EphA2 x ITGA

大型制药公司和投资者正在涌入精准辐射领域，因为下一代越来越有效的靶向α粒子疗法有望以对健康组织的损害最小的方式破坏癌细胞。      Advan Cell在2月份筹集了1.12亿美元，用于试验一种可能同类最佳的前列腺癌靶向α放射疗法。该公司正在进行转移性前列腺癌的放射性核素治疗ADVC0011/2期试验。在过去两年中，诺华、礼来、阿斯利康和百时美施贵宝等参与者达成了一系列金额达100亿美元的交易。这四家大型制药公司押注于一种新的、更有效的放射性同位素，而不是迄今为止美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物中使用的放射性同位素。新的α发射同位素疗法有望在肿瘤学领域引起轰动，因为它们直接向癌细胞提供聚焦辐射。      放射性药物是通过接头连接到放射性有效载荷的小分子、肽或抗体。这些含有放射性的治疗将辐射直接传递到肿瘤细胞，破坏细胞的DNA并导致细胞死亡，同时避免损坏周围健康组织。最畅销的放射性核素治疗药物是诺华的Pluvicto（镥Lu-177 vipivotide tetraxetan），于2022年被美国FDA批准用于转移性前列腺癌。Pluvicto使用同位素镥177，这是一种β放射，可释放高能电子在DNA中引起单链缺口，靶向前列腺肿瘤细胞上发现的前列腺特异性膜抗原（PSMA）。另一种获批的放射疗法，诺华的Lutathera（镥Lu-177 dotatate），使用相同的β放射镥-177，但将其靶向生长抑素受体2型（SSTR2）以治疗神经内分泌肿瘤。新出现的放射性核素试剂携带一种不同类型的同位素：α发射体。它们拥有一些关键优势——它们在更近距离调度更多的DNA损伤——导致药物开发人员越来越多地转向铅212、砹211和锕225。发射α放射性核素会抛出氦核（一种α粒子），虽然氦核的能量转移能力更强，但只能穿透少数细胞层。这导致仅在目标癌细胞中发生无法修复的双链DNA断裂，同时限制对附近健康细胞的额外损伤。      更具前景的是，通过将α发射器与生物分子相结合，这种短程损伤可以专门集中在肿瘤细胞上。在神经内分泌肿瘤上测试此类分子的试验的结果表现良好。这些结果包括Radio Medix的候选药物Alpha Medix的结果，该药物已获得Sanofi的许可，将铅212导联引导至SSTR2。它缩小了约55%患者的晚期新内分泌肿瘤，许多患者没有疾病证据。制药公司现在的目标是将这一成功扩展到其他类型的癌症。未来，将能够攻击癌症。      研究人员希望的难以治疗的癌症之一是高级别神经胶质瘤，这是一种浸润性和免疫性无抑制性脑癌。公司正在使用低密度脂蛋白受体、碳酸酐酶XII或L型氨基酸转运蛋白等靶标，这些靶标通常在神经胶质瘤中过表达。试验处于早期阶段（表1），但结果可能会很快出现，因为针对某个靶点的同位素也可以在治疗前和治疗期间可视化肿瘤，这种方法称为治疗诊断学。使用弱放射性同位素的成像使临床医生能够观察患者的病变以进行靶标表达，选择它们进行试验并跟踪药物的摄取以管理治疗的剂量。     放射性核素疗法甚至可能在其他靶向抗癌药物达到上限的地方发挥作用。例如，抗体-药物偶联物（ADC）非常有效，但受到不可接受的毒性特征的限制。相比之下，精确辐射可能会检测ADC由于有效载荷有限而无法处理的低表达靶标。即使对于具有低表达靶标的癌症，α辐射也足以摧毁它们。在制造过程中，也可以通过添加更多放射性来增加放射性药物的活性。体内，它们的机制很简单——它们不需要被带入细胞来发挥作用。      然而，开发人员面临的挑战是最大限度地提高肿瘤上的放射性，并将其保持足够长的时间，以便放射性同位素能够完全释放其细胞杀伤损伤，同时确保对附近健康细胞的损伤最小。这项工作仍在进行中，到目前为止，没有人突破这些跨目标的挑战。在输送放射性有效载荷方面，肽是大多数制药公司的首选（表1）。肽是放射性核素的完美递送系统，并具备全身半衰期短和通过子细胞快速清除等优点。然而，肾脏往往会重吸收氨基酸，因此限制该器官中的同位素积累很重要。表1|选定的放射性药物治疗性临床试验，不包括PSMA和SSTR2作为靶点     生物制药公司正在采用一系列新结构，以改进和增强肽的治疗性。Bicycle Therapeutics开发合成双环肽作为癌症靶点的配体；其先导分子处于2/3期试验中，由与毒素偶联的环肽组成。与现在进入放射性制药领域的其他几家生物技术公司一样，Bicycle最近利用其在ADC方面的经验进行了投资，现在正在采取行动加速其产品组合中的放射性药物候选药物。      将肽携带到靶标上并将其保留在肿瘤部位是由中国北京大学的研究人员设计的。他们开发了一种点击化学形式——将两个互补分子足够快、选择性地捕捉在一起以用于体内的反应——以α和β辐射靶向纤维原始细胞激活蛋白（FAP），这是一种在肿瘤基质中表达的泛癌靶点。当FAP配体与其靶标共价结合时，小鼠的摄取率比非共价配体高2.5倍，肿瘤保留率高13倍，并且具有更好的抗肿瘤作用。而且，在两名患者中，共价配体成像了更多的肿瘤病变。      抗体还可以递送具有极高特异性的放射性核素。缺点是抗体可以在体内停留数周，当与放射性结合时，可能会将辐射沉积在骨髓中并引起血液毒性。因此，制药公司现在越来越被具有抗体结合亲和力的肽模拟物所吸引，例如抗体片段、DARPins、环肽和微型蛋白。Bicycle Therapeutics的环肽可以满足这些要求。它们由两种线性肽组成，旨在模拟抗体的表位结合区域，通过化学支架折叠过滤并保持原位。Bicycle Therapeutics公司正在布局EphA2，一种受体酪氨酸激酶。其基于双环的黄斑放射线的短循环半衰期（40-60分钟）应该可以克服无法控制的出血副作用，这些副作用会阻止针对该靶点的ADC。预计2025年底将提供用于验证EphA2作为靶标的人体成像数据。     其他抗体模拟蛋白（设计的锚蛋白重复蛋白或DARPins）可以识别各种靶标，同时克服ADC的另一个缺点。例如，在某些肺癌和卵巢癌上表达的癌症靶点中皮素已被证明对ADC具有挑战性，因为它们倾向于结合脱落到循环中的可溶性间皮素。Molecular Partners设计DARPins，使用锚蛋白重复序列（介导蛋白质-蛋白质相互作用的天然锚定蛋白结构域）以高特异性和亲和力结合靶标。临床前研究中的一种此类DARPin将辐射引导到细胞表面间皮素——具体来说，是到一个小的膜近端区域。就灵敏度和特异性而言，这对于环肽等模式来说确实很难实现。该公司的放射线DARPin具有优化的骨架表面，以防止肾脏重吸收，并被设计为延长循环半衰期以促进肿瘤摄取。一种将放射性核素引导至细胞表面间皮素的DARPin候选药物正处于临床前研究中。另一种靶向DLL-3（Notch信号通路的抑制性配体）的lead-212候选药物预计将于2025年开始针对小细胞肺癌的首次人体研究。      其他几家公司已经设计了抗体功能单元，将小肽的优势（高溶解度和肿瘤渗透性）与传统单克隆抗体的卓越特异性相结合。Precirix是最早生成临床数据的生物技术公司之一。这家生物技术公司将β发射体碘-131连接到称为纳米体的工程单域抗体或片段上，以将放射性有效载荷输送到表达HER2的肿瘤。其单域抗体结合靶标并在肿瘤细胞上停留7天以上，未结合的放射性核素可在数小时内被肾脏迅速清除。该研究提供了机制的临床证据。“单域抗体作为一个定位概念，作为一个平台，是有效的。研究表明，该产品对HER2具有高度特异性，而不会引起血液毒性。该公司现在专注于放射性元素，以配合行业趋势，其最先进的项目针对FAP的α发射放射性核素。     其他开发人员认为全长抗体具有靶向放射性同位素的理想属性。Tagworks的战略是利用传统单克隆抗体的高亲和力、良好的肿瘤暴露率和低肾脏暴露量，一旦作用完成，它就会将抗体从放射性同位素上解开。该公司的点击释放技术使用可切割的连接子将同位素连接到靶向分子上。一旦药物注入患者体内并且抗体与靶标结合，就会注射四嗪分子，它使用点击化学来释放同位素。然后该同位素从体内迅速清除。tetrazine触发分子不具有细胞渗透性，因此它无法到达已被肿瘤细胞内化的抗体-同位素偶联物，从而确保放射性被困在肿瘤中。预计2025年晚些时候将开始一项首次人体试验，主要针对经过充分验证的HER2靶标的同位素。   包括Y-mAbs、Roche和OncoOne在内的其他公司以及学术团体正在探索相反的路线：只有在用抗体预靶向后才能连接放射性核苷酸。患者首先接受锁定在肿瘤上的未标记抗体或自组装抗体组分，任何未结合的抗体组分都会通过血液清除。然后向患者注射放射性示踪剂，该示踪剂通过点击化学或双特异性抗体相互作用与结合的抗体结合。任何多余的部分都会被快速清除。      一项成像试验正在胰腺癌细胞上使用CA19-9抗体测试这种称为预靶向的策略。更先进的是Y-mAb1期试验，使用自组装抗体片段将镥-177递送至非霍奇金淋巴瘤靶标CD38。在小鼠模型中未观察到骨髓毒性的证据。如果这种策略奏效，将只对肿瘤发挥作用而不损坏健康组织。该公司正在与Roche合作开发预定位方法。     一种策略布局超分子化学，专注于分子之间较弱和可逆的相互作用，例如氢键。科学家们可以应用这些非共价效应，使两个药物片段（其中一个封装放射性核苷酸）以可逆、非共价相互作用的方式保持在一起。可以向此类分子系统添加更多功能，例如多个放射性同位素或靶向片段，与传统的蛋白质或小分子工程相比，研究人员和制药公司可以更灵活地进行创新。      布局radio pharmaceuticals的另一个优势是它们可以用作低剂量辐射，以补充免疫疗法并提高其治疗癌症的有效性。一项试验发现，单次初免剂量的Pluvicto与PD1蛋白阻滞剂Keytruda（pembrolizumab）联合使用可缩小转移性前列腺癌患者的肿瘤。当与免疫肿瘤学药物联合使用时，调整放射性核素疗法以降低辐射剂量可能对儿童儿童癌症特别有效，因为尽量减少辐射剂量和暴露对年轻患者很重要。      皮茨堡大学的研究人员正在神经胶质瘤小鼠模型中测试这种策略，这种癌症约占儿童癌症的四分之一。研究表明，针对肿瘤相关髓系细胞上CD11b的α或β辐射典型剂量的1/50使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。这导致存活率比单独使用检查点抑制治疗高得多。目前正在努力分析数据，并考虑可能进行临床试验。低剂量辐射作用的机制尚不确定，但辐射诱导的肿瘤细胞损伤可能会对肿瘤微环境产生免疫刺激作用，募集免疫细胞以增强抗肿瘤免疫力。对放射性药物领域的快速和大规模投资无疑将推动进一步的理解并促进进一步的创新。一些人警告不要急于选择配体或靶标，尽管如此，“Lutathera和Pluvicto可能只是先锋。现在，医生、风险投资家和生物技术公司的目光都集中在放射线药物领域。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:对抗疾病上升和传播最宝贵且成本效益最高的健康措施是疫苗接种。癌症疫苗（CV）是临床肿瘤学家极具前景且有益的工具。众多肿瘤相关抗原为免疫疗法和疫苗接种提供了极好的靶点。为确保抗原持续释放到免疫系统，载体被用于疫苗管理。最近，研究人员专注于可以专门针对肿瘤组织的疫苗输送系统，避免了与系统效应相关的挑战。本章讨论了旨在开发更精确疫苗输送系统以治疗肿瘤的研究。装载抗原的载体在靶向治疗中显示出前景，通过激活免疫系统以触发对疾病抗原的独特免疫反应。这些载体可以被抗原呈递细胞（APCs）主动摄取。有多种载体系统可用，包括物理方法和非物理方法，如类病毒颗粒（VLP）/病毒体、聚合物微粒和纳米颗粒（NPs）、脂质体、古菌脂质脂质体（archaeosomes）、免疫刺激复合物和细胞穿透肽（CPP）。本章将讨论它们在未来CV开发中的潜力以及它们的治疗潜力。 1.引言 1.1.癌症简介 几十年来，癌症一直是死亡的主要原因。然而，开发成功的癌症治疗方法非常具有挑战性。理解恶性肿瘤的病因和癌症细胞扩散过程至关重要。一系列以异常细胞无控制增殖为特征的恶性疾病统称为“癌症”。它被认为是继心血管疾病之后全球第二大死因。2015年，世界卫生组织（WHO）报告称，癌症单独导致了全球5800万死亡中的760万。研究表明，到2030年，全球将有1540万癌症相关死亡，比每年增加1000万例。化疗、放疗和手术是癌症常见且有效的治疗方法。这些治疗的有效性取决于癌症的类型。化疗的一个缺点是它无差别地针对快速分裂的细胞，导致恶性和健康细胞的破坏。放疗和手术的主要限制是它们不能消除转移。因此，仍然需要更有效、伤害更小的癌症治疗方法。研究表明，癌症疫苗（CVs）可能比传统化疗更有效，因为它们与患者的免疫系统协同工作以抑制癌细胞的生长。 1.2.疫苗简介 自1798年爱德华·詹纳首次测试天花疫苗以来，疫苗显著降低了疾病发病率和死亡率，潜在地使它们成为有史以来最重要的医学创新。尽管疫苗无疑已被证明是有益的，但在载体生产、运输和可用性方面的进展将非常有利。路易·巴斯德的“三步”范式——分离、灭活和注射——历史上一直是疫苗开发的基础。然而，随着我们对免疫学、病理学和微生物学的更好理解，疫苗开发正转向更“合理设计”的观点。这些合理设计的疫苗通常由最小成分组成（如亚单位或肽段），这使它们免疫原性较低，但在安全性和生产成本方面提供了优势。预计整合和优化这些方法，连同实施新的剂量和佐剂策略，可以帮助弥合这一效力差距。 1.3.癌症疫苗 CVs通过激活适应性免疫系统工作，最终消除癌细胞，同时通过诱导对肿瘤的免疫反应提供预防性防御。这种方法减少了来自身体不同器官或器官系统的癌细胞的肿瘤复发可能性。这归因于免疫系统识别体内肿瘤细胞的固有能力。抗原作为免疫系统刺激物，为身体对抗癌细胞做好准备。