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2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 肿瘤免疫治疗旨在激活宿主的抗肿瘤免疫，形成肿瘤抑制微环境，最终实现消除肿瘤，提高患者的整体生存率。肿瘤疫苗是一种很有前途的抗肿瘤免疫治疗手段。针对肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）的疫苗可以特异性攻击和摧毁这些抗原高水平表达的恶性肿瘤细胞，并通过免疫记忆实现持续的肿瘤杀伤。因此，与其他类型的免疫治疗相比，癌症疫苗理论上可以提供特异、安全和耐受性良好的治疗效果。 基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了对插入突变的担忧；mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。 mRNA疫苗是一类重要的癌症疫苗，能够编码和表达TAA、TSA及其相关细胞因子。mRNA癌症疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫，提高这些疫苗对不同疾病和患者的适应性。目前，多种mRNA癌症疫苗正在临床中进行开发，为癌症免疫治疗带来新的曙光。 1 mRNA疫苗制备策略 体外转录（IVT）mRNA模拟内源性mRNA的结构，有五个部分，从5ʹ到3ʹ包括：5ʹcap，5ʹ非翻译区（UTR），一个编码抗原的开放阅读框，3ʹUTR和一个PolyA尾。 与天然真核mRNAs一样，5′端帽结构包含一个7-甲基鸟苷核苷，5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解，并与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体以启动翻译。PolyA尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。 编码区两侧的5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位，来自高表达基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首选。此外，UTR可根据细胞类型进行优化，如通过去除3′UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域，将mRNA降解降至最低。 mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分，尽管开放阅读框不像非编码区那样具有可塑性，但可以通过优化密码子，从而在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。例如，CureVac AG公司发现人类mRNA密码子很少在第三位有A或U，从而用G或C替换开放阅读框第三位的A或U。并将此优化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正处于III期试验阶段。 为了最大化翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷的使用，特别是修饰尿苷，阻止了模式识别受体的识别，保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修饰。另一种避免模式识别受体检测的策略，由CureVac首创，使用序列工程化和密码子优化，通过提高疫苗mRNA的GC含量来消耗尿苷。 除了mRNA序列的改进外，在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。临床上使用的合成mRNA通过使用噬菌体RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）从DNA质粒在体外转录。另外，使用CleanCap的共转录封盖技术，简化了纯化步骤。 2 mRNA递送系统 由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，因此无法通过细胞膜的阴离子脂质双层。此外，在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已经为此开发了许多基于创新材料的解决方案。 01 脂质纳米颗粒（LNP） 脂质纳米颗粒是临床上最先进的mRNA载体。截至2021年6月，所有正在研制或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外，LNP通常包括四种成分，可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们共同封装和保护脆弱的mRNA。 可电离脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒，使脂质带正电荷并吸引RNA。此外，它们在内涵体的酸性环境中带正电荷，这促进了它们与内涵体膜的融合，将其释放到细胞质中。 DODAP和DODMA是第一种用于RNA输送的可电离脂质。通过设计提高DODMA的功效，产生了DLin-MC3-DMA。这是第一个FDA批准的药物制剂中使用的可电离脂质：siRNA药物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地递送siRNA外，DLin-MC3-DMA还用于mRNA的递送。 目前，学术界和工业界的许多团体使用组合反应方案来合成潜在的传递材料，这种方法产生了许多有效的脂质，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于辉瑞疫苗BNT162b2）。 除了寻求提高疗效外，人们越来越关注提高药物的特异性，特别是对疫苗和免疫疗法的特异性。含有多环金刚烷尾的脂质11-A-M58，和含有环咪唑头的脂质93-O17S59，已被设计用于体内靶向T细胞。尽管机制尚不清楚，但这些脂质的环状基团对于靶向T细胞至关重要。 尽管电离脂质可以说是LNP最重要的成分，但其他三种脂质成分（胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质）也促进了纳米粒子的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质，它通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并有助于在摄取到细胞的过程中与内涵体膜融合。 辅助脂质通过促进有助于膜与内涵体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效。最佳辅助脂质的选择取决于可电离脂质材料和RNA载体。例如，对于类脂质材料，饱和辅助脂质（如DSPC）最适合传递短RNA（如siRNA），而不饱和脂质（如DOPE）最适合传递mRNA 。DSPC已被用于FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。 LNPs的聚乙二醇化脂质成分由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG可以稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。 02 聚合物和聚合物纳米颗粒 尽管临床进展不如LNP，但聚合物具有与脂质相似的优势，能够有效传递mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成具有不同形状和大小的复合物，可通过内吞作用进入细胞。 聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸传递聚合物。尽管其功效卓越，但由于其高电荷密度，其毒性限制了应用。此外，已经开发出几种毒性较小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA传递方面表现出色，尤其是对肺。 最近开发出了一种新型的含脂聚合物，称为电荷改变可释放转运体（CARTs），它能有效地靶向T细胞，操纵T细胞是非常困难的，因此，CART 是一种极具吸引力的传递材料，在mRNA疫苗和基因治疗领域具有巨大潜力。 03 其他递送系统 除了脂质和聚合物载体外，肽也可以将mRNA传递到细胞中，这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基（例如精氨酸），这些阳离子或两亲胺基与mRNA静电结合并形成纳米复合物。例如，含有重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合细胞穿透肽。 富含精氨酸的鱼精蛋白肽在中性pH下带正电荷，也可以浓缩mRNA并促进其传递。鱼精蛋白与mRNA复合物激活识别单链mRNA的Toll样受体（TLR7，TLR8）通路，因此，它还可以作为疫苗或免疫治疗应用的佐剂。CureVac AG正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。 最后，基于角鲨烯阳离子纳米乳液也可以传递mRNA，这些纳米乳剂由油性角鲨烯核组成。一些角鲨烯制剂，如诺华的MF59，在FDA批准的流感疫苗中用作佐剂。MF59使注射部位的细胞分泌趋化因子，从而招募抗原呈递细胞，诱导单核细胞分化为树突状细胞，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。角鲨烯基阳离子纳米乳剂从内涵体逃逸并将mRNA输送到细胞质中的机制尚不清楚。 3 mRNA疫苗的免疫作用 在注射mRNA癌症疫苗后，mRNA编码的蛋白质由核糖体合成，然后翻译后修饰以产生正确折叠的功能蛋白质，并呈现给免疫系统。该过程类似于RNA病毒感染和连续诱导保护性免疫反应的自然过程。外源mRNA进入细胞质导致与内源性mRNA类似的反应。 01 诱导先天免疫反应 宿主免疫系统通过PRRs检测病原体相关分子模式（PAMP）激活固有免疫反应。注射疫苗后，mRNA和传递系统成分将通过一系列PRR识别为外源性物质，导致Toll样受体（TLR）的激活，例如主要在抗原呈递细胞（APC）上表达的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被细胞膜、内体以及细胞质中的各种PRR识别，并在刺激内源性免疫反应中发挥作用。 IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介导。TLR7由B细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达，并介导识别单链RNA（ssRNA）的过程。在细胞质中，其他一些PRR可以感应不同类型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。 在非免疫细胞中，细胞质维甲酸诱导基因I样受体（RLR）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）感应外源mRNA并调节细胞因子和趋化因子的产生，导致天然免疫细胞募集到mRNA注射部位。 02 诱导适应性免疫反应 mRNA疫苗接种后，编码的蛋白质将被翻译并呈递给免疫系统，并刺激适应性免疫。mRNA编码的蛋白质通过内吞或吞噬作用被APC吸收，它们可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的内体，抗原蛋白通过树突状细胞上的主要组织相容性复合体呈递。 mRNA癌症疫苗通常编码在癌细胞上表达的TAA。这些TAA可进一步分为组织分化抗原（如MART-1）、肿瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、肿瘤细胞过表达的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和肿瘤特异性突变抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，体细胞突变可能产生新抗原表位，码新抗原的mRNA疫苗被认为是最佳的候选癌症疫苗。 除了诱导T细胞免疫外，mRNA疫苗还诱导中和抗体。滤泡辅助性T细胞（Tfh）不仅对生发中心的发育至关重要，而且还驱动免疫球蛋白样转化、亲和力成熟和持久的B细胞记忆反应。这些细胞可以被mRNA疫苗激活，产生足够数量有效和持久的中和抗体。 4 mRNA癌症疫苗的临床开发 基于IVT mRNA的疫苗正在逐步开发，用于多种肿瘤治疗。目前，mRNA癌症疫苗根据最终产品类型可以分为编码TAA、TSA、细胞因子和抗体的癌症疫苗。 01 编码TAAs 的mRNA疫苗 在多项临床试验中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。 BNT111是一种BioNTech FixVac平台开发癌症疫苗，该平台利用TAA的固定组合，旨在触发针对癌症的强大而精确的免疫反应。2021年底，FDA批准了BNT111快速通道资格，这是一种治疗晚期黑色素瘤的新型癌症免疫疗法，目前BNT111正在两项临床试验中进行研究。一项I期试验（NCT02410733）的中期分析报告表明，BNT111是有效的免疫疗法。随后的II期试验（NCT04526899）研究BNT111单独或与抗PD-1抗体cemiplimab联合的安全性和有效性。 CV9201和CV9202是两种针对非小细胞肺癌中表达的靶抗原的mRNA疫苗。临床试验（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，这两种疫苗耐受性良好，治疗后可以检测到免疫反应，从而支持在非小细胞肺癌中的进一步临床研究。 02 编码TSA的mRNA疫苗 编码多种突变抗原的mRNA疫苗是治疗突变诱发的恶性肿瘤的理想疫苗，这种类型的癌症疫苗进行的临床试验最多。