EXOSC10

尼帕病毒（Nipah Virus）是具有包膜的负义单链RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridea），与埃博拉病毒是近亲，其天然宿主是果蝠。1998年，尼帕病毒在马来西亚首次爆发，感染了数百个人和动物，造成了大量的经济损失。之后，尼帕病毒也在其他国家，例如菲律宾、印度和孟加拉，有过爆发。时至今日，印度和孟加拉依旧每年有尼帕病毒爆发的报道。尼帕病毒感染会使人患致死性脑炎，其致死率在40%～75%之间。然而，目前尚没有可以用来预防或治疗尼帕病毒感染的有效药物或抗体。除了致死性脑炎，尼帕病毒感染者也可能是无症状的，这大大提高了尼帕病毒大范围爆发的可能性，并可能威胁全球人类的安全健康。 近日，哈佛医学院Jonathan Abraham团队与波士顿大学医学院Rachel Fearns团队（共同一作为胡思德、Heesu Kim、杨盼）合作在Cell上发表了文章Structural and functional analysis of the Nipah virus polymerase complex(尼帕病毒聚合酶复合物的结构和功能的分析)。 该研究分析了尼帕病毒聚合酶复合物（包括一个L蛋白和四个P蛋白）的结构，并利用生化实验寻找并验证了几个影响尼帕病毒聚合酶复合物活性的位点。最后，利用分子动态对接（Molecular dynamics docking），他们解释了一个药物对多种副黏病毒的L蛋白有效但是对尼帕病毒的L蛋白无效的原因，使之有望成为药物设计的起点。 研究团队首先利用冷冻电镜技术，解析了尼帕病毒聚合酶复合物NiV L-P的高分辨率的结构。在对该复合物结构进行分析的时候，他们发现了几个特殊的位点。第一个是一段特殊的L蛋白的序列，该序列的结构在尼帕病毒的L蛋白上（氨基酸603～709）没有被观测到。然而通过氨基酸序列比对，他们发现相比于其他的L蛋白，NiV L的这段序列明显较长，例如，尼帕病毒的L蛋白比埃博拉病毒的L蛋白在这一段多100多个氨基酸。由于L蛋白有一个保守的右手“大拇指-手指-手掌”（Thumb-fingers-palm）结构，而这一段序列在尼帕病毒的L蛋白中位于手掌区域，这部分序列被称为“手掌插入”（palm insert）。 第二个是其中一个P蛋白单体（P4）的序列，被成为多肽延伸（peptide extension）。这个部分与另外一个结合在L蛋白RdRp结构域的P蛋白到XD分别位于RdRp结构域的两侧。有意思的是，这个多肽延伸在其他的副黏蛋白结构上没有被观测到，然而，在肺病毒科（Pneumoviridae）上可以看到其P蛋白的一部分在这个位点走势高度一致。值得一提的是，P蛋白在不同科甚至不同属里面都不是保守的，其序列乃至长度差别都非常大。所以这个结果表明，P4的多肽延伸可能是一个高度保守的特点。 为了研究这些特点还有一些其他的保守的解雇特点，比如锌指结构域（zinc finger motif）和HR结构域等对L-P蛋白复合物活性的影响，该团队利用微基因组实验（minigenome assay）对这些突变体进行了验证。微基因组实验包括两个系统，一个是多循环系统，另一个是一步复制系统。在多循环系统中，细胞可以表达T7 RNA聚合酶，在将基因组、L、P和N的基因转化到细胞之后，T7 RNA聚合酶可以启动L、P和N蛋白的表达，并将基因组复制以产生反义基因组。然后在L-P蛋白复合物的作用下，反义基因组可以转录产生mRNA或者复制产生基因组。在一步复制系统中，由于5‘短有一个突变，在这个系统中，可以利用基因组产生反义基因组和mRNA，而反义基因组不能在L-P蛋白复合物的作用下生成基因组。然后，通过RNA印记对基因组、反义基因组和mRNA进行探测，可以判断这些突变影响的是基因组复制还是mRNA转录。 试验结果表明，HR结构域、palm insert和锌指结构域都会让L-P复合物失去RNA合成的能力，P4 多肽延伸则会导致其活性下降为野生型的30%左右。这些结果表明，这些位点都会影响L-P复合物的活性。 有意思的是，由于其他的L蛋白的palm insert很短，如埃博拉病毒，该团队一开始猜测palm insert不会影响其活性。然而，出乎意料的是，生化实验表明palm insert删除会导致L蛋白失去合成RNA的能力。这表明palm insert参与RNA合成的过程在单链负义RNA病毒目（Mononegavirales）的不同病毒中是不同的。