许多调查已经识别出与癌症相关的广泛抗原，其中一些目前正在临床试验和研究中作为CVs使用。现代技术在识别肿瘤中T细胞特别识别的抗原方面取得了重大进展。肿瘤抗原（TAs）可以分为两大类：肿瘤特异性共同抗原和肿瘤特异性独特抗原。由多种肿瘤细胞表达的共享抗原有时被称为肿瘤相关抗原（TAAs）。最有效的免疫疗法剂和/或输送系统与在正常组织中表达程度不同的最合适的TAs协同工作，以实现最佳治疗效果。因此，选择合适的疫苗输送机制对于发展癌症治疗的免疫策略至关重要。 1.4.治疗性免疫疗法 研究人员已经认识到治疗性抗癌疫苗相较于预防性疫苗的必要性。治疗性疫苗在疾病发生后进行管理，旨在完全停止恶性细胞的生长或控制转移和疾病复发。在针对癌症的免疫激活中涉及的主要因子是抗原呈递细胞（APCs），特别是树突状细胞（DCs）。通过针对肿瘤微环境（TME）中的DCs，可以将促进肿瘤生长的炎症转向杀伤肿瘤模式。DC特异性抗体和DC激活剂，结合癌症特异性抗原，诱导强烈的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞介导的免疫反应。在触发细胞介导的免疫反应后，癌细胞被干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子和接触介导的细胞毒性所破坏。许多纳米颗粒（NP）/脂质体配方包含靶向分子，如抗体和免疫调节剂，以及肿瘤特异性抗原，以促进APCs的激活，主要是DCs。由于其大小和组成，纳米配方很容易被DCs摄取，导致T细胞和抗体反应。大多数治疗性疫苗接种技术通过DC介导的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应导致肿瘤退缩。这些配方设计交付的货物（抗原/抗体/Toll样受体（TLR）配体/细胞因子，见图1.1）用于进一步分类这一部分。 图1.1 癌症疫苗诱导免疫的机制途径。 在过去20年中，对肿瘤疫苗和免疫学的研究，这些都是当前癌症治疗的诱人替代品或补充品，已显著增加。这些方法旨在刺激患者的免疫系统识别和消除肿瘤细胞。它们提供了几个重要优势，包括能够： 诱导针对性的肿瘤细胞死亡，对健康非肿瘤细胞的伤害最小； 通过系统性诱导抗肿瘤免疫反应，同时针对原发性和继发性转移； 产生免疫记忆，为未来潜在的肿瘤复发提供长期保护。 2.疫苗输送系统 2.1.物理方法 DNA疫苗诱导的免疫反应类型可能因其管理方法而异。DNA可以通过静脉内（I.V.）、皮下（S.C.）、肌肉内（I.M.）或鼻内（I.N.）给药。一些研究表明，皮肤给药具有免疫学优势，与传统给药方法相比，具有更强的免疫反应。然而，由于缺乏能够一致且准确将疫苗输送到皮肤的有效给药系统，皮肤免疫接种的结果有时不明确。疫苗管理的鼻途径也因其局部和系统效应而受到关注。然而，缺乏有效的疫苗配方和安全的鼻内给药方法。当前研究正在调查基于聚丙烯酸盐聚合物的颗粒系统以增强粘膜免疫反应。标准疫苗通常使用皮内（I.D.）或皮下（S.C.）接种。在各种动物模型和临床研究中，肿瘤内和/或淋巴结内疫苗接种已被证明比其他方法更有效。在“癌症研究进展”中报告的一项研究报告中，皮下初次免疫后序贯进行静脉加强疫苗接种比单独任一管理方法产生了更强的抗肿瘤效果。注射途径可能受到几个因素的影响。最近的发现表明，使用生物弹道方法，如基因炮或Biojector 2000，可以提高效率。在小鼠上进行的研究表明，与针头注射相比，需要100倍更少的DNA就能引发抗体反应。生物弹道和针头注射可能导致不同的免疫反应。基因枪通常诱导DNA疫苗的T辅助型2（Th2）反应，而针头注射通常引发Th1反应。这种差异可能归因于使用更高的注射剂量。需要注意的是，这种结果并不常见。先前的研究表明，使用未经任何涂层的裸露DNA疫苗的基因枪输送会导致Th1偏向的免疫反应，表明基因枪轰击中使用的Au颗粒可以改变产生的免疫反应。此外，无论途径如何，某些抗原都可以影响免疫反应。增加表达DCs的抗原数量的一些技术包括激光疗法前的皮内注射、电穿孔前的肌肉内注射和微胶囊疫苗的肌肉内注射。以下讨论通过物理输送增强基于基因的免疫接种的策略。这些方法也在图1.2中描述。 图1.2 通过物理方法进行癌症疫苗递送的不同方法。 2.1.1.纹身 最近，纹身被提出作为一种将脱氧核糖核酸（DNA）物理注入表皮细胞的方法。这种方法与用于天花疫苗接种的有效策略相似，因为它似乎加快了强健宿主防御和有效免疫的发展。免疫后抗原的快速和零星合成可能解释了这种效果。研究表明，与皮内注射和基因枪递送相比，DNA纹身后的基因表达更高。通过纹身进行DNA转移似乎与肌肉内注射相比，导致不同的基因表达模式。在一个实验中，肌肉内（I.M.）注射100微克DNA导致至少比纹身20微克DNA高出10倍的基因表达峰值。纹身后基因表达立即增加，然后在接下来的四天内逐渐减少。相比之下，观察到肌肉内注射DNA后基因表达水平升高，峰值出现在七天后，可能持续长达30天。尽管DNA浓度较低且基因表达减少，但与肌肉内DNA注射相比，纹身DNA诱导了更强的细胞和体液免疫反应对抗原。此外，已经研究了通过纹身或肌肉内针头注射施用的DNA疫苗的有效性，与两种添加剂：心脏毒素和含有小鼠GM-CSF的质粒DNA（pDNA）的效果。本研究中使用了编码L1主要衣壳蛋白的人乳头瘤病毒16型（HPV16）基因作为模型抗原。结果显示，肌肉内给药分子佐剂显著提高了HPV16 L1 DNA疫苗的效果。此外，纹身设备施用的HPV16 L1 DNA比肌肉内针头递送配合分子佐剂产生了更强更快的体液和细胞免疫反应。然而，当需要更即时和强大的免疫反应时，纹身递送DNA是一种实用且经济的技术，可以应用于实验室。纹身导致几个小的机械损伤，随后出血、坏死、炎症和皮肤再生，这无意中增强了免疫系统。因此，纹身“仅”部分取代了佐剂的作用。 2.1.2.基因枪 基因枪是一种生物弹道装置，允许DNA通过使用附近的室击中目标DNA直接进入细胞。通过体外或体内基因枪技术，包括原代培养和知名细胞系在内的各种体细胞类型，已被作为悬浮或粘附培养物移植。这些事件导致树突状细胞（DCs）扩展和迁移到附近的淋巴组织，在那里它们启动T细胞以目标方式响应抗原。最近，使用TAA、人类gpl00和报告基因测定作为实验平台，进行了针对黑色素瘤的皮肤疫苗接种。研究发现，在不同类型的癌症中，包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌和结直肠癌中，表皮生长因子受体（EGFR）蛋白高度表达。在一项小鼠实验中，通过三种不同的技术传递编码人类EGFR外域的pDNA来评估免疫和抗癌反应：肌肉内针头注射（I.M.）、镀金的DNA基因枪和未镀金的DNA基因枪。在动物肺癌研究中，未镀金pDNA基因枪注射显示出最大的抗肿瘤效果和CTL活性。这些发现可能指导未来人类临床试验中使用的DNA疫苗的开发。创建一个针对表达该基因的恶性肿瘤的EGFR DNA疫苗可能需要DNA免疫。此外，发现由胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤组成的CpG基序可以修改基因枪轰击后在引流淋巴结（LN）中建立的Th2型细胞因子环境。发现表明，插入CpG基序可以提高局部LN中白介素（IL）-12 mRNA的水平，无论它是通过皮内注射、肌肉内注射还是基因枪轰击给药。这些结果表明，CpG基序注射在局部LN中诱导了T辅助细胞类型1（Th1）偏向的环境。DNA疫苗和CpG基序的结合可以激活Th1免疫反应，并作为一种“警告信号”。与常规肌肉内（I.M.）注射相比，使用基因枪进行皮内（I.D.）给药被发现是施用人类乳头瘤病毒（HPV）DNA疫苗最有效的方法。最近，有报道称可以使用低压下的基因手枪传递无载体裸DNA。与金颗粒包被的DNA免疫相比，无载体无保护的预防性HPV DNA疫苗有效地减少了局部皮肤损伤。通过与金颗粒层HPV DNA疫苗进行比较，研究人员确定它也能增强对HPV抗原的T细胞免疫并改善抗肿瘤效果。最近的临床调查使用了一种名为Sig/E7detox/HSP70 DNA疫苗的HPV16 DNA疫苗，该疫苗编码与HSP70连接的信号肽与HPV16 E7（E7 detox）的抑制变体。在之前的研究中，使用三种不同的递送方法施用了pNGVL4a-Sig/E7（detox）/HSP70疫苗：针头肌肉内注射、生物喷射器和基因枪。目的是评估抗原和抗肿瘤反应。基因枪DNA免疫方法产生的E7特异性CD8+ T细胞数量最多，与针头肌肉内注射和生物喷射器给药相比。 2.1.3.超声波 为了促进细胞内DNA的融合，细胞膜可以通过超声波（US）暂时性破坏。此外，治疗性超声波与微泡造影剂的结合可能提高基因转染的效率。这一过程使得DNA能够直接且成功地转移到细胞质中。虽然已经使用这种技术将蛋白质送入细胞，但尚未将抗原引入树突状细胞（DCs）用于癌症免疫疗法。体外和体内研究表明，使用US技术可以促进裸pDNA进入结肠癌细胞。此外，在小鼠鳞状细胞癌模型中，在US处理前进行裸pDNA的肿瘤内注射增强了DNA的运输和基因表达。目前，US正在临床环境中进行研究。Memgen开发的CV在加州大学圣地亚哥分校进行的II期研究（ID：NCT00849524）中，反复通过静脉（I.V.）给药给患有慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）的患者。 2.1.4.电穿孔 在这种方法中，对皮肤施加电脉冲，导致暂时性孔隙形成，促进DNA细胞内进入。一旦移除电能，皮肤就会恢复其结构，并由于孔隙关闭而保持免疫原性物质。历史上，毫秒和微秒脉冲已在电穿孔（EP）中得到应用。最近的研究探索了使用极强纳秒电脉冲（10-300纳秒）在极高强度（10-300千伏/厘米）下直接将DNA转移到细胞核。EP可以通过增加蛋白质表达，释放炎症趋化因子和细胞因子，吸引如巨噬细胞和DCs的APCs到EP部位来增强免疫反应。与单独肌肉内DNA注射所达到的水平相比，EP介导的pDNA传输增加了抗原特异性的体液和细胞免疫反应。已证明，在体内，EP在小型和大型动物中都能可靠地增强免疫反应，表明其在人类中的潜在应用。随后EP和US之间的比较显示了使用EP转染骨骼肌与暴露的pDNA的有效性。在最近的研究中，已经证明单独在小鼠中通过EP给药pDNA已被证明是成功的作为增强免疫。这种成功可能归因于EP增强疫苗所达到的高水平抗原生成。值得注意的是，与使用两剂DNA和EP剂量相比，这种方法显示出更大的成功。这种策略特别吸引人，因为它消除了需要两种不同的疫苗类型。例如，研究表明，当使用表达结肠癌细胞CT26的CTL表位AH1的DNA疫苗时，疫苗的剂量和体积显著影响小鼠的启动和肿瘤保护效率。动物模型已被用来研究EP驱动的DNA疫苗策略治疗前列腺癌。为了有效刺激针对表达前列腺抗原的肿瘤的抗肿瘤免疫反应，通过肌肉内介导的EP在体内给药编码phPSA的质粒。结果表明，phPSA疫苗治疗显著延缓了恶性肿瘤的进展并延长了动物的寿命。研究人员采用了多种策略来开发最佳的HPV DNA疫苗，包括融合E6和E7肿瘤抗原（E6/E7）、组织型纤溶酶原激活剂（tpa）信号序列、包含CD40配体（CD40L）和Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）。当E6和E7融合（E6/E7（Co））时，E6/E7抗原特异性CD8(+) T细胞反应减少，但预防性抗肿瘤影响增加。与CD40L相关的HPV DNA疫苗相比，Flt3L融合的HPV DNA疫苗显示出改善的治疗抗肿瘤结果和增加的E6和E7特异性CD8+ T细胞反应。在卡罗林斯卡大学医院进行的I/II期临床调查中，Chron Vac-C，一种治疗性DNA疫苗，通过EP给药给以前感染过病毒的患者，以通过增强免疫反应加快他们的康复。这项临床试验在瑞典医院的胃肠病学和传染病诊所进行。这是最早使用EP技术给人们使用的针对传染病的DNA疫苗之一。为了通过MHC类I途径增强抗原处理和传递，并增强细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的产生，有必要通过与免疫刺激性分子如钙网蛋白（CRT）的相互作用将TAs亚细胞定位。即使在当前的进步下，找到一个可靠的DNA递送机制仍然是确保免疫治疗方法有效性的关键。在比较三种疫苗接种技术的研究中——传统的肌肉内（I.M.）注射、通过电穿孔（EP）介导的I.M.递送和表皮基因枪介导的粒子递送——使用了pNGVL4a-CRT/E7（detox）DNA疫苗。结果表明，EP是免疫E7最有效的方法，因为它产生了最大量的E7特异性细胞毒性CD8+ T细胞。 最近，几种HPV DNA疫苗已经成功地使用电穿孔（EP）技术给猕猴和老鼠模型生物进行了接种。其中一种疫苗是VGX-3100，它包含针对HPV亚型16和18的E6和E7蛋白的质粒。目前，该疫苗正在进行I期临床试验。建议有CIN 2或3病史的个体以及接受过手术的人接种这种疫苗。Cyto Pulse比以往的肌肉内电穿孔技术更有效地特异性针对皮肤细胞。Cyto Pulse开发了两种临床疫苗输送设备，DermaVax和Easy Vax。Easy VaxTM专注于皮肤的表皮层，广泛用于预防性病毒疫苗接种。另一方面，Derma VaxTM主要针对皮肤的真皮层。这种方法适用于需要强烈免疫反应和高剂量的情况，如基因治疗和癌症疫苗（CVs）。Derma Vax将在进行中或计划中的临床研究中使用。其中一项研究，编号NCT01064375，旨在使用ID EP（El-porCEA）创建一种DNA疫苗来治疗结直肠癌。该研究评估了CEA DNA免疫技术在结直肠癌患者中的免疫原性和安全性。 