RSPO1

深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769近期，国人团队发表重要综述 Organoids: opportunities and challenges of cancer therapy，仅需一张图简明扼要地总结了不同肿瘤类器官培养方法的关键。从肿瘤组织中通过机械或酶解获得肿瘤细胞，用几乎相同的基础培养基进行培养，而细胞因子是肿瘤类器官培养成功的决定因素之一。不同肿瘤类器官培养方法的简要概述（源自参考文献：Organoids opportunities and challenges of cancer therapy）接下来，我们将重点介绍几种重要的肿瘤类器官培养基组分及方案。1. 胃癌类器官通过构建源自胃癌患者的类器官（PDO），能够直接对临床样本进行研究。Vlachogiannis 等人为了成功培养胃癌类器官，除了使用 ADMEM/F12 培养基和基底膜基质外，还添加了 EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10 等细胞因子。胃癌患者的类器官（PDO）培养步骤：如下实验流程和数据均引用Vlachogiannis等人发表的文章（doi: 10.1126/science.aao2774），供参考。1，配置 PDO 培养基：改良的 DMEM/F12 基础培养基，添加 1x B27 additive、1x N2 additive、0.01% BSA、2 mM L-Glutamine、100 units/ml 青霉素-链霉素，以及如下表的细胞因子或其他添加物：*HGF 仅用于胆管癌类器官。2，样本收集：通过图像引导或内窥镜手术收集活检样品。收获后，样本置于冷 PBS 中，并在冰上运输到实验室，20 分钟～2 小时内将组织切片切碎。3，样本处理：组织切碎后，加入 5 ml 5 mM  的 PBS/EDTA，室温静置 15 分钟。用含有 2x TrypLe 的 1 mM PBS/EDTA 5 ml 在 37 ℃ 消化 1 小时。施加机械力（如吹液）以促进消化。4，接种细胞：用改良的 DMEM/F12 培养基收集分离的细胞，并在 4 ℃，1,200 转/分离心 5 分钟，使细胞成球状，用 120 µl GFR 基质胶重悬，接种到 24 孔或 48 孔的平底细胞培养板中。5，将基质在 37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 20 分钟，进行固化。然后添加 500 µl 配置好的 PDO 培养基，要完全覆盖培养孔。6，每两天换一次培养基。2. 结直肠癌类器官患者来源的肿瘤类器官已成为结直肠癌临床前研究的一种出色的模型，原代上皮细胞可在特定生长因子的控制下和 3D 细胞外基质（ECM）中成功培养类器官。肠上皮细胞的自我更新由位于隐窝中的 Lgr5 干细胞驱动。Wnt 信号是维持隐窝干细胞活跃所必需的，Wnt 激动剂 R-Spondin 1 是 Lgr5 的配体，诱导隐窝增生。EGF 信号与肠道增殖有关，Noggin 诱导隐窝数量的急剧增加。因此 van de Wetering 等人开发的结直肠癌类器官培养体系如下：（如下实验流程和数据均引用 van de Wetering 等人发表的文章（doi: 10.1016/j.cell.2015.03.053），供参考。）1. 基础培养基：改良的 DMEM/F12 培养基，添加青霉素-链霉素、10 mM HEPES 和 Glutamax。2. 人肠干细胞培养基：Wnt 条件培养基、R-Spondin 1 条件培养基、Noggin 条件培养基和基础培养基按照 50%、20%、10% 和 20% 的体积比混合，然后加入 1x B27、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、50 ng/ml 人 EGF、10 nM Gastrin、500 nM A83-01、3 uM SB202190、10 nM Prostaglandine E2 和 100 mg/ml Primocin。3. H&E 染色分析：通过 H&E 染色对培养后的原代肿瘤细胞和类器官进行分析，发现大多数类器官的特征是存在一个或多个管腔，与原代肿瘤的管状结构相似（如 P8 和 P19b），没有管腔的原代肿瘤会形成没有管腔的紧凑型类器官（P19a）。肿瘤类器官与原代肿瘤上皮相似3. 肝癌类器官肿瘤类器官的培养非常复杂，如肝癌类器。原发性肝细胞癌主要分为肝细胞癌（HCC）、胆管细胞癌（CC）和混合型（CHC）。在肝细胞癌类器官培养中需要使用地塞米松但是胆管细胞性肝细胞癌类器官培养则需加入 R-spondin 1 来维持细胞生长。Broutier 等人发现原发性肝癌（PLC）组织培养获得的类器官可以在体外真实地模拟人类 PLC 的遗传复杂性。构建的类器官包含 PLC 常见的三种亚型：HCC、CC 和 CHC，再现亲本肿瘤的组织结构和表达谱，同时保留患者及亚型之间的差异性，有利于肝癌相关基因和潜在生物标志物的鉴定。