换言之，虽然单链负义RNA病毒的聚合酶复合物大体结构类似，表明它们合成RNA的过程也大体相同，但是它们在细节上可能有较大的差别。 最后，该团队利用分子动态对接，将GHP-88309对接到聚合酶复合物中。GHP-88309是一个广谱到抗副黏病毒的药物，可以抑制多种副黏病毒L蛋白的活性，然而，这个药物对尼帕病毒无效。之前的结果表明，将NiV L蛋白的H1165突变成Y，可以让GHP-88309的抑制效果提高60多倍。对接结果表明，GHP-88309的环氮距离H1165的咪唑基太远（6.1 Å），不能形成氢键，而Y1165则将它缩短为3 Å，这使GHP-88309可以有效地与L蛋白结合。而通过AlphaFold3，该团队预测了L-RNA的复合物的结构，这个结构则表明GHP-88309的结合位点恰好位于模版RNA出L蛋白的位置，使RNA延伸不能得以继续下去，抑制了RNA的合成。 本研究为L-P聚合酶复合物在RNA合成中的作用提供了新见解，并且找到几个可以影响其活性的位点，增加抗尼帕病毒的药物设计的可能性。而分子动态对接和结构预测的结果，则合理地解释了GHP-88309对尼帕病毒L蛋白无效的原因，接下来的研究可以利用这一结果，以GHP-88309为起点进行改造，从而实现对尼帕病毒L蛋白的有效抑制。 原文链接： https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01434-X 本文转自【BioArt】公众号 --------- End --------- 感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。

中文摘要 目的   研究肺炎球菌多糖结合疫苗中各血清型肺炎球菌在液体培养基中传代培养的稳定性。 方法   在液体培养基中对各代次肺炎球菌的培养时长进行对比；对第15代次（P15）与P4（对照组）进行菌种检定与荚膜多糖抗原基因序列分析；将P15菌种按生产工艺进行发酵培养，分析培养情况和荚膜多糖抗原产量及质量，与P4代次对比。 结果   在P7—P15中，各代次培养时长相近，且P15菌种检定、抗原基因序列与P4相比无差异，序列相似度为100%；P15菌种发酵培养后，菌体生长、荚膜多糖产量与荚膜多糖相关检定指标与P4无明显差异，且均符合中国药典质量标准。 结论   用于生产肺炎球菌多糖结合疫苗的各血清型肺炎球菌在液体环境中传代培养稳定。 正文 肺炎球菌广泛分布于自然环境、人类鼻咽与动物粪便中，已鉴定出超过100个血清型，少数可对人类致病，引起脑膜炎、菌血症、肺炎等，导致免疫力低下人群死亡。虽然抗生素治疗肺炎球菌感染的效果良好，但抗生素的不合理使用导致肺炎球菌耐多药菌株不断增加，使得预防显得尤为重要。当前有2类疫苗可用于预防肺炎球菌感染，即肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗。肺炎球菌多糖疫苗在婴幼儿、老年人和免疫缺陷者等人群中免疫应答低下。这种缺陷可以通过将多糖抗原与蛋白载体缀合来克服。另外，还有一些肺炎球菌蛋白以及灭活疫苗正处于上市申报或临床试验阶段。 随着肺炎球菌疫苗数量和种类的不断增加，中国药品监管部门对疫苗产量和质量的把控越来越严格。疫苗产量和质量的稳定性由菌种和工艺稳定性决定。据调研，目前尚无对肺炎球菌传代稳定性的报道。本研究采用更接近发酵环境的液体培养基对肺炎球菌进行传代培养，对其生物学特性、荚膜多糖产量与疫苗多糖质量等方面进行分析，从而确定肺炎球菌在液体环境中的传代稳定性。 1 材料与方法 1.1 菌株 肺炎球菌菌株来自中国医学细菌保藏管理中心，各血清型菌株号见表1。 1.2 材料 1.2.1　试剂　固体菌种培养基与液体发酵培养基主要成分：大豆蛋白胨（25 kg/桶）购自法国Organotechnie公司，L-半胱氨酸盐酸盐（5 kg/袋，药用级）购自天津天药药业股份有限公司，L-色氨酸（100 g/瓶，生化试剂）购自国药集团化学试剂有限公司，L-酪氨酸（25 kg/桶， 药用级）购自天津天药药业股份有限公司，磷酸氢二钾（1 kg/袋，药用级）购自湖南九典宏阳制药有限公司，浓盐酸（500 ml/瓶，药用级）购自湖南尔康制药股份有限公司。葡萄糖发酵管、菊糖发酵管、棉子发酵管、蜜二糖生化管、山梨醇发酵管购自青岛海博生物技术有限公司，奥普托欣纸片购自温州市康泰生物科技有限公司。 