2.1.5.激光 体外研究表明，激光束可以将能量（首次高达20兆电子伏）传递给目标细胞，通过局部热效应改变膜的通透性。对于药用用途，需要额外的能量（高达250兆电子伏）。最近，这种尖端方法被描述为提高注射质粒的转染效率的有效方式，并在T细胞和体液免疫中引发针对抗原的免疫反应。这种新方法仅在少数试验中使用，显示出开发治疗性HPV DNA疫苗的巨大潜力。 2.1.6.喷射注射器 喷射注射器用于将雾化的药液或悬浮液注入皮肤，使用弹簧机制或压缩气体（通常是二氧化碳、氮气或氦气）包含在一个小药筒或大罐中。这种方法允许药物直接到达肌肉或更深入地穿透皮下或真皮层。 2.1.6.1.液体喷射注射器 液体喷射注射器正在开发为一次性和多次使用组件。对于像糖尿病这样的慢性疾病，使用可重复使用的设备来每天给予持续效果的剂量。预装药物的可更换设备用于办公室基础免疫、大规模疫苗接种和紧急情况，如治疗过敏和偏头痛发作。 这些设备在不需要针头的情况下对液体进行加压，这会在皮肤上形成孔。压缩气体或弹簧可以用作动力源。这导致压力配置文件较低，将剩余的液体推入皮肤。由于药物已经是液体形式，因此无需重新配制。 Walther等人已经证明，使用注射器、有限喷射注射少量暴露的pDNA用于半乳糖苷酶（LacZ）和绿色荧光蛋白靶基因范式，可以成功且安全地在各种临床前癌症模型中进行非病毒基因转染。对喷射注射的肿瘤进行定性和定量分析，揭示了有效的基因转录、增加的肿瘤内分散和深入的DNA渗透。基于这些有趣的临床前数据，进行了一项I期基因交换实验，使用喷射注射将微量的pDNA肿瘤内注射。通过定量和定性检查LacZ在mRNA和蛋白水平的表达，评估了基因转移的效率。这个实验的结果证明了这种方法在治疗局部可及的转移性实体瘤如黑色素瘤、乳腺肿瘤和其他类型的恶性肿瘤方面的有效性。对使用喷射注射器输送小干扰RNA的临床前研究也显示出额外的癌症基因治疗应用的潜力，包括DNA疫苗接种、免疫基因治疗和基因抑制技术。此外，体内喷射注射输送人TNF-α作为CD的自杀基因显著减少了肿瘤进展。 然而，液体喷射注射器也有一些缺点。它们需要精确的动力源控制，以准确可靠地向不同的皮肤类型或同一个人的皮肤的不同区域输送疫苗。喷射的高速冲击血管和神经，导致出血和不适，可能会降低患者的依从性。 2.1.6.2.固体剂量注射器 以固体形式交付的疫苗的稳定性，无论是药物还是变应原，都消除了对冷链储存的需求。这允许同时给予初始剂量和加强剂量，增强了患者的依从性。一种交付固体配方的方法是Powderject方法，它使用氦气驱动的设备将药物以超音速推进到皮肤的外层。药物颗粒由氦气微缸中的压缩气体加速，使它们在激活时能够穿透皮肤。使用时，设备直接应用于皮肤。Corgentech和辉瑞都在探索这项技术，分别用于开发局部麻醉剂和在金载体颗粒上交付DNA疫苗。另一种方法是滑块固体剂量注射器方法，其中手动操作器推动药物。操作器由一个小型固体杆组成，包含药物和辅料。当达到预定的弹簧力时，操作器自动启动并给予药物。推动动作至关重要，因为它确保了药物一致且受控地输送到皮肤的深层，无论皮肤类型或位置如何。这与Powderject方法不同，在Powderject方法中，建立一致且有效的治疗率可能是具有挑战性的。在需要给予多个剂量的情况下，操作器可以设计为可重复使用的设备，带有预装药物盒，以方便使用。 2.1.7.微针（MN） 微针（MN）由多个微结构投影组成，涂有药物或疫苗。它被应用于皮肤以将活性物质皮内输送，绕过角质层。与依赖扩散的经皮给药系统不同，MNs手动暂时性地破坏表皮，促进药物或疫苗进入其目标部位。由于它们的尺寸很小（直径1微米，长度1到100微米），MNs与普通针头不同。它们可以由各种材料制成，如金属、硅、二氧化硅、聚合物、玻璃等。MNs可以设计得足够短，以避免神经末梢，同时仍然到达角质层，减少不适、感染或受伤的风险。空心MNs、实心MNs、涂有药物的MNs和可溶解MNs是不同设计中的一部分。这些设计通过各种机制使药物的给药成为可能，允许研究治疗时间控制。实心MNs通常用于组织预处理，以增强治疗药物向选定组织的输送。在这里，微小针头的引入及其随后的移除在组织中创造了只有几纳米宽的孔，允许后来应用的氢凝胶或药物溶液到达更深的组织层。另一方面，MNs可能具有分层结构，下层输送治疗化学品，上层为穿透目标组织提供机械支持。通过这种方式，MNs应用后，不同的MN层将分解，允许治疗分子流入组织。基于癌症免疫的免疫接种旨在动员宿主的先天免疫来破坏肿瘤组织。这些方法通常侧重于将疫苗输送到皮肤，皮肤是身体最大的免疫器官，含有丰富的APCs，如巨噬细胞、朗格汉斯细胞和DCs。这些APCs可以激活T和B细胞，从而引发对肿瘤的更广泛的免疫反应。为了实现这一目标，研究人员正在研究含有免疫刺激佐剂和/或抗原的MN贴片的使用。Zaric等人通过结合甲基乙烯基醚和顺丁烯二酸酐MNs与OVA负载的PLGA NPs，展示了一种刺激免疫系统对抗表达OVA的B16黑色素瘤肿瘤的方法。作者在这一过程中使用了水包油双乳液技术来生成OVA负载的PLGA NPs用于MNs，然后将NPs添加到甲基乙烯基醚和顺丁烯二酸酐的溶液中（19×19阵列）。这些研究人员观察到MNs能够穿透小鼠皮肤并达到真皮层和附近的DCs在体外测试中。研究人员还观察到，转染的DCs能够迁移到近端LN，在那里它们可以激活CD8+ T细胞并诱导产生如IFN-γ等细胞因子。此外，这种由MNs释放NPs触发的免疫系统激活，导致表达OVA的B16黑色素瘤肿瘤生长延迟了13天。同样，Kim和同事开发了一种使用Pluronic F127和聚乙二醇（PEG）的MN贴片，以同时共输送resiquimod（R848）和TAs。人TLR7和TLR8作为R848的配体，表达在巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等免疫细胞上。R848与TLR7/8之间的相互作用导致IL-12、IFN-γ和TNF的产生，随后触发针对抗原的体液和Th1免疫反应。在这项研究中，使用表达OVA的淋巴瘤细胞允许同时给予OVA，将免疫反应集中在由E.G7-OVA组成的肿瘤异种移植物上。 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具被用来沉积Pluronic F127/R848和PEG/OVA的混合物，然后在室温下在真空中固化，之后被切割成一个包含49个金字塔形针头的微针（MN）阵列。发现这些微针可以穿透小鼠的皮肤并将有效载荷释放到附近的细胞中。作者还观察到溶解的微针形成了纳米胶束，可能有助于R848和OVA分布到RAW264.7细胞中，从而诱导巨噬细胞成熟和细胞因子释放。体内实验表明，装载R848和OVA的微针可以迁移到淋巴结并激活皮肤抗原呈递细胞（APCs）。 另一方面，微针可以被设计为基于抗体的免疫疗法，旨在克服或绕过肿瘤细胞发出的免疫抑制信号。Ye及其同事开发了一种由透明质酸（HA）组成的微针阵列，用于向B16F10黑色素瘤肿瘤递送1-MT和抗PD1抗体。通过特别针对T细胞表达的PD-1受体，抗PD1抗体可以逃避癌细胞的抑制信号，允许T细胞激活。 2.2.病毒和非病毒递送系统（非物理的） 2.2.1.病毒载体 2.2.1.1.病毒载体 病毒的遗传物质可以被改变以递送转基因到感染的细胞中，因为它们天生具有免疫原性。然而，使用病毒载体在临床试验中的有效性并没有产生与传染病研究相似的结果。重组病毒可以在免疫细胞中表达转基因，特别是抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DCs）。这导致肿瘤抗原（TAs）向细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的呈递增加，从而更频繁和强烈地攻击肿瘤细胞。抗原由疫苗载体表达。 病毒可以自然感染人类细胞并引发T细胞和体液反应，使它们适合作为疫苗递送方法。某些病毒可以被修改为特别针对肿瘤细胞或具有固有的溶瘤特性。溶瘤病毒疗法（OVT）被广泛用于癌症治疗，因为它可以选择性地裂解肿瘤细胞并诱导对病毒和肿瘤抗原的免疫反应，导致长期记忆T细胞的产生。溶瘤病毒不仅可以直接裂解细胞，还可以被基因修改为疫苗疗法的递送载体。腺病毒、单纯疱疹病毒、副粘病毒、弹状病毒、牛痘病毒和其他病毒株是递送机制的可行选择。 腺病毒已被广泛研究作为治疗乳腺癌的溶瘤病毒平台。这是因为与健康组织相比，乳腺癌细胞中E2F-1的表达更高。腺病毒基因组策略性地位于E2F-1启动子下游，允许通过整合免疫调节元素IL-15进行选择性病毒疗法。Yan等人通过创建一个整合E2F-1启动子和IL-15的重组腺病毒载体来证明这种复制选择性病毒疗法。由Zhu等人开发的另一种重组腺病毒，通过hTERT启动子控制腺病毒E1A基因，并通过缺氧响应元素（HRE）启动子控制腺病毒E1B基因。这种重组腺病毒还包括IL-24基因，它诱导肿瘤特异性凋亡并抑制肿瘤细胞生长。 逆转录病毒，特别是RNA病毒，可以被用作DNA递送载体来管理恶性肿瘤，当病毒蛋白gag、pol和env被移除时。重组逆转录病毒载体有能力表达肿瘤细胞特有的转基因。GDEPT（基因导向酶前药疗法）利用重组逆转录病毒将非活性药物转化为肿瘤细胞内特有的活性有毒代谢物。MetXia-P450逆转录病毒载体在减少MDA-MB-231乳腺癌异种移植模型中恶性组织的生长并对T47D乳腺癌细胞对环磷酰胺（CTX）敏感方面显示出有希望的结果。Rexin-G是一种单独的疫苗方案，用于治疗包括乳腺癌在内的各种实体癌。它基于重组复制无能逆转录病毒载体，并表达促进凋亡和抑制血管生成的合成人类cyclin G1转基因。 TLRs 3和9可以被细小病毒-H1利用以刺激人类免疫系统，这触发了一个NF-κB依赖的适应性免疫反应。从乳腺癌患者的肿瘤中分离出的原发性乳腺癌细胞比正常细胞对H1PV有更高的亲和力。重组HIPV也已被用于癌症免疫疗法。具有增加的炎症细胞因子（IFN-γ和TNF-α）转基因的基因修饰HIPV显示出治疗益处。 病毒载体-DC疫苗和病毒载体-CAR T是病毒介导疫苗递送的两种关键方法。用转基因技术靶向DC已被证明是引导免疫反应朝向耐受或免疫的有效策略。使用病毒载体遗传修饰DC的关键优势是通过这种方法实现的DC成熟度增强。在Chen等人的一项体外研究中，与Ad5一起传递ErbB-2/neu基因的DCs导致了对过度表达该基因的乳腺癌细胞系的治疗性和保护性免疫。 最近对癌症疗法的研究集中了很多注意力在使用CAR修饰的T细胞和溶瘤病毒一起针对和指导实体瘤。已经探索了将基于基因的疫苗或治疗性转基因递送到实体恶性肿瘤的肿瘤微环境（TME）的潜力。病毒载体与肿瘤特异性T淋巴细胞的相互作用被发现可以增强它们的效应能力。患有血液学恶性肿瘤的患者从CAR修饰的T细胞中显示出显著的好处。根据Bajgain等人的发现，共表达倒置的细胞因子受体（4/7ICR），它连接IL4受体外域和IL7受体内域，通过转化抑制性IL4信号，增强了CAR T细胞在体内乳腺癌模型中的抗癌活性。 2.2.1.2.细菌载体 Busch和Fehleisen首次建立了癌症和细菌（化脓性链球菌）之间的联系。他们发现在癌症患者中由该生物引起的丹毒感染抑制了肿瘤生长。在19世纪，William Coley利用减毒的粘质沙雷菌和化脓性链球菌组合来治疗骨骼和软组织肉瘤。这种混合物被命名为Coley毒素。这一发现激励研究人员专注于寻找和利用细菌菌株或其产品来治疗不同的癌症。实际上，某些细菌成分，包括外毒素，已被发现能直接启动对肿瘤细胞的抗癌作用，而不是间接效果。使用细菌作为具有治疗价值的转基因递送系统提供了许多好处。在恶性细胞的厌氧条件下，像梭菌这样的特定细菌种类非常活跃和移动性强。由于它们能够到达难以接触的肿瘤区域，以及肿瘤细胞的高代谢活性使它们对化疗产生抗药性，细菌被认为是递送抗癌药物或基于基因的疫苗以治疗恶性肿瘤的潜在选择。 用于乳腺癌疫苗的最常见细菌种类包括鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、新威氏梭菌、丁酸梭菌、长双歧杆菌、青春期双歧杆菌和大肠杆菌。鼠伤寒沙门氏菌和梭菌据报道被用作溶瘤载体。在引入抑制的S. Typhimurium和长双歧杆菌以及合成TRAIL等分子的载体后，显著减缓了肿瘤的生长，显示出宿主基因组中凋亡基因（自杀基因）的转录增加。通过破坏细胞周期并触发细胞死亡，通过产生p53和Bax，由铜绿假单胞菌产生的阿祖林蛋白破坏恶性细胞并阻止乳腺癌和黑色素瘤的生长。为了测试细胞因子LIGHT（也称为TNFSF14或HVEM-L）在Balb/c小鼠D2F2乳腺癌模型中的有效性，Loeffler等人创建了一个嵌合的S. Typhimurium VNP20009菌株。S. typhimurium RE88与表达Fra-1和IL-18的DNA疫苗联合使用，预防了乳腺癌的生长和转移，这激活了免疫细胞（T细胞、自然杀伤（NK）细胞和DC）并阻断了血管生成。通过口服给予转基因S. typhimurium SL3261和人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF），体内减缓了4 T1乳腺癌的进展。经过减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株通常被用作人类和兽医学中的活载体。已经证明人类对用于疫苗管理的减毒沙门氏菌（S. typhimurium和S. typhi）反应良好。革兰氏阳性细菌单核细胞增生李斯特菌可以利用溶血素、李斯特菌溶素O和磷脂酶等形成孔的酶从吞噬体中逃逸并进入细胞胞质。这为疫苗递送提供了一个多功能的载体，并实现了更有效的基因转移。