TUBB3

【导读】 对紫杉醇为基础的化疗产生耐药性是三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中的主要障碍。然而，克服紫杉醇耐药性仍是一个未解决的问题。 2月6日，中山大学研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了研究论文，题为“RNF31 induces paclitaxel resistance by sustaining ALYREF cytoplasmic–nuclear shuttling in human triple-negative breast cancer”，本研究旨在确定紫杉醇治疗是否会影响 Aly/REF 出口因子（ALYREF）的细胞质 - 细胞核穿梭，其机制以及泛素化 ALYREF 在紫杉醇耐药性中的作用。 数据表明，RNF31 介导的 ALYREF 泛素化可能是逆转三阴性乳腺癌对紫杉醇耐药性的有力靶点。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ctm2.70203 三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌亚型中最具侵袭性的，占所有乳腺癌病例的 15% 至 20%，也被称为“最毒乳腺癌”。鉴于雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2（HER2/ErbB2）均为阴性，以紫杉烷类药物（如紫杉醇和多西他赛）为基础的化疗仍是早期和转移性 TNBC 的主要治疗策略。不幸的是，尽管最初有反应，但肿瘤不可避免地会对紫杉烷治疗产生耐药性。在早期阶段，约 30% 的 TNBC 患者在五年内病情进展，五年无复发生存率约为 70%，总生存率约为 75%，这远低于 ERBB2+ 或 HR+ 乳腺癌。因此，在临床实践中确定对紫杉醇的耐药机制并尝试克服紫杉醇耐药性至关重要。 紫杉醇通过多种复杂机制发挥抗肿瘤作用。面对紫杉醇施加的各种细胞压力，癌细胞会启动细胞凋亡或使细胞压力转向生存，从而获得紫杉醇耐药性。新出现的证据表明，乳腺癌细胞会发展出多种机制来对抗紫杉醇诱导的压力，例如增加微管动力学、适应氧化应激增加以及上调抗凋亡蛋白。可是，迄今为止，尚未出现逆转紫杉醇耐药性的策略。有证据表明，mRNA 加工和输出参与了对癌症治疗策略的耐药性诱导。然而，mRNA 输出复合物对微管抑制剂耐药性的影响却很少被研究。因此，确定在三阴性乳腺癌（TNBC）中是否存在以及是哪些 mRNA 输出亚基与紫杉醇耐药性相关，这一点非常重要。 蛋白质翻译后修饰（PTM）是调节蛋白质亚细胞分布的关键机制之一，可能在调节应激诱导的运输中发挥作用。RNF31是线性泛素链组装复合物（LUBAC）的核心催化单元。先前的研究表明，RNF31 表达升高会加速肿瘤进展和治疗耐药。然而，RNF31 调节的细胞信号底物及其生物学功能尚不完全清楚。 RNF31 在体外促进了 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌对紫杉醇的耐药性 01 为了探究 RNF31 是否参与 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌（TNBC）对紫杉醇（PTX）的耐药性，研究人员首先通过qRT-PCR检测了紫杉醇处理后耐药细胞和亲代 MDA-MB-231 细胞中紫杉醇耐药相关因子的 mRNA 丰度。过表达 RNF31 可恢复亲代细胞中紫杉醇耐药相关因子的降低水平，特别是上调了微管蛋白 TUBB3、微管结合蛋白 STMN1 和 TAU 的表达水平。此外，在耐药细胞中，沉默 RNF31 降低了紫杉醇耐药相关因子的表达。由于 TUBB3、STMN1 和 TAU 这三种紫杉醇耐药相关因子在响应外源性 RNF31 表达时其表达变化最为显著，因此选择它们进行进一步研究。 RNF31 在体外促进了 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌对紫杉醇的耐药性 与亲代三阴性乳腺癌（TNBC）细胞相比，紫杉醇耐药的 TNBC 细胞中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的水平显著升高。同样，在对基于紫杉醇的化疗耐药的 TNBC 患者中也观察到了 TUBB3、STMN1 和 TAU 水平的上调。TNBC 患者中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的表达水平与核 ALYREF 水平显著相关。此外，通过核质分离和后续的 qRT-PCR 验证，用 siRNA 或噻唑菌素阻断 RNF31 或沉默 IPO13 均可降低 TUBB3、STMN1 和 TAU 的总 mRNA 水平和细胞质 mRNA 水平。研究人员接下来探究了 RNF31 和 IPO13 对 ALYREF 与 mRNA 结合的影响。抗 ALYREF 抗体介导的 RNA 免疫沉淀（RIP）-PCR 显示，在紫杉醇耐药的 MDA-MB-231 细胞中，阻断 RNF31 和沉默 IPO13 显著降低了 ALYREF 与 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的结合水平。相比之下，抑制 RNF31 和沉默 IPO13 促进了 Mtr4 外切体 RNA 解旋酶（MTREX，也称为 hMTR4）对 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的结合，MTREX 是细胞核内 mRNA 降解复合物的关键标志物。此外，在紫杉醇耐药的 MDA-MB-231 细胞中，抑制 RNF31 和沉默 IPO13 显著缩短了 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的半衰期。另外，在亲代细胞中，紫杉醇处理显著降低了 TUBB3、STMN1 和 TAU 的蛋白水平，而过表达 RNF31 恢复了亲代细胞中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的降低水平。同时，抑制 ALYREF 表达消除了外源性 RNF31 表达对亲代细胞在紫杉醇处理时的影响。上述结果表明 RNF31 维持了 ALYREF 的 mRNA 结合和输出功能；因此，研究人员进一步研究了 ALYREF 是否影响亲代细胞在紫杉醇处理时 RNF31 的表达。研究显示，在紫杉醇耐药细胞中，沉默 ALYREF 和 IPO13 降低了 RNF31 mRNA 和蛋白水平，表明 RNF31 和 ALYREF 在紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞中形成正反馈环路。 综上所述，上述结果表明 RNF31 通过上调与紫杉醇耐药相关的因子的表达，促进了 ALYREF 诱导的紫杉醇耐药性。 【参考资料】 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ctm2.70203 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）是现代药物开发中增长最快的肿瘤药物类别之一。通过结合细胞毒性化疗和靶向治疗的优势，ADCs在提供将高效细胞毒性药物传递给表达预定细胞表面靶标的癌细胞方面具有独特性。在肺癌领域，近年来治疗模式发生了巨大变化，现在ADCs已成为肺癌患者的潜在选择。自2020年以来，首个用于非小细胞肺癌（NSCLC）患者的ADC已获得FDA批准（曲妥珠单抗deruxtecan），另外两个ADC已获得FDA突破性疗法认定，目前正在评估中（帕妥珠单抗deruxtecan，替利珠单抗vedotin）。此外，几项早期阶段的试验正在评估各种新型ADCs，无论是作为单药治疗还是与晚期肺癌的联合治疗，预计更多选择性和效力更强的ADCs将很快成为临床上的治疗选择。在这篇综述中，我们讨论了ADCs的结构和作用机制，包括来自临床前工作的见解；我们总结了ADCs在肺癌方面的最新进展，描述了ADCs的毒性概况，并探讨了旨在增强ADC效力和克服抗性的战略。此外，我们讨论了在肺癌中感兴趣的新型ADC策略，包括非细胞毒性载荷，如免疫调节剂和抗凋亡剂。 1.引言 抗体药物偶联物（ADCs）可以说是肿瘤药物开发中增长最快的类别，尽管这不是一个新概念，但其改变临床实践的潜力是巨大的。在肺癌领域，近年来治疗模式发生了巨大变化，现在包括了靶向治疗、免疫治疗和系统性化疗，而ADCs现在也作为潜在选择加入了肺癌患者的治疗列表。 ADCs在提供将高效细胞毒性药物传递给表达预定细胞表面靶标的癌细胞方面的潜力是独特的，从而结合了细胞毒性化疗和靶向治疗的优势。