随着下一代测序技术的发展，可以生产编码突变抗原的个性化mRNA癌症疫苗，这种个性化的癌症疫苗具有非常诱人的前景。 两种个性化mRNA癌症疫苗目前正在进行二期临床试验，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在单个mRNA分子上特异性筛选和编码20-34个新抗原，这取决于患者的癌症突变。一期试验（NCT03313778）的中期数据表明，mRNA-4157单药治疗或与PD-1抑制剂Keytruda联合治疗在所有测试剂量下都具有良好的耐受性，并引发新抗原特异性T细胞反应。该疫苗目前正在黑色素瘤患者进行二期临床试验（NCT03897881）。 BioNTech 的BNT122已经探索了与PD-L1抗体联合治疗的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小细胞肺癌和大肠癌的II期临床试验已于2021上半年启动。 03 mRNA编码免疫刺激剂 理论上，mRNA癌症疫苗可以编码任何蛋白质，包括免疫刺激剂，其可以重塑肿瘤免疫微环境（TIME），克服肿瘤免疫耐受，这已成为mRNA肿瘤疫苗研究的一个重要方向。 在过去几年中，已经进行了编码细胞因子的mRNAs癌症疫苗的临床试验。目前，临床试验中只有七种候选产品，它们属于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna开发了第一个表达mRNA编码的免疫刺激剂（mRNA-2416），其编码OX40L，一项1期临床试验（NCT03323398）评估了mRNA-2416单独和与durvalumab联合的安全性和耐受性。 已有的数据表明，mRNA-2416单药在所有剂量水平下都是可耐受的，没有报告剂量限制毒性，大多数相关不良事件为1级或2级。更重要的是，在PD-L1上调的时间内观察到广泛的促炎活性和有益的变化。目前，mRNA-2416瘤内注射已进入晚期卵巢癌的临床II期试验。 另一种mRNA疫苗mRNA-2752编码OX40L/IL23/IL36γ，早期的临床结果表明，mRNA-2752与抗PD-L1抗体durvalumab联合使用，在所有剂量下都具有良好的耐受性，并显示出抗肿瘤活性的迹象。 此外，BioNTech还开发了编码IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作为单一疗法或与cemiplimab联合用于晚期实体瘤患者。 — 小结 — 几十年来，mRNA设计和核酸递送技术的进步，加上新抗原靶点的发现，使得mRNA疫苗成为对抗癌症的有力工具。mRNA疫苗的优势体现在mRNA癌症疫苗具有同时编码多种抗原的能力，以及非整合、高度降解和无插入突变潜力。IVT产生的mRNA不含细胞和致病性病毒成分，没有感染的可能性；在正在进行的临床试验中测试的大多数mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特异性免疫反应很少。 快速生产是mRNA癌症疫苗的另一个优势，并且mRNA制造技术的成熟允许在短时间内生产新型疫苗。最近新抗原的发现和鉴定促进了个性化疫苗治疗的发展。BioNTech和Moderna进行的几项临床研究表明，在一些治疗多发性实体瘤的临床试验中，使用个性化疫苗具有强大的抗肿瘤免疫，开创了治疗性肿瘤疫苗的新时代。我们有理由认为，mRNA疗法将可能改变现代医学的疫苗接种方法以及癌症免疫疗法。 参考文献： 1. mRNA Vaccines: The Dawn of a New Era of Cancer Immunotherapy. Front Immunol.2022; 13: 887125. 2. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22. 3. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20. 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

摘要：目前针对COVID-19的mRNA疫苗的使用首次展示了mRNA疫苗在传染病领域的潜力。在这里，我们将总结有关改进型mRNA疫苗，即自身扩增mRNA（saRNA）疫苗的当前知识。这种方法可能通过扩增编码抗原的RNA来增强抗原表达。将回顾RNA设计、RNA递送以及RNA诱导的先天免疫反应。 1.RNA疫苗 传统疫苗主要基于灭活或减毒病原体，并且需要长时间的开发，这使得对新出现的病原体的快速反应变得困难。然而，基于核酸的疫苗可以克服这一缺点，RNA作为疫苗候选物的建议早在30多年前就已提出。在当前COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在对抗新兴传染病方面的可行性和明显优势。 mRNA疫苗的生产在技术上简单、快速、成本效益高，且无需细胞和动物材料，易于适应。mRNA疫苗可以从线性化的质粒DNA模板或基于聚合酶链反应的模板通过体外转录使用噬菌体RNA聚合酶如T7、T3或SP6聚合酶来生产。在体外转录过程中或转录后酶促添加帽子结构。所有组件都是无动物材料的；然而，制造必须使用无RNase的材料进行。通过DNase处理去除残留的DNA，并通过基于珠子的方法、色谱法或沉淀进一步纯化所得的mRNA。这些无细胞生产步骤可以轻松标准化并扩大规模，以获得临床级材料。RNA疫苗候选物的生产速度快，有报道称流感疫苗候选物仅在8天内就已生产出来。 与基于DNA的疫苗相比，mRNA没有整合到宿主基因组的风险。mRNA是非感染性的，并且由于宿主细胞RNases的降解而在细胞中短暂存在。这些安全特性也已通过COVID-19 mRNA疫苗得到证明，它们主要只显示轻微的不良反应事件。与载体疫苗相比，没有预先存在的抗载体免疫，并且可以重复进行mRNA免疫。最后，COVID-19 mRNA疫苗已被证明是有效的，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应。 mRNA疫苗由编码免疫原性抗原的开放阅读框（ORF）、5'-和3'-非翻译区（UTR）、5'-帽子结构和3'-聚腺苷酸尾（poly-A）组成（图1）。像细胞mRNA一样，mRNA疫苗直接在位翻译成相应的抗原。将mRNA转移到抗原呈递细胞允许宿主细胞蛋白酶体处理表达的抗原，并随后装载到主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上。此外，在吞噬分泌的抗原并在内体内降解后，肽可以由MHC II类分子呈递。从而分别刺激CD8+和CD4+ T细胞。T细胞激活还需要共刺激分子和细胞因子分泌，这可能来自mRNA疫苗的先天免疫感应（见下文）。除了细胞免疫反应外，通过分泌抗原激活B细胞也可以刺激体液免疫反应。因此，mRNA疫苗接种诱导了抗原特异性的体液和细胞免疫反应。 图1. mRNA疫苗的结构元素 为了有效，mRNA疫苗需要进行几项改进，以增强mRNA的稳定性、调节RNA对先天免疫反应的调节，并使mRNA在体内有效递送。几个元素被优化：1.1.提高mRNA稳定性和翻译效率 病毒或真核基因的5'-和3'-UTR序列调节mRNA的半衰期和翻译，因此UTR序列被优化用于mRNA疫苗接种。 5'-UTR主要涉及RNA被核糖体识别和下游基因的翻译。通常添加Kozak序列以提高翻译效率。3'-UTR主要调节mRNA的稳定性。例如，高表达的β-珠蛋白基因的3'-UTR增加mRNA的稳定性。也可以通过细胞库筛选识别新的3'-UTR元素。 此外，3'-聚腺苷酸尾的长度调节mRNA的稳定性并增强翻译。聚腺苷酸尾通常由大约200个单元组成，但在树突细胞(DCs)中平均大小为120-150个核苷酸。此外，聚腺苷酸尾通过聚腺苷酸结合蛋白和翻译启动因子与帽子结构相互作用，形成环。发现高表达基因具有短的聚腺苷酸序列并有效地形成环。聚腺苷酸尾对真核基因表达的影响已在中进行了综述；然而，聚腺苷酸长度在RNA疫苗中的确切作用仍需要进一步研究。在mRNA疫苗中，已证明100个核苷酸的聚腺苷酸尾足以有效表达抗原并诱导免疫反应。 真核细胞区分自身和非自身mRNA的一种机制是帽子结构。真核帽子是一个7-甲基鸟苷(m7G)帽子，通过5'-5'-三磷酸桥(ppp)(m7GpppN结构)与mRNA相连。Cap-0结构只包含m7G帽子。对第一核糖体部分的2'-羟基进行进一步甲基化产生cap-1，对第二核糖体进行额外甲基化产生cap-2结构。病毒RNA通常包含cap-0结构，含有cap-0结构的RNA被先天免疫系统识别（见下文）；因此，cap-1/2结构对疫苗开发更优越。例如，具有抗反向帽子类似物(ARCAs; m27,3'-OGpppG)的体外转录mRNA已证明增强了翻译。可以通过2'-O-甲基转移酶酶促添加Cap-1结构，或通过CleanCap技术共转录。 此外，抗原序列可以通过密码子优化来增加抗原表达。为此，目的在于消除可能减慢翻译效率的稀有密码子，将同义突变引入基因中。密码子优化还影响GC含量和RNA二级结构，这两者都影响翻译效率，因此可以进行优化。 1.2.mRNA疫苗候选物的体内递送 对于体内应用，基于RNA的疫苗需要被细胞吸收。由于它们的大分子量、负电荷和快速被核酸酶降解，通过细胞膜的磷脂双层传递是具有挑战性的。不同的方法可以用于mRNA的体内递送。 最简单的递送方法是裸mRNA。它可以通过清道夫受体介导的内吞作用被细胞吸收；然而，只有少量的mRNA被释放到细胞质中。因此，大多数细胞类型的mRNA吸收效率不高，不成熟的树突细胞除外，它们作为正常生物学功能的一部分通过微囊泡吞噬作用吸收mRNA。通过裸mRNA的皮内或淋巴结内接种后，mRNA被淋巴结树突细胞吸收，抑制微囊泡吞噬作用会消除内部化。 然而，为了在细胞中获得高水平的mRNA并递送到大量细胞，需要改进的递送方法。通过电穿孔，例如使用基因枪，可以增加细胞内吸收。通过电穿孔将mRNA转移到树突细胞作为癌症疫苗已被证明在癌症患者中是安全的。已经开发了用于体内递送的mRNA配方，这些配方增加了mRNA的稳定性和细胞吸收。其中最广泛使用的是与脂质纳米颗粒(LNP)配方的mRNA。LNP是胆固醇、可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和辅助脂质的混合物，最初用于癌症免疫疗法。脂质的类型和它们之间的比例决定了配方的效率，mRNA疫苗的最佳比例与siRNA递送的不同。在当前COVID-19大流行中的使用表明，LNP配方的COVID-19疫苗在人类中具有高效性和安全性。在随机对照试验中，与安慰剂相比，COVID-19 mRNA疫苗减少了参与者确诊有症状的COVID-19的比例，并减轻了疾病的严重程度。疫苗和安慰剂治疗组之间在严重不良事件方面几乎没有或没有差异。 1.3.调节先天免疫反应以增强mRNA疫苗的蛋白表达 外来RNA在细胞内被先天免疫系统识别，这通常会导致抗原表达的抑制。然而，这种先天免疫反应也可以对疫苗产生佐剂效应。已经使用了几种策略来优化免疫原性。在体外转录过程中，T7 RNA聚合酶的RNA依赖性RNA聚合酶活性和RNA的重新结合允许在3'端自我引物化，以进行互补RNA合成，从而产生双链RNA(dsRNA)。dsRNA可以强烈激活先天免疫反应。在病毒感染期间，dsRNA可以被Toll样受体(TLRs)、视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体、蛋白激酶R(PKR)、寡腺苷酸合成酶(OAS)和NOD-, LRR-, 和pyrin结构域包含1(NLRP1)感知，这导致激活多种信号级联，导致炎症、细胞生长抑制或细胞死亡。可以通过RNA的纯化来去除dsRNA，例如，通过高性能液相色谱或基于纤维素的纯化。或者，可以通过优化核苷酸三磷酸比例或构建突变聚合酶进行RNA合成来减少体外转录过程中dsRNA的产生。此外，修饰核苷的掺入可以减少单链mRNA的免疫原性。例如，伪尿嘧啶和1-甲基伪尿嘧啶防止先天免疫系统的感知，并实现更高的抗原表达率。DNA模板也可能影响mRNA疫苗的先天感知，尽管大部分DNA应该已经通过纯化步骤或DNase处理被去除。外来的细胞质DNA被几种DNA传感器如cGAS和IFI16识别，它们主要通过适配蛋白STING发挥作用。然而，残留DNA对mRNA疫苗的影响尚未详细研究。体外转录的残留蛋白也可能刺激先天免疫反应，但这些蛋白通常通过纯化被去除。 1.4.mRNA疫苗的储存温度 当前的COVID-19 mRNA疫苗需要在-60或-80°C的温度下储存Comirnaty，或在-50°C的温度下储存Spikevax。这些低温储存要求影响mRNA疫苗的全球分布，特别是在低收入和中等收入国家。不正确的储存可能导致RNA的氧化和水解，并可能改变其功能。冻干可能是另一种储存方法，因为它可能在更高的温度下实现长期稳定性。 2.作为自身扩增疫苗候选物的阿尔法病毒复制子  抗原表达与传递给抗原呈递细胞的mRNA量相关；然而，mRNA也被RNases降解。因此，为了刺激强大的免疫反应，需要大量的mRNA和重复的免疫接种。当前的COVID-19疫苗每剂含有30-100微克mRNA。自身扩增(sa)RNA疫苗需要较少的初始RNA量，因为mRNA在细胞内扩增。例如，只有10纳克saRNA的剂量就能在小鼠中诱导SARS-CoV-2特异性免疫反应，5微克saRNA已成功用于临床试验。基于这一原理的疫苗利用单链正义或负义RNA病毒的基因组。负义病毒需要通过它们自己的RNA依赖性RNA聚合酶介导的新蛋白合成来启动转录，并需要技术上要求高的反向遗传学来构建。因此，大多数saRNA疫苗基于正义感的阿尔法病毒委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)或森德堡森林病毒(SFV)的基因组。正义感阿尔法病毒的基因组RNA被直接翻译。阿尔法病毒是包膜的、单链的、正义感RNA病毒，属于Togaviridae家族。阿尔法病毒基因组包含11-12 kb，具有50-甲基鸟苷帽子和30-聚腺苷酸尾(图2A)。它由两个ORF组成：第一个编码四个非结构蛋白(nsP1-nsP4)，第二个编码五个结构蛋白(衣壳和包膜蛋白E3-E2-6K-E1)。nsPs直接作为多蛋白从基因组RNA的第一个ORF翻译，并构建复制复合体(replicase)，它履行病毒复制的基本功能。