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兰卫科普单细胞转录组数据分析之RNA速率分析在多细胞生物的生命过程中，细胞会根据外界刺激或内部信号的变化，调整自身的功能状态，进行分化、增殖或迁移等生物学过程。例如，免疫细胞在接收到信号后会迅速激活，并执行相应的免疫功能。激活后的免疫细胞进入“应答”状态，分泌细胞因子、增殖、吞噬病原体、清除受感染细胞，并启动其他免疫反应。同时，免疫细胞的表面标记物和基因表达谱也会发生显著变化，反映出其状态转变。然而，这些瞬态细胞群的研究具有挑战性。为了解决这一难题，今天我们介绍一种能够捕捉细胞转录动态、重建转录速率变化轨迹的方法——RNA速率分析（RNA velocity analysis）。RNA速率分析的原理与方法：单细胞RNA velocity analysis是一种用于研究细胞转录动态及基因表达变化趋势的计算方法。与基于细胞间状态差异重建发育轨迹的拟时序分析（pseudotime analysis）不同，RNA速率分析从单细胞测序数据中提取未剪接mRNA（unspliced mRNA）与已剪接mRNA（spliced mRNA）的比例信息，从而量化基因表达的瞬时变化速率，进而推断细胞未来的状态转变方向。该方法为解析细胞命运决策、状态转变及其潜在调控机制提供了一个更为动态且定量的研究视角，弥补了拟时序分析在时间方向推断上的局限性。目前，主流的RNA速率分析工具包括Velocyto、scVelo和DeepVelo等，它们利用不同的计算模型推断细胞命运轨迹，并揭示调控机制。RNA速率分析应用领域：RNA速率分析不仅能揭示细胞的分化潜能，还在多个生物学领域中具有广泛应用。它能够追踪免疫细胞激活后的动态变化，帮助理解细胞如何响应病原和癌症免疫逃逸；在肿瘤研究中，揭示肿瘤细胞与微环境细胞的动态重塑，为早期诊断和靶向治疗提供新思路；在发育生物学与干细胞研究中，推测干细胞分化轨迹，优化干细胞培养和再生医学；在神经科学领域，揭示神经元和胶质细胞的动态转变，有助于新治疗靶点的发现等等。RNA速率分析应用案例：1、揭示细胞分化潜能肿瘤邻近组织与肿瘤组织中浸润细胞类型的差异，揭示了肿瘤微环境在结直肠癌（CRC）进展中的动态重塑过程及其关键作用。长期以来，成纤维细胞被认为是调控肿瘤发生与发展的核心基质细胞类型之一，然而其具体的亚群身份与功能机制仍未完全阐明。2022年发表在Nature Communications的一项研究（Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer）中，研究人员发现FAP+成纤维细胞在CRC组织中显著富集，并与患者的不良预后相关。该研究结合RNA速率分析方法，推断了FAP⁺成纤维细胞的潜在分化轨迹，并预测其可能起源于FGFR2⁺成纤维细胞或ICAM1⁺端粒样细胞。这一发现不仅揭示了成纤维细胞在肿瘤微环境中的高度可塑性，也为靶向干预提供了新的理论依据和潜在策略。2、发掘关键基因与调控网络在拟时序分析中，研究人员通过比较不同时间点或发育阶段的基因表达模式，能够识别出在细胞命运决定过程中发挥关键作用的调控基因或基因簇。进一步结合转录因子调控网络的构建，有助于深入解析细胞发育与分化的分子机制。2022年发表在Science Advances的研究（DeepVelo: Single-cell transcriptomic deep velocity field learning with neural ordinary differential equations）系统评估了DeepVelo算法在多种组织类型、发育时间尺度及测序平台下对scRNA-seq数据的解析能力。该研究聚焦于小鼠齿状回（Dentate Gyrus）的发育过程，利用DeepVelo模拟细胞状态迁移轨迹，并引入“细胞关键性指数”（Cell Criticality Index）来评估关键转变阶段的细胞状态。结果发现，该指数与关键调控基因IGFBPL1和GRM5的表达高度相关，提示它们在调控细胞命运选择中发挥核心作用。