1.2.2　菌种　肺炎球菌工作种子由北京民海生物科技有限公司自制，-70 ℃保存。 1.3 仪器 311二氧化碳培养箱、SORVAIL LYNX6000高速离心机购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，SP-752紫外分光光度计购自北京普希科技有限公司，VS-1300L-U洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，BLBIO-5GJ-4-H四联机械搅拌玻璃发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司，JMCDSPCONS超滤系统购自德国Merk Millipore公司。 1.4 各代次培养时长对比 将肺炎球菌工作种子第4代（P4）接种于固体菌种培养基上，为P5，培养一段时间后接种于液体发酵培养基中，为P6，此后在液体发酵培养基中连续传代培养至P15。菌浓度以694 nm处吸光度值（A694 nm）表示，P6—P15均在液体发酵培养基中培养至A694 nm达0.4~0.6时，对培养时长进行统计。 1.5 菌种检定 向P15菌液中加入体积分数30%的甘油，-70 ℃保存。对P15菌种与P4菌种（对照）进行菌种检定，检定项目包括培养特性、染色镜检、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿胀试验。 1.6 荚膜多糖相关基因测序 10 000×g离心收集P15菌体，委托北京诺禾致源科技股份有限公司利用Oxford Nanopore测序技术进行第3代全基因组测序。使用DNAMAN软件对P15菌种与P4菌种（对照）的荚膜多糖合成相关的基因序列进行对比。 1.7 生产适用性 1.7.1　发酵研究　将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类，分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验对象。 分别开启肺炎球菌P15菌种与P4菌种（对照），经1代复苏后，分别转种于150 ml液体培养基中进行2代培养，A694 nm达0.4~0.6后分别转种至2.5 L发酵罐进行分批补料发酵培养。 1.7.2　多糖纯化　发酵培养结束后，加入0.1%脱氧胆酸钠杀菌；15 000×g离心去菌体，上清液经超滤后进行酸沉（向超滤浓缩液中加入冰醋酸调pH至4.00±0.20，静置1~3 h）、醇沉（料液中加入无水乙醇静置3~24 h），再经10倍1 mmol/L醋酸钠缓冲液对离心后的上清液洗滤后得到精制多糖原液。根据中国药典2020年版三部（药典三部）通则3429免疫化学法速率散射比浊法测定多糖含量。分别对P15与P4（对照）菌种发酵液纯化后的多糖原液进行检测，参照药典三部相关方法，对多糖原液进行检测，包括固体总量、蛋白质含量（Lowry法）、核酸含量（分光光度法）、总氮（凯氏定氮法）、总磷（钼酸铵法）、分子大小〔琼脂糖凝胶（SepharoseCL-4B/SepharoseCL-2B）过滤法〕、氨基己糖（二氨基苯甲醛显色法）、甲基戊糖（半胱氨酸显色法）。 2 结果 2.1 各代次培养时长对比 P6—P15各代菌种在液体发酵培养基中培养至相同的菌浓度（A694 nm达0.4~0.6），培养时长见图1。P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。P7—P15各代次培养时长相近，在传代过程较稳定。 2.2 菌种检定结果 各血清型P15菌种检定结果均合格：培养特性试验结果均符合规定；染色镜检均为革兰阳性球菌；生化反应葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二糖均为阳性，山梨醇为阴性；胆汁溶菌试验菌液均变透明；奥普托欣试验除33F血清型对照试验抑菌圈直径为16 mm外，其余试纸抑菌圈直径均为15 mm；荚膜肿胀试验菌体周围均可见明显无色荚膜。结果表明在液体环境中传代对肺炎球菌无影响。 2.3 荚膜多糖相关基因测序 荚膜多糖相关基因位点位于dexB和aliA之间，关键序列长约20 000 bp。对各血清型P15、P4 菌种的荚膜多糖相关基因序列进行对比，相似度均为100%。