nsP1是加帽酶，具有鸟嘌呤-7-甲基转移酶和鸟苷转移酶活性。nsP2是一种蛋白酶，需要处理非结构多蛋白。此外，nsP2具有RNA解旋酶和RNA三磷酸酶活性，并且它诱导宿主细胞蛋白表达的关闭。nsP3介导病毒-宿主和蛋白-蛋白相互作用，这对病毒复制至关重要，nsP4是病毒RNA依赖性RNA聚合酶。复制复合体首先合成全长的负义RNA，它作为合成全长基因组RNA或亚基因组RNA的模板(图2B)。与nsPs相反，结构蛋白是从亚基因组RNA翻译为多蛋白，(图2B)。 基因组包含几个对RNA复制、转录和包装成病毒颗粒重要的序列。这些元素被称为顺式作用元件或保守序列元件(CSEs)（图2A）。5'-UTR包含负链和正义链合成的核心启动子元件。在nsP1编码序列内的一个51个核苷酸长的序列元素对RNA扩增很重要。类似地，30-CSE序列在负链RNA合成中充当启动子，从而实现RNA扩增。因此，5'和3'-CSEs的存在确保了由阿尔法病毒复制酶特异性RNA扩增。对于亚基因组RNA合成的启动，需要亚基因组启动子(SGP)作为一个CSE（图2B）。这个序列通常位于nsP4编码序列中，包括转录起始位点上游的19个核苷酸和下游的2-5个核苷酸。此外，nsP1或nsP2编码序列中的包装信号确保基因组RNA被特异性地包装进病毒颗粒。 图2. 阿尔法病毒基因组和复制：(A) 阿尔法病毒基因组的图解。(B) nsPs 直接从基因组RNA翻译并促进病毒复制。负链中间体作为基因组和亚基因组RNA合成的模板。结构蛋白从后者翻译并形成传染性病毒。3.自身扩增RNA疫苗候选物 对于构建saRNA疫苗，阿尔法病毒的结构蛋白被抗原基因替换，该基因插入在SGP的控制之下（图3A,B）。与传统的mRNA疫苗相比，添加7-8 kb的阿尔法病毒复制酶基因显著增加了RNA的长度。此外，病毒CSEs被用作saRNA疫苗中的5'-和3'-UTR。因此，就像在阿尔法病毒复制中一样，复制酶可以扩增saRNA并转录亚基因组RNA。然后从亚基因组RNA翻译抗原。由于复制酶有效扩增编码抗原的RNA，与从mRNA获得的相比，将表达更高量的抗原。因此，可以使用较少的RNA实现类似的免疫反应。 图3. RNA疫苗方法：(A) 常规mRNA由50-帽子、50-UTR、抗原序列、30-UTR和聚(A)尾组成。抗原直接从mRNA在位翻译。(B) 自身扩增RNA还包含病毒50-和30-CSEs以及阿尔法病毒nsP1-nsP4基因。抗原被置于亚基因组启动子(SGP)的控制之下。复制酶(nsP1-nsP4)直接在位翻译并由于CSEs特异性扩增saRNA。(C) 跨扩增RNA疫苗由两个RNA组成。一个是编码阿尔法病毒复制酶的常规mRNA。第二个是编码抗原的跨复制子(TR) RNA，它由复制酶在转录后扩增。 多项使用saRNA疫苗候选物的临床前试验已被报道，主要目的是预防传染病。在这里，saRNA编码病毒糖蛋白作为中和抗体和细胞免疫反应的目标。基于阿尔法病毒的saRNA在动物模型中作为SARS-CoV-2感染的疫苗候选物成功进行了测试。最近，针对多种蝙蝠和人类冠状病毒刺突抗原表达的跨沙贝科病毒saRNA疫苗候选物的临床前数据显示，它能够保护动物免受致命异源感染。此外，还对针对流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒、VEEV和HIV-1的saRNA疫苗进行了临床前测试。这些疫苗候选物主要与LNPs配方，并诱导了高特异性的抗体和T细胞反应，显示出对小鼠挑战感染的保护。saRNA疫苗也被适应用于对抗细菌感染、寄生虫如弓形虫和癌症。 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。目前，在clinicaltrials.gov上列出了十项saRNA疫苗的临床试验，其中九项针对SARS-CoV-2（表1）。saRNA的应用不仅限于疫苗开发；还开发了使用saRNA的被动免疫策略。通过saRNA传递的寨卡病毒特异性单克隆抗体保护小鼠免受寨卡病毒感染。此外，正在开发使用mRNA或saRNA进行基因替代治疗的新基因疗法方法。 对于临床开发，仍然需要阐明RNA扩增和抗原表达持续多长时间。在给予荧光素酶saRNA后，表达在一个月后恢复到基线水平。此外，从理论上讲，如果saRNA表达具有出芽能力的病毒糖蛋白，它可能被包裹在囊泡中，导致saRNA转移到其他细胞。在saRNA疫苗的安全评估中应考虑这一点。 4.跨扩增（ta）RNA疫苗候选物  最近，通过建立taRNA疫苗的原理，进一步开发了saRNA疫苗[115]。对于taRNA疫苗，使用两种RNA。第一种是体外转录的mRNA，编码阿尔法病毒复制酶，可以直接在体内翻译。第二种RNA，即跨复制子（TR）RNA，编码相应的抗原，置于SGP的控制之下（图3C）。由于含有阿尔法病毒50'和30'-CSEs，TR-RNA通过阿尔法病毒复制酶进行跨扩增。最初，为VEEV建立了一个称为“splitzicon”的分裂复制子系统。借助荧光报告基因作为抗原，确定了自扩增taRNA所需的成分。最近，使用编码复制酶基因的非复制mRNA和表达流感病毒血凝素的TR-RNA构建了流感病毒taRNA疫苗候选物。与saRNA疫苗候选物相比，taRNA能够以较少的抗原RNA诱导保护性免疫反应。这可能是因为只扩增了短的TR-RNA而不是长的saRNA。重要的是，研究表明，与短RNA相比，阿尔法病毒复制酶对RNA的扩增更快、更有效。 此外，使用编码阿尔法病毒复制酶的密码子优化mRNA诱导了更强的免疫反应。基于另一种阿尔法病毒——基孔肯雅病毒（CHIKV）的taRNA疫苗候选物诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并能够保护小鼠免受CHIKV挑战感染。此外，还描述了一种新型双价taRNA疫苗候选物，涉及传递三种RNA：一种编码复制酶和两种编码抗原的TR-RNA。与saRNA疫苗相比，taRNA疫苗在安全性、可制造性和优化潜力方面有所改进。使用两种RNA最小化了RNA转移到更多宿主细胞的风险。taRNAs的RNA比saRNAs短，因此扩大生产更容易。然而，需要生产两种RNA，并且尚未证明有效的体内传递配方。 5.saRNA疫苗的生产和传递  saRNA和taRNA像mRNA一样，通过体外转录从DNA模板生产，并添加帽结构。除了已建立的帽试剂外，最近还开发了CleanCap试剂AU，用于阿尔法病毒saRNA的加帽，以允许共转录加帽具有天然Cap-1结构。saRNA疫苗可以作为体外转录的RNA传递，也可以包装成病毒颗粒（VP）。当包装在VPs中时，原则上可以被视为减毒病毒。它们应该在人类中显示有限的复制，但仍然能够诱导良好的免疫反应，而没有疾病迹象。已经描述了使用这种传递方法的疫苗候选物用于CHIKV。已经报道了CHIKV基因中的几种缺失，例如nsP3中的大缺失（∆5nsP3）或在衣壳中，一些这些减毒病毒已经进入了临床开发。然而，基于VP的传递有几个缺点；它们通常具有次优的安全概况，并且总是保留恢复为致病病毒的潜力。此外，载体是免疫原性的，这使得加强免疫变得困难。通过体外转录生产saRNA疫苗，像传统的mRNA疫苗一样，绕过了这些障碍。 在临床前模型中，taRNA的免疫接种主要通过皮内注射稀释在无RNase PBS中的RNA进行。同样，裸露的saRNA能够诱导针对HIV 1和寨卡病毒的特异性免疫反应。然而，RNA剂量很高，与mRNA疫苗相当。已经证明有多种配方可以改善mRNA的体内传递。由于存在阿尔法病毒复制酶基因，saRNA疫苗比mRNA长，需要新的传递配方。探索了多种saRNA配方方法。在将saRNA配方与脂质体、固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和乳液进行比较时，使用1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷聚合物纳米颗粒诱导了最强大的免疫反应。还根据先前为siRNA和mRNA优化的LNP配方开发了优化的saRNA LNPs。将saRNA与LNPs配方作为COVID-19疫苗候选物，将小鼠诱导强大免疫反应所需的剂量减少到仅为10 ng。LNP配方也可以类似地适应taRNA系统。从而，RNA稳定性和传递可能会得到改善，并且通过肌肉内应用以较低的RNA剂量刺激强大的免疫反应。 6.saRNA疫苗候选物及诱导先天免疫反应  作为非自身分子，RNA疫苗被细胞途径感知，并有效地激活先天免疫系统。如上文所述，可以采用几种方法来规避先天免疫激活；然而，对于sa/taRNA疫苗，核苷修饰在扩增步骤中会丢失，因此益处较小。在taRNA疫苗中，复制酶mRNA可以进行核苷修饰；然而，其效果仍有待评估。此外，RNA可以初步纯化以减少先天感应。 与mRNA疫苗相比，细胞内RNA扩增产生dsRNA，从而更强烈地激活先天免疫反应。RNA可以被多种模式识别受体识别，包括TLR3、TLR7、RIG-I样受体、黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）、PKR和OAS。由此产生的信号级联导致产生I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子。尽管先天反应具有辅助作用，可以促进特异性免疫反应，但它也可以诱导RNA降解，从而减少抗原表达。 已经为saRNA疫苗描述了减少IFN激活的策略。例如，表达来自避免免疫感应的病毒的蛋白质可以抑制先天反应。在单独的mRNA上编码牛痘病毒的E3、K3和B18R蛋白以及流感A病毒的非结构蛋白1，在体外和体内增加了抗原表达。同样，saRNA上顺式编码的抑制先天反应的蛋白能够增加刺激的免疫反应。阿尔法病毒通过关闭宿主细胞转录和翻译来对抗先天免疫反应。因此，IFN的产生也减少了。此外，阿尔法病毒感染和复制酶表达是细胞毒性的，并诱导宿主细胞凋亡。复制酶nsPs包含影响RNA扩增和宿主细胞反应的元素。nsP2诱导宿主细胞关闭导致细胞死亡。这对疫苗应用的确切影响还有待阐明。有趣的是，已经描述了CHIKV nsP2中的突变，这些突变减少了细胞病变效应。此外，在体外方法中，已经鉴定出VEEV nsPs中的突变，这些突变增强了原位亚基因组RNA的合成。在CHIKV适应A549细胞过程中，复制酶基因中发生了两个突变，增加了病毒复制。因此，sa/taRNA疫苗候选物的复制酶可以进一步优化，以提高抗原表达和免疫。 除了减少IFN激活的策略外，还探索了通过使用佐剂来调节saRNA疫苗接种后的免疫反应。例如，已经评估了与基于佐剂MF59的阳离子纳米乳液配方的saRNA或与TLR激动剂配方的saRNA。尽管诱导了强大的免疫反应，直接益处仍有待证明，且缺乏临床数据。此外，LNP配方具有佐剂效应。比较皮内电穿孔与LNP传递的研究表明，LNPs强烈诱导先天免疫反应，减少了小鼠皮肤中saRNA的抗原表达。 7.saRNA疫苗用于人类 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。已完成的基于saRNA的COVID-19疫苗候选物的临床试验数据看起来令人鼓舞，最近进行了第一阶段I试验。基于VEEV的saRNA疫苗（LNP-nCoVsaRNA），表达SARS-CoV-2的前融合稳定化刺突糖蛋白，耐受性良好，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。尽管血清转化率没有达到100%，但血清阳性参与者中特异性抗体浓度与来自康复期血清的值相似。然而，人类对SARS-CoV-2的反应明显低于小动物模型预测的反应。另一种基于VEEV的saRNA疫苗候选物（ARTC-021），表达SARS-CoV-2刺突糖蛋白，也被发现是安全的，并且有100%的血清转化率。抗刺突IgG滴度等于COVID-19康复期血浆中的那些。目前正在进行一项更大的临床试验，使用ARTC-021作为加强疫苗（NCT05012943）。这些例子表明，saRNA技术正在进入临床开发，但需要进一步改进以产生有效的疫苗。 8.结论 在COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在预防传染病方面的可行性。saRNA疫苗候选物将进一步完善这一策略，它们有望以更少的RNA实现有效性。然而，仍然需要进一步的研究，特别是提高RNA传递的效率和研究先天感应的作用。目前还不确定使用更少的RNA（在体内扩增）在临床上是否比标准mRNA疫苗有利。在小鼠模型中进行了比较saRNA与mRNA优势的临床前研究，这些模型不能适当地重现人类的先天免疫反应。saRNA疫苗的第一阶段临床试验刚刚完成，mRNA与saRNA的直接比较仍有待进行。像RNA疫苗一样，saRNA疫苗可能不仅限于传染病，还可能用于基因治疗、抗癌或输送基于蛋白质的治疗剂。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：mRNA疫苗已被证明是传统疫苗的强大替代品，因为它们具有高效力、安全性和有效性，以及快速的临床开发能力和快速、低成本生产的潜力。这些疫苗已经从一种纯粹的好奇心发展为COVID-19大流行疫苗的领跑者。在纳米技术领域为mRNA疫苗开发输送载体的进步非常重要。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的每一个方面。文章描述了mRNA的结构、其诱导免疫的药理功能、脂质纳米颗粒（LNPs）、以及mRNA疫苗制造的上游、下游和配方过程。此外，还描述了正在进行临床试验的mRNA疫苗。对未来mRNA疫苗的展望，如其冻干、输送系统，以及LNPs靶向抗原呈递细胞和树突细胞，也进行了总结。 1.引言  疫苗接种是预防传染病传播的最有效手段。疫苗对卫生保健系统经济可行性的影响极大，因为它降低了传染病的治疗成本。此外，疫苗还有助于减少疫情爆发的影响和风险。疫苗在公共卫生与安全方面的更广泛作用及其对经济的延伸效应，在COVID-19大流行期间得到了重申和见证。成功的疫苗接种运动已经根除了天花和脊髓灰质炎等致命传染病，并试图应对COVID-19。世界卫生组织估计，疫苗每年可预防因百日咳、破伤风、流感和麻疹引起的200万至300万人死亡。疫苗已经从利用灭活和减毒病原体发展到包含病原体组分的亚单位，以触发免疫反应。