进一步的体外功能验证实验确认了发育驱动因子Runx1t1和Prox1对颗粒细胞与锥体神经元谱系分化路径的调控效应。该研究表明，RNA速率分析不仅能够揭示细胞发育轨迹，还能识别关键驱动基因，从而揭示发育过程中的潜在调控机制。3、空间转录组学中致癌的动力学RNA速率分析的应用不局限于单细胞水平，还可结合空间转录组学（spatial transcriptomics），用于解析肿瘤微环境的动态变化。2024年发表在Nature Communications的研究（Multivariate stochastic modeling for transcriptional dynamics with cell-specific latent time using SDEvelo）应用RNA速率分析深入探讨了肝细胞癌（HCC）的空间转录组数据。研究团队利用来自同一患者的四个组织切片（包括两个肿瘤切片和两个癌旁组织切片），发现基质区域向肿瘤/正常上皮区域的过渡趋势，揭示了HCC组织的空间动态特征。此外，该研究识别出多个与肿瘤进展相关的关键驱动基因，其中APO家族基因在癌旁组织中呈现显著动态变化，提示其在肝癌发生过程中可能起到关键作用。这项研究表明，RNA速率分析结合空间转录组学，能够揭示肿瘤微环境的时空动态，为癌症进展机制提供新的视角。总结：RNA速率分析为探索细胞状态转换与基因动态变化提供了有力手段，有助于在多种生物学背景下解析细胞命运轨迹及其调控机制。从肿瘤微环境的重塑到发育过程中的关键基因筛选，再到空间转录组学中的肿瘤动力学，RNA速率分析已成为单细胞数据解析的重要手段。随着计算方法的不断发展，如DeepVelo和SDEvelo等先进模型的引入，该技术在精准医学、发育生物学及癌症研究等领域的应用前景将更加广阔。未来，结合多组学数据（如表观遗传、蛋白组和代谢组），RNA速率分析有望进一步提升对细胞状态转换及疾病发生机制的理解，并推动相关领域的发展。本文由 医学事务中心 徐坤 提供

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 肿瘤异质性及其驱动因素影响肿瘤进展和癌症治疗。单细胞RNA测序用于研究肿瘤生态系统的异质性。 近日，浙江大学郭国骥、梁廷波等研究人员在权威期刊《Advanced Science》上发表了题为“Pan-Cancer Single-Nucleus Total RNA Sequencing Using snHH-Seq”的研究论文，本研究中， 研究人员开发了一种高通量、高灵敏度的方法snHH-seq，该方法将随机引物与液滴微流控平台的预索引策略相结合。 这种创新的方法允许从临床冷冻样品中检测单个细胞核中的总RNA。并且建立了一个强大的流水线，以促进全长RNA-seq数据的分析。snHH-seq应用于来自32例不同肿瘤类型患者的73万多个单核。泛癌症研究使其能够全面分析肿瘤转录组数据，包括表达水平、突变、剪接模式、克隆动态等。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304755 研究背景 01 癌细胞及其驱动因素的异质性在肿瘤发生和恶性进展中起着重要作用，并对癌症治疗有重要影响。单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够在单细胞水平上测量转录信息，从而准确地解决肿瘤异质性。 许多研究利用scRNA-seq来阐明肿瘤微环境的多样性，揭示治疗策略的机制，并据此提出新的分子标记和治疗靶点。 然而，scRNA-seq在处理临床肿瘤样本，特别是档案材料(如冷冻组织)方面具有独特的后勤和技术挑战。首先，临床肿瘤样本的scRNA-seq需要实施快速组织解离程序，目前大多数医院的常规病理实验室不存在这种程序。其次，大多数scRNA-seq方法使用oligo-dT引物来捕获和扩增聚腺苷化转录本，这一过程高度依赖于组织样品的质量。此外，寡聚dt捕获导致缺乏对许多生物过程很重要的非聚腺苷化转录本。第三，高通量scRNA-seq方法只能检测转录本3 '或5 '端的短片段，这限制了临床样本的突变和剪接分析，特别是对肿瘤。 