表明肺炎球菌在液体培养基环境中传代稳定。 2.4 发酵研究数据分析 分别将P15、P4（对照）菌种复苏后，用相同的发酵培养基与发酵条件进行发酵，并观察与对比同一血清型的2条发酵生长曲线，见图2。3、5、9N、17F、33F型肺炎球菌在发酵的迟缓期、对数生长期和稳定前期均无明显差异。当发酵进入对数后期或稳定前期时进行收获，收获时间点如图中标示的点所示。P15菌种收获时菌浓度与对照无明显差异。 分别对P15与P4（对照）的发酵液进行多糖含量检测，并对其发酵的多糖表达量进行计算，见表2。3、5、9N、17F、33F型P15菌种发酵表达量与P4（对照）无明显差异。 2.5 多糖纯化数据分析 由表3可知，3、5、9N、17F、33F型P15与P4（对照）的多糖原液各项指标无明显差异，且均符合药典三部23价肺炎球菌多糖疫苗标准。 3 讨论 将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类。第1类包括1、2、6A、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F和23F；第2类包括8、9N、9V、11A、14和15B；第3类包括10A、20和33F；第4类包括4、5和12F；第5类包括3型。本研究分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验研究对象。 肺炎球菌传代培养时，P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，且由于不同血清型适应能力不同，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。不同血清型在P7—P15各个代次中，培养至相同菌浓度（A694 nm在0.4~0.6）时，其培养时长在传代过程中都较为稳定。在检测方面，根据药典三部通则规定的形态及培养特性、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、血清凝集试验及遗传稳定性研究等方法，分别对P15与P4（对照）菌种进行检定。药典三部中规定主种子批启开后至工作种子批，传代应不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过5代。通过上述实验和检测结果，可以得出结论：各血清型肺炎球菌菌种在生物学特性、生化特性、血清凝集试验和分子遗传特性等方面均符合23价肺炎球菌多糖疫苗各论要求，从而证实了肺炎球菌在使用代次内传代过程中能够稳定遗传。 在遗传稳定性方面，对肺炎球菌1个代次菌种经培养收获的菌体进行了全基因组测序，并对肺炎球菌荚膜多糖合成的靶位点基因序列进行对比，相似度均为100%。使用3代测序技术对肺炎球菌荚膜多糖关键基因片段进行检测，P4与P15测序中暂未发现序列突变，通过比较不同传代水平菌种基因组的核苷酸序列确定了种子批的遗传稳定性。通过对基因组的测序结果分析可以在后续的生产和使用过程中更好地保存、管理、监测菌种。 通过控制单一变量的方法，分别将P15与P4代次复苏后的3、5、9N、17F、33F型菌种进行发酵培养，同一血清型发酵生长曲线的迟缓期、对数生长期和稳定期均无明显差异，且P15与P4菌种的发酵表达量无明显差异，均在800 μg/ml以上，从而证实了肺炎球菌在使用代次内的传代过程中具有良好的遗传稳定性。 本研究通过分析肺炎球菌菌种、发酵培养阶段生物学特性、遗传稳定性和纯化阶段产量一致性，确定了肺炎球菌多糖疫苗生产用菌种不同批次培养后菌种传代稳定性，从而保证生产过程中菌种稳定性及产品产量和质量的稳定性。 综上所述，肺炎球菌菌种建立的主种子批、工作种子批均符合中国药典要求，具有良好的细菌培养传代稳定性。这一研究为肺炎球菌疫苗的生产研究和质量控制奠定了良好的研究基础，同时也为进一步研究肺炎球菌的基因遗传和表观遗传稳定性提供了有力的依据。后续将做好生产研发菌种的传代试验以保证疫苗质量符合规程要求，增加多批次发酵的数据并进行分析，从而使研究结果和讨论有据可依，为肺炎球菌多糖结合疫苗菌株遗传稳定性相关研究奠定良好理论依据。 作者 陈淑霞  王研研  汪辉  陈晓莹  蒋春红  于肖寒  李跃龙  曹欣 北京民海生物科技有限公司，结合疫苗新技术研究北京市重点实验室，北京  102600 通信作者：曹欣， Email：caoxin@biominhai.com 引用本文：陈淑霞, 王研研, 汪辉, 等. 肺炎球菌多糖结合疫苗菌株传代稳定性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 349-354.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240415-00015 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。