疫苗研究的重要里程碑包括重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、结合多糖或基于蛋白质的疫苗以及类毒素疫苗的开发。然而，最重要的也是关键的里程碑是mRNA疫苗的开发，因为其在COVID-19大流行中迅速开发和批准，以及其mRNA技术在细胞内产生所需的疫苗抗原。 我们目前正处于mRNA疫苗接种的时代，因为基础研究早在三十年前就已奠定。尽管1990年代早期在动物模型中产生有效的体外转录（IVT）mRNA疫苗的表位呈递是有效的，但mRNA疫苗和治疗并未得到发展，因为直到19世纪末它们才得到验证。在过去的十年中，通过以下方式改善整体mRNA质量的关键技术创新和广泛研究：（i）通过引入加帽、加尾、点突变和有效的纯化技术提高其稳定性，（ii）通过引入脂质纳米颗粒改进mRNA递送，以及（iii）通过引入修饰核苷酸减少其免疫原性，已导致其作为疫苗的广泛使用。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有几个重要优势，包括活病原体、亚单位和基于DNA的疫苗。这些包括（i）安全性，因为mRNA不与宿主DNA整合且无传染性；（ii）有效性，因为mRNA结构的修改可以使疫苗更稳定、有效，并减少免疫原性；（iii）制造和规模化效率，因为mRNA疫苗在无细胞环境中生产，因此允许快速、可扩展且成本效益高的生产。例如，一个5升的生物反应器可以在单一反应中生产出一百万个mRNA疫苗剂量。此外，mRNA疫苗还有编码多个抗原的能力，从而加强针对一些顽固病原体的免疫反应。 当mRNA疫苗由Pfizer–BioNTech为COVID-19大流行开发并获得批准时，这种疫苗技术的有效性得以实现。这些疫苗在世界被SARS-CoV-2病毒感染、导致住院和死亡后不到一年的时间里开发出来，以创纪录的时间开发了Spikevax®（Moderna）和Comirnaty®（Pfizer–BioNTech），并广泛接种给数百万人，帮助控制了COVID-19疫情。 这些疫苗制造商展示的开发、批准和制造能力已经验证了mRNA平台作为一种安全有效的疫苗工具。此外，这也激发了科学界对探索mRNA作为预防性疫苗工具的极大兴趣。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的基础知识，包括其mRNA结构及其药理作用，mRNA结构修改，并解释了mRNA疫苗如何在宿主中引起所需的免疫反应。综述还解释了脂质系统的重要性，如脂质纳米颗粒对mRNA疫苗递送的作用。文章深入探讨了脂质纳米颗粒的结构组成部分及其功能。第二代mRNA疫苗的最新发展以及当前的临床试验也在详细描述。 2.mRNA疫苗的药理学  2.1.mRNA结构  mRNA分子通过细胞质中的核糖体将DNA遗传序列有效地翻译成所需的蛋白质。非复制型mRNA和自扩增RNA是作为潜在疫苗候选抗原正在研究的两种主要类型的mRNA。传统的非复制型mRNA疫苗编码所需的抗原，用于免疫反应，包含50和30非翻译区（UTRs）和开放阅读框（ORF），也称为编码区和聚（A）尾。自扩增mRNA包含所有这些组件，在其ORF中有一个额外的编码区域，该区域编码病毒复制机制，使细胞内RNA连续扩增，随后是扩增的抗原表达。体外转录（IVT）是一种反应，其中包含感兴趣基因的线性化DNA质粒被转录成mRNA序列。 2.2. 5'端帽 mRNA的5'端含有一个7-甲基鸟苷(m7G)基团，紧随其后的是第一个核苷酸的三磷酸基团(m7GpppN)。m7GpppN被称为5'端帽，它是一种保护结构，可以保护RNA不被外切酶切割，调节前mRNA剪接，并启动mRNA的翻译和从细胞核到细胞质的输出。5'端帽对于识别非自身mRNA或外源mRNA与自身mRNA或内源mRNA也至关重要。通过引入许多转录后修饰，可以改善mRNA的效力和稳定性。这些包括在第一个核苷酸(Cap 1, m7GpppN1m)和第二个核苷酸e(Cap 2, m7GpppN1mN2m)的20位的20-O-甲基化。这些5'端帽结构的修饰不仅增加了mRNA的翻译效率，还阻止了内体和细胞质受体的激活，包括RIG-I和MDA5，这些受体是针对病毒mRNA的防御机制。因此，5'端帽结构的20-O-甲基化是提高mRNA转录后蛋白产量并阻止宿主免疫系统对外源性IVT mRNA产生不良免疫反应的非常理想的属性。这种5'端帽可以通过向IVT mRNA反应中添加S-腺苷甲硫氨酸和Cap 0结构来实现，这会产生带有Cap 1结构的IVT mRNA和S-腺苷-L-高半胱氨酸。Cap 1指的是m7GpppNm，其中Nm代表任何具有20 O甲基化的核苷酸。三核苷酸帽类似物也可以用来在共转录反应中制造Cap 1类似物。Ishikawa等人使用m7GpppAG类似物对IVT mRNA进行加帽。这些类似物在IVT反应中允许mRNA在5'端具有m7G基团，而没有反向加帽的5'端mRNA产品。使用A、Am、m6A或m6Am等核苷酸的进一步修饰导致了IVT mRNA特异性的进一步提高。特别是，m7Gpppm6AmG帽在体外转染实验中实现了最大的荧光素酶表达。Sikorski等人比较了改变第一个转录核苷酸如A、m6A、G、C和U以及有无20-O-甲基化在mRNA IVT反应中的效果。他们观察到，携带A、Am或m6Am作为第一个核苷酸的脂质体传递mRNA在荧光素酶表达上更高，而携带G或Gm的IVT mRNA则较低。重要的是，在树突状细胞(DC)系JAWSII中mRNA翻译导致了m6A和m6Am 5'端帽之间8倍的差异。这些发现证明了5'加帽结构对于有效靶向DCs和产生所需的免疫反应的重要性。 2.3. 5'和3'非翻译区(UTRs) 尽管UTRs不会翻译成所需的抗原或蛋白质，但它们参与调节mRNA表达。这些区域位于ORF和mRNA的5'和3'端之间，在mRNA的上游和下游。这些UTR包含与mRNA稳定性以及mRNA的有效和正确翻译相关的调控序列。它们还帮助核糖体识别mRNA，并帮助mRNA的转录后修饰。通过在UTRs中包含顺式调控序列可以改善mRNA的翻译及其半衰期。此外，包括天然发生的序列，如来自α-和β-珠蛋白的序列，已被广泛用于设计疫苗的mRNA构建。Zeng等人基于鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量及其(GC)长度为mRNA疫苗的开发设计了新的5'UTR序列。 2.4. 聚(A)尾 IVT mRNA在其3'端有一个聚腺苷酸部分，称为聚(A)尾。这个聚腺苷酸尾对于决定mRNA的寿命至关重要。哺乳动物细胞中自然发生的mRNA分子的聚(A)尾长度大约为250个核苷酸(nt)，这在mRNA在细胞质中的寿命期间逐渐缩短。由于尾巴大小影响mRNA的降解，因此在生产具有更长半衰期的mRNA疫苗和治疗剂时，加入聚(A)尾是可取的。向聚(A)尾添加大约100个nt可以生产出具有所需延长降解的mRNA。 2.5. 修饰核苷酸 天然mRNA和其他RNA分子包含ATP、CTP、GTP和UTP作为四种基本核苷酸。在mRNA分子的转录后修饰后，一些核苷酸会得到修饰，如伪尿苷和5-甲基胞苷。这些修饰核苷酸可以用于mRNA的体外转录。尽管未修饰的mRNA有其自身的优势，但修饰核苷酸的好处在于它们可以避免IVT mRNA被先天免疫系统识别，从而避免任何不良的免疫反应，并提高mRNA到所需抗原的翻译效率。Andries等人证明，含有N(1)-甲基伪尿苷(m1Ψ)修饰的mRNA在转染到细胞系或小鼠时，与伪尿苷(Ψ)修饰的mRNA平台相比，分别提供了大约44倍和13倍更高的报告基因表达。作者还证明，(m5C/) m1Ψ修饰的mRNA在体外转染后导致细胞内先天免疫原性的降低。这种修饰导致Toll样受体3（TLR3）的控制激活，并启动下游先天免疫信号传导，这是mRNA疫苗的一个理想特性。图1描述了mRNA分子的结构组成部分。 图1. mRNA 分子结构组成 2.6. mRNA疫苗通过先天和适应性免疫刺激 由病原体特异性免疫原（编码病毒蛋白）和佐剂组成的疫苗可以帮助刺激适应性免疫反应。虽然佐剂旨在刺激先天免疫反应并提供T细胞激活的信号，但理想的佐剂应该在不引起全身炎症的情况下刺激先天免疫反应，这可以引起严重的副作用。对于mRNA疫苗，mRNA分子既作为免疫原又作为佐剂，由于mRNA的内在免疫刺激性。一旦肌肉内注射mRNA疫苗，就会通过以下途径潜在地激活适应性免疫系统：（i）转染肌肉细胞和表皮细胞，（ii）转染注射部位的组织驻留免疫细胞，如树突状细胞（DC）、巨噬细胞和郎格汉斯细胞，从而启动T和B细胞的启动，以及（iii）运输到二级淋巴组织，如淋巴结（LNs）和脾脏。图2描述了肌肉内注射的mRNA-LNP疫苗的作用方式。宿主细胞通过各种内体和细胞质先天受体识别单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA），这些受体是人类对外源病毒先天免疫反应的关键部分。Toll样受体（TLR3和TLR7）与内体内的外源ssRNA结合，炎症信号受体包括RIG-I、MDA5、NOD2和PKR与细胞质中的ssRNA和dsRNA结合。这导致细胞激活，并产生I型干扰素和其他多种炎症介质。I型干扰素对细胞翻译有抑制作用，可以抑制mRNA疫苗产生的抗原量。目前可用的mRNA疫苗含有纯化的IVT mRNA，其本质上是单链的，并含有修饰核苷酸。这有助于减少与TLR3和TLR7的结合，以及免疫传感器，因此限制了I型干扰素的过度产生及其对mRNA细胞翻译的抑制作用。mRNA疫苗转染组织驻留的免疫细胞，包括APCs，如DCs和巨噬细胞。 图 2. mRNA 脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）的肌肉内注射部位及其作用方式。mRNA-LNP 疫苗可以转染肌细胞，并转染注射部位附近的组织驻留抗原呈递细胞（APCs）。此外，mRNA-LNP 疫苗可以流入淋巴结（LNs）并转染淋巴结内驻留的细胞，导致 T 细胞和 B 细胞的激活。 mRNA疫苗通过转染非免疫细胞发挥作用，导致所需抗原的产生。这种抗原随后在细胞质中的蛋白酶体中被分解，暴露出抗原表位，与主要组织相容性复合体（MHC）I类形成复合体，呈现给表达CD8+的细胞毒性T细胞。这有助于建立对mRNA表达的抗原的细胞免疫。mRNA疫苗通过转染肌细胞可以激活骨髓来源的树突状细胞（DCs），这有助于CD8+ T细胞的启动。mRNA疫苗还通过转染包括DCs和巨噬细胞在内的组织驻留免疫细胞发挥作用。这在注射部位触发局部免疫反应。免疫细胞的mRNA转染可以导致通过MHC I类途径的抗原呈递，这会导致CD8+ T细胞的成熟。此外，APCs的激活也可以导致MHC II类途径的呈递，从而激活表达CD4的T辅助细胞。在转染局部免疫和非免疫细胞后，一些施用的mRNA疫苗通过淋巴系统排入淋巴结。淋巴结包含单核细胞和原始T和B细胞。淋巴结APCs的转染可以启动T细胞和B细胞的激活。图3描述了mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。 图 3. mRNA-LNP 疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。(1) 体外转录的 mRNA 被包裹进脂质纳米颗粒（LNP）中。(2) 使用 LNP 表面的专用脂质，将 mRNA-LNP 疫苗分子转染到宿主细胞中。(3) mRNA-LNP 的内吞作用。(4) 内吞介导的内化后，mRNA 从内体逃逸到细胞质中。(5) 宿主细胞的核糖体将 mRNA 翻译成细胞内所需的抗原蛋白。(6) 抗原蛋白在细胞外释放，或者被蛋白酶体降解，暴露抗原位点。(7) 主要组织相容性复合体 I（MHC I）将 MHC I 上的表位呈现到细胞膜上进行抗原呈递（APC）。MHC I 将表位呈递给 CD8+ T 细胞。(9) 早期释放的外源蛋白可以通过 MHC II 表位降解并呈递。细胞外抗原可以被 B 细胞识别，导致 B 细胞成熟。 3.mRNA疫苗的药物递送技术  本节可能通过小标题进行划分。它应该提供对实验结果、它们的解释以及可以得出的实验结论的简洁而精确的描述。mRNA疫苗分子体积较大（104-106 Da），带负电荷。它们无法通过细胞膜的磷脂双层。裸露的mRNA会被血液中的核酸酶破坏和降解。此外，裸露的mRNA也会被组织和血清中的免疫细胞附着和吞噬。将mRNA分子递送到细胞内的方法包括基因枪、电穿孔和体外转染等技术。体内递送mRNA的方法涉及使用脂质或转染剂转染免疫或非免疫细胞。 3.1.脂质纳米颗粒（LNPs） 尽管裸露的mRNA、脂质体和多聚体在人类中已显示出临床效果，但LNPs是唯一证明临床效果并获得批准用于人类使用的mRNA疫苗的药物递送系统。针对SARS-CoV-2的COVID-19 mRNA疫苗，由Moderna和Pfizer/BioNTech开发，采用LNPs将mRNA有效载荷递送到体内。LNPs目前是非病毒载体中用于基因治疗的最前沿。当LNP-siRNA治疗药物Onpattro®（patisiran）获得美国FDA批准用于遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性时，首次证明了LNPs的临床效果。LNP配方是最成功、有效和安全的方法，用于递送mRNA疫苗进行人类免疫。LNPs为mRNA递送到作用部位提供了许多优势，包括易于配方和规模化生产、高效的转染能力、低毒性概况、模块化、与不同类型和大小的核酸的兼容性、保护mRNA免受内部降解，并增加mRNA疫苗的半衰期。LNPs通常由四种成分组成：一种可电离的阳离子脂质、一种辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。这些脂质包裹mRNA疫苗的有效载荷，保护核酸核心免受降解。 3.2. 阳离子和可电离脂质 阳离子脂质是最早开发的脂质之一，用于mRNA疫苗递送。这些脂质含有一个季铵氮原子，赋予它们永久的正电荷。这些脂质的正电荷使它们能够与带负电荷的mRNA疫苗形成离子相互作用，形成一种称为脂质复合物的脂质体。DOTMA及其合成类似物DOTAP是1989年首次用于递送mRNA疫苗的阳离子脂质。自那时以来，包括商业上成功并广泛使用的Lipofectin在内的阳离子脂质如DOTMA、DOPE和DOGS已广泛用于mRNA递送。