许多研究表明L. monocytogenes作为癌症治疗递送系统的效力。在Wood等人的一项研究中，使用针对CD105（Lm-LLOCD105A和Lm-LLOCD105B）的基于李斯特菌的疫苗治疗了乳腺癌小鼠模型。PROSTVAC疫苗，也称为PSA-TRICOM，包括重组禽痘-PSA-TRICOM增强剂和重组牛痘-PSA-TRICOM（前列腺特异性抗原加上三个共刺激分子的TRIad）的初始注射。在II期临床试验中，患有转移性、激素难治性前列腺癌的个体接受了PSA-TRICOM。 2.2.1.3.类病毒颗粒（VLPs） 被称为VLPs的高度结构化的、极其重复的结构，由病毒衣壳蛋白包装而成。这种衣壳蛋白的高密度提供了许多构象病毒表位，可以诱导强大的免疫反应。重要的是，VLPs是由病毒衣壳蛋白自行组装而成，没有任何病毒致病核酸。由于它们无法复制，它们提供了一种相对于通常用于免疫的减毒病毒的潜在更安全的选择。第一个基于VLP的疫苗针对乙型肝炎病毒（HBV）。在20世纪60年代末，Baruch Blumberg博士偶然发现了急性和慢性乙型肝炎患者血清中的独特澳大利亚抗原。他还提供了VLP生产的初步具体证据。在随后的年份中，电子显微镜被用来研究病毒形态，在20世纪80年代初，使用酵母表达系统首次组装了HBV VLPs。 伽马疱疹病毒EBV是人类发现的第一种致癌病毒，它攻击上皮细胞和B细胞。EBV与多种恶性肿瘤有关，包括淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌，这些疾病可能发生在免疫功能正常和免疫功能低下的个体中。EBV也是单核细胞增多症的主要原因。为了开发另一种EBV疫苗模型，将EBV的gp350/220与新疾病病毒的融合F蛋白融合，使得gp350/220外域以VLP颗粒形式呈现。利用中国仓鼠卵巢细胞生产EBV-VLPs，并对BALB/c小鼠进行免疫。这导致了持久且针对性的抗体反应，即使不使用佐剂，也能在体外抑制EBV感染。为了创造一种多价疫苗，将对EBV入侵至关重要的糖蛋白gH/gL或GB、EBV核抗原1和表达在所有EBV感染细胞表面的潜伏膜蛋白2（LMP2）也纳入VLPs中。gH/gL-EBNA1和GB-LMP2 VLPs成功地在CHO细胞中生产，无需使用佐剂，并证明了它们在BALB/c小鼠中诱导高中和抗体滴度或EBV特异性T细胞反应。因此，这些EBV-VLPs可以作为治疗EBV相关恶性肿瘤的有效治疗性疫苗，以及预防EBV感染的预防性疫苗。表1.1显示了一些作为CV递送剂的VLPs的例子。 2.2.1.4.病毒体 这些极小的圆形单层脂质膜囊泡（150纳米）缺乏通常包含原始病毒遗传物质的核衣壳。然而，它们装满了病毒膜蛋白，如流感病毒中的血凝素和神经氨酸酶。这些蛋白使病毒体膜能够通过与免疫系统细胞融合，直接将其内容物——特定抗原——传递给靶细胞。这一过程即使在免疫原性较弱的病原体存在的情况下也能触发特定的免疫反应。一旦抗原被传递，细胞内的病毒体被完全消除。与其他脂质体和蛋白脂质体载体系统不同，病毒体的免疫学特性受到夹在磷脂双层之间的病毒蛋白的强烈影响。这种插层不仅为病毒体配方提供了结构稳定性和均匀性，而且还决定了抗原的表位是否位于病毒体表面（PeviPROTM）或内部，从而影响病毒体配方诱导的免疫反应类型（PeviTERTM）。使用PeviPROTM会触发免疫学体液反应，导致由于细胞内体中抗原的分解而呈现MHC II抗原。除了在体内引起CD4+和CD8+阳性反应外，PeviTERTM产生的抗原还可以产生强烈的CTL反应。病毒体封装确保通过MHC I途径正确呈现抗原，因为抗原自然地被送入抗原呈递细胞的细胞质中。 2.2.2.非病毒载体 2.2.2.1.阳离子和可生物降解聚合物 最近，制药研究和工业利用阳离子和其他碳水化合物聚合物的能力来调节药物、蛋白质、抗生素、肽、DNA或疫苗的分布。近年来开发了多种系统，如聚赖氨酸及其共轭物、壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）、脂多胺、二乙基氨基乙基-右旋糖酐（DEAE-右旋糖酐）、聚酰胺胺（PAMAM）树状聚合物、右旋糖酐过氧物酶多阳离子和右旋糖酐过氧物酶多阳离子。包括树状聚合物（高度分支的PAMAM）和壳聚糖（一种可生物降解的线性氨基多糖）在内的许多阳离子聚合物，已被检查其基因转移能力。此外，壳聚糖可以通过静电相互作用与带负电的DNA（多聚体）形成复合物。最近，使用基于渗透的方法生产了壳聚糖和壳聚糖/DNA纳米球。PEI和聚（L-赖氨酸）（PLL）作为基因治疗的聚合物进行了广泛研究。由于它们的性质，可以在PEI聚合物的表面附加靶向配体和/或PEG，为基因载体提供立体稳定性。当聚乙二醇化PEI多聚体与肿瘤特异性配体共轭并静脉给药时，转染效率比聚乙二醇化（无转铁蛋白）PEI多聚体提高了五倍。研究人员研究了阳离子多聚电解质对体外恶性细胞和植入艾氏肉瘤或引起腹水的小鼠白血病（L5178Y）的影响。在肿瘤移植后5天，高分子量PEI、聚乙烯胺和PPI在中性pH下给药，导致实体艾氏肉瘤小鼠的肿瘤生长减少了10%到40%。唯一能延长由白血病细胞引起的腹水小鼠寿命的物质是PPI。因此，阳离子聚合物可能通过直接与肿瘤细胞静电相互作用并诱导宿主的一般免疫反应而有用。2013年，一种溶瘤腺病毒（Ad-DB7-U6shIL8）（oAd/PNLG）被涂覆了聚合物N-（2-氨基乙基）-2-氨基乙基甲氧基聚（乙二醇）-b-聚-N-L-谷氨酸（PNLG）聚合物。2014年，另一种阳离子聚合物被创造出来，这次特别设计了精氨酸部分以促进低水平和高水平的CAR表达。mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-gPEI-mPEG（PPSA）具有生物可还原的二硫键以减少细胞毒性，并具有几个精氨酸功能部分以增加转基因表达。溶瘤腺病毒（DWP418）在与PPSA复合后（DWP418/PPSA），被瘤内注射到CAR阴性MCF7异种移植小鼠中。结果表明，与裸露的DWP418相比，DWP418/PPSA提供了更强的抗肿瘤效果。 2.2.2.2.微粒（MPs）作为疫苗递送载体 作为疫苗递送工具，微尺度颗粒或胶囊相较于可溶性抗原具有优势。通过使用MPs，它们还可以提供持续的抗原释放、延长的抗原呈递，以及将抗原和佐剂同时传递给同一APC，大量抗原可以被传递给APCs。佐剂和抗原可以被共同封装在单个颗粒中、分开放置，或集体附着在其表面。能够增强和延长免疫反应的疫苗分布的最佳尺寸范围仍然不明确，如引用研究的发现所示。文献中包含许多使用各种可生物降解颗粒配方作为CVs的临床前研究。这些用于CVs的颗粒已使用众所周知的基于聚(α-羟基酸)的聚合物制成，如聚乳酸(PLA)和PLGA，以及更多实验性的聚合物，如聚酸酐。来自聚酸酐的MPs被报道具有固有的免疫佐剂属性。这类聚酸酐的例子包括2,6-二氧杂辛烷和1,8-双(p-羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷(p-羧基苯氧基)己烷。合成佐剂CpG和OVA使用双乳液溶剂蒸发技术共载于聚酸酐颗粒（直径1-3微米）。这些MPs提供了额外的预防性保护，以对抗表达OVA的肿瘤威胁，证据是与用可溶性OVA和CpG免疫的小鼠相比，肿瘤生长更慢，小鼠死亡率得到改善。接受这些MPs免疫的小鼠也显示出比用可溶性OVA和CpG免疫的小鼠更高水平的OVA特异性CD8+ T细胞。在肿瘤裂解物的背景下，CpG在另一种基于颗粒的疫苗配方中显示出有益效果。通过反复冷冻和解冻肿瘤细胞（无论是自体还是异体）得到的粗TA制剂，可以作为可溶性疫苗使用，或封装在颗粒中。目前正在研究利用肿瘤裂解物的潜在癌症疫苗。根据De Temmerman等人的研究，小鼠被腹腔注射含有肿瘤裂解物（来自B16.F1黑色素瘤）和CpG的PLGA（75:25）MPs。结果，脾脏中的T细胞数量显著增加。研究表明，腹腔中的树突状细胞（DCs）吞噬了MPs并将它们运输到脾脏，在那里它们触发了TH1免疫反应，证据是分离的脾细胞中IFN-γ产量增加。正在探索以碳酸钙或二氧化硅为基础的无机MPs作为疫苗载体。人类EGFR 2抗原已被装载到直径1微米、高400纳米的多孔硅MPs上。用抗原装载的硅MPs免疫刺激了肿瘤特异性CTL反应的发展，CD11c+ DCs的广泛浸润，以及肿瘤内I型IFN和MHC II表达的增加。此外，多孔二氧化硅MP载体（MSV）能够同时给同一DCs施用源自B16的抗原酪氨酸相关蛋白（TRP）2和TLR激动剂如CpG或MPLA。基于二氧化硅MPs的免疫可能通过协调有效的宿主免疫反应显著增加荷瘤小鼠的中位生存期。无机CaCO3 MPs也已开发用于封装肿瘤裂解物，目的是用于个体化抗癌疫苗。由于APCs吸收TLR激动剂的速率更高，TLR配体吸附和抗原封装的CaCO3 MPs在激活APCs和增强CV效果方面优于TLR激动剂和抗原的可溶性混合物。 2.2.2.3.纳米颗粒作为疫苗递送系统 利用纳米颗粒（NP）系统作为疫苗载体有潜力通过增加抗原递送到特定免疫细胞的效率来增强免疫细胞的免疫反应。目前，口服纳米颗粒系统用于疫苗被认为是最有希望的方法。事实上，控制时间释放剖面对于免疫刺激可能不像在更高剂量下产生药理反应那样关键。通过化学修饰，疫苗抗原可以被压缩在NPs内部或共轭在NPs表面。使用NPs递送的抗原已被证明比其他方法更有效，这可能导致快速抗原解体或减弱的免疫反应。表1.2列出了一些用于癌症递送的NPs。此外，除了抗原的定向释放外，某些复合NPs还实现了抗原的持续释放，以增强免疫系统的暴露。此外，几种NPs RNA干扰治疗目前正在进行人类临床研究，以评估其有效性和安全性。图1.3展示了用于心血管（CV）递送的不同NPs。 图1.3 用于癌症疫苗递送的不同纳米颗粒。 1.聚合物纳米粒子：壳聚糖、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）、HT，以及其他合成和天然聚合物，如PEI、PLA、聚丙烯硫化物、丙烯酸基聚合物和PLGA等被包含在内。包括PLGA、PEI和壳聚糖在内的聚合物的使用在临床前和临床试验中显示出巨大潜力。与聚-L-赖氨酸和PEI相比，壳聚糖显示出更低的毒性。PLGA/PLA颗粒作为肿瘤疫苗和免疫疗法的主要优势在于它们能够作为一种无毒的治疗载体，同时递送抗原和佐剂，并且可以分散在长时间内。壳聚糖纳米粒子展示了肿瘤细胞选择性。越来越多的研究集中在修饰壳聚糖以增强壳聚糖纳米粒子的选择性和生物利用度。修饰后的壳聚糖纳米粒子表现出靶向精准、pH敏感性和热敏感性等特点。体外抗肿瘤测试表明，500 mg/L浓度的壳聚糖纳米粒子抑制了宫颈癌Hela细胞27%，肝癌SMMC-7721细胞23%，胃癌BGC-823细胞29%，乳腺癌MCF-7细胞55%。当树突状细胞（DCs）暴露于可溶性抗原、PLGA修饰颗粒或含有抗原的PLGA纳米粒子时，Shen等人研究了抗原吸收和CD8+ T细胞激活。Reddy等人开发了通过激活补体级联反应和产生原位危险信号来激活DCs的普朗尼克稳定的聚丙烯硫化物纳米粒子。刘等人描述了基于纳米粒子的多佐剂全细胞肿瘤疫苗用于癌症治疗。他们还使用PLGA纳米粒子作为全细胞肿瘤疫苗的递送系统，并证明了有效抑制肿瘤生长。为了应对这些挑战，目前正在探索聚合物纳米粒子包裹的姜黄素，或纳米姜黄素。在小鼠模型中，静脉注射携带TAA肽（TRP-2）和TLR-4配体（7-酰基脂质A）的PLGA颗粒显示出用两剂抑制肿瘤生长的效果。Bourquin和同事扩展了他们早期的研究，利用装载CpG的阳离子明胶纳米粒子。他们证明了用OVA和这些纳米粒子免疫的小鼠能够产生专门和保护性的抗肿瘤免疫反应。纳米乳液疫苗被用来递送肿瘤特异性抗原，结果在小鼠中引发了强烈的肿瘤靶向抗体和CTL反应。这最终提供了对肿瘤生长的保护。魏和同事开发了靶向黑色素瘤的纳米乳液疫苗，包裹TAAs，MAGE-1和/或MAGE-3。此外，他们的配方包括SEA和HSP70，这被认为可以增强肿瘤特异性免疫的发展。史等人创建了一种免疫刺激疫苗以预防胃癌，递送CpG和MG7抗原。在最近的一项研究中，小鼠被接种了装载TAA EphA2的γ-PGA纳米粒子，以评估诱导对EphA2表达肿瘤细胞的保护水平。用EphA2-PGA纳米粒子免疫的小鼠显示出增加的EphA2特异性CD8+ T淋巴细胞刺激，目标细胞分解和减少的整体肝脏生长，作为肿瘤保护的指标。 2.无机纳米粒子：尽管无机材料的生物可降解性差，但基于无机材料的疫苗已经得到了广泛的研究。无机颗粒被用作佐剂和抗原递送载体以增强免疫反应。疫苗中使用的四种最常见的无机颗粒类型是铝、Ca3(PO4)2、二氧化硅和金。 研究表明，铝颗粒既可以作为载体也可以作为佐剂来刺激免疫系统，尽管它们可以安全地与抗原结合并改变它们的结构，从而降低疫苗的有效性。李等人使用OVA和炭疽保护抗原蛋白作为模型抗原，开发了表现出增强抗原-抗体反应的氢氧化铝纳米粒子。磷酸钙颗粒由于其生物可吸收性、无毒性、佐剂特性和易于抗原装载，成为疫苗应用的有吸引力的选择。胶体金，由金纳米粒子（AuNPs）组成的溶液，已被用作免疫诊断标记和癌症治疗的治疗剂。作为一种有效的癌症疫苗（CVs）递送方法，Ojeda和同事开发了一种具有自组装单层碳水化合物抗原的AuNP系统，称为糖纳米粒子。根据Lee等人的说法，基于AuNP的CVs可以通过激活树突状细胞（DCs）上的Toll样受体9（TLR-9）来增强免疫反应。Kang等人研究了携带OVA的AuNPs对OVA运输到淋巴结（LNs）和激活CD8+ T细胞反应的影响。