因此，ADCs是精准肿瘤学的代表，利用这些靶向特性可以大大增强附着的有效载荷的治疗指数，这些化合物如果单独使用则毒性太大。ADCs由三个关键部分组成，是现代药物开发的“制导导弹”，包括（1）选择性结合肿瘤细胞表面的抗原的单克隆抗体，（2）细胞毒性药物载荷，以及（3）可切割或不可切割的连接子。 至今，已有十二种ADCs获得了FDA在肿瘤学领域的批准（表1），其中自2017年以来有九种获得了批准，这一类别的开发速度正在加快。 在这篇综述中，我们讨论了ADCs的结构和作用机制，包括来自临床前工作的见解；我们探讨了ADCs在肺癌中的活性，并总结了ADCs在临床中的最新进展（表2），描述了这些化合物当前的挑战和毒性概况；最后，我们探讨了潜在的联合策略以及其他旨在增强ADC效力和克服抗性的战略。 2.结构 ADCs在动物模型中的使用最早在20世纪60年代报道，但直到20世纪80年代才开始进行基于小鼠免疫球蛋白G（IgG）分子的ADCs的首次临床试验。经过五十多年的研究，最初的承诺终于实现——第二代ADCs brentuximab vedotin（由Seattle Genetics在2011年开发）和trastuzumab emtansine（也称为ado-trastuzumab emtansine或TDM1，由Roche在2013年开发）的批准为目前大量临床试验铺平了道路，这些试验正在研究临床上潜在的ADCs。许多最近的下一代ADCs对治疗难治性癌症有令人印象深刻的活性，尽管仍有限制，例如与治疗相关的毒性、不充分的生物标记物选择和获得性抗性，但对这个治疗方法有理由保持乐观。 作为一类药物，所有ADCs都由三个主要部分组成：一个结合肿瘤相关抗原的抗体、一个细胞毒性载荷和一个连接两者的连接子（图1）。这三个组成部分在不同的ADCs之间可能不同，可能导致对比鲜明的药理学和临床特性。 图1 典型的抗体药物偶联物的结构和组成部分，包括单克隆抗体、连接子和载荷。抗体：嵌合/人源化单克隆IgG抗体，针对肿瘤细胞表面优先表达的蛋白质。连接子：确保载荷在血浆中附着在抗体上，但在肿瘤细胞中有效释放。连接子可以是可切割的（通过肿瘤相关因子）或不可切割的（溶酶体降解）；载荷：增强细胞毒性，尽管不同的药物：抗体比例影响效力和清除率。ADCs的抗体组分与免疫效应细胞结合，引发抗肿瘤免疫，包括补体依赖性细胞毒性（CDC）、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）效应。MC 马来酰亚己基，MCC 马来酰亚甲基环己烷-1-羧酸盐；MoA 作用机制。 3.作用机制 ADCs的作用机制复杂，涉及抗体与目标抗原的结合、随后的内化、连接子分解和细胞内载荷释放，虽然这看起来是一个简单的过程，但实际情况更为复杂。与其他现代癌症治疗中的药物不同，ADCs需要癌细胞的作用才能发挥最大的效力。 ADCs是精准医学的代表——“生物制导导弹”，可以特异性地靶向肿瘤细胞并诱导细胞死亡，允许将药物传递到特定选择的肿瘤细胞，同时减少非靶标事件的好处。在ADCs中，单克隆抗体特异性地结合肿瘤细胞上表达的目标抗原；然后ADC被肿瘤细胞内化，最终与溶酶体融合，允许释放细胞毒性物质，最终通过靶向DNA或微管导致细胞死亡或凋亡（图2）。 图2 抗体药物偶联物的作用机制。ADCs选择性地将有毒载荷输送到肿瘤细胞，导致细胞死亡。ADCs的“旁观者效应”改变肿瘤微环境，以增强细胞杀伤。 一些载荷产生旁观者效应，其中自由药物在内化和降解ADC后无意中从目标肿瘤细胞穿过细胞膜释放，杀死相邻的肿瘤细胞，包括那些可能不在细胞表面表达目标抗原的细胞。ADCs的这一特性经常受到讨论，一些药理学特性，如亲脂性载荷或可切割的连接子，在这一现象中似乎起着重要作用。 当释放的细胞毒性载荷可渗透或跨膜时，它也可以诱导“旁观者效应”，这可以提高ADC的效力。此外，ADCs的旁观者效应还可能改变肿瘤微环境，反过来可能进一步提高ADCs的杀伤效果。而且，关于旁观者效应，一些载荷的化学特性，例如亲脂性、疏水性和未带电的载荷，对ADCs的膜渗透性很重要，允许从ADC靶向的肿瘤细胞分布到非靶向的肿瘤细胞。 如上所述，连接子类型，如与赖氨酸残基的结合，也可能导致减弱的旁观者效应，因为带电残基可以促进药物在靶向肿瘤细胞内的停留。在ADC设计中需要考虑的重要因素包括目标细胞选择、抗原的性质、抗体的结构和稳定性、连接子化学以及细胞毒性载荷。 3.1.抗体和抗原 抗原的选择和适当抗体的选择是ADC设计的重要组成部分。首先，根据分子靶标选择抗体。最好是抗体识别肿瘤部位过度表达的目标，以避免不恰当地将载荷传递到非靶标部位，因为ADCs旨在将它们的有毒载荷传递到表达目标抗原的任何细胞。例如，(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)(ERBB2或HER2)在肿瘤组织中的表达量是非癌症组织的100倍以上。TROP2和nectin 4是进一步的临床例子，这些蛋白质虽然在非癌症组织中有一定程度的表达，但被肿瘤细胞过度表达的程度显著增加。其次，抗体所针对的抗原应在癌细胞上存在高拷贝数（>10^5/细胞）。人IgGs包括四个亚类——IgG1、IgG2、IgG3和IgG4——它们在恒定区和铰链区有所不同；此外，亚类之间的微妙变化影响抗体的溶解度和半衰期，以及它们对免疫效应细胞上表达的不同Fcγ受体的亲和力。大多数现代ADCs基于IgG1架构开发，因为与其他亚类相比，IgG1在溶解度、血清半衰期和Fcγ受体结合亲和力方面最佳结合。 其他生物过程也影响ADC活性，包括目标转换率、内化、溶酶体处理和降解。例如，较高的目标转换率可以导致更有效的药物传递和目标补充，从而增加抗肿瘤活性。此外，仅在癌细胞表面存在的致癌靶标，不太可能通过降低表达作为药物抗性的机制，因此可以被利用为额外的ADC活性。肿瘤异质性是另一个考虑因素：在HER2阳性乳腺癌中，与均匀HER2表达的患者相比，具有高水平肿瘤内或肿瘤间异质性的患者对ado-trastuzumab emtansine（TDM1，曲妥珠单抗-DM1）的反应较差。 3.2.连接子 连接子将抗体与载荷连接起来，是与ADC的稳定性和载荷释放特性相关的关键因素。根据它们的切割机制，连接子被分类为可切割和不可切割，对ADC的最终治疗指数至关重要。可切割连接子被设计为响应与肿瘤相关的因素而分解并释放ADC的细胞毒性载荷；因此，利用肿瘤细胞和系统循环之间的差异，以一种有指导、精确的方式释放载荷。可切割连接子分为两类，化学（包括二硫键和腙键）和酶连接子（肽键和葡萄糖苷酸键）。腙是一种pH敏感的连接子，允许ADC在系统循环中保持稳定，并在特定的pH下被水解（例如，pH 4.8在溶酶体中诱导载荷释放）。因此，可切割连接子的降解可以根据许多特定特征而变化，无论是在目标细胞外部还是内部，如外部pH（酸敏感连接子）、特定的溶酶体蛋白酶（蛋白酶可切割连接子）或谷胱甘肽还原（二硫键连接子）。 最近的可切割连接子（例如，enfortumab vedotin、sacituzumab govitecan、trastuzumab deruxtecan (T-DXd)）在系统循环中是稳定的，与不可切割连接子形成对比，例如ado-trastuzumab emtansine (TDM1)。不可切割连接子同时由稳定键组成，这些键对血液中的蛋白水解更具有抵抗力；ADCs被溶酶体或蛋白酶内化并随后抗体降解后，发生切割，然后导致载荷的释放。例如，TDM1是一种使用不可切割连接子（基于硫醚）的ADC，由抗HER2单克隆抗体通过基于硫醚的连接子与DM1（mertansine）连接。TDM1中的不可切割连接子允许ADC在系统循环中保持稳定，然后在抗体降解后释放活性药物，DM1的代谢物，赖氨酸-MCC-DM1。在不可切割连接子中，例如与赖氨酸残基的结合，一些带电残基可以促进药物在靶向肿瘤细胞内的停留，从而减弱旁观者效应。 3.3.载荷 载荷是ADC被内化时对肿瘤细胞施加强大细胞毒性的部分。要用作载荷，需要具有高效力，IC50在纳摩尔和皮摩尔范围内；此外，它们应在生理条件下稳定，并且具有可用于与抗体偶联的功能团。现代ADC载荷大致可分为四类——auristatins（抗微管蛋白）、maytansinoids（抗微管蛋白）、calicheamicins（DNA切割）和camptothecins（拓扑异构酶1抑制）（图1）。通常，这些载荷作用于DNA结构，并通过凋亡机制（拓扑异构酶1抑制剂、calicheamicins）诱导细胞死亡，或影响细胞的微管结构（auristatins和maytansinoids），通过抑制微管聚合诱导G2/M期阻滞和凋亡。无论类别如何，这些药物通常是具有纳摩尔和皮摩尔范围内IC50的强效细胞毒性化合物，如果系统给药将导致严重的毒性。目前正在临床试验中测试的ADCs中，几乎三分之二的细胞毒性载荷基于auristatins或maytansinoids。