2025年1月4日，浙江大学车金鑫/董晓武团队在国际顶级药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为Auto-RapTAC: A Versatile and Sustainable Platform for the Automated Rapid Synthesis and Evaluation of PROTAC的论文。 该研究针对PROTAC发现过程中合成繁琐和生物活性评估通量有限的难题，创新性地构建了Auto-RapTAC平台，实现了PROTAC的自动化快速合成和高通量评估。通过该平台，研究团队在短时间内针对多个靶点成功识别出新的PROTAC先导化合物，为PROTAC药物的快速开发提供了强有力的工具和方法，有望推动蛋白质降解药物研究的进一步发展。 前言 PROTAC（蛋白质降解靶向嵌合体）的设计在很大程度上依赖于经验方法，繁琐的合成程序和具有挑战性的纯化对结构多样性的PROTAC的合成构成了重大挑战。此外，PROTAC活性评估的大部分工作传统上依赖于Western blot来观察细胞裂解物中蛋白质水平的变化，但其生物测定通量不足常常阻碍了对构效关系（SAR）的理解和PROTAC效力的快速验证。因此，这些问题极大地限制了预期的快速PROTAC发现。考虑到PROTAC是一类异双功能分子，其模块化特性使得其两个结构组分可以预先组合，从而形成构建块库。 许多合成方法已被研究，如“点击化学”、无痕Staudinger连接、RapidTAC和“直接到生物学（D2B）”方法。这些预组装的基元通常在适当的末端功能化以引入特定的官能团，并已有效地用于识别针对BRD4、FGFR1、PARP1等靶标的强效PROTAC。研究启发认识到，反应就绪的合成构建块可以显著简化降解剂的组装，并大大加快PROTAC的制备。此外，生物相容的反应系统可以直接用于后续的生物评估而无需进一步纯化；例如Rapid-TAC和preTACs-cytoblot平台已展示了用于高通量评估PROTAC的“Ready-for-screening”（R4S）策略。因此，假设将构建块库与R4S结合可以进一步加快发现过程，但仍然需要大量人工干预，可能会限制该策略的应用。 近年来，机器人实施的自动化化学实验标志着人工智能（AI）驱动实验室的开始。如SynCar、ASL、chemputer和AutoSyn等药物分子的自动化合成技术，不断推动自动化技术和化学合成的融合。然而，当前的自动化合成技术大多集中在具有相对简单和固定合成过程的聚合物，如多肽、寡糖和寡核苷酸。此外，自动化合成平台依赖于特定的合成方法。活性分子的获取必须经过广泛的生物筛选和评估。这表明自动化系统的干预可能有助于PROTAC的合成和标准化产品，这对于R4S策略所需的直接生物评估尤为重要。然而，大多数机器人系统价格昂贵且需要在复杂的实验室环境中操作。因此，开发一种新的可持续的机器人系统以将构建块库与模块化PROTAC组装相结合是非常必要的。 在获得PROTAC分子实体后，其活性评估是发现PROTAC的另一个主要速率限制步骤。传统的Western blotting方法需要多次洗涤和孵育步骤，如低通量使其不适合快速初步筛选。此外，一些方法和技术的出现并帮助加速了蛋白质水平变化的测试工作，包括荧光蛋白融合和报告标签、流式细胞术、时间分辨荧光能量转移（TR-FRET）和分裂荧光素酶系统。例如，基于毛细管电泳免疫分析（CEI）的数字Western blot技术，已自动化了蛋白质分离和免疫检测程序，将获得定量结果的过程缩短到不到3小时。此外，更高通量的检测技术正逐渐实施，如Nano-Glo HiBiT检测系统和基于荧光的筛选，这些技术促进了基于高通量板和时间依赖性评估，从而加速了PROTAC的评估。