Lipofectin是DOPE和DOTMA的混合物，是最早成功实现mRNA体内翻译的LNP配方之一。 早期的阳离子脂质在体外基因递送方面显示出了希望，但它们在体内效果不佳。氮头基团的正电荷和早期阳离子脂质的非生物可降解性是它们在体外递送和效果不佳的原因。可电离脂质，也称为pH依赖性离子脂质，是第二代阳离子脂质，包含一个在生理pH或低于生理pH时赋予它们正电荷的伯胺。这些脂质在生理pH的血液中具有中性电荷的特性有助于提高它们的安全性，与第一代阳离子脂质相比。它们还延长了LNPs的循环时间，与由阳离子脂质衍生的LNPs相比。这些脂质的开发是为了克服第一代阳离子脂质的缺陷和安全性问题，例如免疫激活和与血清蛋白的相互作用。DLin-MC3-DMA是第一个获得美国FDA批准的离子脂质，用于第一个siRNA药物Onpattro®。DLin-MC3-DMA离子脂质是在对第一代离子脂质DODMA进行一系列修改后合成的。DLinDMA是通过替换DODMA的油酸尾部形成的。与DODMA相比，DLinDMA在体内抵抗呼吸道合胞病毒(RSV)的保护免疫方面表现出更优越的能力。DLinDMA进一步优化为DLinKC2-DMA，再进一步为DLin-MC3-DMA，这取决于一系列基于结构-活性关系的研究。DLin-MC3-DMA被认为是第一代可电离脂质。 DLin-MC3-DMA或MC3具有72小时的长血浆半衰期，增加了siRNA的作用持续时间。后来证明MC3离子脂质在递送mRNA以及siRNA方面也是有效的。MC3唯一的缺点是它的长半衰期(72小时)。这限制了使用MC3的疫苗的长期给药。因此，下一代可电离脂质采用了可生物降解的官能团，可以促进快速清除。引入酯基有助于增加MC3的生物可降解性，并增加了其系统清除率。酯基易于安装在脂质中，可生物降解，化学稳定，可被细胞内酯酶轻易裂解。MC3作为开发可生物降解酯基可电离脂质的重要前体和起点。这些包括Moderna的专有脂质、Acuitas的专有脂质等，还包括YSK12-C4、CL4H6和L319脂质，被认为是第二代可电离脂质。基于酯的可生物降解可电离脂质在基因递送方面比MC3可电离脂质表现出更高的效力。Moderna的脂质5被发现效力是MC3的三倍，Acuitas的脂质，ACL-0315（用于Pfizer/BioNTech COVID-19疫苗的脂质），在向动物递送荧光素酶mRNA方面效力是MC3脂质的六倍US10166298B2。 第三代可电离脂质以优化的方式合成，化学合成步骤有限，这增加了可电离脂质的高通量生产。98N12-5是第三代可电离脂质的第一个例子。对98N12-5脂质的修改和改进导致了包括C12-200和C14-113在内的优越类似物的发明。C14-113脂质可以特异性靶向心肌，从而可以为优化和靶向基因疗法以增强心脏功能开辟新的视野。Li等人报道TT3是一种有效的脂质，用于递送编码CRISPR/Cas9、因子IX和SARS-CoV-2的各种mRNA分子。除了寻找提高效力外，还在进行提高基因递送特异性到特定目标细胞或器官的兴趣。针对免疫细胞以及初级和次级淋巴器官的疫苗和免疫疗法的靶向递送正在迅速进行。一些靶向剂的例子包括含有多环尾部的脂质，包括11-A-M，以及含有环状咪唑头基的脂质，如93-O17S，专门设计用于靶向T细胞。此外，脂质A18-Iso5-2DC18中的环状胺头基已被证明可以结合干扰素基因刺激因子(STING)蛋白。这导致树突状细胞成熟，并通过免疫刺激具有抗肿瘤效果。这对于使用基因疗法的癌症免疫疗法可能是一个有用且理想的特征。利用第三代可电离脂质的基因疗法也显示出对抗多药耐药细菌感染的希望。将抗菌肽和组织蛋白酶B mRNA递送到巨噬细胞的环状维生素C衍生的可电离脂质表明，该疗法可以消除多药耐药细菌，并保护小鼠免受细菌诱导的败血症。LNPs是mRNA最先进的且经临床批准的递送载体。 3.3. PEG-脂质 在成分中，聚乙二醇(PEG)是一种亲水材料，以其在化妆品、食品和制药工业中的广泛应用而闻名。LNPs中的聚乙二醇化脂质组分通常连接到锚定脂质上。发现PEG是LNPs配方中的基本化学物质，可以减少纳米颗粒被过滤器官的摄取，也提高了LNPs在生物流体中的胶体稳定性。因此，LNPs的循环半衰期和体内分布得到了增强。通常，PEG-脂质在LNPs的脂质成分中占最小摩尔百分比（大约1.5%）。然而，它们在影响诸如粒径、多分散性指数、聚集减少、颗粒稳定性改善和封装效率等关键参数方面发挥着非常关键的作用。PEG的分子量和锚定脂质的碳链长度可以被利用来微调循环时间，并通过免疫细胞的摄取，改变效率。此外，LNPs上的PEG-脂质涂层作为防止存储期间自组装和聚集的立体亲水屏障。因此，PEG的存在有助于稳定LNPs并通过限制脂质融合来调节大小。PEG的数量与LNPs的大小成反比；PEG含量越高，LNPs的尺寸越小。通常，PEG的分子量范围在350到3000 Da之间，锚定脂质的碳链在13到18个碳之间。多个文献报告表明，PEG的分子量越高，脂质链越长，纳米颗粒的循环时间就越长，免疫细胞的摄取也越少。随着PEG-脂质从LNP表面解离，它减少了LNP的循环时间，并提供了更多的机会，通过称为“PEG-困境”的效应将mRNA货物传递到目标细胞。在某些情况下，当PEG-脂质的摩尔%保持在1.5%时，体内转染水平被发现与脂质的碳链长度无关。PEG-脂质的一个额外优点在于它们能够将特定配体结合到LNPs上，从而有助于靶向药物递送。 3.4. 辅助脂质 辅助脂质在LNPs配方中的主要功能在于支持其在储存和体内循环过程中的稳定性。从化学角度来看，这些是甘油酯类，并且是非阳离子性质的。在各种辅助脂质中，甾醇和磷脂是最广泛使用的。胆固醇是细胞膜中存在的天然成分。它是一种可交换的基团，可以很容易地在LNP中积累。从一系列的不同研究表明，胆固醇可能存在于表面、脂质双层内部，甚至与其核心中的离子化脂质共轭。它通常被纳入LNP配方中，通过填补脂质间的空隙来维持稳定性。需要胆固醇的存在来调节LNP内部脂质双层基质的密度、摄取和流动性。因此，它通过“凝聚效应”控制膜的刚度和完整性，防止任何泄漏。胆固醇的疏水尾部、甾体环的柔韧性以及羟基的极性被报道影响LNP递送的效力。胆固醇还有助于通过减少表面结合蛋白来提高LNPs的循环半衰期。此外，它通过与LNPs的细胞摄取期间的内体膜融合发挥作用。它在降低从层状相向六角相转变所需的温度中起着至关重要的作用；因此，LNP中的mRNA货物将被递送到细胞质中。磷脂在LNP配方中的包含可以帮助提高封装效率（与胆固醇一起）并增加细胞递送。通常，LNP中的磷脂数量大大减少，同时增加胆固醇含量以延长循环时间。此外，磷脂的包含促进了LNP的包封效率和转染效力。有报道称，增加磷脂的摩尔百分比有助于通过LNPs加速递送效力。这些以Zwitter离子形式存在的磷脂被报道在通过稳定阳离子脂质、mRNA货物和周围水分子之间的静电相互作用中发挥关键作用。然而，磷脂在通过LNPs递送mRNA中的实际作用仍然不明确。因此，进一步探索磷脂在增强颗粒稳定性和体内递送中的实际作用仍然很有趣。图4描述了LNPs的成分，包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 图 4. 脂质纳米颗粒的成分，包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质 3.5. 影响mRNA-LNPs的物理化学性质 LNPs具有许多独特的特性，其中大多数是有益的；讽刺的是，一些特性赋予了一些不希望的毒性。因此，非常关键的是要理解影响装载mRNA的LNP的物理化学性质。 大小和表面积：大小和表面积决定了LNP与生物系统的相互作用过程，以及分布、消除、内吞、降解和响应。减小大小对应于表面积的增加，从而使其对周围生物环境更具反应性。包括内吞作用和细胞摄取在内的基本生物活动大多依赖于颗粒大小。任何大小依赖的毒性都是基于LNPs进入生物系统并修饰大分子的能力，从而改变基本的生物功能。在疫苗的情况下，报告了高效率的递送，同时保持了大约50纳米的粒径，不考虑其化学成分。 电荷：电荷在决定LNPs的生物分布和疗效命运中起着主要作用。载体的电荷对于将mRNA疫苗穿过生物膜非常重要。因此，带负电荷的mRNA可以与带正电荷的阳离子脂质发生静电相互作用，从而实现高效封装。最终，阳离子脂质体与带负电荷的细胞表面和内体膜相互作用，释放mRNA货物。阳离子脂质的pKa（获得正电荷的能力）对递送mRNA货物有显著影响；显然，了解其作用非常重要。尽管，围绕基因递送所需的实际pKa值仍存在一些不确定性。一些报告指出，通过IV途径递送LNPs的理想pKa范围在6.2到6.6之间。电荷调节已经被有效地研究用于减轻毒性表现，同时改善从LNPs中递送mRNA。 形状和结构：形状和内部结构是直接影响细胞摄取和与生物环境相互作用的重要参数。一些报告提到，与其他形状相比，球形纳米颗粒的内吞作用相对容易。或者，非球形纳米颗粒更倾向于通过毛细血管流动。关于形状和结构的作用机制及其在体内的作用至今仍不清楚。由于涉及许多技术挑战，由形状和结构引起的实际作用机制仍然未被广泛探索。因此，需要加快研究步伐，以了解它们在变形膜和治疗效率方面的活动。 表面组成：LNPs的有效递送和生物分布可能受到递送载体表面组成的影响。众所周知的例子包括通过聚乙二醇化（PEGylation）在LNPs表面引入PEG-脂质进行表面修饰。这种聚乙二醇化过程已知能够改变纳米载体的运输，并延长循环半衰期。然而，除了改善生物分布和循环外，聚乙二醇化还可能通过空间位阻减少LNPs的摄取，并限制与血浆膜的相互作用。因此，PEG-脂质会从血清中脱离并缓解空间位阻，以利于内体摄取。 4.mRNA疫苗制造  mRNA疫苗相比传统疫苗展示了多项优势，包括易于开发、易于扩大规模和快速制造。与其它疫苗类似，mRNA疫苗药物产品在制造过程中经历三个典型步骤，即上游生产、下游纯化，以及最终的mRNA药物物质的配方。本节将讨论这些步骤以及每个过程中的较新发展，以简化mRNA疫苗生产。 4.1.上游生产 mRNA疫苗的上游生产包括从含有感兴趣基因的质粒中生成mRNA转录本。这个反应被称为体外转录反应（IVT）。IVT酶促反应依赖于RNA聚合酶，如T7、SP6或T3。RNA聚合酶催化合成目标mRNA，该mRNA来源于含有感兴趣基因的线性化DNA模板。线性化DNA模板是通过限制性内切酶酶切含有感兴趣基因的质粒产生的，或者通过PCR扩增感兴趣基因也可以用来产生mRNA分子。IVT反应的基本酶包括：(i) RNA聚合酶 - 将DNA转换为RNA，(ii)无机焦磷酸酶（IPP） - 提高IVT反应产量，(iii)鸟苷酸转移酶 - 向mRNA的5'端添加GMP核苷酸，(iv)Cap 20-O-甲基转移酶（SAM）- 该酶在mRNA的5'帽的20位置添加甲基，(v) DNase I - 用于去除RNA样品中污染的基因组DNA和IVT反应中DNA模板的降解的内切酶，以及(vi)聚(A)尾聚合酶和(vii)修饰和未修饰的核苷酸三磷酸(NTPs)。这些酶促进了含有感兴趣基因的质粒的mRNA转录本的上游开发。加帽酶包括SAM和鸟苷酸转移酶，它们在mRNA的5'端酶促形成5'帽，而聚(A)尾聚合酶尾部酶形成聚(A)尾。另一种5'加帽方法是使用共转录方法，其中5'帽事先准备好，然后以非酶促方式添加到mRNA上。这种共转录反应可以使用CleanCap®试剂AG进行。 4.2. 下游纯化 mRNA通过上游生产阶段的IVT反应产生；然后在下游处理中通过多个纯化步骤进行分离和纯化。IVT反应混合物包含几种杂质，包括残留的NTPs、酶、错误形成的mRNA和DNA质粒模板。基于实验室规模的IVT mRNA纯化涉及通过DNase酶消化去除DNA的方法，然后是氯化锂(LiCl)沉淀。基于实验室的方法不允许完全去除异常mRNA物种，包括dsRNA和截断的RNA片段。去除这些杂质是获得纯mRNA产品的关键，该产品展示了其预期的效力和安全概况。低效的纯化技术可能导致mRNA疫苗产品具有降低的翻译效率和不必要的免疫刺激性。例如，当通过反向相HPLC纯化修饰的mRNA然后将其传递给树突状细胞之前，观察到mRNA转染和相关蛋白质产量增加了10-1000倍。色谱法是生物制药行业中普遍且广泛接受的用于疫苗和生物药物产品纯化的纯化过程。2004年首次发表的用于大规模核酸纯化的RNA寡核苷酸的程序使用了尺寸排除色谱法(SEC)。SEC有几个优点，包括选择性、可扩展性、多功能性、成本效益以及实现核酸产品的高纯度和产量。然而，SEC不能去除具有相同大小的杂质，如dsDNA。与SEC相比，离子对反向相色谱法(IEC)已被证明是mRNA疫苗的极好纯化技术。IEC可以轻松地将目标mRNA与IVT反应中的杂质分离。这种分离方法依赖于目标mRNA和杂质之间的电荷差异。IEC有几个优点，包括从目标mRNA中分离出更长的RNA转录本、更高的结合能力、成本效益和可扩展性。由于IEC在变性条件下进行，该过程变得复杂且对温度敏感。基于亲和的色谱分离是另一种mRNA纯化方法。脱氧胸腺嘧啶(T)-寡脱氧胸腺嘧啶(dT)是一种捕获mRNA聚(A)尾的序列。含有Oligo dT的色谱珠可以用于mRNA疫苗的下游纯化。切向流过滤(TFF)或核心珠过滤可用于去除小尺寸杂质。作为mRNA疫苗的最终抛光步骤，与连接的交互介质单体(CIM)柱连接的疏水相互作用色谱(HIC)含有OH或SO3配体可以极其有益。 4.3. 配方 作为带负电荷的mRNA分子，应该在基于脂质的药物递送系统中进行配方设计，以避免mRNA降解并提高其转染效率和半衰期。LNPs是最受信赖、最可靠且经美国FDA批准的基于脂质的非病毒载体系统，用于递送mRNA疫苗药物物质。通过将溶解在有机相中的脂质沉淀并与水相中的mRNA混合来形成mRNA LNPs。有机相中最常用的脂质是可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。同时，mRNA溶解在pH 4的柠檬酸或醋酸缓冲液中。将水相和非水相混合使可电离脂质质子化，引起可电离质子化脂质与阴离子mRNA之间的静电吸引。这种相互作用同时与其他脂质的疏水相互作用耦合，并推动mRNA-LNPs自发自组装，将mRNA包裹在纳米颗粒的核心内。这个过程也称为微沉淀。LNP形成后，进行透析以去除非水溶剂（通常是乙醇），并将溶液pH提升至生理pH。微流体混合器能够使LNP形成小尺寸、低多分散指数和高mRNA包封效率。微流体混合是实验室规模和GMP水平mRNA LNP配方最常用的方法。