例如，单甲基auristatin E (MMAE)是一种微管蛋白不稳定剂，已被纳入几种ADCs，如brentuximab vedotin和telisotuzumab vedotin。Maytansinoids，如DM1，与微管蛋白结合并破坏微管稳定性。 非细胞毒性载荷现在正在出现，正在研究的免疫调节载荷就是一个例子。被称为免疫刺激抗体偶联物（ISACs），这些药物旨在促进肿瘤退缩并诱导肿瘤抗免疫。ISACs包括非细胞毒性载荷，激活髓系抗原呈递细胞，以不同于检查点阻断的机制刺激免疫系统。SBT6050就是这样一个例子，它针对HER2并带有toll样受体（TLR）8激动剂载荷。TLRs是先天免疫中的重要受体系统，在肿瘤和先天免疫之间的相互作用中发挥重要作用。TLR7和/或TLR8的激活可以引起一系列信号通路的诱导，这反过来可以激活例如NF-κB，导致细胞因子和趋化因子的分泌，并激活淋巴细胞。BD-C1001是一种新型HER2靶向TLR7/8 ISAC，目前正在早期临床试验中进行研究（NCT04278144），无论是作为单药治疗还是与免疫检查点抑制剂联合用于治疗晚期HER2驱动的癌症。实际上，目前有许多正在进行的临床试验使用免疫检查点抑制剂与ADCs联合，以增加这些药物的效力，并可能增强免疫治疗活动。例如，ImmunoTAC平台由Silverback Therapeutics开发；这包括一些ISACs，使用TLR8激动剂作为载荷（例如，SBT6050、SBT6290和SBT8230）。干扰素基因刺激剂（STING）激动剂是另一种新型载荷，XMT-2056来自Mersana和CRD5500来自Takeda是正在临床开发的突出STING激动剂ADC项目。 3.4.药物-抗体比率 药物-抗体比率（DAR）是每个单克隆抗体上连接的有效载荷的平均数量。这一特性在ADCs之间变化，并通知了ADC的药理学和活性。现在正在进行的努力集中在可能通过利用分子的结构来增强ADC活性的活动上；增加DAR就是这样一个例子，增加旁观者效应是正在探索的另一种策略。Camptothecins，如sacituzumab govitecan，就是增加DAR被利用为成功策略的一个例子。Sacituzumab govitecan是一种ADC，将抗Trop2抗体与SN-38偶联，这是irinotecan的活性代谢物，活性几乎是irinotecan的1000倍，因此，由于其毒性和溶解度差，不能作为未结合药物给药。Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki是另一个在诊所中有前景的高活性ADC的例子，具有高DAR 8，这可能是推动其活性的原因。 4.肺癌中已建立的ADC靶点 4.1.HER2 人表皮生长因子受体2（HER2）是一种跨膜蛋白，由erb-b2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）基因编码，属于ErbB或表皮生长因子受体（EGFR）家族。HER2在乳腺癌和胃癌中已是成熟靶点，其过度表达也与多种癌症相关，如肺癌、卵巢癌、结直肠癌和唾液腺肿瘤。HER受体既作为单体存在，也作为二聚体存在，无论是同源或异源二聚体，配体结合到HER1、HER3或HER4会迅速诱导受体二聚化。尽管HER2没有已知的配体，但它是与其他HER成员形成异源二聚体的首选伙伴，这导致激活HER信号通路。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，记录的HER2变异包括HER2基因扩增、HER2突变和HER2蛋白过度表达。HER2蛋白过度表达的频率在文献中差异很大，尽管据报道在高达20%的NSCLC患者中观察到，并且与较差的生存结果相关。可靶向的HER2突变发生在约2%的晚期NSCLC病例中。 曲妥珠单抗依美坦辛（TDM1） TDM1是一种ADC，由抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗通过不可切割的硫醚连接子（马来酰亚甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC））连接到细胞毒性载荷DM1（依美坦辛）。自2013年以来，TDM1已作为单一药物获批用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌，并随后在肿瘤中进行了研究。在晚期NSCLC中，TDM1在II期篮式试验中使用，导致具有激活HER2突变的患者总体反应率（ORR）为44%，中位无进展生存期（PFS）为5个月；39%的患者实现了疾病稳定。此外，治疗耐受性良好，不良事件主要是1或2级。尽管如此，TDM1尚未在这种情况下获得FDA批准，尽管它被纳入NCCN指南作为晚期预处理NSCLC具有激活HER突变的推荐（证据类别2A）。 Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu，T-DXd） Fam-trastuzumab deruxtecan（T-DXd）是一种ADC，包含人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗，通过可切割的肽连接子（DAR为8）连接到拓扑异构酶抑制剂deruxtecan（DXd）。可切割连接子、膜通透性细胞毒性载荷与高DAR的结合，增加了对邻近细胞的活性，是ADC结构的关键特征，并允许T-DXd在具有异质性HER2表达的癌症中使用，因此，肺癌是这种化合物的主要候选。这一观察在预临床模型中得到证实，T-DXd在对TDM1不敏感的PDX模型中证明是有效的。 T-DXd在晚期HER2表达或HER2突变实体瘤患者中的I期剂量递增和剂量扩展研究包括18名NSCLC患者，包括具有激活HER2突变或HER2表达的肿瘤（定义为IHC ≥ 1+或通过原位杂交或下一代测序扩增）50。其中10名患者实现了部分缓解（ORR 55.6%），中位PFS为11.3个月，中位反应持续时间（DOR）为10.7个月50。在HER2突变NSCLC患者中，ORR为72.7%（n = 8），其中6名患者有第20外显子插入；mPFS为11.3个月，mDoR为9.9个月。在这些令人印象深刻的数据之后，HER2过度表达或HER2激活突变的晚期NSCLC患者被纳入了单臂国际II期DESTINY-Lung01试验。 对HER2过度表达队列的中期分析（中心确认过度表达HER2，IHC 2+或3+）显示，在49名经过大量预处理的HER2过度表达NSCLC患者中，初步证据显示抗肿瘤活性。包括有稳定脑转移的患者，34.7%在入组时有CNS转移；79.6%的患者有HER2 IHC 2+，20.4%有HER2 IHC 3+。独立审查委员会（ICR）确认的总体反应率（ORR）为24.5%（95% CI，13.3%–38.9%），包括1例完全反应（CR）。反应率根据HER2表达的不同而变化：IHC过度表达3+的患者ORR为20.0%（95% CI，2.5%–55.6%），IHC 2+为25.6%（95% CI，13.0%–42.1%）；IHC 3+，中位DOR为6.0个月（95% CI，3.2-NE个月）。疾病控制率（DCR）为69.4%（95% CI，54.6%–81.8%）；估计的中位PFS为5.4个月（95% CI，2.8–7.0个月）。在DESTINY-Lung01（NCT03505710）试验的HER2突变NSCLC队列中产生了更令人印象深刻的反应51。55%的患者发生确认的客观反应（95% CI，44–65），有1例CR，34名患者（37%）疾病稳定（SD）≥ 6周，DCR 92%。观察到的反应多样化，在具有不同HER2突变亚型和跨外显子位置的患者中均有显示；此外，在没有可检测HER2表达和没有HER2扩增的患者中也观察到反应。中位PFS为8.2个月（95% CI = 6.0–11.9个月），中位OS为17.8个月（95% CI = 13.8–22.1个月）51。 安全性概况通常可控，包括ILD，尽管确实发生了两例与治疗相关的死亡，均为ILD相关。大于3级的毒性发生在46%的患者中；这些中记录最多的包括中性粒细胞减少、贫血、恶心和疲劳（分别为19%、10%、9%和7%）。观察到的毒性通常与之前报告的临床试验一致，药物相关不良事件导致25%的患者中断研究药物，包括肺炎13%和ILD 5%，药物相关ILD发生在26%的患者中51。 2022年8月11日，食品药品监督管理局授予T-DXd加速批准，用于治疗携带激活性HER2（ERBB2）突变的NSCLC患者，这些患者已通过FDA批准的测试检测到突变，并且已接受过先前的系统治疗，这代表了首个获批用于HER2突变NSCLC的药物。 4.2.HER3 HER3是ErbB/HER蛋白激酶家族的成员，虽然HER3本身不是致癌蛋白且缺乏酪氨酸激酶活性，但HER3与其他RTKs异源二聚体化，通过PI3K/AKT/mTOR途径激活肿瘤信号，还有MEK/MAPK、Jak/Stat、Src激酶信号，导致细胞增殖并最终促进癌细胞存活、增殖和进展。