这些启发研究人员将检测技术整合，促进特定降解蛋白的快速筛选，并进一步缩短PROTAC的评估周期。 为此，研究人员提出并建立了一个名为Auto-RapTAC（自动化辅助快速PROTAC发现）的平台，可以高效地识别新的PROTAC。通过整合构建块库、自动化合成和快速评估，增强的工作流程使得在8天内发现针对一个靶标的PROTAC成为可能。借助该平台，研究人员对三种类型的靶标进行了确认工作，包括CDK2、CDK12和BCL6，这为Auto-RapTAC平台快速发现新的先导PROTAC的能力提供了概念验证。共制备并评估了160种PROTAC，发现了六种高效的降解剂，它们可以作为工具分子或进一步效力研究的有前途的起点。此外，整个过程还在短时间内提供了一些信息，包括初步的SAR、靶标的可降解性和最佳E3连接酶的招募。 Auto-RapTAC架构的开发 作者基于PROTAC分子的模块化特性及R4S准则，构建了Auto-RapTAC体系架构。 首先，受 “click chemistry” 启发，利用铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）构建了包含POI弹头库（PWL）和E3配体-连接子共轭物库（ECL）的 “Easy Pack” 库，对配体进行修饰以引入特定官能团。在此基础上，开发了自动化合成PROTACs的新架构，将起始原料溶解于DMSO溶液，通过包含机械臂、液体分配设备、封盖设备、反应区和HPLC转化分析等模块的自动化干预进行操作，产物无需进一步纯化即可用于后续生物测试，实现了PROTAC组件的正交组装。同时，开发了基于网络的控制软件，集成用户权限管理、数据库、任务提交和实时摄像头等功能，用户可远程登录局域网访问、控制平台并查看实时画面，数据库用于记录原始PWL/ECL信息，任务提交模块可编辑反应参数驱动自动化平台组装，摄像头模块可上传实时图像便于远程监控。 Auto-RapTAC平台的实用性 首先，为满足生物相容性要求并加速自动化合成的转化，针对CuAAC反应的正交组装条件进行优化实验。以特定的POI配体和E3配体片段为模型底物，筛选如E5当量、催化剂/配体比例、反应温度和时间等变量，并通过HPLC系统比较反应序列的粗纯度。结果表明，提高CuSO₄/TBTA摩尔百分比、反应温度和E5当量可提升转化率，综合考虑后续实验流程，确定反应时间为3小时等组装策略条件。 接着以CDK2为靶点进行概念验证研究。选择CDK2抑制剂的衍生物作为弹头，结合修饰后的E3配体-连接子共轭物，利用平台进行自动化组装。反应完成后经HPLC分析，96个CuAAC反应中82个POI弹头转化率超70%，体现了该组装策略的高反应性和广泛适用性。在R4S原则下，通过基于GFP的荧光测定法对反应混合物直接进行高内涵荧光成像评估降解效果，多数PROTAC化合物显著诱导CDK2降解，部分组合的降解能力与基准化合物CPS2相当或更强。初步筛选后对部分化合物进行放大合成和纯化分析，确定了活性CDK2 PROTACs的相关SAR，如连接子主要为特定长度的烷基链，且主要通过招募CRBN和VHL配体发挥作用，其中VHL招募配体降解活性更优，整个过程在8天内成功鉴定出强效的CDK2 PROTACs，证明了平台在快速发现新型PROTACs方面的高效性。 针对CDK12和BCL6的PROTACs自动组装与评估过程 鉴于CDK12在DNA损伤反应基因转录中的关键作用及当前抑制剂的毒性问题，以及BCL6在弥漫性大B细胞淋巴瘤发生中的重要性和其作为治疗靶点的潜力，研究选取相关衍生物修饰为弹头（CDK12弹头P4、BCL6弹头P5），并结合ECL利用Auto-RapTAC平台进行快速自动化组装。结果显示，64个反应转化率较高，部分产品转化率超60%，最高达90%，表明组装策略具有一定底物耐受性。随后分别在Hela细胞系（通过cytoblot分析）和HEK 293T细胞系（基于GFP的荧光分析）中评估CDK12和BCL6 PROTACs的降解能力，多数CDK12组装产物在1 μM浓度下表现出高降解率，特定的 VHL和MDM2招募的PROTACs降解率超 60%；BCL6 PROTACs中部分含特定碳链长度脂肪族连接子的化合物效果最佳。