阴离子poly I:C和阳离子抗原肽自组装在金纳米粒子模板（iPEM-AuNPs）上，形成了一个无需溶剂或额外结构组件的免疫增强纳米系统，显著增加了抗原特异性CD8+ T细胞的数量。 基于硅的颗粒是疫苗开发中常用的一种无机颗粒，由于其生物相容性和在尺寸和形状方面的多功能性而受到青睐。已经证明，介孔硅颗粒在体内有效地作为持久的抗原载体。Kim等人使用OVA模型抗原和CSF佐剂开发了介孔硅棒作为控制的疫苗递送系统。介孔硅纳米粒子已被研究用于它们与各种细胞系的体外相互作用，包括HeLa细胞、3T3内皮细胞、人类间充质干细胞和人类结肠癌细胞。Myungi和同事在小鼠肿瘤模型中记录了使用硅纳米粒子作为疫苗递送技术增强抗原特异性B细胞和T细胞反应的生成，从而诱导保护性抗癌免疫。 3.磁性纳米粒子：Hai-Yan Xie、Wei及其团队报告了一种磁性癌症纳米疫苗，在磁场的影响下显示出显著改善的淋巴结保留，导致对癌的疫苗效果增强。当施加磁场时，淋巴结中的CD8+ DCs显示出对装饰有抗CD205的磁体素的摄取显著增加。 4.树状分子：这些是通常形成球形大分子的合成聚合物，并且具有由重复分支的链组成的结构。这些树状分子由三个不同的结构域组成：末端基团、重复分支单元和一个提供可变表面功能的中心核心。在各种树状分子类别中，基于PPI的树状分子和PAMAM被广泛使用，并引起了显著关注。Chahal等人通过用2-十三烷氧基环氧乙烷处理PAMAM G1树状分子，开发了新型烷基化树状分子，从而生产出包含脂锚定PEG和mRNA的纳米粒子。这项技术促进了特异性识别抗原的抗体和CTLs的产生。通过利用树状分子，将G250肾癌细胞特异性抗原与GM-CSF嵌合分子融合，创建了一种特别有效的疫苗，引发针对肾癌的特异性免疫反应。 2.2.2.4.脂质体和脂质纳米颗粒（LNP） 构成球形纳米囊泡的磷脂双层被称为脂质体。磷脂的头部是亲水的，而尾部是疏水的，使它们能够在水环境中自组装形成脂质体。基于脂质的技术，如脂质体，通常用于人类临床试验，特别是在癌症基因治疗中。通过调整脂质体的脂质组成、电荷、大小和表面特性，可以创建一个多功能的NP疫苗递送系统，提供一系列理想属性。脂质体已被用于运输RNA、DNA和抗原，增强对癌症疫苗目标抗原的免疫反应。脂质体纳米药物在癌症治疗、疫苗开发和胆固醇管理等领域的先进疗法中具有巨大潜力。 在1998年，Longenecker的研究团队描述了一种24-mer人类糖蛋白1（MUC1）肽脂质体疫苗。这种疫苗使用MPLA作为佐剂，比KLH偶联疫苗在小鼠中引起了更强的Th1反应并提供了保护。此外，HER-2/neu63-71与CpG的脂质体共包载导致显著的CD8+ T细胞反应和现有肿瘤的消退。与PLGA纳米粒、ISA-51和乳液相比，脂质体在诱导功能性抗原特异性T细胞方面更为有效，这一点由另一项研究所证实。Stimuvax，也称为BLP25脂质体疫苗或L-BLP25，是由Oncothyreon与默克公司合作开发的癌症疫苗。它针对MUC1的外源性核心肽以刺激免疫系统。MUC1是一种在包括前列腺、乳腺、肺和结直肠肿瘤在内的各种肿瘤中广泛表达的I型膜糖蛋白。VacciMax（VM）是另一种用于癌症肽疫苗的脂质体技术。包含MPLA和QS-21的AS01脂质体配方能够产生CD8+ CTL和抗原特异性抗体反应。将短MUC1表位、Th表位和激活TLR2的合成三酰化脂肽（Pam3CSK4）结合的三部分疫苗可以整合到脂质体中，在小鼠中产生高IgG抗体滴度，甚至无需外部佐剂。早期针对肺癌、肝癌、结肠癌和直肠癌的试验表明，含有muramyl二肽衍生物（ImmTher®）的传统脂质体增强了巨噬细胞对Ewing肉瘤的细胞破坏作用。开发了一种非紫外线活性的仙台病毒脂质体和复制蛋白抗原的组合。这些脂质体使得仙台融合蛋白能够添加到各种类型的哺乳动物细胞中，促进直接进入细胞质。与这些疫苗相比，传统脂质体的临床测试显示癌症风险较低。赵等人使用蛋白质抗原载体在小鼠模型的恶性肿瘤中增强免疫识别，使用DNA脂质体-多阳离子复合物。由于其高效率，最近作为疫苗佐剂在实验测试中被研究，用于传递与宫颈癌相关的抗生素蛋白HPV16 E7。为了创建pH敏感的融合性二油酰磷脂酰乙醇胺/蛋黄磷脂脂质体，Eiji Yuba及其同事使用了两种pH敏感的不同类型的聚（甘油醇）衍生物，它们具有线性（MGlu-LPG）结构或超支化（MGluHPG）结构。LNPs，与脂质体类似，是生物相容性和生物可降解药物管理的关键平台。徐等人开发了具有不均匀脂质双层和钙磷酸核心的钙磷酸脂质纳米粒，用作TRP2肽疫苗递送方法以治疗皮肤癌。脂质-钙磷酸疫苗刺激了与游离TRP2肽/CpG相比更强的抗原特异性CTL反应，导致在肺癌模型和B16F10 S.C.中肿瘤生长的更大减少。 2.2.2.5.免疫刺激复合物（ISCOM） 被称为免疫刺激复合物（ISCOM®）疫苗的颗粒状抗原递送载体由磷脂、胆固醇、免疫原和皂苷组成。在这项研究中，我们展示了利用ISCOM®技术开发具有抗癌特性疫苗的优势。通过使用动物模型和模型癌症抗原，观察到ISCOM®疫苗可以独立于CD4+ T细胞刺激CD8 T细胞反应，在三种不同的肿瘤模型中提供保护，并增强Th1偏向的免疫。此外，发现将疫苗抗原与ISCOM®结构耦合显著改善了免疫反应的前三个阶段。值得注意的是，ISCOM®疫苗激活的CD8 T细胞不受体内针对疫苗抗原的抗体存在的影响。虽然免疫接种已被证明对表达疫苗抗原的肿瘤有效，但对表达疫苗抗原阴性的邻近肿瘤细胞没有观察到活性。这表明，通过决定因素传递或旁观者激活并没有实现显著的抗癌作用。作为尚未经过大量人类测试的第三代抗肿瘤疫苗的一部分，正在开发各种合成的非活性佐剂和递送策略。这些包括ISCOM®疫苗、VLPs、脂质体、MF59和热休克蛋白（HREs）。另一类免疫刺激佐剂由植物提取物组成，而不是与细菌或病毒病原体相关的化学物质。南美洲的Quillaja saponaria树皮产生皂苷，它们是水溶性和结构多样的化合物，具有强大的促炎症活性。用于疫苗开发的最常用的RP-HPLC分数的Quillaja saponaria提取物是QS21。被假定为佐剂活性部位的三萜醛类，已在临床前研究中发现可诱导强烈的混合T辅助1（Th1）、体液和CD8 T细胞反应。ASC/NALP3炎症体途径将前IL1和前IL-18转化为它们的生物活性形式，QS21已被证明在很大程度上激活了这些。这证明了它与TLR4配体的组合，以触发前体的上游表达。然而，大量QS21可以引起细胞膜溶解和抗原呈递细胞（APCs）的死亡，表明由此产生的免疫反应的强度和意义与炎症体激活的程度没有直接关系。QS21在癌症免疫治疗疫苗配方中经过了广泛的测试，使用了神经节苷脂抗原（GD2、GD3或GM2）。尽管经常有强烈的体液反应，但没有个体细胞介导免疫的明确证据。QS21和MPLA在佐剂配方AS01和AS15中结合，类似于MAGE-A3癌症疫苗（GSK）。 2.2.2.6.肽和蛋白质偶联递送系统 与其他方法相比，肽疫苗具有几个优点。首先，自从1984年Merrifield因发明固相肽合成而获得诺贝尔奖以来，肽的制造和纯化过程不断发展并实现了自动化。因此，许多合同制造公司现在为研究和治疗目的提供高质量的合成肽，这些肽有详尽的描述且价格合理。与整个蛋白质或其他类型的抗原相比，肽更容易合成和放大。它们的合成简单直接，允许创建针对特定抗原靶标的肽疫苗。这消除了对蛋白质正确折叠或目标抗原位置的担忧，无论是表面结合还是细胞内。另一方面，CAR T细胞疗法需要关注表面抗原。其次，肽代表了癌症表位的最简单和最基本的生物学组成部分。通过使用肽疫苗，可以开发具有明确作用机制的疫苗策略。免疫反应可以精确针对所需的表位。相比之下，确定如肿瘤裂解物等疫苗的内容（包含一系列抗原、其他蛋白质和额外的肿瘤组分）可能具有挑战性甚至不可能。然而，肽疫苗的适度免疫原性可能是它们最大的缺点。肽通常与递送机制和/或佐剂结合使用，因为它们本身通常不足以引发足够的免疫反应。尽管这些系统正在进行研究，但仍需要改进。破伤风类毒素是另一种在肽偶联疫苗（CVs）开发中使用的载体蛋白。Kunz的研究团队描述了一种由破伤风类毒素和源自MUC1的肽组成的合成疫苗。这种疫苗显著增加了小鼠中抗原特异性免疫反应的水平。随后，研究人员将MUC1糖蛋白与Thomsen-Friedenreich抗原和破伤风类毒素的二氟衍生物结合起来，产生能够结合到MCF-7乳腺癌细胞系的MUC1特异性抗体。根据Tsuruma等人的说法，一项针对晚期或复发性结直肠癌患者的survivin衍生肽疫苗的I期临床试验。然而，这种仅含有源自survivin的肽的疫苗并没有显示出任何明显的临床效果。根据Jaeger等人的研究，肿瘤疫苗使用了酪氨酸酶、与黑素瘤相关的Melan A/MART-1肽、gp100/Pme117和流感病毒矩阵肽。自组装肽递送系统中的肽序列或修饰可以诱导超分子组装。例如，可以设计两亲性肽形成胶束、纳米颗粒、类似蠕虫的胶束、纤维状结构或水凝胶网络。刘等人开发了使用来自黑色素瘤的TRP2或来自HPV-16的E7肽的两亲性肽疫苗。这些疫苗与佐剂CpG结合时，有效地抑制了黑色素瘤肿瘤的进展，并分别诱导了大型TC-1肿瘤的持续消退。与它们的母体化合物相比，这些疫苗对身体的危害较小，并显示出增强的抗肿瘤效果。朱等人利用内源性白蛋白和自组装外源疫苗组分（CpG和SIINFEKL）生成了白蛋白/疫苗纳米复合物。这些纳米复合物显著增强了CpG和抗原在淋巴结中的积累。在他们的研究中，王等人得出结论，白蛋白提高了酸性细胞内隔室中抗原的稳定性，并促进了抗原呈递细胞（APCs）的内化。此外，白蛋白促进了抗原在引流淋巴结中的积累。 3.挑战与发展 尽管取得了许多进展和显著的临床结果，但仍有几个挑战需要解决。这些包括低抗肿瘤效果、昂贵的程序和不良反应。控制载体（CVs）必须具备安全、高效和成本效益的品质。纳米颗粒（NPs）由于其增强的免疫原性、能够靶向树突状细胞（DCs）、安全性、改善的抗原吸收和增加的生物利用度，显著有助于实现这些目标。各种物理和化学特性，如大小、靶向配体、颗粒刚度、zeta电位和内在免疫原性，已被证明对抗原呈递、细胞吸收机制、抗原分布以及免疫反应的类型和强度有显著影响。考虑这些因素对于最大化抗肿瘤反应至关重要。 然而，肿瘤生长涉及宿主免疫系统诱导抗肿瘤反应与免疫系统抑制性微环境之间的微妙平衡。CVs和减少癌症微环境（CME）的治疗方法可以结合使用，以增强免疫治疗效果。在这方面已经进行了临床前和临床研究。治疗选项包括适度的激酶抑制剂、抗体或RNA干扰，这些可以调节抑制性免疫环境，以及添加化疗药物如多柔比星、顺铂和多西他赛。 在本章中，我们描述了各种基于聚合物的系统，旨在增强前面提到的癌症免疫疗法的整体效果。这些系统可以通过使用合适的聚合物来解决上述免疫疗法的限制，进一步改善治疗效果、生物相容性和特异性。聚合物系统为结合免疫配体和装载免疫治疗药物提供了独特的递送策略，具有低毒性、高生物可降解性和可定制的表面及尺寸等优势。值得注意的是，聚合物系统可以保护生物活性分子免受不良免疫反应的影响，或促进有利于身体条件的免疫反应。然而，在这些基于聚合物系统的免疫递送方法在临床设置中实施之前，仍有挑战需要克服，包括治疗效果低、免疫疗法抗性、患者安全问题和高昂的治疗成本。因此，需要进一步的研究来增强当前的分布策略。此外，需要更多的研究来探索纳米医学的治疗潜力，考虑到它们的生物相容性以及不同聚合物系统对各种身体部位的影响。 此外，未来基于聚合物纳米粒子的免疫疗法类别应该是异常多功能的，具备目标定位、智能响应性和便于应用的能力。未来的研究趋势将主要集中在并特别看好利用聚合物纳米粒子的个性化免疫疗法。 基于肽的癌症疫苗可以安全、经济、有效地生产。它们已显示出在针对肿瘤特异性和肿瘤相关抗原方面的潜在效果。肽因其能够被用于多重技术中，针对多个表位并传达产生抗原特异性T细胞所需的最小生化信号而特别吸引人。解决低效力问题是肽药物载体可以解决的主要问题之一，以增强免疫反应刺激。大多数关于先进肽递送系统的临床前研究已经采用了一组经过良好表征的肽表位和癌细胞模型。 在临床和临床前研究中，努力标准化肽剂量可能有助于促进直接比较。 可以合成展示增强TCR结合和MHC结合的新肽变体。利用肽混合物可以引发多个CD8+ T细胞反应以及CD4+反应，从而增强T细胞免疫。在MHC限制方面，可以想象识别更大的肽序列或肽池，以适应更广泛的MHC反应性，可能使更多的患者群体受益。 在不久的将来，我们预计癌症肽疫苗的某些模式将持续存在。通过检查点阻断技术和新抗原靶向的进步，可以促进新型肽疫苗递送系统的发展。目前，有几项I/II期临床试验正在进行中，研究肽疫苗与检查点阻断抑制剂联合使用的情况。 疫苗递送系统的进步导致了NPs、自组装肽和无针递送方法的发展。在我们的I期临床试验中，SCIB1是使用EP给药的，以前的癌症和传染病疫苗也是如此。这些更近期的递送技术提供了优越的替代方案，尽管它们的实施受到EP给药不适和需要特定疫苗给药系统的限制。 由于其灵活性、高安全档案以及能够储存微小药物分子或RNA或肽抗原的能力，脂质体被用作递送载体。优化脂质体是必要的，以实现正确的电荷和粒径，以便有效地整合为载体并穿过细胞膜。可以通过各种方法针对癌症抗原，例如向佐剂中添加肽、将抗原封装在NPs中或修改遗传载体以增强局部免疫反应并增加流向LN的交通。 另一个关键的技术挑战是抗原疫苗递送的纳米载体的大规模生产。目前，大多数纳米载体在实验室中以小批量生产，然后扩大到更大的工业产能。鉴于扩大规模过程的高成本，必须密切评估直接影响治疗效果的规模依赖变量。此外，仔细评估扩大规模过程的经济可行性，以防止任何质量危机。 除了配方挑战外，重大的监管障碍阻碍了遗传疫苗在癌症治疗中的使用。