Precision NanoSystems的NanoAssemblr®平台已广泛用于LNP配方开发和在受控环境下的GMP生产。该系统使用错位鲱骨型微混合器（SHM）墨盒结构。SHMs的结构使得两种水相和非水溶剂在微秒内混合。这个时间尺度比脂质聚集所需的时间要小得多；因此，SHMs产生均匀尺寸的小纳米颗粒。NanoAssemblr®的设置可以简单调整流速和水相与非水相的体积，以获得所需尺寸和尺寸分布的LNPs。总流速12-14 mL/min和流速体积比3:1，非水相：水相，通常用于产生小的单分散LNPs。尽管SHMs在高效生产LNPs方面具有多个优点，但由于溶剂不兼容性，它们在GMP生产中的实用性受到限制。SHM及其内部部件长期暴露于含聚二甲基硅氧烷的乙醇中可能导致其变形。在连续的GMP生产运行中更换墨盒变得困难。因此，T型混合器被用于LNP的放大和生产。它们可以产生与SHM相似的LNPs，可以处理更高的流速和体积（60-80 mL/min），并且与乙醇等有机溶剂兼容。图5解释了mRNA疫苗制造的过程。 图 5. mRNA 疫苗制造过程的步骤和阶段。mRNA 疫苗生产可以分为三个阶段：上游 mRNA 制造、下游 mRNA 纯化和 mRNA 脂质纳米颗粒的配方。mRNA 生产可以通过一步共转录反应进行，其中使用加帽试剂，或者通过两步反应进行，其中进行酶促加帽。小规模实验室规模的 mRNA 纯化过程包括 DNase I 消化酶，然后是 mRNA 的 LiCl 沉淀。大规模的 mRNA 纯化涉及利用已建立的色谱方法结合切向流过滤（TFF）。最后，mRNA 疫苗的配方包括将 mRNA 水溶液与非水相的脂质溶液混合。这导致脂质纳米颗粒（LNPs）的自组装，并将带负电的 mRNA 包裹在 LNPs 的核心内。mRNA 和脂质分子在错落有致的鲱鱼骨微型混合器（SHM）中的混合发生在多个周期中，这导致了最终 mRNA-LNP 疫苗的形成。 5.mRNA疫苗在临床试验中  任何疫苗候选物在成功的临床前研究之后和市场推出之前的关键步骤是临床开发。任何mRNA疫苗的临床开发包括一系列临床试验，以评估其在人类中的安全性、免疫原性和有效性。根据患者的群体和试验的目标，它们被归类为1期、2期、3期和4期。1期研究在一小群人类（理想情况下是一个中心）中进行，主要确定疫苗的安全性和药代动力学。2期研究是概念验证研究，主要旨在确认1期研究中获得的结果，并在稍微更多的人类中评估效力。3期研究是确认性研究，在多个中心和广泛的人类群体中进行，以确认疫苗候选物的有效性和安全性。这些研究通常使用活性对照或安慰剂进行。4期研究在疫苗候选物获得市场批准后进行，主要旨在确认疫苗的安全性。每种疫苗候选物在商业推出之前都必须在所有临床研究中经过关键的临床评估。疫苗的开发需要几年时间才能完成。然而，由于COVID-19大流行，Comirnaty（辉瑞）和Spikevax（Moderna）在不到一年的时间内获得了紧急使用授权（EUA）。目前，有各种各样的mRNA疫苗正在进行临床试验，目标是传染病（COVID-19、流感、寨卡病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等）、遗传性疾病和癌症，因为mRNA疫苗能够平衡适应性和先天免疫反应。这些疫苗大多数都是基于脂质体的，并且处于1期和2期临床试验中。此外，约60-70%的正在进行的临床研究是使用基于mRNA的COVID-19疫苗进行的。因此，我们在下面的表1中总结了所有正在进行的非COVID-19 mRNA疫苗的临床试验。如前所述，大多数mRNA疫苗处于临床试验的早期阶段（1期或2期），只有少数基于mRNA的疫苗处于3期开发阶段。下面的部分提供了当前处于3期阶段的疫苗的详细信息。 5.1.mRNA-1345 mRNA-1345是Moderna针对呼吸道合胞病毒（RSV）感染开发的疫苗候选物，它编码一种称为融合前F糖蛋白的RSV蛋白，从而引发有效的中和抗体反应。这种蛋白负责病毒的进入和细胞间的传播，对于RSV感染的传播至关重要。这种疫苗是一种基于脂质纳米颗粒的疫苗，包含优化的蛋白质和密码子序列。美国FDA最近为60岁以上的成年人授予了mRNA-1345的快速通道审查指定。以前为RSV感染开发的几种疫苗在临床试验中失败，原因是免疫反应低。最近，Moderna报告了正在进行的1期研究的中期结果，评估了mRNA-1345在儿童、年轻人、老年人和育龄妇女中的耐受性、反应原性和免疫原性。结果显示，截至数据截止日期，疫苗在试验中的所有剂量水平都得到了良好的耐受。该研究预计将在2023年完成。正在进行的mRNA-1345疫苗2/3期研究（NCT05127434）在60岁及以上的成年人中进行，以评估mRNA-1345疫苗的安全性和耐受性，并证明与安慰剂相比，mRNA-1345疫苗单剂量在预防首次RSV相关下呼吸道感染（RSV-LRTD）方面的效力，从注射后14天开始至12个月。该研究计划在两个安慰剂对照阶段进行，即2期在400至2000名参与者中进行，3期在超过30000名参与者中进行。研究的主要目标是评估疫苗的安全性和效力。安全性终点包括监测参与者发生不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括mRNA-1345疫苗效力（VE）在注射后14天至12个月内预防首次RSV-LRTD发作。这项研究于2021年11月开始，预计将于2024年11月完成NCT05127434。 表 1. 正在进行的 mRNA 疫苗临床试验（不包括 COVID-19 疫苗） 5.2 mRNA-1010 mRNA-1010是由Moderna开发的一种四价流感疫苗候选物，它编码了世界卫生组织建议的四种季节性流感病毒的表面蛋白——血凝素（HA）蛋白，包括季节性流感A/H1N1、A/H3N2以及流感B/Yamagata和B/Victoria谱系。HA被认为是疫苗开发的重要靶点，因为它能产生广泛的抗流感保护，并且是目前可用流感疫苗的主要靶点。mRNA-1010的有效性已在1期和2期研究中进行了评估。2021年12月，Moderna公布了正在进行的1期研究的中期结果，该研究评估了mRNA-1010在年轻人和老年人中的三个剂量（50微克、100微克和200微克）。结果显示，在所有参与者中，所有剂量在接种疫苗后29天成功提高了针对所有菌株的血凝抑制试验几何平均滴度，并且没有显著的安全发现。该公司还确认，正在进行的mRNA-1010的2期研究已达到完全招募，计划在2022年进行中期分析。正在进行的3期对照研究（NCT05415462）旨在评估成人≥18岁的mRNA-1010季节性流感疫苗的免疫原性和安全性。活性对照是任何许可的四价灭活季节性流感疫苗。本研究的主要目标是评估mRNA-1010相对于活性对照针对疫苗匹配的流感A和B株在第29天的体液免疫原性，并评估mRNA-1010的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括第29天的抗血凝素（HA）抗体几何平均滴度（GMT）和达到血清转换的参与者百分比。本研究于2022年6月开始，预计将于2023年8月完成NCT05415462。 5.3 mRNA-1647 mRNA-1647是由Moderna开发的一种针对生育年龄妇女的巨细胞病毒（CMV）感染的疫苗候选物。它由六个mRNA组成，编码CMV表面的两个抗原。五个mRNA编码形成膜结合五聚体复合体的亚单位，而第六个编码全长膜结合糖蛋白B（gB）。mRNA-1647疫苗指导人类细胞制造抗原，产生功能性抗原，模仿CMV在自然感染期间呈现给免疫系统的抗原。迄今为止，mRNA-1647疫苗已在1期和2期研究中进行了评估。这两项研究的中期分析结果积极，并启动了3期研究以确认mRNA-1647的有效性和安全性。这项3期研究（NCT05085366）是一项随机、观察者盲法、安慰剂对照研究，旨在评估16至40岁健康参与者的mRNA-1647疫苗的有效性、安全性和免疫原性。本研究的主要目标是评估CMV血清阴性女性参与者中mRNA 1647疫苗的有效性，并评估所有参与者中mRNA-1647疫苗的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括血清免疫球蛋白G（IgG）对mRNA-1647未编码抗原的阴性至阳性结果的血清转换（时间框架：第三次注射后第197天（第三次注射后28天）至第887天（第三次注射后24个月））。本研究于2021年10月开始，预计将于2025年7月完成NCT05085366。 5.4 mRNA疫苗的临床安全性 任何疫苗候选物在临床开发计划中的早期临床试验的主要目的是评估其在人类群体中的安全性。通过主要监测不良事件、死亡、实验室发现等来评估疫苗的安全性。只有在安全性概况可接受的情况下，才可能获得任何疫苗的市场授权/批准。如果在研究期间和临床开发计划中出现任何不良事件，监管机构/机构伦理委员会（IEC）可以停止临床试验。预计与疫苗候选物相关的不良事件应该能够迅速解决/恢复。即使在疫苗获得市场批准后，申办方也有责任监测其安全性概况。由于核苷的存在，毒性是需要为基于mRNA的疫苗考虑的重要因素之一。据文献报道，一些基于核苷的抗癌药物和抗病毒药物的毒性是由于非天然核苷。特别是针对mRNA疫苗，肝脏毒性是在Crigler-Najjar综合征疫苗开发期间观察到的最常见毒性。这可以归因于用于递送的脂质纳米颗粒配方中的任何有毒辅料的存在。在另一项关于狂犬病的mRNA疫苗研究中，由于mRNA的炎症特性，在临床试验中报告了系统性不良事件。与mRNA疫苗相关的大多数毒性主要是由于配方中使用的辅料或其他在配方开发期间使用的溶剂。通过在安全限制内使用辅料并遵循减少疫苗中残留有毒成分的过程，可以避免这些毒性。未来，预期的mRNA疫苗的毒性包括局部和全身炎症、表达免疫原的生物分布和持久性、刺激自身反应性抗体以及任何非天然核苷酸和递送系统组分的潜在毒性效应。除上述外，这些疫苗还可能引起强烈的I型干扰素反应、水肿（由于细胞外裸露的RNA）、血液凝固和病理性血栓形成。另一方面，已有几种mRNA疫苗获得了全球卫生当局批准用于人类。所有批准的疫苗在临床试验评估期间都显示出可接受的安全性概况。例如，来自Pfizer–BioNTech（Comirnaty）和Moderna（Spikevax）的两种COVID-19 mRNA疫苗已经展示了出色的安全性和有效性概况。总体而言，临床开发中几种基于mRNA的疫苗的安全性概况一直是可接受的（耐受性良好），至今很少有或没有被撤出临床试验的。临床研究期间报告的大多数不良事件包括注射部位反应。所有申办方在疫苗开发期间都应将安全性视为一个重要因素，通过在非临床开发期间进行彻底的毒性测试。非临床研究的观察结果应在临床试验中考虑，并应仔细监测。 6.第二代mRNA疫苗  第二代疫苗是在改进了第一代mRNA疫苗的一些低效问题并增强了安全性、有效性、储存和处理之后开发的。这些改变包括使疫苗在室温下稳定，减少对冷链储存和运输的需求，同时保持相同的有效性和安全性。其他改变包括寻找更强大和靶向配体的纳米载体，这些载体可以有更好的安全性和mRNA递送效率概况。此外，正在进行大量研究，探索各种RNA基分子作为疫苗的使用，包括自扩增RNA。本节重点介绍预计将在未来开发的第二代mRNA疫苗。 6.1. 冻干mRNA脂质纳米颗粒 通常，mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗必须在零下温度下储存以保持稳定性和有效性。疫苗的冷链运输限制了低收入和新兴经济体国家获得疫苗的机会。长期稳定性是LNPs开发的主要问题之一，因为在水溶液中储存LNPs时观察到物理和化学不稳定性。化学降解涉及mRNA分子中键的改变。物理降解包括变性/聚集（二级和三级结构的丧失）、融合和封装mRNA的泄漏。mRNA的化学降解主要通过水解和氧化发生。LNPs中脂质的降解也导致水解和氧化。水解主要发生在mRNA分子的主链——磷酸二酯键上。另一方面，氧化影响mRNA的核苷酸碱基和糖基团。氧化导致mRNA链断裂、碱基断裂和二级结构改变，这可以阻止体内抗原的翻译。此外，LNPs储存过程中的脂质结晶和脂质多态转变导致药物泄漏或排斥。储存条件是强烈影响mRNA-LNP疫苗稳定性的一个关键参数。mRNA-LNPs的长期储存尚未完全探索。在长时间储存期间，mRNA-LNPs可能会经历结构变化。因此，了解在储存期间对它施加了哪些变化以获得稳定的mRNA-LNP至关重要。由于mRNA-LNPs中的降解反应是由水的存在引发的，冻干是一种广泛使用的干燥技术，用于包括mRNA-LNPs在内的纳米颗粒的长期储存。在冻干的蛋糕或粉末形式下，mRNA-LNP疫苗可以方便地在全球运输，而不需要冷冻储存。 冻干过程分为三个阶段：冷冻、一次干燥和二次干燥。在冷冻过程中，水被冻结成冰晶，而溶质材料被排除在冷冻浓缩相中。一次和二次干燥过程都是在真空下进行的。一次干燥步骤在低温下进行，此阶段通过升华过程去除冻结的水。在二次干燥步骤中，温度升高以通过解吸机制去除未冻结的水。冻干过程的详细信息在其他研究中讨论。 由于mRNA-LPN疫苗是由特定类型的脂质在一定浓度下制备的，因此在冻干及随后的储存过程中保留物理化学参数（如粒径、多分散性和封装效率）非常重要。因此，仔细选择冻干过程参数、缓冲液和冷冻保护剂和冻干保护剂至关重要，以确保稳定效果。在一项研究中，Shirane等人在形成LNPs后冻干了含有siRNA-LNP的乙醇分散液。结果表明，新鲜制备（传统）和重新配制的冻干配方之间的体内基因敲低效率没有差异，证明了mRNA-LNPs冻干的可行性。在冻干过程中的冷冻和干燥步骤中，封装在LNP中的mRNA可能会暴露于不同的压力下，这最终会影响mRNA-LNP的稳定性。因此，在配方中使用冷冻保护剂非常重要，并且稳定LNPs的最佳冷冻保护剂取决于材料和配方类型。 Zhao等人确定了类似脂质纳米颗粒（LLNs）的mRNA的最佳储存条件。LLNs是使用可电离脂质、N1、N3、N5-三(3-(二十二烷氨基)丙基)苯-1,3,5-三羧酰胺衍生物、TT3制备的。筛选并评估了冷冻保护剂（海藻糖、葡萄糖和甘露醇）的类型和物理状态条件（如液态、冷冻或冻干）对纳米颗粒大小和体外及体内mRNA表达等属性的影响。在水性条件下，LLNmRNA没有保持长期储存稳定性。在最佳浓度下添加冷冻保护剂有助于保持冻干LLNs中mRNA的体外表达效率。