为了克服这些挑战，研究人员开发了“高通量高灵敏度单核总RNA测序”(snHH-seq)，将随机引物和预索引策略结合在液滴微流控平台上。单核RNA-seq (snRNA-seq)减少了对样品收集和处理的要求。这也为纵向样本的分析铺平了道路。使用随机引物而不是oligo-dT引物捕获转录本，不仅可以拯救部分降解转录本的档案临床样本，而且具有更高的灵敏度(一个转录本有多个可捕获的位点)和更高的覆盖率(转录本的3 '和5 '端，非聚腺苷化转录本和聚腺苷化转录本)。该预索引策略应用于基于液滴和基于平板的方法，提供至少一个数量级的吞吐量增益，并促进临床样品的多路分析。 研究进展 02 为了能够评估大量临床冷冻样本，减少解离的批次，研究人员建立了snHH-seq，一个基于液滴的高通量、高灵敏度的单核总RNA测序平台。snHH-seq是一种结合随机RT引物和预索引策略优势的强大方法。 snHH-seq具有高通量和高灵敏度，为肿瘤图谱绘制和其他基因组研究提供了新的可能性。 接下来，研究人员使用snHH-seq分析冷冻临床肿瘤样本。研究人员分析了32例患者的735 722个细胞核，涵盖了中国发病率和死亡率最高的肿瘤类型，包括肺腺癌(LUAD)、肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)、胶质瘤、结肠腺癌(COAD)、直肠腺癌(READ)、乳腺浸润性癌(BRCA)、食管癌(ESCA)和胃腺癌(STAD)。在单细胞癌症研究中，识别恶性细胞是至关重要的一步，因为它们构成了癌症样本的主要组成部分。为了在研究人员的数据集中识别细胞类型(恶性细胞和非恶性细胞)，研究人员使用了标记基因和推断拷贝数变异(CNV)的组合。考虑到所研究的癌症类型，研究人员使用带注释的非上皮细胞，如内皮细胞、基质细胞和巨噬细胞作为intercnv的参考，以推断每个患者的CNV特征。 为了进一步说明TME(肿瘤微环境)的异质性，研究人员收集了来自不同患者的内皮细胞、骨髓细胞和基质细胞，并进行了亚聚类分析。研究人员获得了15个肿瘤内皮细胞(TEC)亚簇，包括动脉TEC (C4、FBLN5和SULF1)、静脉TEC (C6、ACKR1)、淋巴TEC (C2、PROX1)、毛细血管TEC (C7、BTNL9和CD36)、外周血TEC (C9、PDGFRB)、尖端TEC (C3、COL4A1)、细胞周期TEC (C12、C2orf48和CIT)和免疫样TEC (C10、DOCK2和PTPRC)。Tip TEC (C3)和cell cycle TEC (C12)在多个肿瘤中富集。在泛癌髓系细胞中，研究人员观察到肿瘤和NAT之间共享和特异性的基因特征。此外，研究人员在乳腺肿瘤和NAT样本中观察到显著的异质性。C2和C5主要驻留在乳腺肿瘤中，表达抑癌基因，可能调控乳腺TME中硫酸肝素的表达;C13主要存在于乳腺NAT和高表达的LRP1B中，LRP1B是一种可能抑制肿瘤迁移和侵袭的肿瘤抑制因子。表达C8的TNXB主要存在于NAT中，对多种肿瘤有贡献，可能阻碍肿瘤细胞的侵袭和转移。 总的来说，研究人员对细胞区室的泛癌症分析揭示了肿瘤环境的共享和癌症限制特征。 使用snHH-seq进行泛癌分析 研究结论 03 总之，研究人员证明了高分辨率单细胞全长转录组测序在鉴定新的肿瘤生物标志物方面的价值，并为全长单细胞测序提供了详细的分析。研究人员的综合分析方法包括检查基因表达、体细胞突变、剪接模式和克隆行为。通过利用这些不同的观点，研究人员可以确定与癌症相关基因和细胞类型相关的特定变异。这个项目代表了研究人员理解癌症潜在遗传机制的能力的重大进步。最终，这些发现加深了研究人员对肿瘤生物学的理解，并为更有效的诊断和治疗方法铺平了道路。 参考资料： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304755 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜12月19日-20日 ▶第四届单细胞测序技术应用研讨会暨单细胞&空间组学研讨会（日程稍后公布） 点击对应文字 查看详情