要获得监管批准，解决与用于生成用于管理遗传疫苗的纳米系统的辅料相关的主要配方问题及其毒性概况至关重要。 4.结论 基因治疗的主要目标是开发高效且安全的基因载体，能够将外源性基因组分送入特定细胞类型，特别是肿瘤组织。开发和评估向癌细胞传递治疗基因的载体包括病毒和非病毒方法。各种病毒，如逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒，已被修改以消除毒性，同时保持它们强大的基因转移能力。由于与病毒载体相关的局限性，非病毒载体作为一种替代品受到了关注。可生物降解的阳离子聚合物如PEI、PLL、MPs、NPs、肽和脂质体是非病毒载体的例子。 为了提高转染效率，已经开发了几种创新的运输技术和对现有递送系统的改进。疫苗接种的给药方法也可以影响疫苗与注射部位不同抗原呈递细胞之间的相互作用，从而影响免疫系统反应的发展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现，为儿童和成人患者中复发/难治性血液系统恶性肿瘤的长期清除带来了前所未有的成果。然而，与CAR-T细胞相关的严重毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性，影响了治疗的实用性；并且对实体瘤的治疗效果仍然不够令人印象深刻。因此，出现了修改其他免疫细胞类型的工程策略，特别是自然杀伤（NK）细胞。由于CAR依赖性和CAR非依赖性（先天免疫介导的）抗肿瘤杀伤能力、主要组织相容性复合体非依赖性细胞毒性、降低异体反应风险以及缺乏主要CAR-T细胞毒性，CAR NK细胞构成了有前景的下一代CAR免疫细胞，并且也适用于“现成的”治疗。在这篇综述中，我们比较了CAR-T和CAR NK细胞疗法，特别关注免疫突触、工程策略和挑战。 引言 CAR T细胞疗法基于用重组抗原特异性CAR分子对T细胞进行工程改造，赋予CAR T细胞目标特异性细胞毒性，独立于T细胞抗原受体（TCR）。与传统的细胞毒性T细胞功能不同，后者受TCR复合物在T细胞上与目标细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合和识别的限制，CAR介导的CAR T细胞的细胞毒性是非MHC限制性的。CAR T细胞在患有复发/难治性血液系统恶性肿瘤的患者中实现了持久的缓解。然而，严重的毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以及对实体瘤的有限疗效，促使人们改造具有细胞毒性潜力的替代免疫细胞，如NK细胞。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）批准的所有CAR T细胞疗法都依赖于患者衍生的和工程改造的CAR T细胞的自体转移以避免移植物抗宿主病（GvHD），但FDA也批准了基因改造的同种异体CAR T细胞的临床试验。目前正在研究低免疫原性同种异体CAR T细胞的开发，以实现健康捐赠者的同种异体CAR T细胞的大规模工程和输血。在这篇综述中，我们比较了T细胞和NK细胞抗肿瘤细胞毒性的机制、CAR设计和工程策略，并讨论了解决CAR T细胞和CAR NK细胞疗法面临的挑战如何影响它们未来的应用，特别是针对实体瘤。 NK细胞是如何与T细胞一起抗击癌症的NK细胞是先天免疫细胞，作为第一线的防御者。与T细胞不同，NK细胞的抗肿瘤功能独立于MHC分子，并且不需要抗原启动。NK细胞表达一系列激活受体（aNKRs）和抑制受体（iNKRs）；取决于aNKR和iNKR信号之间的协调是倾向于NK细胞激活还是抑制，分别导致目标细胞的裂解或免疫自我耐受。当肿瘤细胞下调自身MHC I类分子，创造出“缺失自我”的状态，或者通过aNKRs识别肿瘤相关的压力配体时，NK细胞的脱颗粒和目标细胞裂解就会发生。NK细胞的细胞毒性也可以通过FasL与肿瘤细胞上的相应受体结合发生，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）发生，涉及NK细胞上的CD16与抗体结合的目标细胞的结合，或者间接通过释放免疫原性细胞因子。免疫系统与实体瘤的战斗涉及一个复杂的先天和适应性免疫细胞网络。这些细胞在肿瘤内的丰度和它们的信号协调影响肿瘤进展或控制的命运。在新转化的实体瘤中，NK细胞可以检测到肿瘤细胞亚群上的压力配体。 CAR NK细胞相对于CAR T细胞的优势  CAR NK细胞相对于CAR T细胞具有几个优势，可以用来治疗实体瘤。例如，CAR NK细胞可以利用NK细胞的先天抗肿瘤能力，同时更倾向于目标特异性的杀伤。这使得CAR NK细胞能够杀死表达目标的癌细胞（CAR介导的杀伤）和缺乏目标的癌细胞。 (CAR独立/先天NK细胞毒性介导的)，这一优势对于治疗实体瘤尤为重要，对于治疗实体瘤来说尤其重要，因为这些肿瘤通常以抗原异质性和逃避免疫细胞毒性为特征。由于大多数NK细胞的细胞毒性能力在癌症患者中在肿瘤进展过程中以及在如手术等治疗性方案后会降低，大多数CAR NK细胞需要同种异体来源。迄今为止，对接受同种异体CAR NK细胞治疗的患者进行的临床研究记录显示，由于缺乏MHC I类限制，没有发生移植物抗宿主病(GvHD)。 尽管可逆，细胞因子释放综合征(CRS)是一种危及生命的状况，通常发生在接受CAR T细胞治疗的患者中，这是由于效应免疫细胞的过度激活和血清细胞因子水平的放大分泌，无论是由CAR T细胞还是CAR T细胞激活的巨噬细胞分泌的，包括干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)和白细胞介素-6 (IL-6)及IL-10。然而，在接受CAR NK细胞治疗的患者中，CRS的发生率非常低。虽然原因尚未完全理解，但在CAR NK细胞治疗后CRS病例的罕见可能部分归因于NK细胞激活后不同的细胞因子谱，包括干扰素γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子CCL1、MCP-1、MIP-1α（也称为CCL3）、MIP-1β(CCL4)、CCL5和CXCL8，以及与CAR T细胞试验相比完成的CAR NK细胞临床研究的数量有限。 此外，从脐带血、干细胞分化、外周血或NK细胞系大量生产CAR NK细胞的前景对于未来的现成生产是有希望的。例如，在一项研究中，通过在70天内进行五轮刺激，从脐带血中获得的NK细胞扩增了大约1100万倍，从外周血中获得的NK细胞扩增了超过2500亿倍。在另一项研究中，使用辐照的自体外周血单核细胞、IL-2和抗CD3抗体的混合物，可以获得高达15000倍的高活性外周血衍生NK细胞扩增。 CAR与典型T细胞和NK细胞免疫突触的比较  CAR淋巴细胞与目标肿瘤细胞之间形成的免疫突触的类型和特征对CAR淋巴细胞抗肿瘤效果至关重要（图1）。CAR T细胞与肿瘤细胞的第一次接触涉及通过形成免疫突触，在T细胞上的CAR分子与肿瘤细胞上的目标抗原之间进行识别和稳定结合；然而，由CAR分子形成的免疫突触与典型TCR在许多方面都有所不同。一个经典的成熟的免疫突触由三个同心的超分子激活簇(SMACs)区域组成，这些对于TCR细胞毒性功能是必不可少的。在溶解性免疫突触中，中央SMAC由Lck激酶-TCR微簇组成，参与启动激活信号级联和释放溶解颗粒。外围SMAC控制LFA-1整合素与目标细胞表面的ICAM-1粘附分子的结合，被认为是稳定突触的，远端SMAC主要是一个含有如CD43和CD45等糖萼蛋白排斥因子的肌动蛋白环，这些因子保护T细胞，并由CD2的冠与目标细胞上的CD58结构域相互作用，从而实现额外的共刺激信号。然而，在某些情况下，单个受体的参与或膜微簇的形成就足以触发T细胞激活，无需成熟的突触形成。另一方面，CAR T细胞中的免疫突触不涉及成熟的突触形成，而是包括复杂的Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。这种较不组织的突触使得CAR介导的参与更快，随后比TCR更快地释放信号级联，并且与更快的细胞毒性颗粒分泌和随后CAR从目标细胞上的脱离有关。 肿瘤激活的NK细胞释放XCL1、XCL2和CCL5趋化因子，吸引传统的1型树突状细胞（cDC1s），导致炎症活跃的微环境，通常被称为“热肿瘤”。新抗原呈递或肿瘤相关抗原（TAA）呈递的cDC1s在肿瘤引流淋巴结中启动CD8+ T细胞，使进一步的T细胞浸润和MHC I类介导的肿瘤细胞裂解成为可能。多克隆的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞，包括一个能够通过MHC II类介导的肿瘤杀伤的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，具有多样化的TCR库和不同的记忆分化和耗竭表型，响应于这种启动而浸润实体瘤。免疫逃逸可以通过肿瘤细胞分泌前列腺素E2来促进，它不仅阻断了CD8+的细胞毒性，还降低了NK细胞的存活率、活性以及趋化因子CCL5和XCL1的分泌，这削弱了NK细胞介导的cDC1s到肿瘤微环境（TME）的招募。肿瘤细胞内在的对干扰素-γ（IFNγ）的敏感性，由活化的TAA特异性CD8+ T细胞分泌，促进肿瘤细胞上PD-L1和其他免疫检查点配体的表达，通过与T细胞上的相应检查点受体（如PD-1）结合，使肿瘤细胞对T细胞细胞毒性产生抗性。在这种情况下，免疫检查点阻断（ICB）可以是一种有效的免疫疗法；然而，肿瘤也可以通过减少抗原呈递来逃避T细胞细胞毒性并获得对ICB的抗性，从而使肿瘤内的T细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用进入邻近的淋巴结。由于iNKR与自身MHC I类复合物的结合有利于NK细胞的抑制，ICB耐药肿瘤细胞中MHC I类复合物的丢失通过限制iNKR的结合，重新使肿瘤内的NK细胞敏感，从而恢复NK细胞的细胞毒性。然而，并非所有肿瘤内的NK细胞都具有细胞毒性。一项研究发现，在三阴性乳腺癌患者中存在一个促进肿瘤发生的亚群Socs3hiCD11b−CD27−未成熟NK细胞，这与预后不良相关，并可能促进肿瘤进展和阻碍异种移植小鼠模型中ICB的效力。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞被肿瘤细胞招募以创造一个缺氧和免疫抑制的TME。抗炎M2样巨噬细胞通过释放抑制性的转化生长因子-β（TGFβ）并推动NK细胞上CD85j抑制性受体的上调来抑制NK细胞的脱颗粒和功能。根据肿瘤类型、恶性阶段和TME的状态，TAMs可以通过向CD4+ T细胞交叉呈递新抗原来增强抗肿瘤功能，这些T细胞获得细胞毒性能力。TAMs也可以帮助肿瘤逃逸。最近的研究显示，TAMs是TME内主要的葡萄糖消耗者；通过细胞内在的持续糖酵解作用导致TME内乳酸积累，TAMs有利于调节性T（Treg）细胞的招募和CD8+ T细胞的驱逐。髓源性抑制细胞表达NK抑制性配体，分泌活性氧，有助于抑制性的腺苷和TGFβ的积累，并激活Treg细胞释放更多的TGFβ，这些协调作用对NK和T细胞功能有严重影响。TME中丰富的Treg细胞和表达PD-1的滤泡调节性T（TFR）分化细胞，具有强大的免疫抑制能力，可以减少肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞毒性，并可能进一步抑制抗PD-1 ICB的效力。因此，持久的免疫抑制TME和克服肿瘤免疫逃逸机制对于成功的CAR T或CAR NK细胞疗法至关重要。 图1 | T细胞和NK细胞中的典型免疫突触与CAR免疫突触。辅助T细胞-APC相互作用代表了TCR和MHC之间典型的免疫突触。这种免疫突触由中心TCR-Lck复合体（中心SMAC）构成，但不包含溶解颗粒，周围是由外周LFA-1/ICAM-1组装（外周SMAC）和伴随CD45和CD2结合的远端肌动蛋白聚合环（远端SMAC）所环绕。CTL-肿瘤细胞溶解突触具有类似的SMAC簇，但也涉及MTOC极化后的中心SMAC内溶解颗粒释放。NK溶解免疫突触包括aNKR配体结合以及CD16介导的ADCC，抑制性NK细胞受体-自身MHC I类结合的丰度低或缺失，并由LFA-1/ICAM-1的外周组装所环绕。NK细胞在静息阶段含有溶解颗粒，并且只有在涉及MTOC极化的时空有序的信号级联发生后，才会经历“定向分泌”。CAR T细胞中的免疫突触包括卷曲的CAR-Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。同样，CAR NK细胞的免疫突触涉及溶解颗粒释放和多个CAR-抗原聚集，但在突触裂隙处的肌动蛋白组织较少。PDZ CAR NK细胞-肿瘤细胞溶解突触与CAR NK细胞相比具有更好的突触组织，其特征是Scribble的积累以及浓缩的突触区域和激活的ZAP70与溶解颗粒的增强聚集。使用BioRender.com创建。 NK细胞的功能取决于aNKRs和iNKRs之间的信号平衡。抑制性受体，如人类杀手免疫球蛋白样受体（KIR）和小鼠Ly49，在维持自身MHC I类耐受对内源性健康细胞的同时，在促进NK细胞激活对抗低MHC I类表达细胞的过程中也起着关键作用，这一过程被称为“教育”。在NK细胞激活过程中，NK溶解免疫突触的形成始于含有SH2结构域的磷酸酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）形成小的中心簇，周围环绕着LFA-1，随后是细胞毒性颗粒在中心SMAC中的聚集，而LFA-1重新定位到外围，这一步骤使得NK细胞激活突触对低MHC I类表达目标的教育成为可能。