然而，在冻干和重组过程中，LLN-mRNA的纳米结构发生了变化，这影响了mRNA-LLNs与血清蛋白的体内相互作用，导致不同的体内效率。在液氮中冷冻mRNA的LLNs，加入5%的蔗糖或海藻糖被认为是长期储存的最佳选择。 Hong等人使用阳离子脂质基递送系统开发了一种可冻干的SARS-CoV-2疫苗。重组疫苗在小鼠中诱导了针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应，证明了冻干后SARS-CoV-2的免疫原性和中和抗体活性。 在冷冻过程中的各种压力可能会影响LPNs的稳定性，包括晶体形成、界面效应、冻浓、缓冲液pH变化和相分离。冷冻过程中的晶体形成会施加一个冰-液界面，这可能导致胶体结构的吸附和损伤，包括mRNA的蛋白质分子。冷冻增加了剩余液相中溶质材料的浓度，促进了粒子-粒子相互作用，并导致粒子聚集。冻浓增加了对脂质双层的渗透压，给膜带来物理压力并导致膜破裂。此外，渗透稳定性取决于脂质膜组成，因为溶质的选择性渗透性。关于冷冻和干燥引起的压力的详细信息在其他研究中进行了讨论。 在一项研究中，Jones等人检查了冻干对mRNA完整性的影响。将25 µg/mL的纯化RNA在水或10%海藻糖中冻干，储存在-70°C、-20°C、4°C、37°C或室温下，在氮气下储存长达10个月，并分析RNA的完整性。在水中冻干的RNA恢复率在66%到零之间变化，而冻干在10%海藻糖中的RNA在所有时间点都显示出高一致性的恢复，允许在4°C下储存RNA长达10个月。这允许即使在发展中国家也可以开发RNA疫苗。 Muramatsu等人证明，修饰核苷的mRNA-LNPs可以冻干，并且mRNA LNPs的物理化学属性（粒径、封装效率）在环境温度下12周和至少在4°C下储存24周后没有显著变化。然而，在4°C和25°C储存时，冻干的修饰核苷mRNA-LNPs的RNA完整性分别观察到10-15%和30%的下降。此外，在小鼠中进行的体内生物发光成像研究表明，冻干的萤火虫荧光素编码mRNA-LNPs保持其高表达，没有失去其高翻译性。在比较小鼠免疫研究中，作者证明冻干的修饰核苷mRNA LNP流感病毒疫苗在室温储存12周后或在4°C储存至少24周后仍保持其效力。 水分替代假说和小分子玻璃化是冷冻保护剂（糖）在冻干过程中稳定生物系统的两种机制。作为冻干保护剂的海藻糖被报道在冻干过程和随后在-80°C、5°C、25°C和40°C储存期间都能稳定mRNA-鱼精蛋白复合物配方。在储存期间分析的质量属性，包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压，都满足了稳定和安全RNA药物所需的稳定性规格（WO2016165831A1）。 蔗糖似乎也是稳定LNPs成分之一的可裂解质子激活脂质材料（ssPalm）的合适冷冻保护剂。通常，在冷冻过程中，相互混溶性较差的分子会导致相分离，颗粒将通过相互碰撞发生聚集/聚合。蔗糖与含有接枝聚乙二醇（PEG）聚合物的LNP表面具有高混溶性。蔗糖与LNP表面PEG层之间的优先相互作用通过展示冷冻保护属性来稳定颗粒。 糖与磷脂头基之间的相互作用降低了干燥状态下脂质膜的熔化温度。糖减少了磷脂的酰链之间的范德华相互作用，并保持了头基间距。因此，糖减少了水与磷脂之间的相互作用，然后取代了水。 在无水条件下，糖是水的良好替代品。糖与脂质双层表面的脂质形成多个氢键，而不改变脂质双层结构。糖可以同时与不同的脂质相互作用，与磷脂极性基团（P=O和/或C=O）以及脂质胆碱部分的甲基基团相互作用。在玻璃化过程中，糖溶液在冷冻过程中变得冻浓，在去除水分后形成稳定的玻璃基质，导致冻干蛋糕被困在糖的玻璃基质中。具有低流动性和高粘度的玻璃基质保护脂质双层免受冰晶引起的损伤。此外，糖玻璃基质抑制了脂质相变介导的构象变化。渗透和体积效应是玻璃化期间两个关键属性，通过防止脂质膜聚集时相邻双层的紧密接触，从而减少机械应力。冻干技术的进展，包括使用SMART冻干进行量热温度测量和用于监测关键过程参数的过程分析技术，有助于满足mRNA-LNP疫苗更好的储存要求。 6.2.聚合物纳米载体 通常，与基于脂质的载体类似，用于mRNA递送的聚合物载体利用电静吸引力（聚合物的正电荷和mRNA的负电荷之间）进行mRNA多聚体的自组装。与基于脂质的系统相比，mRNA多聚体形成更坚硬的超分子结构，具有高分子量和较慢的聚合物链流动性，提供了卓越的稳定性。 Palamà等人通过乳液-扩散-蒸发方法开发了聚(ε-己内酯)纳米颗粒，用于细胞内递送GFP（绿色荧光蛋白）-mRNA。在颗粒组装之前形成鱼精蛋白-mRNA复合物，以获得更好的稳定性、控制释放和更高的mRNA装载量。具有核壳结构的纳米颗粒有一个被聚(ε-己内酯)层覆盖的mRNA内核，提供了更大的稳定性和隐身属性。作者指出，聚(ε-己内酯)纳米颗粒有潜力解决mRNA不稳定问题。mRNA递送的聚合物载体一直在与细胞毒性斗争，部分原因是聚合物的阳离子电荷。用聚乙二醇链修饰阳离子电荷聚合物可以改善体外和体内的货物递送并减轻细胞毒性。此外，聚合物载体的固有异质性和它们相对较低的基因转移效率限制了聚合物mRNA疫苗的临床转化和大规模生产。由于患者依从性和较少侵入性的疫苗接种，利用支架的mRNA疫苗递送已经被开发。Yan等人报告了一种可注射的壳聚糖海藻酸盐凝胶支架用于mRNA疫苗递送。通过单链mRNA与脂质体载体纳米颗粒的复合形成脂质复合体复合体。然后将mRNA脂质复合体装载到冻干的壳聚糖-海藻酸盐支架上，随后进行再水化步骤。此外，还确定了凝胶中mRNA的释放动力学和凝胶-mRNA的免疫效率。结果表明，基于支架的mRNA疫苗递送可能是传统免疫方法的潜在替代品。 聚乙烯亚胺已广泛用于mRNA疫苗递送。聚乙烯亚胺结构的优化提供了高基因转染效率。聚乙烯亚胺的属性，如在广泛的pH范围内的缓冲容量和在低pH下氨基酸基团的更高质子化比例，有助于核酸复合物的形成。尽管效果出色，但聚乙烯亚胺的应用受到其毒性和与带负电荷的血清蛋白的相互作用行为的限制，这导致蛋白质聚集。将PEG纳入配方、使用低分子量聚合物形式（大约2kDa的聚乙烯亚胺）、与环糊精共轭和二硫键连接是一些可以减轻聚乙烯亚胺毒性的策略。 低分子量聚乙烯亚胺（2k）已被用于递送HIV-gag mRNA至树突状细胞和BALB/c小鼠。在体内皮下注射后，形成的mRNA-低分子量聚乙烯亚胺复合物有潜力诱导抗原特异性免疫反应。基于2kDa聚乙烯亚胺的mRNA疫苗的鼻内给药成功递送了编码HIV gp120抗原的mRNA并诱导了系统性免疫反应。通过与几种环糊精复合来修改聚乙烯亚胺的化学结构，已被研究以确定聚乙烯亚胺的化学结构对mRNA递送到目标部位（淋巴结）及随后的免疫反应的影响。Tan等人合成了β-环糊精（β-CD）和支链聚乙烯亚胺（2kDa）共轭物，用于mRNA疫苗的递送。形成的复合物有效地封装了mRNA，并通过穿过质膜和从内体逃逸提供了高转染效率。 除了聚乙烯亚胺，其他聚合物载体，如聚(-氨基酯)、壳聚糖、聚酰胺胺和聚(2-丙基丙烯酸)，也已被研究用于mRNA递送。聚(-氨基酯)是一种生物可降解的聚合物，由于其外围高度的胺基密度，通过形成高度分支的树状球形树状大分子，有效地形成mRNA复合物。基于壳聚糖(CS)的核酸(mRNA)递送纳米颗粒之前已有研究。然而，它们有限的逃离内体的能力阻碍了mRNA的递送。壳聚糖是一种从几丁质衍生的生物相容性阳离子生物聚合物，与核酸通过静电力相互作用，并且可以接受化学修饰。电荷密度或脱乙酰度、分子量和胺基-磷酸盐比率(N:P)是壳聚糖参数，这些可以影响基于SiRNA-CS系统的转染效率。通过硫酸透明质酸包覆和添加海藻糖，CS-mRNA纳米颗粒的生物活性提高了4-10倍。尽管壳聚糖纳米颗粒的体外和体内递送是有效的，但与用于递送mRNA的脂质纳米颗粒相比，它们的胶体稳定性和内体逃逸潜力较差。聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子是高度分支的(甲基丙烯酸和乙二胺，并以胺基和羧酸末端基团结束)阳离子聚合物，具有生物相容性，允许与核酸包埋。Chahal等人为RNA疫苗递送开发了体外转录的传统未修饰mRNA和修饰PAMAM树状大分子纳米颗粒(MDNP)。修饰的树状大分子纳米颗粒可以通过在小鼠中提供多种抗原，对包括H1N1流感病毒和埃博拉病毒在内的广泛致命病原体提供保护性免疫。 聚(ε-己内酯)是一种吸引人的聚合物，用于mRNA应用，已获得食品药品监督管理局(FDA)的批准。由聚(ε-己内酯)组成的纳米颗粒具有低体外和体内毒性、在生物流体中高胶体稳定性、封装货物的控制释放行为，以及通过内吞作用实现的卓越细胞摄取。已采用生物可降解聚合物如聚葡萄糖(一种葡萄糖聚合物)和精胺(一种存在于所有生物体中的多胺)用于递送mRNA疫苗。在电荷比为5:1的情况下，聚葡萄糖:精胺共轭物与编码SARS-CoV-2 RBD抗原的mRNA自组装，保护了封装的mRNA不被核酸酶降解，允许在4°C下以冻干形式储存而不失核酸活性，这对于疫苗储存和运输是一个重要考虑因素。 E. Jeandupeux等人研究了将聚(2-丙基丙烯酸)PPAA纳入壳聚糖mRNA纳米颗粒，以提高生物活性并促进内体逃逸。PPAA是一种在酸性pH下具有膜溶解性质的阴离子聚合物。三元(CS/mRNA/PPAA)纳米颗粒对粒径、多分散指数、z-电位和体外转染效率进行了评估。与生物活性仅为75%的脂质对照(LipofectamineTM MessengerMaxTM (LP-MM) mRNA脂质纳米颗粒)相比，三元纳米颗粒在pH 6.5时显示出86%的表达水平，且未显示出任何代谢毒性。假设PPAA通过增加内体释放或降低CS/mRNA复合物稳定性来增强生物活性。尽管越来越多的研究表明使用各种聚合物载体进行mRNA递送，但值得注意的是，目前还没有全面比较研究可以指导使用聚合物载体有效递送mRNA疫苗的理想配方。 6.3.佐剂纳入脂质纳米颗粒 为了通过激活细胞特异性受体来增强免疫反应，从而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它们与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 肽也作为佐剂纳入脂质纳米颗粒。Xiang等人合成了靶向淋巴结的蜂毒肽-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离蜂毒肽相比，α-蜂毒肽-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面显示出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-蜂毒肽的良好稳定性和无副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导全身抗肿瘤反应。在一些研究中，来自细菌的单磷酸脂质作为佐剂被纳入。Ravindran等人通过将可溶性利什曼抗原(SLA)与佐剂单磷酸脂质-海藻糖二硬脂酸肌醇酸盐结合，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与未加佐剂的对照组相比，加佐剂的脂质体制剂在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对利什曼原虫的保护水平显著更高。即使在接种疫苗四个月后，包括诱导IFN-γ和Ig2a抗体在内的细胞免疫反应也很明显，这为所开发配方能够提供长期免疫提供了潜在证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中并增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被称为病原体相关分子模式(PAMPs)的分子组，能够被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特异性识别。佐剂通过TLR-9信号通路发挥作用，从初步数据中可以看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮的诱导和内体成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将一种名为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。可电离脂质已成为mRNA递送的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易地将mRNAs纳入，以生产具有高封装效率特征的脂质纳米颗粒。制定的纳米颗粒显示出成功表达肿瘤抗原，最终导致免疫反应的刺激。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为通过mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了通过在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白质亚单位疫苗，可以增强其效力，这归因于诱导T滤泡辅助细胞和激活体液反应。发现纳入可电离脂质组分在引发免疫反应中至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，被发现比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用使核酸结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒的纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤功效的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号通路。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内功效的估计显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗接种后免疫反应的增强。在脂质纳米颗粒中配制修饰核苷的mRNA已被证明是针对传染病的有效免疫方式。