该研究首次发现了大脑表面存在不同于硬脑膜、蛛网膜和软脑膜的第4层膜结构——SLYM，这将更新教科书中的解剖学基础知识。 大脑表面自外向内具有3层脑膜结构——硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，这是每个医学生学习大脑解剖的基础知识。 然而，这一基础知识或许到了该更新的时候了。 近日，来自罗切斯特大学医学中心的Maiken Nedergaard团队和哥本哈根大学的Kjeld Møllgård团队，在小鼠和人类大脑中发现了第4层脑膜结构，并将其命名为蛛网膜下淋巴管样膜（SLYM），相关研究成果发表于《科学》杂志[1]。 SLYM位于蛛网膜与软脑膜之间，将蛛网膜下腔分为浅层和深层，并包裹着蛛网膜下腔内的血管，其形态和免疫表型类似于外周器官表面的间皮层。在功能上，SLYM不仅可起到润滑作用，在运动过程中减少大脑和头骨之间的摩擦，还可分隔并控制脑脊液在大脑表面的流动和物质的交换。 SLYM的解剖位置 此外，SLYM对大脑的免疫功能也起到重要作用，完整的SLYM可阻止外周免疫细胞随意进入脑内。同时，SLYM上有着自己的免疫细胞群体，通过与脑脊液的接触，监控脑内是否有炎症或感染的迹象。 总的来说，SLYM的发现对于进一步理解脑内代谢物质的清除和免疫功能具有十分重要的意义。 论文首页截图 人类对大脑的探索始于对解剖的认识。 随着研究技术的进步，过去许多关于大脑的固有认知都被一一打破，如原本认为大脑内不存在淋巴系统，但Maiken Nedergaard团队在2012年发现的类淋巴系统[2]（也叫做胶质淋巴通路），以及2015年脑膜淋巴管[3]的发现颠覆了这一认知。 该研究则来源于Kjeld Møllgård团队的一个猜想，即在外周脏器表面存在的间皮层（包裹并保护脏器，同时含有免疫细胞）在大脑中是否存在[4]？ 为了更深入地分析脑组织外的膜结构，Møllgård等使用双光子显微镜观测了Prox1-EGFP+（Prox1：一种决定淋巴管发育的转录因子）小鼠体感皮层的脑膜。同时，研究人员使用二次谐波对未标记的胶原纤维进行可视化，并分别使用Cascade Blue偶联葡聚糖和磺基罗丹明101来标记血管和星形胶质细胞，以区分脑组织外的各层结构。 在硬脑膜纤维束下方，他们发现存在一层与松散排列的胶原纤维混合在一起的单层连续扁平Prox1-EGFP+细胞。这层细胞将蛛网膜下腔分为浅层和深层，并覆盖蛛网膜下腔血管，其厚度为14.2±0.5μm，比硬脑膜要薄（21.8±1.3μm）。研究人员将这层膜命名为SLYM。 小鼠体内双光子成像显示脑表面存在第4层膜 紧接着问题来了，SLYM对物质的通透性如何呢？这关系到膜两侧物质的交换。 为了测试这一点，Møllgård和他的同事将与红色荧光基团结合的直径1μm微球注射到Prox1-EGFP+小鼠蛛网膜下腔的浅层，同时将与蓝色荧光基团结合的直径1μm微球注射到蛛网膜下腔内深层，然后使用双光子显微镜进行观察。结果显示，红色微球被限制在浅层，而蓝色微球则被限制在深层，表明SLYM对直径1μm的微球不具有通透性。 但脑脊液中的许多溶质，如细胞因子和生长因子，大小都远远小于1μm。因此，研究人员将更小的示踪剂TMR-葡聚糖（3 kDa）注射到Prox1-EGFP+小鼠蛛网膜下腔的深层，结果显示TMR-葡聚糖仍然无法透过SLYM。然而，在硬脑膜损伤和脑脊液漏的小鼠中，SLYM的两侧均可观察到注射的示踪剂。 基于以上研究结果，Møllgård团队认为SLYM将蛛网膜下腔从物理上分成了浅层和深层，并可限制了大多数多肽和蛋白质在蛛网膜下腔浅层和深层之间的交换。 SLYM可限制了大多数多肽和蛋白质在蛛网膜下腔浅层和深层之间的交换 接下来，Møllgård团队对SLYM的免疫表型进行了表征，发现SLYM中另一个淋巴管标志PDPN表达呈阳性，而淋巴管内皮细胞受体1（LYVE1）表达呈阴性。此外，SLYM中细胞维甲酸结合蛋白2（CRABP2）表达呈阳性。