有趣的是，在未受教育的自耐受小鼠Ly49A+ NK细胞（来自MHC I类敲除小鼠）与经过MHC I类分子H2Dd教育的自耐受Ly49A+ NK细胞（来自H2Dd转基因小鼠）中，SHP-1在NK细胞激活突触中的聚集模式不同，包括SHP-1在激活免疫突触中的积累程度以及SHP-1与F-肌动蛋白和SLP-76信号适配器的共定位。研究表明，激活突触中SHP-1的积累导致下游信号蛋白的去磷酸化，以维持“自我耐受”。一旦激活突触通过iNKRs接受“教育”，SHP-1就被排除在激活突触之外，从而解除抑制，激活下游信号，并提高NK细胞的响应性。 一般而言，免疫突触形成的多步骤过程对于许多免疫细胞相互作用都是成立的，包括辅助T细胞-抗原呈递细胞（APC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）-肿瘤细胞，以及NK细胞-肿瘤细胞或NK细胞-健康细胞。对于溶解突触，它始于抗原识别和受体信号，并随后是效应器激活、微管组织中心（MTOC）极化和脱颗粒，并以从溶解目标细胞的解离结束，使免疫稳态和串行杀伤级联成为可能。然而，研究表明NK和CTL溶解突触之间存在一些动力学和机械转导差异。与T细胞不同，T细胞是在激活后诱导溶解颗粒，NK细胞在静息阶段就含有溶解颗粒，因此在激活和突触形成期间遵循精确的空间时间机制的溶解颗粒分泌，这一过程称为“定向分泌”。NK细胞也可以通过聚集iNKRs，例如与健康细胞上的自身决定因素结合的KIR，形成抑制性突触，形成超分子抑制簇，阻止SMAC形成并保护健康细胞不受溶解。NK细胞膜突出物有助于抑制性突触形成和细胞间蛋白转移。在一项研究中，从肝癌患者体内分离的肿瘤内NK细胞与肿瘤周围NK细胞或健康供者的外周NK细胞相比，膜突出物较少。肿瘤诱导的丝氨酸代谢改变降低了肿瘤内NK细胞膜中的鞘磷脂水平，导致膜突出物调节异常，损害了溶解突触形成和细胞毒性。阻断鞘磷脂代谢增加了解离自膜突出物的突触数量，并在体外以及在肝癌人源化小鼠模型中恢复了肿瘤内NK细胞的溶解活性。 由于CAR溶解突触需要比典型免疫突触更高的抗原识别阈值才能启动杀伤，并且更容易受到磷酸酶诱导的失活，科学家们假设通过靶向细胞极化并引发CAR免疫突触的更有序组装，可能会实现更好的CAR实体瘤细胞毒性。通过将细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM）的突触后密度-95、discs large和紧密连接蛋白-1结合基序（PDZbms）插入到称为CAR PDZ NK的CD28z CAR的C末端，生成了突触调节的CAR NK细胞。与传统CAR NK细胞相比，这些发现表明体外增强了亲和力、抗原敏感性、细胞毒性、突触强度和CAR PDZ NK细胞极化，以及在实体瘤小鼠模型中延长了CAR PDZ NK细胞的存活和持久性。同样，当在T细胞中测试时，CAR PDZ构建物与传统CAR T细胞相比，在体外和异种移植小鼠模型中都有增强的效应功能。 CAR T细胞与CAR NK细胞工程 CAR设计的相似之处、差异和进展 与传统的T细胞受体（TCR）相比，CAR是一种合成受体，它赋予CAR T细胞以非MHC限制性机制的靶向特异性细胞毒性。第一代CAR由一个细胞外的单链可变片段（scFv）构成，通过一个铰链域和跨膜域连接到C末端的CD3ζ激活域，该激活域将非TCR外部-内部激活信号传递到T细胞。然而，第一代CAR T细胞的临床效果有限，可能是由于有限的植入和细胞毒性。为了提高CAR T细胞的细胞毒性、产生细胞因子和对目标刺激的增殖能力，后来对CAR分子进行了修改，包括插入一个（第二代）或两个（第三代）细胞内共刺激（ICS）域在CD3ζ上游（见图2a）。值得注意的是，CAR模块化域或链接结构的任何遗传改变都可能影响CAR T细胞的亲和力、效力和持久性。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的六种靶向CD19或BCMA的CAR T细胞疗法已经在许多血液恶性肿瘤患者中实现了持久缓解。然而，为了创造下一代CAR T细胞以治疗实体瘤并增强CAR T细胞的细胞毒性、持久性、渗透性和安全性，已经实施了额外的工程策略。 CAR NK细胞采用了用于CAR T细胞工程的CAR骨架，但在跨膜和ICS域方面有更多的变化[7]（见图2a）。将scFv替换为aNKR的细胞外域，如NKG2D CAR T细胞和CAR NK细胞，可以增加对传统NK细胞靶标的效力。纳米抗体是单域骆驼抗体片段，由于更高的稳定性、改善的TME渗透性和更容易的遗传工程，比传统的单克隆抗体表现更好。对于CAR T细胞和CAR NK细胞，将CAR scFv域替换为纳米抗体在临床前对血液和实体瘤都显示出有效性。CAR NK细胞的一个主要特点是缺乏MHC依赖性细胞毒性，这使得来自健康捐赠者的异体NK细胞可以耐受MHC I类分子在供体和受体之间的差异。然而，从健康捐赠者异体CAR T细胞中遗传删除TCR以及MHC类-I相关和MHC类-II相关基因，以及在诱导的多能干细胞（iPS）细胞衍生的CAR T细胞中过表达HLA-E，允许生成通用CAR T细胞，这些细胞可以承受受体宿主免疫系统而不会诱发GvHD。尽管供体细胞中MHC类I的遗传删除提供了来自受体异体T细胞的保护，但它创造了一个“缺失自我”信号，使供体细胞暴露于受体NK细胞攻击。因此，规避受体NK细胞细胞毒性的策略包括额外过表达HLA-E、HLA-G或CD47，以生成低免疫原性CAR T或CAR NK细胞。 图2 | CAR设计和工程策略以克服实体瘤逃避CAR T和CAR NK细胞。a，典型TCR信号涉及Lck、CD3ζ和ZAP70的顺序激活，以及SLP76和LAT的磷酸化，它们与GADS和PLCγ形成信号复合体，导致T细胞激活。第一代CAR通过一个重组细胞外（Exc）域通过一个铰链和TM域连接到细胞内CD3ζ作为主要激活信号，以促进CAR细胞激活。在第二代和第三代CAR中，信号由一个或两个ICS域支持。LINK CAR T细胞使两个scFv CARs的门控激活成为可能，其信号取决于SLP-76与LAT作为ICS域的复合，仅当肿瘤细胞上呈现两种认知抗原并且与scFv CARs结合时。b，通过工程DN-TGFβ-RII单独或与IL-15受体激动剂（HCW9218）复合；DN-PD-1作为ICB；或者通过遗传删除T细胞或NK细胞中的负调节因子来阻断CAR细胞功能障碍。增强CAR T细胞细胞毒性的方法包括工程化TRUCK CARs，这些CARs使CAR诱导的细胞因子分泌，插入细胞因子受体作为额外的ICS，工程化组成型活性IL-7受体（C7R），或者通过过度表达orthoIL-2/orthoIL-2Rβ。增强CAR NK细胞细胞毒性的方法包括增加细胞因子载荷或使用K562/4-1BBL/膜结合IL-21（mbIL-21）或K562/膜结合IL-15（mb15）/4-1BBL饲养细胞，或补充IL-2、IL-15和/或IL-21的培养基，体外扩增CAR NK细胞。通过与IL-12、IL-15和IL-18的刺激，可以产生具有改善持久性和代谢适应性的类似记忆的CAR NK细胞。多靶向CAR设计的例子以克服抗原异质性和丧失包括IL-13/抗EphA2 Tan-CAR T细胞或一种多靶向CAR NK细胞，该细胞共表达肿瘤可切割的抗CD73 scFv连接到抗GD2 CAR以及NKG2D CAR。抗CD73 scFv与CD73的结合阻止了从腺苷酸（AMP）产生免疫抑制腺苷。通过过度表达趋化因子受体或肝素酶，可以增强CAR T细胞的渗透和持久性，肝素酶降解蛋白聚糖和其他细胞外基质（ECM）蛋白，与CAR一起。αFAP-scFv CAR T细胞靶向癌症相关成纤维细胞上的FAP，以减轻FAP诱导的ECM重塑。将scFv替换为FAP在CAR NK细胞上改善了ECM降解，并增加了NK细胞的渗出和渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、髓源性抑制细胞（MDSC）。使用BioRender.com创建。 成功实施CAR T和CAR NK细胞疗法的另一个主要挑战是，由于正常组织共享抗原识别，存在严重的肿瘤外毒性风险。为了缓解这个问题，已经开发了几种逻辑门控和开关受体CAR T细胞[1]。最新的是一种可逆的布尔逻辑AND门控细胞内网络(LINK) CAR，其中CD3ζ被替换为细胞内近端下游信号分子LAT和SLP-76，以产生CD19-28TM-LAT和HER2-8TM-SLP-76 CAR T细胞(图2a)。CD19+ HER2+ 目标细胞诱导的LINK CARs刺激在体外和体内效应功能改善以及限制肿瘤外靶向毒性方面，优于以前开发的逻辑门控平台。同样地，对于CAR NK细胞，SENTI-202是一种新型的“或门和非门逻辑门控”CAR NK细胞候选物，它被设计成通过一个或门激活CAR靶向急性髓系白血病(AML)相关靶标FLT3或CD33，同时通过一个非门EMCN靶向抑制性CAR，避免健康造血干细胞受到肿瘤外毒性的影响。这最终将增强AML白血病干细胞/母细胞肿瘤清除，同时减少对骨髓移植的需求。 针对血液肿瘤的CAR T和CAR NK细胞的临床试验已在其他地方讨论。这里我们关注以实体瘤为靶标的CAR T或CAR NK细胞的临床试验，从Clinicaltrials.gov截至2023年7月1日提取，胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌是目标肿瘤列表中的首选。对于CAR T细胞，针对实体瘤的试验总数为340（23项已完成，23项正在进行/不招募，165项积极招募或邀请注册，67项状态未知，33项暂停/终止/撤回，29项尚未招募）。与此同时，已报告19项针对实体瘤的CAR NK细胞试验（9项积极招募，6项状态未知，4项尚未招募）。表1列出了所有CAR NK细胞试验和已完成的针对实体瘤的CAR T细胞试验。虽然来自CAR T细胞疗法的临床数据未能再现血液肿瘤的持久反应率，但CAR NK细胞的数据仍在等待中。对于CAR T和CAR NK细胞来说，肿瘤内归巢和在实体瘤环境中的持久性是尚待克服的主要障碍。缺乏关于CAR NK细胞在实体瘤中的归巢的临床数据；然而，从第一个CAR NK细胞试验中推断出的投入，该试验利用了携带人类IL-15的CD19 CAR NK细胞，证明了输注的CAR NK细胞在患者外周血中至少持续1年，尽管水平较低。在NK细胞中过表达DNAM-1和/或NKG2D是增强NK细胞肿瘤内渗透的提议策略之一，并已在体外对患者衍生的肉瘤标本显示出有效性。 增强CAR T和CAR NK细胞特别是对实体瘤的抗肿瘤细胞毒性是一个不断增长的研究领域。研究人员使用的策略包括工程化共刺激域，增强CAR修饰细胞的激活细胞内信号。尽管TCR是介导T细胞细胞毒性的唯一主要受体，但许多跨膜共刺激分子，如CD28、4-1BB、ICOS和OX-40，可以放大TCR下游的信号能力，以获得优越的细胞毒性效果。这些分子中的每一个都有利于不同的信号通路，一旦包含在CAR构建物的ICS域中，就会影响CAR T细胞的细胞毒性、增殖和持久性。与此同时，NK细胞有各种激活和抑制受体，它们招募不同的下游信号介导者，其信号线索的微调控制了NK细胞的激活与抑制作用。研究表明，使用NK特异性信号域，如2B4和DAP10或DAP12，作为ICS域，定制NK细胞的CAR工程，可以增加CAR NK细胞抗肿瘤功效和IFNγ分泌，与T细胞定制的CAR构建物相比（图2a）。 克服实体瘤逃逸是CAR基础细胞工程中另一个积极扩展的领域。克服CAR T和CAR NK细胞功能障碍的方法包括过表达TGFβ（DN-TGFβ-RII）或PD-1（DN-PD-1）的优势负性受体(DNRs)，或遗传删除包括PD-1和二酰甘油激酶在内的负面CAR细胞调节器。正交和/或膜结合细胞因子/细胞因子受体工程策略也已被用于增强CAR T或CAR NK细胞的抗肿瘤功能。通过CAR T或CAR NK细胞对TAAs进行多靶向和串联靶向可以提高对实体瘤及其相关抗原异质性或丢失的功效，与单一CAR相比。改善CAR T或CAR NK细胞通过基质屏障的运输和渗透的策略包括过表达趋化因子受体，生成FAP-scFv CAR T或过表达FAP的CAR NK细胞，或过表达肝素酶。图2b总结了已经研究的突出工程方法。 增强抗肿瘤效果的联合免疫疗法 癌症免疫疗法是一系列旨在动员并增强免疫细胞效应功能以消灭肿瘤的治疗方式。图3a描述了CAR T和CAR NK组合免疫疗法的主要模型。 重组单克隆抗体或作为替代品的纳米抗体可以用多种方式增强CAR T和CAR NK细胞的功能[57]。激活性单克隆抗体作为特定激活受体或共刺激分子（如CD28、4-1BB和SLAMF7）的激动剂，对T细胞或NK细胞的扩增和持久性很重要。肿瘤特异性单克隆抗体单独使用或与高亲和力CD16的过表达结合，通过抗体结合的肿瘤细胞的Fc部分的包被作用，将CAR表达细胞重定向至肿瘤细胞和/或增强ADCC功能。阻断性单克隆抗体（如ICB中使用的）通过阻断免疫检查点受体或配体（如TIM3、CTLA4和PD(L)-1）靶向免疫抑制性的TME。尽管FDA批准的ICB作为单一疗法为一些实体瘤患者提供了持久缓解，但在许多其他患者中失败是因为肿瘤特异性的一级和二级抵抗机制。NK抑制性受体阻断单克隆抗体通过模仿通常在抑制配体下调或丢失时发生的“缺失自我”信号，促进NK功能。其他阻断性单克隆抗体靶向炎症性细胞因子受体。例如，tocilizumab是一种FDA批准的阻断性单克隆抗体，靶向IL-6受体（IL-6R），用于管理CAR T细胞诱导的CRS。