肝癌类器官分类培养基：如下实验流程和数据均引用 Broutier 等人发表的文章（doi: 10.1038/nm.4438），供参考。1，基础培养基：改良的 DMEM/F12 培养基，添加 1% 青霉素-链霉素、1% Glutamax、10 mM HEPES 和 1:50 B27 添加剂。2，经典人肝类器官分离培养基：Wnt 条件培养基、R-Spondin 1 条件培养基和基础培养基按照 30%、10% 和 70% 的体积比混合，然后加入 1:100 N2 添加剂、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重组人 Gastrin I、50 ng/ml 重组人EGF、100 ng/ml 重组人 FGF10、25 ng/ml 重组人  HGF、25 ng/ml Noggin、5 uM A83-01、10 uM Forskolin、10 uM Y27632。3，肿瘤细胞特异性分离培养基：经典人肝类器官分离培养基中添加 3 mM 地塞米松。4，肝癌类器官培养基：基础培养基、10% （体积比）R-Spondin 1 条件培养基、1:100 N2 添加剂、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重组人 Gastrin I、50 ng/ml 重组人 EGF、100 ng/ml 重组人 FGF10、25 ng/ml 重组人 HGF、5 uM A83-01、10 uM Forskolin。4. 乳腺癌类器官乳腺癌类器官的培养基与其他肿瘤的略有不同。Seino 等人在类器官培养基优化过程中发现，Neuregulin 1 与乳腺发育和肿瘤发生有关，将其添加到培养基中可维持类器官有效再生和长期增殖（超过 20 代）。Wnt-3A 对类器官培养条件改善不明显。EGF 对乳腺癌类器官培养具有双重作用，高于 5 ng/ml 促进细胞增殖，但会导致类器官解体，失去自组织功能，低浓度则相反。Hans Clevers 等构建乳腺癌类器官的培养基组分：（如下实验流程和数据均引用 Hans Clevers 等人发表的文章（ doi 10.1016/j.cell.2017.11.010 ），供参考。）a：类器官出现解体时减少或不添加，b：浓度超过 1 μM 会降低类器官生成效率5. 肺癌类器官培养肺癌是全球常见的恶性实体肿瘤，但是肺癌早期临床表现不明显，容易与其他感染混淆而被忽视，一般确诊时已发展到中晚期，因此，及时准确地筛选合适的抗肿瘤药物对肺癌患者非常重要。1 份从原发性肿瘤组织中衍生出肺腺癌类器官（成功率达到 80%）的培养基组分：（如下实验流程和数据均引用Zhichao Li等人发表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供参考。）试剂详细配制指南关键：所有操作都应在二级生物安全柜中进行，以保持无菌状态。1200 μg/mL FGF-10 (10,000 X)a. 取100 μg溶于0.5 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 5 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。2250 μg/mL FGF-7 (12,500 X)a. 取 100 μg 溶于 0.4 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 4 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。3100 μg/mL R-spondin 1 (200 X)a. 取 250 μg 溶于 2.5 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 250 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 1 个月。4100 μg/mL Noggin (1,000 X)a. 取 100 μg 溶于 1 mL 无菌的 PBS（加 0.1%  BSA，质量/体积）。b. 每管 50 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 2 个月。5100 mM Y-27632 dihydrochloride (10,000 X)a. 取 50 mg 溶于 1.56 mL 的超纯水中。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 5 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 6 个月。6500 mM N-Acetylcysteine (400 X)a. 取 408 mg 溶于超纯水，至终体积为 5 mL。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 125 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。