BRD7

近日，来自诺华公司的Claudio R. Thoma和Martin Schröder 在 Nature Communications上发表了一篇题为《DCAF1- based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance》的文章。报道了一种基于E3连接酶受体DCAF1的非共价PROTACs分子开发，DCAF1是CRL4连接酶亚家族中包含WD40重复结构域（WDR）的E3连接酶，作者以核蛋白BRD9和酪氨酸激酶BTK作为降解对象，证明了DCAF1的PROTACs可用于靶向降解，并提供了一种替代策略来解决VHL和CRBN耐药。 靶向蛋白质降解 (TPD) 通过小分子诱导的 E3 连接酶重定向来泛素化新底物并标记它们进行蛋白酶体降解，从而调节蛋白质水平。TPD最近已成为药物发现的关键模式。到目前为止，人类基因组编码超过600种E3连接酶，只有少数E3连接酶被用于TPD，包括 CRBN、VHL、cIAPs、MDM2、DCAF15、DCAF16和KEAP1等，基于这些E3连接酶已经开发了一些E3连接酶配体，包括常见的VHL配体VHL-7, CRBN配体免疫调节抑制药物 （IMiD）泊马度胺、来那度胺及其衍生物等。在TPD应用中，很少有其他非共价配体能与这些E3酶的效果相匹配。E3连接酶的共价配体具有一定的缺点：降低了PROTAC分子的催化性质、可能会阻断天然底物的降解、更容易产生靶向毒性。共价E3配体的不可逆性质也可能使高特异性连接酶配体产生复杂化。用于TPD最广泛的免疫调节药物是沙利度胺及其衍生物，它们已被批准用于治疗多发性骨髓瘤（MM），它是一种依赖IKZF转录因子的浆细胞恶性肿瘤。但IMiD治疗的MM患者中，大约30%的难治性患者的CRBN水平发生了改变，在大多数情况下会出现拷贝丢失，而较低的CRBN含量会导致IMiD介导的IKZF降解减少，进而出现耐药。CRBN是一种基于全基因组CRISPR KO研究的非必需基因，因此，靶向必需的E3连接酶是一种潜在的策略，可以避免或至少延缓治疗耐药性的出现。 近期WDR配体的发现（EED27和WDR52）表明WDR是可靶向的，23年一篇文章报道了DCAF1的WD40 domain的可逆配体，进一步强调了开发基于非共价DCAF1的PROTACs的潜力。在约600个E3连接酶中，作者重点研究了48个含有WDR结构域作为推定识别基序的E3连接酶。DCAF1是CRLDAF1和EDVP复合物的一部分，显示出与DDB1相似的肿瘤重要性。此外，DCAF1已被证明是Cullin4连接酶组合中的首选受体，并且是CRL4 E3连接酶中第二丰富的CRL4受体，仅次于CRBN（图1）。 利用核磁共振、计算机辅助药物设计、生物物理学和结构-活性关系等方法，作者筛选和优化了EED27的WDR配体，发现了化合物13通过伯胺占据DCAF1 WDR donut-hole口袋的支架，另一端的哌嗪位于口袋出口，可以用于后续的衍生。作者于是构建了炔基衍生的化合物16并进行了化学蛋白质组学实验，实验结果表明化合物16可以成功富集到整个CRL4-DCAF1复合物（包括CUL4A/B，DDB1，DDA1和RBX1）（图1）。 考虑到DCAF1主要定位在核质中，作者首先测试了DCAF1 PROTAC能否靶向降解BRD9。作者将已知的BRD9溴结合域配体与化合物13的哌嗪部位偶联，得到了PROTAC分子DBr-1，并通过TR-FRET和SPR评估了其对DCAF1的结合力，结果成功证明了DCAF1- DBr-1-BRD9三元复合物的形成。随后作者在细胞内验证了DBr-1的降解能力，结果显示在HEK293细胞中1000 nM的DBr-1在6 h后成功降解了90%的BRD9，且该过程可以被蛋白酶体抑制剂所抑制。浓度为1000 nM DBr-1的时间梯度降解实验显示，30 min后降解90%并保持6h以上，24h和48h后缓慢反弹。