HER3表达还可以介导对靶向治疗的抵抗（例如，通过维持HER3介导的PI3K/AKT信号激活，对肺癌中EGFR靶向治疗的抵抗）。受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3（HER3）在多种实体瘤中表达，并已在83%的原发性NSCLC肿瘤中报告。HER3表达还与转移性疾病进展和患者无复发生存期减少相关，因此，HER3是NSCLC中的一个有吸引力的治疗靶点，特别是由于其在介导对靶向治疗抵抗方面的潜在功能作用。 Patritumab deruxtecan Patritumab deruxtecan (U3-1402, HER3-DXd) 是一种新型的针对HER3的ADC，由针对HER3的人IgG1单克隆抗体 patritumab 与拓扑异构酶 I 抑制剂载荷 (MAAA-1181a, 一种exatecan衍生物) 通过稳定的四肽基可切割连接子共价连接，具有高DAR比率45,59。载荷非常强大，系统半衰期短，细胞膜通透，这允许旁观者杀伤效应，影响目标和周围肿瘤细胞60。基于在多种实体瘤异种移植模型中展示HER3-DXd抗肿瘤活性的有希望的临床前数据61，一项I期研究在局部晚期或转移性EGFR驱动的NSCLC患者中启动，这些患者之前接受了EGFR TKI和基于铂类的化疗 (NCT03260491)，最终在2021年12月获得了FDA突破性疗法认定 (BTD)。 在研究报告的剂量递增部分，在接受HER3-DXd 5.6 mg/kg IV Q3W的57名患者中，确认的ORR为39% (95% CI, 26.0–52.4)，中位PFS为8.2 (4.4–8.3)个月，mDOR为6.9个月62。在已知和未知EGFR TKI耐药机制的患者中观察到反应，并且在一系列HER3表达范围内观察到反应，以至于HER3表达水平没有明显区分应答者与非应答者62。接受过奥希替尼和基于铂类的化疗的患者显示出与整体人群相似的疗效，脑转移患者也是如此62。最常见的≥3级TEAE是血液学毒性，包括血小板减少 (28%) 和中性粒细胞减少 (19%)。只有4名患者 (5%) 经历了与治疗相关的ILD，没有一例是4级或56。 最近报告的剂量扩展安全性和活性数据证实，HER3-DXd 5.6 mg/kg为接受大量预处理的晚期EGFR驱动的NSCLC患者提供了有希望的初步抗肿瘤活性和安全性证据63。大多数患者 (n = 49, 86%) 之前接受过奥希替尼治疗，包括有稳定CNS转移的患者 (n = 27, 47%)。ORR为25% (14/56; 14.4–38.4)，包括1例CR (1/56, 2%)，在13/56 (23%)中PR，25/56 (45%)中SD63。有趣的是，跨各种EGFR TKI耐药机制观察到疗效，包括EGFR C797S突变、MET扩增、HER2突变、BRAF融合和PIK3CA突变。达到了70%的DCR (39/56, 范围 55.9–81.2)，DoR为7个月 (3.0–7.0)。 总体而言，HER3-DXd的安全性概况是可控的，最常见的≥3级治疗中出现的不良事件是血液学的。治疗相关的ILD (5%) 发生频率与之前EGFR-TKIs在NSCLC患者中的报告发病率相似 (ILD率，0-5.7%)64。没有死亡。正在进行的II期HERTHENA-Lung01研究目前正在评估至少接受过一种EGFR TKI和一种基于铂的化疗的转移性NSCLC患者中的HER3-DXd。 4.3.Trop2 滋养层细胞表面抗原 (Trop2) 是一种跨膜糖蛋白钙信号转导体，介导细胞迁移和无锚定生长，并且在许多上皮肿瘤中表达65。它与几种实体瘤的总体和无病生存不良相关66,67。在肺癌中，Trop2过度表达在多达64%的腺癌和多达75%的鳞状细胞癌NSCLC中观察到，与生存率降低相关69；还提出了其在对化疗和CD8+ T细胞凋亡的抵抗中的潜在作用70。 Datopotamab-deruxtecan (Dato-DXd) Dato-DXd是一种ADC，由针对TROP2的单克隆抗体组成，通过稳定的四肽基可切割连接子 (DAR 4) 连接到一种强效的拓扑异构酶 I 抑制剂。Dato-DXd在I期TROPION-PanTumor01试验 (NCT03401385) 中展示了令人鼓舞的抗肿瘤活性，这是一项正在进行的多中心、开放标签、剂量扩展研究，评估不同剂量水平的Dato-DXd在实体瘤中的安全性和耐受性71。试验的剂量递增部分评估了逐渐增加剂量的Dato-DXd的安全性和耐受性，而试验的剂量扩展部分正在评估在NSCLC患者和转移性三阴性乳腺癌患者中使用选定剂量水平 (4 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg) 的Dato-DXd的安全性和耐受性。患者不是基于TROP2表达被选择的。 在世界肺癌大会上报告了159名NSCLC患者接受不同剂量Dato-DXd (4 mg/kg、6 mg/kg或8 mg/kg) 的更新中期结果72；大多数患者之前接受过免疫治疗和基于铂的化疗，分别为84%和94%。ORR范围为21至25%，(4 mg/kg时23% (n = 9)，6 mg/kg时21% (n = 8)，8 mg/kg时25% (n = 20))。有一例确认的CR (6.0 mg/kg)，32例PR由BICR评估 (4.0 mg/kg时29名患者中有8例PR，6.0 mg/kg时20名患者中有4例PR，8.0 mg/kg时76名患者中有20例PR)；29例CR或PR被确认。疗效结果支持持久的临床反应，观察到的DCR为67至80%，中位PFS为4.3至8.2个月，尽管需要更长时间的随访72。4/kg和6 mg/kg剂量更易耐受，最常见的3级不良事件包括贫血、口腔炎、粘膜炎症和疲劳。不出所料，在更高剂量8 mg/kg治疗的患者中，不良事件的频率更高：报告了14例 (8%) 的ILD，大多数ILD病例 (12/14) 出现在8 mg/kg队列中；其中3例为致命的5级事件72。6 mg/kg剂量被确定为注册TROPION-Lung01 III期试验的推荐剂量水平。 在2021年ESMO大会上报告了TROPION-PanTumor01中包括的可操作基因组改变的NSCLC患者的令人鼓舞的结果，包括34名 (中位年龄，62岁；56%为女性) 晚期/转移性NSCLC患者73；研究者报告的可操作基因组改变包括ALK (n = 3)、EGFR (n = 29) 和ROS 1和RET (均为n = 1)。跨剂量的确认ORR为35% (95% CI, 19.7–53.5)，中位DOR为9.5个月 (95% CI, 3.3–NE)。 Sacituzumab govitecan (SG) Sacituzumab govitecan (SG, IMMU-132, Trodelvy®) 是一种首创的抗Trop2 ADC，由针对Trop2的人源化单克隆抗体sacituzumab与拓扑异构酶 I 抑制剂SN-38通过可水解的可切割连接子高DAR比率 (7.6) 连接。2020年4月，SG获得了FDA加速批准，作为至少两种先前转移性疾病治疗后的三阴性乳腺癌 (TNBC) 治疗，基于I/II期IMMU-132-01篮式试验的结果，在治疗难治性转移性上皮性癌症中74，最近在尿路上皮癌中获得了FDA加速批准。 在I/II期IMMU-132-01篮式试验中，无论Trop2表达如何，患者都被纳入，并在3周周期的第1天和第8天接受8至18 mg/kg剂量的治疗。包括NSCLC和SCLC：在NSCLC队列中，54名患者接受了8、10或12 mg/kg治疗；ORR为16.7% (7.9–29.3)，有9个PR (16.7%)，22个SD (40.7%)。mDOR 6.0个月 (2.5–21.0)，mPFS为4.4个月，mOS为7.3个月74。10 mg/kg剂量被选为进一步的剂量扩展研究。 在NSCLC队列中，59.6%的患者经历了3级或更高级别的治疗相关不良事件（TRAEs），包括中性粒细胞减少症（42.4%）、贫血（10.3%）、腹泻（7.9%）、疲劳（6.3%）和发热性中性粒细胞减少症（5.2%）。在SCLC队列中，已在大量预处理的mSCLC患者中确认了安全有效的治疗概况，包括对一线化疗敏感或耐药的患者。该队列中的ORR为17.7%，中位PFS为3.7个月，中位DOR为5.7个月，中位OS为7.1个月。3级及以上TEAEs与其他肿瘤类型相当，包括中性粒细胞减少症（34%）、疲劳（13%）、腹泻（9%）、低氧血症（4%）和发热性中性粒细胞减少症（2%）。 4.4.MET Telisotuzumab vedotin。MET信号通过受体过度表达而在NSCLC的发生中发挥作用，同样也在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和前列腺癌中发挥作用。