72 M Nicotinamide (200 X)a. 取 6.1 g 溶于 1x PBS，至终体积为 25 mL。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 250 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。830 mM SB202190 单盐酸盐水合物 (3,000 X)a. 取 5 mg 溶于 0.453 mL 的二甲基亚砜（DMSO）中b. 每管 16.67 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的黑色离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。关键：不要用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤含有 DMSO 的溶液，因为 DMSO 可以溶解这种膜。关键：使用黑色离心管，防止该溶液受到光照。建议：过滤 DMSO 溶液，可以使用 DMSO 安全过滤器或尼龙膜过滤器。925 mM A83-01 (50,000 X)a. 取 5 mg 溶于 0.474 mL 的二甲基亚砜（DMSO）中b. 每管 2 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。10分装基质胶a. 取一瓶新的基质胶，放于 4 ℃ 冰箱中解冻 8 小时。b. 将瓶子倒置几次，使其充分混合。c. 取 1.5 mL 的离心管置于冰上冷却。d. 将基质胶和 1.5 mL 的离心管置于冰上，按实验所需体积将基质胶分装到 1.5 mL 的离心管中，并在 -20 ℃ 保存。关键：移液器枪头应在抽吸基质胶之前，为了防止基质胶黏在枪头上，应通过多次抽吸和排出冷的无菌 PBS（含 01.% BSA）进行预湿和预冷。注意：基质胶是一种重组基膜制剂，富含胞外蛋白，应避免反复冻融。6. 卵巢癌类器官目前，培养卵巢癌类器官的方法有多种，但成功率较高的是使用基质胶和改良 DMEM/F12 基础培养基的组合，并辅以 EGF、FGF2、FGF10、Noggin、Rspondin1、p38 抑制剂等，可使类器官培养成功率达到 80%～90%。Senkowski 等人为了获得高级别浆液性卵巢癌（HGSC）类器官的长期培养方案，对培养基添加组分进行优化，获得两种成功率更高的配方。并且体外培养的 HGSC 类器官保留了原始肿瘤的基因组和表型特征，其药物反应与临床结果具有相关性。培养基优化主要涉及添加物种类和浓度，尤其是细胞因子类。研究人员在改良型 DMEM/F12 培养基中加入 Glutamax、Primocin、N-acetyl-cysteine 和 B27 添加剂构成基础培养基。通过分析添加剂对 HGSC 原代细胞短期类器官形成和生长的影响，使用添加 FGF-10、SB202190 和 A83-10 的基础培养基（M 0.1）进行优化。但 M 0.1 培养基能促进生长，但在传代后并不能维持生长。进一步确定 HGSC 类器官培养基配方中加入了 5 mM 烟酰胺，形成培养基 M1。在培养基 M1 中添加 EGF、Heregulin-β-1、Hydrocortisone 和 Forskolin，形成培养基 M2。对于不同的样品，M2 可能具有促进或抑制类器官生长的「矛盾」结果，因此为了最大限度地提高类器官形成，每个 HGSC 样品应在两种不同的培养基 M1 和 M2 中平行培养。类器官形成和长期培养测试的主要因子及其影响概述7. 其他肿瘤类器官膀胱癌类器官利用 CTOS 培养基进行培养，主要成分为改良型 DMEM/F12、B27、A83-01，需补充添加 FGF10、FGF7、HER3。培养前列腺类器官时，一般会加入 FGF10、FGF2、p38 抑制剂 SB202190、Rho 激酶抑制剂等，而小鼠前列腺癌类器官无需添加 FGF10、FGF2、PGE2、烟酰胺和 SB202190。文章来源：生物学霸END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

单细胞转录组测序数据显示胆管上皮细胞分化产生的肝细胞相较于肝脏祖细胞上调表达WNT/β-catenin信号通路相关基因，提示WNT/β-catenin信号通路调控胆管上皮细胞向肝细胞的分化。 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组和诺华生物医学研究所Jan S. Tchorz研究组合作，在 Nature 子刊 Nature Genetics 上以封面故事发表了题为：Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration 的研究论文。 