR 识别病原体相关分子模式（如 LPS、病毒核酸）后，招募 MyD88，后者与 IRAK4 结合，激活 IRAK1，最终诱导 NF-κB 入核，调控炎症基因表达。10.3389/fimmu.2023.1276512涉及 TLR 类型TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9 等。IL-1R（白细胞介素 - 1 受体）通路IL-1、IL-18 等细胞因子与 IL-1R 结合后，通过 MyD88-IRAK4-IRAK1 轴激活 NF-κB，参与先天免疫和炎症反应。下游效应诱导促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、趋化因子（CXCL8）和 I 型干扰素（IFN-α/β），介导免疫细胞活化、募集和炎症反应。IRAK4 与免疫相关疾病遗传性免疫缺陷病IRAK4 缺陷常染色体隐性遗传，患者对化脓性细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌）易感，表现为反复感染，尤其是儿童期，但对病毒和真菌免疫正常。机制：IRAK4 缺失导致 TLR/IL-1R 信号受阻，中性粒细胞和单核细胞功能缺陷，促炎因子产生不足。自身免疫与炎症性疾病化脓性汗腺炎（HS）IRAK4 介导的 IL-1β、TNF-α 等细胞因子过度分泌，驱动毛囊周围炎症和组织破坏。特应性皮炎（AD）TLR7/8 激活 IRAK4，促进 Th2 型炎症（如 IL-4、IL-13）和皮肤屏障破坏。其他疾病类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等，IRAK4 参与炎症级联反应的放大。IRAK4与肿瘤IRAK4 在肿瘤中的作用机制1. 促肿瘤炎症信号传导激活 NF-κB 通路IRAK4 通过 TLR/IL-1R-MyD88-IRAK4-IRAK1 轴激活 NF-κB，诱导抗凋亡基因（如 Bcl-2、c-IAP）和促血管生成因子（如 VEGF）表达，促进肿瘤细胞存活与增殖。驱动促炎微环境IRAK4 介导的 IL-6、TNF-α 等细胞因子分泌，招募髓系抑制细胞（MDSCs）和调节性 T 细胞（Tregs），形成免疫抑制微环境。2. 肿瘤细胞增殖与侵袭调控细胞周期IRAK4 信号可激活 MAPK（如 ERK1/2）通路，促进肿瘤细胞 G1/S 期转换。增强转移能力通过上调基质金属蛋白酶（MMPs）和上皮 - 间质转化（EMT）相关基因（如 Twist、Snail），促进肿瘤细胞侵袭和转移。3. 免疫逃逸机制抑制抗肿瘤免疫IRAK4 介导的 IL-10、TGF-β 分泌可抑制 CD8+ T 细胞功能，同时促进 M2 型巨噬细胞极化，削弱免疫监视。调节 PD-L1 表达：通过 NF-κB 通路诱导肿瘤细胞 PD-L1 表达，增强免疫检查点逃逸。二、IRAK4 与特定肿瘤类型的关联1. 乳腺癌表达与预后IRAK4 在三阴性乳腺癌（TNBC）中高表达，与淋巴结转移和不良预后相关。机制IRAK4 激活 PI3K/AKT 通路，促进 TNBC 细胞耐药性；通过 TLR4-IRAK4 轴增强肿瘤干细胞特性。2. 结直肠癌（CRC）炎症 - 癌变关联在炎症性肠病（IBD）相关 CRC 中，IRAK4 介导的 IL-1β 信号驱动肠上皮细胞癌变。临床数据CRC 患者癌组织中 IRAK4 表达高于正常黏膜，且与肿瘤分期正相关。3. 肺癌小细胞肺癌（SCLC）IRAK4 高表达与化疗耐药相关，抑制 IRAK4 可增强依托泊苷的细胞毒性。非小细胞肺癌（NSCLC）TLR3-IRAK4 通路激活可促进肺癌细胞增殖，而 IRAK4 抑制剂可减少肿瘤生长。4. 血液系统肿瘤B 细胞淋巴瘤IRAK4 参与 B 细胞受体（BCR）信号通路，其异常激活见于弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL），靶向 IRAK4 可协同化疗药物诱导细胞凋亡。多发性骨髓瘤（MM）IRAK4 通过 NF-κB 通路维持骨髓瘤细胞存活，降解剂 NX-2127 已进入临床研究。靶向 IRAK4 的免疫治疗治疗策略IRAK4 激酶抑制剂如 PF-06650833，通过抑制激酶活性阻断信号传导，但对支架功能无影响，临床效果有限。IRAK4 降解剂如 KT-474（SAR444656），通过泛素 - 蛋白酶体系统降解 IRAK4，同时抑制激酶和支架功能，在 1 期临床试验中显示对 HS 和 AD 的疗效。不过，现在口服、高效且选择性靶向 IRAK4 的候选药物 KT-485（代号 SAR447971）将在未来取代 KT-474（SAR444656）。10.1021/acs.jmedchem.4c01305优势与挑战优势：相比单靶点抗体（如抗 IL-1β），IRAK4 降解剂可同时抑制多种 TLR 和 IL-1R 家族信号，具有广谱抗炎潜力。挑战：需平衡免疫抑制与感染风险（如 IRAK4 缺陷患者的感染易感性提示过度抑制可能增加感染风险），需在临床试验中评估长期安全性。总结IRAK4 是天然免疫信号网络的核心节点，其异常激活参与多种炎症性疾病，而功能缺失则导致免疫缺陷。靶向 IRAK4 的降解剂通过同时抑制激酶和支架功能，为 HS、AD 等疾病提供了新的治疗方向，但需在疗效与免疫平衡间寻找最佳平衡点。未来研究将聚焦于优化药物选择性和评估长期安全性，以推动临床转化。部分参考资料https://investors.kymeratx.com/news-releases/news-release-details/kymera-therapeutics-announces-sanofi-irak4-collaboration-updateKang C, Li X, Liu P, Liu Y, Niu Y, Zeng X, Zhao H, Liu J and Qiu S (2023) Tolerogenic dendritic cells and TLR4/IRAK4/NF-kB signaling pathway in allergic rhinitis. Front. Immunol. 14:1276512. doi: 10.3389/fimmu.2023.1276512IRAK4 degrader in hidradenitis suppurativa and atopic dermatitis: a phase 1 trial.Ackerman L, Acloque G, Bacchelli S, Schwartz H, Feinstein BJ, La Stella P, Alavi A, Gollerkeri A, Davis J, Campbell V, McDonald A, Agarwal S, Karnik R, Shi K, Mishkin A, Culbertson J, Klaus C, Enerson B, Massa V, Kuhn E, Sharma K, Keaney E, Barnes R, Chen D, Zheng X, Rong H, Sabesan V, Ho C, Mainolfi N, Slavin A, Gollob JA. Nat Med. 2023 Dec;29(12):3127-3136. doi: 10.1038/s41591-023-02635-7.Discovery of KT-474─a Potent, Selective, and Orally Bioavailable IRAK4 Degrader for the Treatment of Autoimmune Diseases，J Med Chem .2024 Oct 24;67(20):18022-18037. doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c01305. Epub 2024 Aug 16.