Telisotuzumab vedotin (Teliso-V)由针对c-Met的人源化单抗ABT-700通过缬氨酸-瓜氨酸连接子与MMAE连接而成，I期研究证实该化合物在c-Met阳性NSCLC中耐受性良好，并展示了抗肿瘤活性。 2022年1月，基于LUMINOSITY试验（NCT03539536）的数据，FDA授予Telisotuzumab vedotin (Teliso-V)突破性疗法认定，这是一项正在进行的II期研究，针对不同c-Met表达水平的NSCLC患者，作为二线或三线治疗。在EGFR野生型非鳞状NSCLC患者中，c-Met高表达组的ORR为53.8%，c-Met中等表达组为25.0%。Teliso-V目前正在与奥希替尼（I期，NCT02099058）联合治疗c-MET过度表达的NSCLC患者的临床试验中进行评估；它也在III期随机研究TeliMET NSCLC-01 (NCT04928846)中作为单药治疗进行研究，针对先前治疗过的c-MET过度表达的NSCLC患者。 4.5.肺癌开发中的ADC靶点 目前正在进行几项早期临床试验，积极评估在晚期肺癌中使用新型ADCs的感兴趣致癌靶点。值得注意的是，目前在早期NSCLC中没有注册的ADC试验，尽管这可能只是暂时的。正在进行的对晚期NSCLC的兴趣包括NECTIN4、组织因子（TF）、CEACAM5、间皮素和LIV1。这些靶点及其相关ADCs在临床试验中的情况总结在表3中。Enfortumab vedotin是一种针对Nectin 4 (PVRL4)的ADC，Nectin 4是一种与免疫球蛋白样粘附分子有关的1型跨膜蛋白家族成员，在先前治疗的晚期尿路上皮癌中已显示出临床效益。这导致FDA批准enfortumab vedotin-ejfv用于这种情况，目前正在NSCLC中进行调查（表3）。Tisotumab vedotin-tftv是一种针对组织因子（TF）的抗体和微管抑制剂偶联物，是另一种最近获得FDA加速批准的ADC：这是基于II期innovaTV 204试验，在先前治疗过的复发或转移性宫颈癌患者中。鉴于组织因子表达在晚期NSCLC中已被证明更高，TF是另一个引起兴趣的目标，目前正在NSCLC中进行调查（表3）。 4.6.毒性 ADCs的开发目的是通过其设计限制毒性，然而，在临床上管理与ADCs相关的毒性仍然是一个持续的挑战。虽然现代新型ADCs的安全性概况更为有利，但ADCs仍可能导致一些使人丧失能力甚至可能致命的毒性。ADC剂量限制毒性可能范围广泛，已被证明包括肝脏、神经系统和眼科不良事件，这些主要由ADC载荷在循环中的过早释放引起的非靶标效应，以及ADC结合到靶抗原的非癌症表达细胞所致。例如，曲妥珠单抗deruxtecan已在各种肿瘤类型中导致5级ILD，auristatin类ADCs已与高级别神经和眼科毒性相关联。 总的来说，毒性可以由“靶标/非肿瘤”或“非靶标/非肿瘤”引起；此外，这些毒性可能与载荷本身的AEs有关，也可能无关（尽管“非靶标，非肿瘤”AEs似乎主导了大多数现有ADCs的毒性概况）。因此，靶抗原的表达模式不可避免地影响载荷的分布以及随后的积累位置。然而，荟萃分析实际上表明，MMAE与贫血、中性粒细胞减少和周围神经病变相关，与靶抗原无关；同样，DM1与血小板减少和肝毒性相关，MMAF和DM4与眼科毒性相关，所有这些都与靶抗原无关。毒性并不总是可预测的——例如，尽管具有相同的载荷、连接子和类似的DARs，brentuximab vedotin和enfortumab vedotin具有不同的毒性概况。曲妥珠单抗deruxtecan和曲妥珠单抗duocarmycin都是针对HER2的ADCs，使用不同的载荷，然而，两者都通过未知机制引起肺部毒性；这种毒性在使用T-DM1的患者中也观察到，尽管程度较小。 Destiny-lung01报告了26%的ILD/肺炎，使用6.4 kg/mg每周3次给药，然而，对九项T-DXd单药治疗研究的汇总分析评估了1150名大量预处理患者的ILD/肺炎风险，T-DXd在1000多名乳腺癌和肺癌患者中表现出15.4%的ILD率，其中2.2%为5级ILD。在最近DESTINY-LUNG02试验中，调查了5.6 kg/mg剂量，试验资格要求没有当前或历史上的ILD，没有肺切除术，也没有疑似ILD。因此，使用T-Dxd需要对有ILD或疑似ILD的肺癌患者谨慎。 在肺癌患者中，与间质性肺疾病 (ILD) 相关的死亡在ADC临床试验中报告的发生率不同，并且可以想象这个数字在现实世界中可能更高。迫切需要对医生进行适当的培训，以识别和管理这种有毒和潜在致命的效应。通常，在有症状的ILD中，应停用ADC；在无症状的情况下，可以在完全缓解后考虑重新引入ADC，并且皮质类固醇仍然是ILD治疗的基石。类固醇剂量取决于事件的严重程度，早期诊断和治疗是关键，同样需要我们的肺科医生同事的参与。早期和准确的诊断ILD在临床上是一个重大挑战，尽管技术的最新发展已导致呼吸分析被用作ILD诊断的有前途的工具。一项研究表明，使用呼吸分析的eNose技术，可以准确地从健康对照组中识别出ILD患者，此外，还可以区分不同的ILD亚组，表明可能成为未来ILD的生物标志物，可以在疾病的早期阶段识别ILD。由于ILD等肺部毒性的频率，在使用ADCs治疗晚期转移性肺癌患者时需要谨慎，并需要高度警惕这些和其他罕见但潜在致命的事件。因此，在考虑使用ADCs治疗患者时，应始终考虑ADCs的毒性概况。 7.未来的挑战和考虑 随着ADCs在临床实践中的应用，了解抗性机制对未来药物开发可能至关重要，但由于ADCs在肺癌领域的相对不成熟，关于抗性机制的临床数据很少。然而，临床前数据可以提供一些潜在的见解。例如，在临床前乳腺癌模型中，经过TDM1长期暴露后，细胞表面HER2表达减少，导致TDM1结合减少。蛋白质组学分析还发现，在这些对TDM1耐药的细胞系中，药物外排泵上调，而在TDM1耐药细胞中也发现了内吞作用的转化机制以及ADCs运输到溶酶体的失调。此外，在临床前NSCLC模型中，SLC46A3表达的丧失是获得性抗DM1（依美坦辛载荷）的机制，而在NSCLC中，TUBB3和FOXO3α的高表达与对基于紫杉醇的ADC载荷的抗性相关。 另一个积极研究的领域是患者选择。TROP2 ADCs的成功证实了ADCs不仅适用于由致癌基因驱动的肺癌，而且抗原表达并不一定是ADC成功所需的关键特征。细胞表面抗原表达水平是一个连续变量，这引发了是否应该根据特定水平的抗原存在来预先筛选和排除患者接受治疗的问题。选择参加评估ADCs的临床试验的患者仍然不确定，一些正在进行的试验采用了预先筛选阶段，以招募仅表达特定靶标患者，而其他试验则将纳入标准限制在具有特定高水平靶标表达的肿瘤类型。例如，T-DXd等ADCs已在靶标表达减少的患者中诱导反应，显然迫切需要开发验证的检测方法和临界值来定义抗原阳性，以及预测反应的生物标志物。 展望未来，合理的联合策略可能对增强ADC活性和克服潜在抗性机制很重要。ADCs与其他抗癌疗法的联合试验已经在进行中，从抗血管生成剂，旨在改变肿瘤血管并改善向肿瘤组织的药物传递，到免疫疗法，这可能增加ADCs诱导的抗肿瘤免疫，通过增强细胞介导的肿瘤识别和免疫效应功能，ADCs的细胞毒性作用或通过增强抗体依赖性细胞毒性。将这些药物与ADCs联合使用可能会增加肿瘤细胞表面靶标抗原的表达，并促进抗体-抗原结合，这可能会改善抗原的周转或降解。 为了扩大ADCs的治疗窗口，正在开发位点特异性ADCs、双特异性ADCs或前药型ADCs。技术的快速发展正在推动这些努力：例如，pClick技术正在开发中，允许位点特异性结合。pClick技术可能为ADC开发中的位点特异性结合提供了一种新的、更便捷、更有效的选择。双特异性抗体技术允许引人注目的ADC设计，这可能会改善ADC的内吞作用并提高肿瘤特异性。例如，针对同一肿瘤抗原的不同位点的双特异性ADCs，可能导致受体聚集改善和更快的目标内吞作用。 双载荷ADCs是克服潜在抗性机制的另一种方法。这些ADCs巧妙地使用两种不同的载荷，具有不同的机制，并合理地通过将这两种协同载荷以控制的方式传递到癌细胞中，可能提供更强的细胞毒性反应。一个例子是含有MMAE和MMAF的抗HER2 ADC，在临床前动物模型中显示出有希望的疗效。 细胞毒性药物的替代品也在开发中。免疫毒素和Bcl-2抑制剂是载荷的例子，它们不是细胞毒性的，而是诱导凋亡。例如，ABBV-155靶向B7-H3，载荷为clezutoclax，通过抑制Bcl-XL诱导凋亡。ABBV-155目前正在进行I期试验，作为单一药物和与多西他赛或紫杉醇联合使用的策略，计划为小细胞肺癌和NSCLC进行扩展队列（NCT03595059）。LMB-100是另一种实验性ADCs，包含促凋亡载荷，假单胞菌外毒素A，通过抑制延伸因子-2诱导凋亡。免疫调节载荷是另一个有趣的概念：这些非细胞毒性载荷通过激活髓系抗原呈递细胞和使用与检查点阻断不同的机制刺激免疫系统。