该研究在人类多种肝脏疾病和小鼠肝损伤模型中鉴定出一群同时表达胆管上皮细胞和肝细胞特征的肝脏祖细胞；发现这群肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞；利用双同源重组示踪技术发现这群肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的能力；通过基因敲除及过表达发现Notch和WNT/β-catenin信号通路分别调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞、肝脏祖细胞向肝细胞的分化。 成体肝稳态中，大部分肝细胞处于静息状态，增殖缓慢；当肝脏发生损伤后，肝细胞重新进入细胞周期，参与损伤修复，维持肝脏功能。近年来，越来越多的实验证明在肝脏损伤中，肝细胞具有显著的再生能力，肝损伤主要通过肝细胞的自我增殖进行损伤修复，而肝祖细胞对肝细胞的贡献几乎可以忽略。然而，在肝细胞中进行β1-integrin基因敲除或者p21基因过表达来抑制肝细胞的增殖，同时利用谱系示踪技术标记胆管上皮细胞，在肝损伤模型中直接观察到胆管上皮细胞转分化为肝细胞，促进肝脏损伤修复。 研究人员通过给予小鼠长期喂养TAA等药物来诱导慢性肝损伤，也观察到在慢性肝损伤过程中胆管上皮细胞可以转分化为肝细胞参与肝脏再生。随后，多个不同研究组独立证明在肝细胞增殖受阻的肝损伤条件下，胆管上皮细胞可以贡献给肝细胞参与肝脏损伤修复。以往的研究中由于诱导胆管上皮细胞向肝细胞转变的效率太低，很难进行细胞和分子机制的深入研究。关于胆管上皮细胞向肝细胞分化是否经历肝脏祖细胞状态这一细胞机制及胆管上皮细胞向肝细胞分化的分子机制尚未明确。 在该研究中，研究人员首先构建了高效稳定的胆管上皮细胞向肝细胞转分化的遗传学模型，为胆管上皮细胞向肝细胞转分化的细胞及分子机制研究奠定基础。研究人员在Fah基因中插入loxp-stop-loxp序列，构建了Fah-loxp-stop-loxp（Fah-LSL）小鼠，阻止Fah基因的正常表达。Fah-LSL小鼠与组织特异性CreER小鼠结合可以在特定类型细胞中发生Cre-loxp同源重组，切除stop序列，使细胞恢复表达Fah基因的能力。对CK19-CreER;R26-tdT;Fah-LSL/Fah-LSL小鼠进行他莫昔芬诱导，可将胆管上皮细胞及其子代细胞标记为tdT+，同时在胆管上皮细胞及其子代细胞中将Fah基因中的stop序列切除，使胆管上皮细胞及其子代细胞恢复表达Fah基因的能力。之后对小鼠停止给予NTBC药物，肝脏呈现严重损伤状态，刺激胆管上皮细胞向肝细胞分化。该遗传学模型从基因组水平进行全身性Fah基因敲除，不存在抑制肝细胞增殖的效率问题，因为每个肝细胞都是缺乏Fah基因的，这样能够高效稳定地诱导具有表达Fah基因能力的胆管上皮细胞向肝细胞转分化，为研究转分化的细胞和分子机制奠定基础。 在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中，研究人员对Epcam+细胞进行单细胞转录组测序，结果显示Epcam+细胞群分为不同亚群；一群细胞高表达细胞增殖相关基因（Cdk1），定义为增殖的胆管上皮细胞群（Proliferating BECs）；一群细胞同时表达胆管上皮细胞分子标记（Krt19、Epcam）和肝细胞分子标记（HNF4a、Ttr），定义为肝脏祖细胞群（LPCs）。将上述单细胞转录组测序数据与之前报道的2组DDC诱导的肝损伤中Epcam+细胞的单细胞转录组测序数据进行整合分析，研究人员未在DDC诱导的肝损伤中检测到肝脏祖细胞；也未在正常肝脏中检测到肝脏祖细胞。同时，研究人员通过免疫荧光染色实验在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞，并且这些细胞也表达Epcam、A6、OPN等肝脏祖细胞分子标记；而DDC诱导的肝损伤中未检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞（图1）。此外，研究人员在多种人类肝脏疾病包括非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎等中发现肝细胞呈现衰老状态，并检测到CK19+HNF4a+肝祖细胞，发现肝细胞的衰老程度与肝祖细胞的产生呈现正相关联系；并且在这些人类肝脏疾病中，胆管上皮细胞未呈现衰老状态，提示在人的肝脏疾病中，胆管上皮细胞可能作为肝脏祖细胞的来源贡献给肝细胞而发挥重要作用。 图1：小鼠和人类肝脏LPC的鉴定 研究人员对单细胞转录组测序数据进行拟时序分析发现肝脏祖细胞来源于胆管上皮细胞；之后利用CK19-CreER工具小鼠标记并示踪胆管上皮细胞，揭示胆管上皮细胞可以贡献给肝脏祖细胞。为了研究肝脏祖细胞的分化潜能，研究人员利用双同源重组酶介导的谱系示踪技术来标记肝脏祖细胞（图2），示踪结果揭示肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的潜能。值得注意的是，肝脏祖细胞不具有增殖活性，并且单个肝脏祖细胞不能同时产生胆管上皮细胞和肝细胞。 图2：利用双重组酶特异性标记肝脏祖细胞 单细胞转录组测序数据显示肝脏祖细胞群相较于胆管上皮细胞群下调表达Hippo信号通路相关基因和Notch信号通路相关基因，提示Notch信号通路调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化。