选择性实验也表明，DBr-1在降解BRD9的同时仅对BRD7有微弱的影响（图2）。 基于VHL的BRD9 PROTAC VZ185也可以降解BRD7和9，而CRBN的PROTAC dBRD9可以选择性地降解BRD9。为了评估DCAF1 PROTAC的选择性并对其性能进行测试，作者直接比较了DBr-1与VZ185、dBRD9在HEK293细胞中降解BRD9和BRD7的能力。结果显示，DCAF1的降解效果与CRBN和VHL基本相当（图3）。 在成功降解BRD9之后，作者探索了DCAF1 PROTACs是否也可以介导核外蛋白的降解。dasatinib结合超过30种激酶，并在低纳摩尔浓度下抑制ABL、DDR、TEC、SRC和EPH亚家族的57种酪氨酸激酶。作者将dasatinib偶联到DCAF1配体上，合成了另一个的PROTAC DDa-1。首先通过WB测试DDa-1对四种非受体酪氨酸激酶的作用：C-Src酪氨酸激酶（CSK）、Lck/Yes相关蛋白酪氨酸激酶（LYN）、LIM结构域激酶2（LIMK2）和Abelson蛋白酪氨酸激酶1（ABL1）。结果显示CSK和LIMK2蛋白水平在6小时后以蛋白酶体（26Si）和CRL依赖方式（NAE1i）显著降低，但LYN或ABL1蛋白水平没有下降。与CRBN-dasatinib降解剂CDa-1相比，DDa-1对这两种降解激酶的降解能力有所降低（图4）。 为了深入了解全局蛋白丰度的变化，作者利用蛋白质组学的方法分析了DDa-1处理6小时后的HEK293T细胞。证实了两种激酶CSK和LIMK2的下调，并进一步发现了另外两种非受体酪氨酸激酶TEC和TNK2显示出显著的蛋白水平降低。据报道，TEC和TNK2都优先定位于质膜。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是TEC家族的另一个成员，已被证明是PROTAC介导的劫持CRBN降解的一个有吸引力的靶标。因此作者后续构建了一个BTK筛选系统，在该系统中测试DDa-1验证了内源性BTK降解的发现（图4）。 随后作者使用一个特异性的BTK配体合成了不同的DCAF1-BTK PROTACs。选择了两个分子进行进一步的表征，DBt-5是通过一个长的聚乙二醇linker连接，而DBt-10通过一个更刚性的linker连接DCAF1和BTK配体。通过TR-FRET和SPR评估这两种PROTAC的DCAF1二元亲和性。DBt-5对DCAF1的亲和性略高于DBt-10。在TR-FRET和SPR实验中，额外的BTK增加了DBt-10对DCAF1的亲和力，而降低了更柔性的DBt-5对DCAF1的亲和力（图5）。 作者进一步评估了DCAF1-PROTAC-BTK三元复合物的形成以及两种PROTAC处理后BTK的体外泛素化。DBt-10的初始速度和最大SPR响应高，说明稳定的三元配合物可以提高泛素化效率。尽管DBt-5和DBt-10表现出不同的二元和三元配合物稳定性和细胞渗透性，但DBt-5和DBt-10都能有效降解BTK-GFP。DBt-10的毒性比DBt-5小，因此选择DBt-10进行后续实验，结果表明DBt-10具有高选择性并能显著降解BTK（图5）。以上结果证明DCAF1配体也可以用于开发高选择性的PROTACs。 作者选择缺乏VHL表达的768-O细胞作为模型。基于VHL的降解剂VZ185并不能有效降解BRD9。在相同的实验环境下，DCAF1和基于CRBN的BRD9降解剂DBr-1和DBRD9对BRD9的降解效率基本一致。这些结果证实，在VHL不表达的生物学环境中，DCAF1是PROTACs应用的另一种必需连接酶（图6）。 随后作者又测试在基于CRBN的PROTACs失去降解能力的情况下，必需的连接酶DCAF1是否可以作为替代品。DCAF1和CRBN都需要相同的结合伙伴（如DDB1和CUL4A）来形成活性E3连接酶复合物。使用CRBN-BTK PROTAC敏感和耐药的TMD8细胞来进行研究，研究结果显示用DBt-10检测TMD8 CBt敏感和耐药的细胞，结果显示BTK的降解没有差异，而使用CBt处理这两种TMD8细胞系导致了100倍的增殖抑制差异。以上实验数据表明DCAF1是一种极具潜力CRBN和VHL的替代物（图6）。 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