例如，SBT6050是一种靶向HER2的ADC，载荷为toll样受体8（TLR8）激动剂。在ADCs的构建中，包括替代单克隆抗体的新技术（例如，Nanobodies，蛋白质框架（设计的ankyrin-repeat蛋白质（DARPins）等）也很有趣。 8.结论 经过数十年的研究、可观的技术进步和对作用机制的改进理解，ADCs开始实现最初的承诺。在肺癌中，有两个ADC已获得FDA突破性疗法认定并正在评估中（patritumab deruxtecan，telisotuzumab vedotin），一个ADC已获得加速批准（Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki (T-DXd)）。在各种肿瘤类型中，有数百种ADC处于临床前和临床开发中，该领域没有任何放缓的迹象。在晚期肺癌中，ADCs对于治疗选择有限的患者具有变革性潜力。正在进行的临床试验继续评估新的ADCs，无论是作为单一疗法还是作为肺癌的联合策略。因此，ADCs在临床上的持续成功可能是不可避免的，肺癌治疗的新范式变革即将到来。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：液体活检是一种通过血液、唾液和尿液等生物液体进行微创检测的革命性策略，用于癌症的诊断和预后预测。外泌体是细胞外囊泡（EVs）的一个子集，它们在供体细胞和受体细胞之间穿梭分子货物，并在调节细胞间通讯中发挥着关键作用。越来越多的研究表明，外泌体有很大的潜力作为液体活检中的新型生物标志物，因为大量的外泌体富集在体液中，并参与了许多生理和病理过程。然而，外泌体在临床应用中的进一步发展受到高质量分离和组分分析方法缺乏的极大限制。本综述旨在提供关于外泌体分离、表征和内容检测的传统和新型技术的全面概述。此外，总结了外泌体作为液体活检中潜在生物标志物在癌症诊断、治疗监测和预后预测中的作用。最后，评估了将基于外泌体的液体活检应用于精准医学的前景和挑战。 1.引言 癌症是全球主要的死亡原因之一。越来越多的证据表明，癌症的发展是一个动态过程，涉及多种组分，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。到目前为止，组织活检被认为是癌症诊断的最常用方法。然而，提取的少量组织无法代表肿瘤的异质性或监测动态的肿瘤进展，并且这种侵入性方法可能会增加转移的潜力，最终导致生存和预后不良。由于微创性，液体活检通过收集血液和尿液等生物液体的样本，已经引起了广泛关注，并为癌症诊断和实时监测创造了更多机会。外泌体，直径为40-160纳米，是由大多数细胞积极释放并在体液中稳定循环的脂质双层膜囊泡。最初被低估为细胞废弃物的运输工具，外泌体现在被认识到是细胞间通讯的重要参与者。积累的证据表明，包括核酸、蛋白质和脂质在内的各种生物活性分子富集在外泌体中，并且可以从供体细胞转移到受体细胞，导致信息的细胞内转移。外泌体中的生物活性货物可能被受体细胞摄取，促进肿瘤发生和进展。此外，外泌体参与了前转移生态位的形成、肿瘤血管生成和肿瘤免疫抑制。而且，外泌体可以反映其亲本细胞的生理和病理状态的改变。这些发现导致了分析循环外泌体及其衍生货物可能为癌症液体活检提供新机会的想法（见图1），突显了外泌体作为癌症诊断、进展监测和预后预测的生物标志物的潜力。 图1 外泌体作为液体活检的新靶标。外泌体在体液中富集，并在肿瘤发生、进展和转移中发挥关键作用。与传统的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)相比，外泌体显示出卓越的特性，如活细胞分泌的囊泡、大量存在和稳定循环。传统和先进的技术已被用于从各种体液中分离外泌体并检测外泌体的载物。特定外泌体分子的检测可能为癌症诊断、进展监测和预后预测提供新策略。 目前，循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体已成为液体活检的三个主要分支。与CTCs和ctDNA相比，外泌体在液体活检中显示出更大的优势。首先，在生物液体中存在大量的外泌体（约10^9个/mL）有助于相对容易地获得囊泡，而每毫升血液样本中只有几个CTCs。其次，外泌体由活细胞分泌，具有来自其亲本细胞的丰富生物学信息。因此，外泌体比ctDNA更具代表性，后者有限地反映了凋亡或死亡肿瘤细胞的信息。第三，由于其脂质双层，外泌体本质上是稳定的，即使在恶劣的肿瘤微环境中也能稳定循环。高生物学稳定性允许长期储存样本以进行外泌体分离和检测。值得注意的是，将外泌体应用于液体活检的一个重大挑战是高效和高纯度的分离，这源于它们的纳米尺度大小和固有的异质性。此外，由于癌症外泌体只占体液中外泌体总数的一小部分，超敏感和特异性检测是发展基于外泌体的癌症诊断的先决条件。迄今为止，已经开发了各种方法用于外泌体分离以及外泌体蛋白和核酸的检测。尽管取得了显著进展，但灵敏度和特异性有限、纯度和通量低仍然是学术研究和实际应用的重大挑战。因此，需要积极研究开发易于操作、高灵敏度和高纯度的外泌体分离和检测平台。在这篇综述中，我们讨论了外泌体分离和检测的最新进展以及它们在临床上的应用，强调了新开发的外泌体分离和检测技术。此外，总结了外泌体作为癌症液体活检中潜在生物标志物的应用。 2.外泌体生物发生和内容物 外泌体是由大多数细胞积极释放的异质群体的膜结构囊泡，可以在许多人体液体中找到，如血液、唾液、眼泪和尿液。外泌体生物发生的过程涉及质膜的内陷、多囊泡体（MVBs）的形成和外泌体分泌。MVBs是由内吞体膜向内膨胀形成的内吞结构。在MVBs内部积累的囊泡，称为腔内囊泡（ILVs），通过MVBs与质膜的融合作为外泌体释放（见图2）。广泛的研究表明，供体细胞衍生的生物活性分子富集在外泌体中，这表明外泌体在遗传信息交换中的关键作用。值得注意的是，与亲本细胞相比，外泌体中特定的RNA组分显示出很大的差异，这可能归因于外泌体形成过程中独特的货物分选过程。货物分选的机制尚不清楚，已报道内吞体分选复合物（ESCRT）依赖方式和ESCRT独立机制参与了这一过程。有趣的是，四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）、热休克蛋白（HSP60、HSP70）和ESCRT相关组分（Alix和TSG101）已被确认存在于外泌体中，这为它们的识别和检测提供了一定的标记。 图2 外泌体的生物发生、内容物和内化作用。外泌体是由多囊泡体与质膜融合而衍生的囊泡。来自供体细胞的细胞质内容物，如核酸和蛋白质，被分选进入外泌体，并通过内吞作用、吞噬作用、直接融合或直接结合（受体-配体相互作用）的方式传递给受体细胞。 越来越多的研究表明，各种与疾病相关的蛋白质和核酸被装载到外泌体中，并且在不同起源的肿瘤中差异性表达。Hoshino等人指出，通过蛋白质组学分析，血浆衍生的外泌体可以识别特定的癌症类型并区分肿瘤来源。他们发现，51种和19种血浆衍生外泌体蛋白分别在胰腺癌和肺癌中被特异性识别。此外，据报道，卵巢癌中外泌体的CD63高表达，而在肺癌中低表达。CD317和表皮生长因子受体（EGFR）在非小细胞肺癌（NSCLC）衍生的外泌体上高度表达。与健康受试者相比，糖蛋白-1（GPC-1）在胰腺癌患者的血清外泌体中显著增加，并且可以用于早期检测胰腺癌，具有100%的诊断特异性和敏感性。除了蛋白质，如miRNA、mRNA和lncRNA等核酸在外泌体中差异分布，并且可以用作特定的癌症生物标志物。例如，在胶质母细胞瘤患者的血清外泌体中检测到突变型EGFRvIII mRNA。Zhou等人报道，外泌体miR-15a-5p的表达水平在子宫内膜癌中比其他癌症类型高7-19倍。此外，外泌体miR-1247-3p的高表达与肝癌的肺转移正相关，这表明预后不良。鉴于外泌体由活细胞分泌，外泌体中的具体内容物可以反映其亲本细胞的病理生理状态，这使它们成为疾病进展动态监测的有用生物标志物。总的来说，被分选到外泌体中的货物不仅可以为它们的识别提供额外的特征，而且为癌症患者的诊断、治疗监测和预后预测提供了有希望的生物标志物，为液体活检提供了一种新工具。 3.外泌体分离和富集方法 由于独特的形成方式和特定的货物分选过程，外泌体在大小和分子内容上是异质的。从复杂的生物组分中外泌体的分离和富集对于基础研究和临床转化至关重要。到目前为止，已经开发了许多方法，这些方法在分离外泌体的数量和纯度上有显著差异。 4.传统分离方法 4.1.基于超速离心的分离 作为外泌体分离的金标准，超速离心是最常用的方法，包括差速超速离心和梯度密度超速离心。传统的差速超速离心最初由Johnstone等人提出，用于从网织红细胞的培养基中分离外泌体。通常，首先使用低速离心（300 g）去除细胞碎片，然后使用20,000g速度的离心去除其他大囊泡。最后使用高力（100,000g）沉降外泌体。然而，这种方法需要昂贵的仪器，并且存在聚集蛋白的污染。