已经确定，在针对艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清HIV-1结合抗体的高滴度。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单一或多组分疫苗方面具有有希望的潜力。 6.4.靶向抗原呈递细胞 脂质纳米颗粒因其多功能特性，如生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性，正在成为疫苗递送的极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和Pfizer–BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为一种临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取有限。为了增强免疫反应，通过激活细胞特异性受体进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 肽也被作为佐剂纳入脂质纳米颗粒。Xiang等人合成了靶向淋巴结的蜂毒肽-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离蜂毒肽相比，α-蜂毒肽-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面显示出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-蜂毒肽的良好稳定性和无副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导全身抗肿瘤反应。在一些研究中，来自细菌的单磷酸脂质被作为佐剂纳入。Ravindran等人通过将可溶性利什曼抗原(SLA)与佐剂单磷酸脂质-海藻糖二硬脂酸肌醇酸盐结合，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。加佐剂的脂质体制剂在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对利什曼原虫的保护水平显著更高。即使在接种疫苗四个月后，包括诱导IFN-γ和Ig2a抗体在内的细胞免疫反应也很明显，这为所开发配方能够提供长期免疫提供了潜在证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被称为病原体相关分子模式(PAMPs)的分子组，能够被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特异性识别。佐剂通过TLR-9信号通路发挥作用，从初步数据中可以看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮的诱导和内体成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将一种名为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。可电离脂质已成为mRNA递送的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易地将mRNAs纳入，以生产具有高封装效率特征的脂质纳米颗粒。制定的纳米颗粒显示出成功表达肿瘤抗原，最终导致免疫反应的刺激。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为通过mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了通过在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白质亚单位疫苗，可以增强其效力，这归因于诱导T滤泡辅助细胞和激活体液反应。发现纳入可电离脂质组分在引发免疫反应中至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 6.5.自扩增mRNA疫苗 脂质纳米颗粒由于其多功能特性，如生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性，正在成为疫苗递送的极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和Pfizer-BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为一种临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取有限。为了增强免疫反应，通过激活细胞特异性受体进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，被发现比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用使核酸结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒的纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤功效的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号通路。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内功效的估计显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗接种后免疫反应的增强。在脂质纳米颗粒中配制修饰核苷的mRNA已被证明是针对传染病的有效免疫方式。已经确定，在针对艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清HIV-1结合抗体的高滴度。对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单一或多组分疫苗方面具有有希望的潜力。 7.mRNA疫苗的缺点  7.1.抗体反应的持续时间  mRNA疫苗接种后产生的抗原被抗原呈递细胞(APCs)摄取并运输到淋巴结。在这里，B细胞、APCs和滤泡辅助T细胞(TFH细胞)之间的相互作用促进了生发中心的形成。然后B细胞在生发中心增殖并分化和突变，产生针对病原体的高亲和力中和抗体。这一串生化免疫反应对于持久抗体至关重要，这对应于对传染病的长期作用。几种有前景的mRNA疫苗正在开发中，它们具有积极针对APCs的有前景的策略。针对LNPs与APC细胞特异性配体、单克隆抗体(mAbs)和肽的靶向是一些正在探索的策略，以增加mRNA疫苗产生的免疫反应。此外，通过延长抗原性mRNA的翻译来改变mRNA疫苗的药代动力学特性，现在已成为增强抗体反应的有前途的工具。mRNA疫苗在针对HIV-1、SARS-CoV-2、寨卡病毒和流感病毒的临床前研究中，已引发强大的生发中心免疫原反应和TFH细胞诱导。尽管这些结果是有希望的，但抗体反应的持续时间是一个复杂的现象，这将在抗原与抗原之间大不相同。此外，评估mRNA疫苗的免疫反应持续时间需要更长期的数据才能全面了解。 7.2.安全性 总体而言，目前的mRNA疫苗在临床试验和批准后的实际人口数据中展示了有希望的安全性概况。这些疫苗只有轻度或中度不良事件，如临床试验中所见。然而，也有一些零星的安全事件需要进一步优化mRNA疫苗及其所有组分。例如，CureVac基于精氨酸的狂犬病疫苗CV7201，在78%的参与者中引起不良反应。这导致CureVac采用LNPs作为他们下一个狂犬病候选物CV7202的主要和首选递送载体。像大多数药物一样，mRNA疫苗的不良反应通常随着剂量的增加而增加和升级。例如，在Moderna的流感H10N8疫苗的I期试验中，从400 µg开始观察到不良事件。因此，他们继续使用高达100 µg的较低剂量。在CV7202的I期试验中，5 µg剂量具有高度的反应原性；因此，1 µg是给受试者施用的最高剂量。 在每百万COVID-19疫苗接种中，轻度过敏反应的发生率分别为4.7例，Moderna疫苗为2.5例，Pfizer–BioNTech疫苗为2.2例。这比传统疫苗通常所见的要高得多。科学家提出，这种过敏反应可以归因于患者对LNPs中使用的聚乙二醇化脂质的预先存在的抗体。这些抗体可以在体内形成，以响应许多消费品中存在的聚乙二醇，如牙膏和洗发水。尽管聚乙二醇是安全的，但据传它以T细胞独立的方式在一部分人群中激活体液免疫。它通过直接交联B细胞受体并引入IgM的产生来实现这一点。据报道，40%的人群中存在抗聚乙二醇抗体，这可能会加速并增加过敏反应的风险，并妨碍疫苗效力。疾病控制和预防中心建议，mRNA疫苗不应给予对Pfizer–BioNTech或Moderna疫苗有过敏反应历史的人接种。由于mRNA疫苗配方的一些组分可能会在一部分人口中引起过敏反应，因此应该重新设计配方组分，以提高安全性。 7.3.孕产妇/新生儿疫苗接种 怀孕期间和婴儿新生儿阶段的免疫系统是高度动态和不断发展的，这可能会增加一个人对传染病的易感性。寨卡病毒可以感染发育中的胎儿的皮层神经元和神经胶质细胞，导致细胞死亡、神经炎症和严重的先天性胎儿畸形。巨细胞病毒感染可能导致大约1%的妊娠并发症，导致婴儿的先天性残疾，以及神经功能损害。也有报道称SARS-CoV-2病毒极为罕见地在子宫内传播。其对孕产妇和新生儿健康的影响正在调查中。为了解决这些缺点，孕产妇疫苗接种已成为提高孕产妇健康和减少新生儿发病率负担的工具。孕产妇IgG抗体可以很容易地通过与新生儿结晶片段(Fc)受体结合并进入胎儿循环来穿过胎盘屏障。这保护了胎儿免受病原体和其他传染病的侵害。几项临床前研究表明，孕产妇用mRNA-LNPs疫苗接种可以防止寨卡病毒传播到怀孕小鼠的胎儿，在A组和B组链球菌，并保护小鼠新生儿免受疱疹病毒的侵害。 7.4. 老年人疫苗接种 预计到2050年，世界60岁以上人口比例将从12%翻倍至22%。这一人群迫切需要疫苗，因为许多传染病对老年人的影响格外严重。例如，70-90%的流感相关死亡发生在65岁以上的人群中，COVID-19在65岁以上患者中的致死率比年轻患者显著高出65倍。老年人群体通过疫苗接种获得免疫更加困难，因为年龄对先天和适应性免疫系统产生不利影响。感染后产生的适应性免疫反应通常因细胞因子信号传导受损以及生理和细胞变化而不足。这些变化可能包括较少的初始B细胞和T细胞、T细胞凋亡的易感性增加、T细胞受体多样性减少，以及关键受体如细胞毒性CD8+ T细胞上的CD28表达降低。 mRNA疫苗可能是提升老年人免疫力的解决方案。这些疫苗可能为所有年龄组，特别是老年人提供强大的效力，正如Pfizer–BioNTech疫苗候选物BNT162b2的III期试验所见。该疫苗在所有按年龄明确定义的治疗组中激发了超过93%的效力。同样，Moderna疫苗mRNA-1273也非常有效，在65岁以上的志愿者中显示了86.4%的效力，与18-65岁年龄组的95.6%效力相比。设计有效的药物递送系统对于提高老年人的疫苗效力至关重要。mRNA递送载体作为佐剂，通过增强APC对注射部位的招募来放大疫苗反应。例如，诺华的油包水乳液MF59已被用作mRNA递送载体，并可用作佐剂。MF59增强了流感疫苗的免疫反应，并已获准用于老年人。在老年人群体中，用MF59佐剂的流感疫苗增强了血清转换率和血清保护率，与未加佐剂的疫苗相比。 7.5.疫苗接受度 只有当疫苗被接种，并且公众对疫苗的有效性有满意的接受度和信念时，疫苗才会有效。然而，由错误信息引发的公众怀疑威胁到群体免疫的实现和维持，使最脆弱的群体，如老年人和儿童，面临风险。疫苗覆盖率和接种率的下降可能导致本已根除的危及生命的疾病的重新出现。例如，麻疹在2000年已在美国完全根除，但由于较差的疫苗接受度，在2019年感染了超过1200人。对于COVID-19，由于信息的广泛可用性和大规模的意识，全球疫苗接受率在55%到90%之间。目前美国接受率在56-75%之间，这可能不足以维持对SARS-CoV-2的群体免疫阈值。此外，在美国，mRNA疫苗试验的高效力率提高了公众对mRNA疫苗的信心。 7.6.疫苗获取 负担得起且易于获得疫苗是实现对传染病普遍保护的最大挑战，特别是在低收入国家。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷藏要求，这种获取进一步受到限制。在2014-2016年西非致命的埃博拉病毒爆发期间，需要-80°C储存的疫苗通过便携式和可重复使用的Arktek冰箱供应到刚果民主共和国，允许向40万人接种疫苗。这样的冷藏技术能够在流行病期间迅速部署数百万剂疫苗。然而，在像COVID-19这样不断发展的大流行中，为数十亿人接种疫苗需要热稳定的疫苗。两种SARS-CoV-2疫苗候选物在临床前研究报告称在室温下具有热稳定性。 如果这些热稳定的mRNA疫苗候选物在临床试验中显示出有希望的结果，它们将极大地简化全球未来对mRNA疫苗的获取。设计负担得起、稳定且有效的热稳定mRNA疫苗是当务之急。 8.结论 几十年来在mRNA设计及其递送技术方面的发展和研究，使mRNA疫苗成为抗击大流行病和现有传染病的惊人工具。首批两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗以意想不到的速度开发出来。这些疫苗超出了预期，并为mRNA疫苗的未来奠定了坚实的基础和必要的基础工作。从众多针对mRNA疫苗的临床试验中可以看出，这些疫苗可以与常规疫苗平台并驾齐驱，甚至在未来取代它。mRNA技术有潜力开发出更有效的疫苗，以对抗持久和具有挑战性的病原体，并在未来治疗各种癌症。然而，需要在mRNA递送技术上取得进步，以实现更有效、更安全且无需冷链的mRNA疫苗，这些疫苗有能力跨越边界为数十亿人群接种。需要进一步研究mRNA疫苗如何影响先天免疫反应。已批准的mRNA疫苗的大量积极安全性和效力数据，加上明确的监管批准路径，为科学界带来了希望，即mRNA治疗确实有巨大的潜力，可以改变现代生物治疗方法，用于疫苗接种、蛋白质替代疗法和癌症免疫疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。