引言核孔蛋白(Nups)的突变或失调与神经发育性疾病密切相关，但其潜在机制尚不清楚。2024年1月24日，厦门大学张亮团队在Developmental Cell (IF 11.8)在线发表题为“Nucleoporin Seh1 controls murine neocortical development via transcriptional repression of p21 in neural stem cells”的研究论文，该研究表明核孔蛋白Seh1通过抑制神经干细胞中p21的转录来控制小鼠新皮层的发育。该研究发现放射状胶质祖细胞中Nup Seh1的缺失导致神经祖细胞增殖和分化缺陷，最终表现为神经发生受损和小头畸形。干细胞增殖的丧失与核细胞质运输的缺陷无关。相反，转录组分析表明，神经干细胞中Seh1的消融降低了p21的表达，p21的敲低部分恢复了自我更新能力。在机制上，Seh1与核外周的NuRD转录抑制复合物合作调节p21的表达。总之，这些发现确定了Nups通过发挥染色质相关作用和影响神经干细胞增殖来调节大脑发育。核孔蛋白(Nup)的失调已在许多神经发育性疾病中被发现。同时，Nups的消耗导致神经发生受损。Nup153对成体神经干细胞(NSCs)的维持是不可缺少的Nup133缺陷小鼠胚胎沿神经谱系分化效率低下然而，这些发现主要是基于纯合子胚胎发育或敲低方法的分析。在小鼠模型中组织特异性耗竭的证据仍然缺乏。常染色体隐性遗传先天性小头症的一种综合征形式最近被定位于染色体18p11.22-q12.3, Nup sel1位于该区域。前期的研究表明，Seh1在少突胶质细胞分化中起着重要作用。Seh1是否以及如何影响神经发育仍然是一个谜。最初，Nups被认为是核孔复合物(NPCs)的组成部分，它介导核和细胞质间的大分子运输然而，最近的研究表明，Nups与基因组相互作用以控制转录程序。越来越多的证据表明，Nups在细胞类型特异性基因调控中起着关键作用。Nup153与Sox2相互作用，调控成人NSCs的转录程序。之前的研究也发现，Seh1募集Olig2和Brd7组装转录激活复合物，促进少突胶质细胞分化Nups如何参与基因激活或基因沉默过程的分子细节似乎取决于Nups的结合伙伴。组蛋白修饰因子和染色质重塑因子参与了Nups介导的转录调控核小体重塑和去乙酰化(NuRD)复合体控制着基因的编程发育过程中的细胞状态，包括胚胎干细胞和祖细胞的分化。然而，在大脑发育过程中，NuRD复合物在细胞状态编程中的作用仍然知之甚少。模式图（Credit: Developmental Cell）该研究发现Seh1是通过与NuRD复合物合作来维持NSC增殖和正常神经发生所必需的。重要的是，Seh1的这个功能与NuRD组件的导入没有关联。相反，Seh1可以将NuRD募集到p21并维持p21处于抑制状态。总之，该研究确定了Seh1在NSC增殖中的转运独立作用，为Nups在大脑发育中的生理功能提供了见解。原文链接https://doi.org/10.1016/j.devcel.2024.01.002责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观Nat Med | 黄荷凤院士/张静澜/徐晨明团队发表综合性无创产前筛查临床研究成果热文Science最新发布：全世界最前沿的125个科学问题热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文新发现推翻古老假说：梅毒微生物家族与人类共存已有数千年热文Nat Methods | 自主生物发光成像技术在真核生物中的创新进展