研究人员在胆管上皮细胞中进行Rbpj基因敲除，发现抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化（图3）。此外，研究人员利用Dibenzazepine药物来抑制Notch信号通路也证实抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。当在胆管上皮细胞中激活Notch信号通路后，则完全抑制了胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化，阻碍了肝脏再生。 图3：Notch信号通路抑制促进BEC形成TLPC

该研究在人类多种肝脏疾病和小鼠肝损伤模型中鉴定出一群同时表达胆管上皮细胞和肝细胞特征的肝脏祖细胞；发现这群肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞；利用双同源重组示踪技术发现这群肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细 成体肝稳态中，肝细胞处于静息状态，增殖缓慢；当肝脏发生损伤后，肝细胞重新进入细胞周期，参与损伤修复，维持肝脏功能。近年来，越来越多的实验证明在肝脏损伤中，肝细胞具有显著的再生能力，肝损伤主要通过肝细胞的自我增殖进行损伤修复，而肝祖细胞对肝细胞的贡献几乎可以忽略。 然而，爱丁堡大学Forbes研究组在肝细胞中进行β1-integrin基因敲除或者p21基因过表达来抑制肝细胞的增殖，同时利用谱系示踪技术标记胆管上皮细胞，在肝损伤模型中直接观察到胆管上皮细胞转分化为肝细胞，促进肝脏损伤修复。同一时期，第二军医大学长征医院谢渭芬研究组等通过给予小鼠长期喂养TAA等药物来诱导慢性肝损伤，观察到在慢性肝损伤过程中胆管上皮细胞可以转分化为肝细胞参与肝脏再生。随后，多个不同研究组独立证明在肝细胞增殖受阻的肝损伤条件下，胆管上皮细胞可以贡献给肝细胞参与肝脏损伤修复。 然而，关于胆管上皮细胞向肝细胞分化是否经历肝脏祖细胞状态这一细胞机制及胆管上皮细胞向肝细胞分化的分子机制尚未明确，其中一个重要原因是以前报道的方法诱导胆管上皮细胞向肝细胞转变的效率太低，很难进行细胞和分子机制的深入研究。 近日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（中科院生化细胞所）周斌研究组和诺华生物医学研究所Jan S. Tchorz研究组合作，在 Nature Genetics 期刊发表了发表题为：Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration 的研究论文。 该研究在人类多种肝脏疾病和小鼠肝损伤模型中鉴定出一群同时表达胆管上皮细胞和肝细胞特征的肝脏祖细胞；发现这群肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞；利用双同源重组示踪技术发现这群肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的能力；通过基因敲除及过表达发现Notch和WNT/β-catenin信号通路分别调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞、肝脏祖细胞向肝细胞的分化。 在这项研究中，研究人员首先构建了高效稳定的胆管上皮细胞向肝细胞转分化的遗传学模型，为胆管上皮细胞向肝细胞转分化的细胞及分子机制研究奠定基础。研究人员在Fah基因中插入loxp-stop-loxp序列，构建了Fah-loxp-stop-loxp（Fah-LSL）小鼠，阻止Fah基因的正常表达。Fah-LSL小鼠与组织特异性CreER小鼠结合可以在特定类型细胞中发生Cre-loxp同源重组，切除stop序列，使细胞恢复表达Fah基因的能力。对CK19-CreER;R26-tdT;Fah-LSL/Fah-LSL小鼠进行他莫昔芬诱导，可将胆管上皮细胞及其子代细胞标记为tdT+，同时在胆管上皮细胞及其子代细胞中将Fah基因中的stop序列切除，使胆管上皮细胞及其子代细胞恢复表达Fah基因的能力。之后对小鼠停止给予NTBC药物，肝脏呈现严重损伤状态，刺激胆管上皮细胞向肝细胞分化。该遗传学模型从基因组水平进行全身性Fah基因敲除，不存在抑制肝细胞增殖的效率问题，因为每个肝细胞都是缺乏Fah基因的，这样能够高效稳定地诱导具有表达Fah基因能力的胆管上皮细胞向肝细胞转分化，为研究转分化的细胞和分子机制奠定基础。 在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中，研究人员对Epcam+细胞进行单细胞转录组测序，结果显示Epcam+细胞群分为不同亚群；一群细胞高表达细胞增殖相关基因（Cdk1），定义为增殖的胆管上皮细胞群（Proliferating BECs）；一群细胞同时表达胆管上皮细胞分子标记（Krt19、Epcam）和肝细胞分子标记（HNF4a、Ttr），定义为肝脏祖细胞群（LPCs）。