更多的离心周期可以获得更纯净的结果，但会导致更低的回收率。梯度密度超速离心是获得更高纯度外泌体的更好选择。在离心过程中，不同大小的颗粒从两个或多个溶液中分离成不同的层，其密度从上到下增加。基于此，该方法已被应用于分离外泌体，发现它们在密度为1.15到1.19g/mL处浮动。尽管比超速离心具有更高的纯度，但耗时的过程和对大量生物液体的需求大大限制了其在临床应用中的使用。 4.2.基于大小的分离 固定范围直径的特征允许通过基于大小的方法分离外泌体。过滤是使用具有特定孔径的膜过滤器进行外泌体分离的一种基于大小的方法，具有操作简单和有效纯化的优点，但产量低。超滤通常应用于从大量原始材料（如细胞培养基）中浓缩外泌体。目前，超滤与超速离心的结合已被广泛采用，在这种方法中，过滤用于去除细胞和大囊泡，而外泌体的纯化通过超速离心实现。此外，尺寸排除色谱（SEC）可以根据样品的大小和凝胶孔径分离生物分子组分。在分离过程中，大分子早期被洗脱，而小分子或颗粒直接扩散进入孔中。Anita N Böing等人开发了一种基于交联琼脂糖CL-2B柱的SEC协议，该协议可以有效地从无血小板上清液中分离直径大于70nm的外泌体。郭等人表明，CL-6B柱在颗粒产量和外泌体纯度方面比CL-2B柱表现更好。与离心和过滤方法相比，SEC具有温和处理和非破坏性结果的优点。此外，SEC与超速离心的结合可能具有提高的回收率和纯度。 4.3.沉淀技术 对于沉淀技术，使用高度亲水的聚合物与外泌体膜周围的水分子竞争性结合，从而降低溶解度，最终实现外泌体分离的低输入体积。迄今为止，聚乙二醇（PEG）是用于外泌体分离的最常用聚合物。Rider等人提出了一种名为ExtraPEG的外泌体纯化方法，该方法能够快速富集外泌体，并从囊泡中获取足够的内容物以供下游分析。最近，许多依赖沉淀技术的商业试剂盒已经被开发用于外泌体的分离和富集，如ExoQuick™和Total Exosome Isolation。Ding等人的研究表明，与其他试剂盒相比，ExoQuick™能够产生相对较高的外泌体产量。然而，这种方法经常因其高成本和共沉淀蛋白聚集体的污染而受到批评。 5.新的富集方法 外泌体特异性标记物和组分的发现为分离外泌体及外泌体亚群（图3）提供了新的途径。通过针对肿瘤相关蛋白如GPC-1和EpCAM（上皮细胞粘附分子）的特异性抗体和核酸适配体，可以很好地区分癌细胞来源的外泌体和正常细胞来源的外泌体。此外，微珠、微流控芯片和热泳等应用使得外泌体的快速便捷富集成为可能。在这里，我们总结了新方法在外泌体富集中的优势和局限性（表1）。 5.1.免疫亲和富集 由于简单性和特异性的优势，免疫亲和分离策略已被用于许多研究中的外泌体富集（图3A）。例如，张等人制造了一种针对活化微流控芯片的抗CD81功能化外泌体分离方法。杨等人报告了一种通过形成AuNC-外泌体-AuR复合物的三明治结构进行外泌体分离的集成微流控装置（图3Aa）。该装置在30分钟内从5mL尿液样本中获得了5×109个颗粒的产量。然而，捕获的外泌体的解离仍然是一个巨大的挑战，这源于抗原和抗体之间的强亲和力。为了解决这一挑战，康等人开发了一种外泌体特异性双模式免疫过滤（ExoDIF）装置。生物素化的抗CD63抗体固定在内通道表面，该表面依次用3,3'-二硫双磺苏糖咪啶（DTSSP）、生物素化牛血清白蛋白和亲和素处理。结果，从高稀释的细胞培养基中捕获了近87.1%的外泌体。值得注意的是，被捕获的外泌体可以通过DTT（二硫苏糖醇）解离，通过破坏DTSSP中嵌入的二硫键（图3Ab）。 最近，康等人提出了一种EVs on demand芯片（EVOD），通过四氮唑-抗EpCAM/抗EGFR抗体（TzAb）与TCO（反式环辛烯）功能化的微流控表面之间的反应，实现了癌症相关外泌体亚群的捕获。该芯片能够从癌症患者中选择性地比从健康捐赠者中多分离出76%的EGFR+外泌体，显示出对NSCLC早期检测的巨大潜力。孙等人设计了一个有趣的共价化学介导的EV点击芯片，通过多标记鸡尾酒（抗EpCAM、抗ASGPR1（唾液酸糖蛋白受体1）、抗CD147）从血浆样本中识别、富集和回收肝细胞癌（HCC）特异性外泌体（图3Ac）。所提出的外泌体纯化系统实现了超过81%的回收率和超过85%的纯度，为检测肝细胞癌提供了一种新的液体活检工具。尽管意义重大，但这些方法成本高且依赖于标记物。此外，应更多关注捕获外泌体的非破坏性释放。 5.2.磁性分离和富集 基于磁性珠的免疫亲和富集近年来因其便利性和高效率而受到广泛关注（图3A）。通常，外泌体通过抗体修饰的磁性珠被捕获，然后通过磁场力分离。例如，方等人进行了CD63抗体共轭磁性纳米粒子以分离外泌体。此外，新型免疫亲和超顺磁性纳米粒子（IS-NPs）被证明具有高效率，通过β-环糊精（β-CD）和4-氨基偶氮苯（AAB）之间的相互作用将抗CD63抗体与超顺磁性纳米粒子结合（图3Ad）。α-CD，一种从β-CD-AAB包合物中提取AAB的竞争性试剂，被适应用于外泌体的洗脱。结果，在人工模型样本中外泌体的捕获和释放效率分别高达80%和86.5%。与传统分离方法相比，IS-NPs方法显示出更高的产量、更高的纯度以及更好地保留了外泌体的结构和功能完整性。特别是癌症衍生的外泌体亚群的分离可以通过将磁性珠与针对肿瘤特异性生物标志物的抗体结合来实现。罗等人通过免疫亲和磁性珠和基于DNA折纸的核酸适配体进行了外泌体的快速分离和捕获。通过与DNA荧光探针的结合，可以实现外泌体的定量检测。李等人开发了一种均质磁荧光外泌体（hMFEX）纳米传感器，用于从乳腺癌患者的80μL血浆中分离GPC-1阳性外泌体。何等人开发了一个微流控平台，通过将样本与抗EpCAM或抗CA125抗体标记的磁性珠混合来捕获肿瘤衍生的外泌体。总的来说，免疫磁性分离方法有潜力促进快速分离和临床应用的循环外泌体在所需领域的实现。 图3 外泌体分离新技术。A 免疫亲和/免疫磁性富集。版权所有 2020 年 Yang ，2017 年 Kang ，2018 年 Cai ，2020 年 Sun 。B 基于物理特性的分离。版权所有 2017 年 Liu ，2019 年 Sunkara V ，2019 年 Hattori 。C 脂质介导分离。版权所有 2018 年 Xu ，2021 年 Jiang 。D 基于声学的分离/热泳富集。版权所有 2021 年 Tayebi ，2019 年 Liu ，2021 年 Tian 。 5.3.基于物理特性的分离方法 基于尺寸的微流控芯片被用来从大细胞碎片或其他膜状囊泡中分离外泌体（见图3B）。刘等人设计了一个基于尺寸的外泌体全隔离芯片（ExoTIC），其中30-200纳米的外泌体通过多个纳米孔膜被富集和纯化（见图3Ba）。与传统的超速离心和商业PEG沉淀试剂盒相比，ExoTIC从小体积的人类血浆中获得了更多的外泌体产量。然而，膜孔堵塞大大限制了外泌体的连续分离。为了克服这个问题，陈等人引入了一个超快隔离系统，EXODUS，它将双耦合谐波振荡集成到双膜过滤器配置中。通过周期性负压和气压切换，在线性纳米孔阳极氧化铝膜上产生了周期性负压振荡，允许小颗粒（即蛋白质和核酸）和流体通过，而较大的外泌体则留在中心腔室。此外，两对振荡器通过横向波和声流学流动使颗粒重新悬浮到液体中，有效限制了污染和颗粒聚集。此外，切向流过滤（TFF）是一种有效减少孔堵塞潜在技术，由于流向和过滤方向垂直状态。Sunkara等人开发了一个微流控切向流过滤装置，Exodisc，用于从人类血浆和尿液中分离外泌体，与传统方法相比，显示出更好的外泌体产量（见图3Bb）。决定性横向位移（DLD）已被用于外泌体分离，因为不同大小的颗粒在具有特定角度显示的微柱平台上表现出不同的轨迹。Wunsch等人提出了一个纳米尺度的横向位移（nano-DLD）阵列，其中较大的囊泡在阵列中横向位移并被收集在侧通道，而较小的囊泡以之字形从阵列中排出，最终实现尿液来源的外泌体的收集。然而，DLD受到通量低和需要高电压的限制，囊泡的密度和刚度可能会干扰基于DLD的外泌体分离。 5.4.基于脂质的分离 囊泡表面的脂质分子使外泌体捕获得以通过亲和介导（见图3C）。万等人报道了一种脂质纳米探针，用于从血浆中快速分离外泌体。外泌体的脂质双层被生物素标记的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚（乙二醇）（DSPE-PEG）探针标记，其中DSPE通过疏水效应插入外泌体膜，PEG在水相中提供溶解性。NeutrAvidin包被的磁性亚微米颗粒被用于通过亲和素-生物素亲和收集外泌体。结果，仅需要15分钟就能分离外泌体，大大缩短了分离程序。值得注意的是，胆固醇-PEG1000约6.4纳米被认为可以最小化脂质纳米探针表面固定时的空间位阻，从而实现了更高的捕获效率。此外，吸附在囊泡膜上的脂质分子也被应用于捕获外泌体。T细胞膜蛋白4（Tim-4），对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力，已被证实有助于从血清样本中简单分离外泌体，使快速下游分析更加容易（见图3Ca）。