免疫结合剂，如BiTE和TriTE（对T细胞）以及BiKE、TriKE和TetraKE（对NK细胞），是双特异性或多特异性T细胞或NK细胞结合剂，结合了scFv、纳米抗体和/或其他分子如细胞因子，以促进CAR表达细胞有针对性地消灭肿瘤。 Lenalidomide是E3泛素连接酶途径的免疫调节剂，具有多种免疫效应。除了诱导肿瘤细胞周期停滞外，lenalidomide可以通过阻断血管生成和抑制Treg细胞来调节TME，以及介导恢复与淋巴瘤相关的免疫突触缺陷。与T细胞结合使用时，lenalidomide是一种共刺激剂，增强了抗CD133或抗HER2 CAR T细胞对实体瘤的细胞毒性和细胞因子分泌。在I期临床试验中，lenalidomide促进了NK细胞的扩增，与抗抑制性KIR疗法结合使用，增强了对多发性骨髓瘤的类固醇节约细胞毒性。 溶瘤病毒是一组经过工程改造的病毒，可以增强肿瘤免疫原性和树突状细胞诱导的NK细胞活性，以及实现转基因的肿瘤靶向传递。溶瘤病毒表达截断CD19（OV19t）和抗CD19 CAR T细胞的联合瘤内治疗导致实体肿瘤消退。同样，溶瘤病毒表达人类IL-15/IL-15受体α sushi结构域融合蛋白（IL-15–suIL-15Rα）复合物（OV-IL15C）和抗EGFR CAR NK细胞的组合，在胶质母细胞瘤小鼠模型中引发了协同抗肿瘤细胞毒性和CAR NK细胞的持久性，并改善了生存率。 对于所有这些组合疗法，正在进行血液和实体瘤的临床前和临床评估。虽然ICB与CAR T细胞结合使用的临床评估看起来很有前景，但它在CAR NK细胞毒性中的作用还有待商榷。基于纳米抗体的疗法可能很快会在针对实体瘤的免疫疗法时代占据主导地位，因为它们能够穿透密集的基质；然而，纳米抗体从循环中的快速清除需要额外的工程化。增强两种CAR基础疗法的细胞毒性和持久性的细胞因子装甲已被证明是有效的，还有更多灵活的机会有待探索。最终，由不同癌症免疫疗法介导的多模式机制在增强CAR基础疗法时，考虑到可能的肿瘤外毒性，对未来选择与CAR T和CAR NK细胞一起的最佳组合免疫疗法至关重要。 这些数据来源：https://clinicaltrials.gov。DLL3，类DLL3配体3；CLDN6，紧密连接蛋白6；ROBO1，漫游导向受体1；MUC，粘液蛋白；Meso，间皮素；CIR，嵌合免疫受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；CEA，癌胚抗原；CD133，蛋白I；CLDN18.2，紧密连接蛋白18.2；GD2，二唾液酸神经节苷脂；HCC，肝细胞癌；PSMA，前列腺特异性膜抗原；TNBC，三阴性乳腺癌；Cytoxan，环磷酰胺；Fludarabine，抗代谢物；Pembrolizumab，针对PD-1的单克隆抗体；Ezabenlimab，针对PD-1的人源化单克隆抗体；Aldesleukin，重组人类IL-2；AP1903，一种通过交联FKBP结构域发挥作用的化学二聚体剂。NA，不适用。 影响实体瘤中细胞毒性和持久性的挑战 用于体外扩增的T细胞来源包括外周血和iPS细胞衍生群体，很少有文献报告使用脐带血扩增的T细胞，因为这些细胞在扩增后往往富含Treg细胞。尽管CAR T细胞治疗在对抗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤方面却表现不佳[1]。除了长期体外扩增后诱导的CAR T细胞产品耗竭，影响记忆表型、寿命和增殖能力外，阻止CAR T细胞成功治疗实体瘤的第一障碍是由癌症相关成纤维细胞形成的密集基质，这抑制了CAR T细胞渗透到肿瘤部位。绕过这一障碍的肿瘤内CAR T细胞在持续刺激目标抗原和/或免疫抑制性肿瘤和相关TME后可能会变得耗竭。肿瘤逃逸可能发生，因为肿瘤试图通过突变逃避有效的肿瘤内CAR T细胞毒性，导致抗原丢失或抗原异质性。肿瘤内CAR T细胞也可能因内在和外在因素的复合作用而被驱逐到淋巴结，导致增殖能力降低和持久性丧失。 与可以存活数月的T细胞不同，NK细胞的寿命很短，年轻成人的半衰期不到10天，这一限制因素强调了需要反复输注NK细胞产品以维持体内的有效性和持久性。此外，扩增的NK细胞对冷冻和解冻的敏感性影响了输注后的细胞毒性和存活率。在三维肿瘤模型中，解冻后迁移NK细胞的比例下降了六倍，对细胞毒性效果有严重影响，这可能部分解释了冷冻保存的CAR NK细胞在体内的持久性受损。目前正在研究优化冷冻保存方案，包括使用替代二甲基亚砜的替代品，二甲基亚砜是传统上用于冷冻细胞的保护剂，以保持CAR T和CAR NK细胞在解冻后的完整性、活性、功能和效力，并促进未来的现成生产和冷冻保存。 体外扩增NK细胞需要用细胞因子进行启动，以防止NK细胞耗竭和衰老。NK细胞可以从多种来源扩增用于临床测试，如外周血、脐带血、iPS细胞和不朽的NK细胞系，如NK-92细胞；每种来源都有特定的限制和优势。CAR NK细胞的产生反映了未经编辑的NK细胞的体外扩增方案，尽管后者需要额外的病毒或非病毒工程以表达CAR构建物。这些扩增方案依赖于持续的细胞因子刺激，有或没有饲养细胞的共激活。尽管扩增的CAR NK细胞在体外对目标细胞提供了显著的细胞毒性，但研究表明，它们对细胞因子和激活信号的依赖可能是输注到患者后功能失常和寿命缩短的原因，特别是当这些信号线索在TME内变得稀疏时。 NK细胞暴露于许多肿瘤诱导和TME介导的细胞因子和代谢物中，这可以减少NK细胞的持久性和功能。对患者的血液和实体瘤样本分析表明，肿瘤介导和TME介导的NK细胞功能障碍，以及细胞毒性、持久性和寿命受损，可以总结为五种主要机制：耗竭、抑制、无反应、可塑性和增殖缺陷。导致NK细胞耗竭的肿瘤相关因素包括肿瘤细胞持续激活NK细胞导致效应功能降低。肿瘤相关和TME相关释放的TG-β和其他抑制性代谢物诱导aNKR下调；溶解颗粒释放减少；细胞因子产生缺陷；以及iNKR过度表达。无反应可能是由于过度抑制性信号或在缺乏iNKR许可的情况下持续刺激aNKR所致。由于NK细胞属于第1组先天淋巴细胞（ILC1），肿瘤相关因素诱导的ILC1和ILC3亚类之间的可塑性可能允许将传统的细胞毒性NK细胞转换为细胞毒性较低的或ILC1样表型，具有促肿瘤潜力。NK细胞功能障碍还伴随着增殖能力受损和NK细胞浸润数量减少。 图3 | CAR T和CAR NK组合免疫疗法及CAR细胞工程方法。a，抗CD3和抗CD3/抗CD28激活单克隆抗体偶联珠增强CAR T细胞扩增。CAR NK细胞激活单克隆抗体(mAbs)和纳米抗体(Nbs)的靶标包括共刺激分子和aNKR，单独或与高亲和力CD16(ha-CD16)的过表达结合。阻断单克隆抗体和纳米抗体针对免疫检查点受体或配体(ICB)、iNKR或IL-6受体(IL-6R)。FDA批准的阻断单克隆抗体的例子包括托珠单抗、阿特珠单抗、尼伏单抗和伊匹单抗。来普尼增强了CAR T细胞的细胞毒性和增殖，并且通过在多发性骨髓瘤(MM)细胞上增加aNKR配体的表达，与KIR阻断单克隆抗体(IPH2101)联合使用时增强了CAR NK细胞的细胞毒性。OV19t溶瘤病毒通过实体瘤细胞诱导截短型CD19(CD19t)的表达，使其易于受到抗CD19 CAR T细胞的细胞毒性，而OV-15C诱导肿瘤细胞表达和分泌人类IL-15/IL-15受体α寿司结构域融合蛋白(IL-15–suIL-15Rα)，这提高了抗EGFR CAR NK细胞的抗肿瘤效果。免疫结合剂的例子包括BiHC(抗HER2-Nb/抗CD3-scFv BiTE)或布利纳图单抗(抗CD19-scFv/抗CD3-scFv BiTE)用于CAR T细胞，以及抗EGFR-Nb/抗CD16-Nb BiKE或抗CD16-Nb/重组IL-15/抗CLEC12A-Nb TriKE，后者结合了ADCC和TAA特异性杀伤CAR NK细胞。b，病毒CAR转导导致CAR在T细胞或NK细胞内的整合。c，非病毒CAR工程策略的例子包括通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的mRNA，DNA纳米载体平台和转座子以及CRISPR-Cas9和碱基编辑作为基因编辑工具。正在开发中的先进策略包括使用生物材料进行体内CAR传递和扩增，以及通过顺序磁声激活将抗CD3/抗CD28珠与CAR T细胞结合创建的CAR T细胞基活体微型机器人(M-CAR T细胞)的靶向传递和扩增。使用BioRender.com创建。 当前CAR T和CAR NK细胞高效开发的工程策略包括通过额外的遗传操作或组合疗法来增强这些细胞，以解决T和NK细胞功能障碍和持久性问题。 增强CAR-T和CAR NK细胞的传递技术  传统的CAR T细胞生成涉及病毒载体传递CAR构建体，以实现高转导效率和CAR的稳定表达。最广泛使用的载体是慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。与T细胞相比，NK细胞更难进行工程改造，这是由于其固有的抗病毒能力、对凋亡的高敏感性和有限的扩增潜力。由于慢病毒包膜直接影响原代NK细胞的转导效率，因此可以使用泡状口炎病毒G（VSV-G）、长臂猿白血病病毒包膜（GALV）、猫科内源性逆转录病毒包膜蛋白（RD114-TR）或狒狒包膜（BaEV）对慢病毒进行伪型化，后者显示出与逆转录病毒相当的转导效率。然而，增加的免疫原性、可能的插入突变、有限的插入大小、高昂的GMP级病毒生产成本和相关的监管复杂性是主要缺点，这些缺点激发了探索成本效益的非病毒传递途径。非病毒转座子平台Sleeping Beauty和PiggyBac能够更安全地整合CAR构建体，但效率低于病毒系统。通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的非病毒mRNA基CAR构建体产生高但短暂的CAR表达效率。科学家们还开发了一种简单、多功能、经济实惠、非病毒、非整合的DNA纳米载体平台，能够在体外和体内实现T细胞的非染色体CAR表达，且没有免疫原性或遗传毒性。其他的非病毒基因编辑平台包括CRISPR-Cas9，它能够实现CAR和其他有利基因的位点定向整合或免疫细胞负调节因子、TCR或MHC相关基因的删除。在一项研究中，通过结合T细胞相关基因的基础编辑和CAR-慢病毒转导，产生了抗兄弟细胞毒性的双重CAR T细胞。最后，生物材料传递车辆允许定向转移编辑或未编辑的免疫细胞，有病毒或非病毒编辑的选项，在体内，而无需事先的体外扩增，而基于CAR T细胞的活体微型机器人能够通过磁声激活实现CAR T细胞的靶向传递和激活。 结论  过去十年在CAR基础免疫疗法的工程方面取得了革命性的成功，已有六种FDA批准的CAR T细胞疗法使一些儿童和成人患者的血液恶性肿瘤实现了长达十年的缓解。然而，血液恶性肿瘤患者在接受CAR T细胞输注后的复发率是可变的，而且尚未实现对实体瘤有显著数量的完全缓解。CAR T和CAR NK细胞的耗竭、低反应性和被宿主免疫系统排斥被认为是许多患者肿瘤抵抗和复发的主要因素。因此，要实现CAR基础免疫细胞功能的最优化，需要解决这些细胞疗法面临的多重挑战，同时优化临床给药环境，并利用组合免疫治疗模式。 尽管一些CAR NK和CAR T细胞基础的临床前研究展示了对实体瘤的有效细胞毒性，但CAR NK细胞的临床数据很少，而CAR T细胞在临床上尚未成功。未来的治疗方案应该操纵工程策略和组合疗法，以解决阻碍CAR T和CAR NK细胞对实体瘤效果的挑战。这些挑战包括克服肿瘤诱导的抗原异质性或丧失；促进长期肿瘤内抗原遭遇，以实现有效的肿瘤细胞毒性；在肿瘤内维持更好的CAR表达细胞的持久性和保留；耐受缺氧和免疫抑制的TME；以及维持类似记忆的CAR细胞库，以实现更持久、更具肿瘤特异性的细胞毒性。与溶解性突触形成和稳定性相关的额外挑战，如免疫细胞-目标识别、结合动力学和效力，应该得到解决。应该继续研究消除受体中超活性或有毒CAR细胞的方法，包括逻辑门控和开关式CAR设计以及其他新方法，直到实现最佳平台。最终，成功开发针对实体瘤的高效CAR疗法可能需要一个全面的组合方法，而不是单独针对个别障碍。 未来需要从MHC不匹配的健康捐赠者那里生产“现成的”通用CAR T细胞产品，以促进在疾病关键阶段向患者、弱势社区或缺乏CAR T细胞开发设施的医疗机构提供已经FDA批准的产品。基于MHC非限制性细胞毒性、降低的肿瘤外靶向毒性和“现成的”生产便利性，我们预计未来十年将带来更多的研究结果，帮助优化NK细胞扩增工作流程；减轻NK细胞耗竭，改善解冻后恢复，并增强移植后的细胞毒性和持久性。然而，由于同种异体CAR NK细胞可能促进免疫原性并在后期被宿主免疫细胞排斥，因此需要进行额外的遗传操作，类似于应用于通用CAR T细胞的操作。也应该采用创造最佳无饲养层扩增的新型策略，以实现CAR NK细胞的大规模生产，并绕开监管和一致性问题。 关于CAR T或CAR NK细胞抗肿瘤效果的大多数临床可用数据都是从分析晚期癌症的重度预处理患者中推断出来的，同时缺乏作为早期肿瘤进展阶段的一线疗法的有效性证据。因此，进一步研究CAR基础疗法的最佳时间、剂量、途径和频率，将更好地指导临床决策，并扩大治疗适用患者的范围。CAR基础细胞疗法的另一个主要缺点是治疗成本的显著提高，包括对伴随副作用的症状管理。未来有助于降低成本的步骤包括优化“现成的”生产和冻存“通用”工程CAR产品，减轻肿瘤外靶向毒性，缩短体外扩增工作流程，优化非病毒CAR递送以及微调体内动力学和个别CAR设计的效力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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