肿瘤的突变负担和异质性已被认为是对许多靶向治疗产生耐药性的原因。胞嘧啶脱氨酶APOBEC蛋白与超过70%的人类癌症的突变特征有关。然而，癌细胞如何劫持APOBEC介导的突变机制以促进肿瘤异质性，从而促进治疗耐药性的机制尚不清楚。2023年7月20日，德克萨斯大学西南医学中心牟平团队在Cancer Cell 在线发表题为“Loss of SYNCRIP unleashes APOBEC-driven mutagenesis, tumor heterogeneity, and AR-targeted therapy resistance in prostate cancer”的研究论文，该研究发现SYNCRIP是一种内源性分子制动器，可以抑制前列腺癌(PCa)中APOBEC驱动的突变。在SYNCRIP缺失的PCa细胞中，过度激活的APOBEC3B是一个关键的突变子，代表了PCa中一些常见突变基因(包括FOXA1、EP300)驱动突变的分子来源。功能筛选确定了APOBEC3B突变的PCa中雄激素受体(AR)靶向治疗耐药的8个关键驱动因素：BRD7、CBX8、EP300、FOXA1、HDAC5、HSF4、STAT3和AR。这些结果揭示了APOBEC驱动的突变释放的细胞内在机制，该机制在赋予PCa AR靶向治疗耐药中起重要作用。针对驱动癌基因的治疗方法的发展已经彻底改变了许多癌症的临床管理；然而，它们的反应的幅度和持续时间仍然是可变的，并且不可避免地发生抵抗。大量证据表明，突变负担的增加和遗传异质性既是抗性的燃料，也是抗性的来源。因此，阐明这种增加的诱变和遗传异质性的分子起源和机制对于培养下一代抗癌疗法和克服耐药性至关重要。遗传异质性可能源于许多癌症的基因组不稳定性。新出现的数据表明，肿瘤细胞可以劫持稳态调节机制，从而加强突变，作为促进基因组不稳定的可能途径。这种机制的一个重要例子是脱氨酶APOBEC蛋白。在超过70%的人类癌症中观察到APOBEC驱动的突变模式增加。然而，癌细胞如何劫持APOBEC介导的突变机制以促进肿瘤异质性，从而促进治疗耐药性的机制在很大程度上仍然未知。机理模式图（图源自Cancer Cell ）该研究发现前列腺癌(PCa)中突触结合细胞质RNA相互作用蛋白(SYNCRIP)的频繁丢失是一个分子驱动事件，释放APOBEC驱动的突变。在SYNCRIP缺失的肿瘤中，过度激活的APOBEC3B是PCa(包括FOXA1、EP300和AR)中频繁驱动突变的关键突变子和分子来源。研究结果确定了8个由APOBEC3B失调引起的PCa雄激素受体(AR)靶向治疗耐药的关键驱动因素。与传统认识相反，单细胞转录组学分析显示，APOBEC3B诱导的FOXA1驱动突变胜过其他驱动突变，最终主导耐药肿瘤。总的来说，这些发现揭示了控制肿瘤突变负担和异质性的细胞内在机制，并将SYNCRIP和过度激活的APOBEC3B驱动的突变与经常观察到的赋予AR靶向治疗耐药性的驱动突变在机制上联系起来。文章来源“iNature”责编|文竞择校对|文竞择End 往期精选 围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎 热文 富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老 热文 世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝 热文‍为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者 热文 首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元 点击“阅读原文”，了解更多~