进一步对筛选出的领先PROTAC候选物（CDK12的P4E28、P4E30和BCL6的P5E17、P5E27）进行放大组装、纯化和重新评估，合成过程在2小时内完成且转化率超70%，纯化后纯度超95%，Western blotting 结果显示这些PROTACs在低浓度下具有良好降解活性且呈剂量依赖性，未出现钩状效应，最终确定了它们针对相应靶点的DC50值，证明了平台合成的PROTACs对目标蛋白具有靶向降解效能。 总结 目前，自动化合成主要集中在两个方向：第一个方向是高度定制化的平台，这些平台根据特定化合物的工艺特性整合各种设施，如泵、电磁阀和反应器，专门设计用于合成特定化合物或其直接相关的衍生物。第二个方向是通用合成平台，这些平台不限于特定分子，而是设计用于容纳广泛的化学转化策略和常见操作。例如，AbbVie、Sanofi、Eli Lilly和AstraZeneca等公司开发了多种形式的自动化合成平台，能够支持包括酰胺偶联、还原胺化和Suzuki偶联在内的多种反应。 尽管自动化合成平台取得了显著进展，但仍存在一些挑战： （1）现有平台主要解决特定领域的问题，具有有限的通用性和高昂的建设成本，限制了其广泛应用。 （2）许多硬件模块控制端口未开放，使得与自动化系统的整合变得复杂。 （3）参与合成的人员通常缺乏机械设计和软件编程的专业知识，需要与这些领域的专业人士合作，可能导致沟通困难。 （4）这些平台生成的数据存储和使用的标准化问题尚未解决。 因此，在解决这些挑战的同时，考虑开发成本效益高的平台以解决特定科学问题是一个值得探索的方向。由于PROTAC三元复合物的作用机制复杂且传统合成路线较长，PROTAC的快速发展受到显著阻碍。目前，已研究了多种合成方法，如“Rapid-TAC”和“direct-to-biology（D2B）”方法。这些快速发现PROTAC的化学方法为自动化合成平台的发展奠定了基础。因此，开发一个整合快速合成方法的模块化自动化平台以加速PROTAC分子的发现具有极其重要的意义和价值。 本研究建立了一个基于传统批量反应模型的轨道式机械臂辅助自动化合成工作站，以实现PROTAC的快速组装。通过实施这一协同硬件-软件自动化合成平台，快速识别了针对CDK2、CDK12和BCL6的PROTAC。这些结果表明，AutoRapTAC平台可以显著提高PROTAC的合成前景，从而加快其发现。 因此，该平台的优势包括： （1）构建软硬件模块的方法，无论是内部设计还是商业采购，包括六轴机械臂、移液站、多功能工作站、封盖站、液相色谱系统和网络软件，为其他研究人员提供了开放的参考，简化了自动化系统的整合。 （2）“eassy pack”方法与自动化合成硬件平台的整合，使得在短短8天内即可获得活性分子，大大提高了药物研究的效率。AutoRapTAC平台的适应性表明，它可以针对化学研究的更广泛应用进行微调。 为了增强其实用性： （1）对于平台硬件的优化，将增加液相色谱-质谱（LC-MS）和制备型高效液相色谱（PREP-HPLC），以增强平台的分析和纯化能力。 （2）对于构建块库的扩展，将整合高质量的构建块用于异双功能模式的设计，包括弹头库和E3连接酶配体-连接子偶联物库。弹头库将扩大并覆盖不同类型的蛋白质，如激酶、转录因子、跨膜蛋白、RNA等。连接酶配体-连接子偶联物库将基于其他效应机制进行扩展，如自噬机制、内体/溶酶体、磷酸化途径、RNase L等。此外，基于之前关于异双功能分子药物性探索的报告，连接酶配体-连接子偶联物库的结构类型将进一步更新。例如，将引入N-杂环连接子，使先导分子更具药物性潜力。 （3）对于组装策略的更新，除了点击化学外，还将探索活性酯的偶联反应、烷基化反应、Staudinger反应、固相合成等策略，以考虑合成可及性、生物相容性和药物性等因素，扩展更广泛的组装方法。 （4）为了改进生物筛选系统，将在网络软件中整合一个目标搜索程序，与现有的主流药物靶标数据库集成。设置了多个初始筛选浓度，以涵盖药物的有效范围，同时避免过高或过低的浓度影响实验结果。 这一增强将有助于根据不同靶标建立不同的初始筛选浓度和时间阈值。通过这些改进，Auto-RapTAC平台预计将显著加快先导异双功能分子的优化过程，从而缩短开发时间线，帮助药物化学家加速药物开发进程。 参考来源： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02438 --------- End --------- 感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。