与SLYM不同，硬脑膜上的淋巴管表达所有的经典淋巴标志物（Prox1-EGFP+、PDPN+、LYVE1+和VEGFR3+，但CRABP2-）。 值得注意的是，对成人大脑皮质的分析表明，在软脑膜上方的蛛网膜下腔同样存在CRABP2+/PDPN+的膜结构。因此，SLYM在人类的大脑中同样存在。 SLYM在人类的大脑中同样存在 为了进一步证明SLYM与蛛网膜是不同的膜结构，研究人员进行了CLDN-11免疫染色，CLDN-11是形成蛛网膜屏障细胞层（ABCL）紧密连接的主要成分。染色结果显示，SLYM中CLDN-11表达阴性，而CLDN-11在ABCL和脉络丛基质细胞中均有密集表达，表明SLYM与蛛网膜是不同的两层。同时，SLYM与软脑膜的免疫标记特征同样存在差异。 由此研究人员得出结论，SLYM为环绕小鼠和人类大脑的第4层脑膜结构，在免疫表型上有别于硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，并显示出淋巴样特征（Prox1-EGFP+，PDPN+，LYVE1-，CRABP2+，VEGFR3-，CLDN-11-和E-Cad-）。有意思的是，SLYM与外周器官表面的间皮层具有相同的特征。因此，SLYM可能就是大脑的间皮层，起到减少运动时脑组织与颅骨之间摩擦的作用。 SLYM在免疫表型上有别于硬脑膜、蛛网膜和软脑膜 那SLYM还有其他功能吗？答案是肯定的。 研究人员在Prox1-EGFP+小鼠的大脑切片中发现，Prox1-EGFP+SLYM细胞经常与静脉窦内皮细胞直接接触并形成紧密连接，且这种紧密结合是可渗透的，允许小分子在血液和脑脊液之间进行交换。 此外，SLYM还起到免疫屏障的作用，可阻止外周的免疫细胞直接进入深层的脑脊液中，同时SLYM中常驻着免疫细胞。而在脑部出现炎症或脑部退行性改变后，SLYM中的免疫细胞明显增多，LYVE1+、CD206+和CD68+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞会在SLYM上聚集，表明SLYM具有免疫监视的作用。 SLYM具有监测脑脊液是否有感染和炎症迹象的功能 总的来说，该研究首次发现了大脑表面存在不同于硬脑膜、蛛网膜和软脑膜的第4层膜结构——SLYM，这将更新教科书中的解剖学基础知识。 SLYM控制着脑脊液和血液物质的交换，同时具有免疫屏障和免疫监视功能，与中枢神经系统感染和阿尔茨海默病等各种疾病均具有密切关联，值得进一步深入研究。 参考文献 1.Mollgard K, Beinlich FRM, Kusk P, Miyakoshi LM, Delle C, Pla V, Hauglund NL, Esmail T, Rasmussen MK, Gomolka RS et al: A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science 2023, 379(6627):84-88. 2.Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, Benveniste H, Vates GE, Deane R, Goldman SA et al: A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Sci Transl Med 2012, 4(147):147ra111. 3.Louveau A, Smirnov I, Keyes TJ, Eccles JD, Rouhani SJ, Peske JD, Derecki NC, Castle D, Mandell JW, Lee KS et al: Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature 2015, 523(7560):337-341. 4.https://www.urmc.rochester.edu/news/story/newly-discovered-anatomy-shields-and-monitors-brain