将上述单细胞转录组测序数据与之前报道的2组DDC诱导的肝损伤中Epcam+细胞的单细胞转录组测序数据进行整合分析，研究人员未在DDC诱导的肝损伤中检测到肝脏祖细胞；也未在正常肝脏中检测到肝脏祖细胞。同时，研究人员通过免疫荧光染色实验在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞，并且这些细胞也表达Epcam、A6、OPN等肝脏祖细胞分子标记；而DDC诱导的肝损伤中未检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞。 此外，研究人员在多种人类肝脏疾病包括非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎等中发现肝细胞呈现衰老状态，并检测到CK19+HNF4a+肝祖细胞，发现肝细胞的衰老程度与肝祖细胞的产生呈现正相关联系；并且在这些人类肝脏疾病中，胆管上皮细胞未呈现衰老状态，提示在人的肝脏疾病中，胆管上皮细胞可能作为肝脏祖细胞的来源贡献给肝细胞而发挥重要作用。 研究人员对单细胞转录组测序数据进行拟时序分析发现肝脏祖细胞来源于胆管上皮细胞；之后利用CK19-CreER工具小鼠标记并示踪胆管上皮细胞，揭示胆管上皮细胞可以贡献给肝脏祖细胞。为了研究肝脏祖细胞的分化潜能，研究人员利用双同源重组酶介导的谱系示踪技术来标记肝脏祖细胞，示踪结果揭示肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的潜能。值得注意的是，肝脏祖细胞不具有增殖活性，并且单个肝脏祖细胞不能同时产生胆管上皮细胞和肝细胞。 单细胞转录组测序数据显示肝脏祖细胞群相较于胆管上皮细胞群下调表达Hippo信号通路相关基因和Notch信号通路相关基因，提示Notch信号通路调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化。研究人员在胆管上皮细胞中进行Rbpj基因敲除，发现抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。此外，研究人员利用Dibenzazepine药物来抑制Notch信号通路也证实抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。当在胆管上皮细胞中激活Notch信号通路后，则完全抑制了胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化，阻碍了肝脏再生。单细胞转录组测序数据显示胆管上皮细胞分化产生的肝细胞相较于肝脏祖细胞上调表达WNT/β-catenin信号通路相关基因，提示WNT/β-catenin信号通路调控胆管上皮细胞向肝细胞的分化。研究人员在胆管上皮细胞中进行β-catenin基因敲除，发现抑制WNT/β-catenin信号通路阻碍了肝脏祖细胞向肝细胞的分化；而在胆管上皮细胞中激活WNT/β-catenin信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，促进胆管上皮细胞向肝细胞分化；并且在胆管上皮细胞中激活WNT/β-catenin信号通路后促进肝脏祖细胞中肝细胞基因以及肝细胞代谢相关基因的上调，提示激活WNT/β-catenin信号通路能够促进肝脏祖细胞向肝细胞分化。此外，研究人员利用RSPO1重组蛋白来激活WNT/β-catenin信号通路，也能够显著促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。以上研究揭示了胆管上皮细胞转分化为肝细胞的细胞及分子调控机制，为肝脏祖细胞诱导产生肝细胞治疗肝脏疾病的临床转化应用提供新的理论基础和研究思路。 双潜能肝脏祖细胞促进肝脏再生机制，a, 示意图显示肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞，并在肝脏再生中贡献给肝细胞。肝脏祖细胞是双潜能的，可以分化为肝细胞或胆管上皮细胞，但是一个肝脏祖细胞不能同时产生肝细胞和胆管上皮细胞。b, 示意图显示抑制Notch信号能促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，激活Notch信号则抑制这一分化过程而促进胆管上皮细胞增殖。c, 示意图显示抑制WNT信号削弱肝脏祖细胞向肝细胞分化，激活WNT信号会促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞和肝脏祖细胞向肝细胞的分化。 中科院分子细胞卓越中心周斌研究组副研究员蒲文娟和博士生朱欢、张铭珺为该论文的共同第一作者，周斌研究员和诺华生物医学研究所Jan S. Tchorz博士为论文共同通讯作者。该研究得到瑞士巴塞尔大学Heim Markus、意大利IRCCS Humanitas大学Luigi Terracciano等大力支持和帮助。该工作得到中科院、基金委、科技部和上海市科委等部门的经费资助。