此外，TiO2壳层与外泌体磷酸基团的亲和作用是富集磷酸化肽段的一种新策略。庞等人使用Fe3O4@TiO2纳米颗粒在5分钟内富集和分离外泌体，捕获效率为96.5%。Fe3O4@TiO2纳米颗粒与表面增强拉曼散射（SERS）标签的结合可以同时富集外泌体并实现目标miRNAs的原位鉴定（见图3Cb）。 5.5.基于声学的分离方法 基于声学的微流控是一种简单高效的外泌体分离方法。通常，超声波应用于样本，颗粒根据其物理特性（如大小和密度）经受不同的作用力并被分离（见图3D）。Anson等人利用微米级种子颗粒和纳米颗粒在谐振腔中的超声波散射来富集外泌体。集成的声学装置实现了快速操作、非接触和连续分离尿液和血浆样本中的外泌体。吴等人开发了一个声流学平台，用于直接、无标记、非接触富集全血中的外泌体。该装置集成了两个分离模块，其中一个能够去除直径大于1微米的颗粒，另一个可以从未外泌体和其他颗粒中分离外泌体。最近，顾等人报道了一个声学驱动的旋转液滴装置，其中倾斜的交错换能器（IDTs）被用来根据不同频率的声波使纳米颗粒移动。通过将两个不同大小的液滴放置在一起，可以特别集中固定大小的颗粒。结果，该方法可以从5微升样本中在不到1分钟的时间内分离外泌体。此外，Tayebi等人将声辐射力（ARF）与介电泳（DEP）结合起来，在流动路径中放置高频（>10 MHz）的交错换能器，同时产生ARF和介电泳力场。介质中的颗粒通过流体阻力、ARF和DEP力场之间的竞争呈现横向平移，从而实现了细胞外囊泡的主动分离（见图3Da）。 5.6.热泳富集 热泳是指颗粒通过局部激光加热诱导的温度梯度，从高温区域迁移到低温区域的现象。为了解决耗时的分离和纯化程序的挑战，刘等人开发了一种敏感的热泳方法来富集肿瘤衍生的外泌体。通过使用针对肿瘤特异性标记物的核酸适配体，热泳能够实现快速分离和富集外泌体，而无需预先分离外泌体（见图3D）。外泌体的积累产生了核酸适配体的放大荧光信号，这使得外泌体表面生物标志物的分析以及miRNAs的检测成为可能（见图3Db）。田等人进行了类似的检测，分析了1微升血浆中的外泌体，为转移性乳腺癌的液体活检提供了一种低成本、敏感的方法（见图3Dc）。 6.外泌体表征 如2018年细胞外囊泡研究的最小信息标准（MISEV2018）所建议，外泌体的鉴定应包括西方墨点验证外泌体特异性标记物，并且至少使用两种方法对外泌体单个颗粒进行表征。 6.1.可见表征 透射电子显微镜（TEM）被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法，其典型结构为杯状（见图4A）。对于扫描电子显微镜（SEM），通过收集从样本中弹出的电子来呈现图像（见图4C）。值得注意的是，外泌体的形态可能会受到样本处理过程中脱水的影响。相反，冷冻电子显微镜（冷冻-EM）是更好的选择，因为它避免了样本固定和脱水。外泌体在非常低的温度下被分析，并且呈现出与TEM图像不同的圆形结构（见图4B）。此外，原子力显微镜（AFM）可以通过振幅调制和相位调制提供表面形态和材料属性（刚度、粘附性）的信息（见图4D）。而且，特定外泌体膜标记功能化的AFM探针允许单个外泌体中蛋白质的识别和检测。 图4 外泌体表征技术。A 透射电子显微镜。版权所有 2020 年 Li。B 冷冻电镜。版权所有 2018 年 Tian。C 扫描电子显微镜。版权所有 2010 年 Sharma 。D 原子力显微镜。版权所有 2010 年 Sharma。E 动态光散射。F 纳米颗粒追踪分析。G 可调电阻脉冲传感。 6.2.定量表征 动态光散射（DLS）是一种测量外泌体尺寸分布和zeta电位的技术。散射光的干涉和强度变化可以通过传感器识别，从而估计颗粒的尺寸分布（见图4E）。然而，蛋白质聚集体和大囊泡的污染使得DLS很难将它们与外泌体区分开来。纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于确定颗粒浓度和尺寸分布的方法（见图4F）。颗粒被一束光照射，散射光信号被光学显微镜收集。可调电阻脉冲传感（TRPS）检测外泌体通过充满导电介质的孔时离子电导率变化产生的电信号（见图4G）。 7.检测外泌体内容物的技术 7.1.传统的蛋白质分析 外泌体中的膜蛋白和细胞质蛋白都可以被检测到。一些外泌体上的膜蛋白参与了癌症的发展和进展，因此被用作外泌体分离和纯化的靶点。西方墨点和酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测外泌体蛋白质的两种常规方法。然而，这些方法面临着复杂程序和低灵敏度问题。 8.新的蛋白质检测方法 8.1.比色检测 到目前为止，已经开发出多种新技术来检测外泌体蛋白质（见表2）。比色检测是一种通过比较或测量有色物质的颜色强度来确定组分含量的方法（见图5A）。与其他纳米材料如Fe3O4 NPs和AuNPs类似，DNA具有显著增加单壁碳纳米管（s-SWCNTs）过氧化物酶活性的能力。夏等人开发了一种直观简单的外泌体检测方法。简要地说，CD63核酸适配体提高了s-SWCNTs的微小过氧化物酶活性，并有效地催化了3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，使无色溶液变蓝。相反，外泌体的加入诱导核酸适配体从纳米管表面释放，溶液的颜色由深变浅，这可以通过肉眼或紫外-可见光谱仪观察到，检测限（LOD）为5.2×105个粒子/μL。如前所述，ZnO-芯片被设计用于有效分离外泌体。在外泌体与一抗混合物（抗CD9/CD63抗体）孵育后，通过HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗识别（见图5Aa）。最后，通过紫外-可见光谱仪或微孔板分析仪获得了最小可检测浓度为2.2×104个粒子/μL。梁等人设计了一个与双膜过滤器和ELISA集成的微流控系统，用于检测膀胱癌患者尿样中外泌体的含量。除了常见的外泌体蛋白，比色法也可以用来检测癌症特异性蛋白。例如，PSA（前列腺特异性抗原）核酸适配体基础传感器被用于在500μL人类血浆中直观检测前列腺癌特异性外泌体。此外，Di等人报告了一种纳米酶辅助免疫吸附测定（NAISA），它能够灵敏和快速地多重分析外泌体蛋白（见图5Ab）。外泌体表面蛋白可以被固定在微孔板表面的抗体特异性捕获并催化比色反应。来自微孔板阅读器的信号强度与目标蛋白的数量成正比。结果，NAISA允许从临床样本中快速分析多种外泌体蛋白，如CD63、CEA（癌胚抗原）、GPC-3（Glypican-3）、PD-L1（程序性死亡配体1）和HER2（人类表皮生长因子受体2）。 8.2.荧光检测 荧光光谱光度法是一种根据荧光光谱线的阳性和强度进行物质鉴定和含量测定的方法（见图5B）。何等人进行了一种微流控芯片，用于检测30μL血浆样本中的表面和腔内生物标志物。该芯片获得了IGF-1R（胰岛素样生长因子1型受体）的显著提高的检测灵敏度，0.281pg/mL的IGF-1R和0.383pg/mL的p-IGF-1R，这比ELISA实现的灵敏度高100倍（见图5Ba）。刘等人开发了一种免疫吸附测定，其中免疫磁性珠被用来捕获外泌体，然后与酶报告分子结合，可以产生用于量化液滴微流控系统中GPC-1+外泌体的荧光信号。魏等人提出了类似的单分子阵列（SiMoa）平台，通过该平台可以超灵敏地检测通用外泌体和肿瘤衍生外泌体，检测限分别为34个粒子/μL和25个粒子/μL。余等人进行了一种基于CD63核酸适配体的检测方法。外泌体上的CD63可以与修饰在磁性珠表面的核酸适配体结合，导致Cy3标记的短序列进入上清液。上清液中的荧光强度用于量化复杂临床样本中的外泌体。氧化石墨烯具有通过荧光共振能量转移（FRET）与荧光染料结合时淬灭荧光的能力。例如，当FAM标记的核酸适配体被吸收到氧化石墨烯膜上时，荧光被淬灭，而目标外泌体与核酸适配体竞争性结合并重新表现出荧光信号，检测限为1.6×105个粒子/mL（见图5Bb）。李等人开发了一种基于聚集诱导发光体（AIEgens）的简便荧光核酸适配体传感器。氧化石墨烯吸收（含有四苯基的叔胺）TPE-TAS/核酸适配体复合物在没有外泌体的情况下允许荧光淬灭。当目标外泌体被引入时，核酸适配体优先与其目标结合，导致TPE-TAS/核酸适配体复合物从氧化石墨烯表面分离，随后出现“开启”的荧光信号。在优化条件下，肿瘤衍生外泌体的线性范围大约为4.0×105个粒子/μL至1.8×107个粒子/μL。 8.3.电化学检测 电化学检测是通过测量样品的电化学势或电流来检测分析物的方法，具有高灵敏度和宽测量范围的优点（见图5C）。近年来，研究人员开发了电化学生物传感器，因为当识别元素如抗体和核酸适配体特异性结合到外泌体时，改变的电化学信号可以量化外泌体。曹等人提出了一种电化学生物传感器，用于准确检测PD-L1+外泌体（见图5Ca）。外泌体首先被抗CD63功能化的磁性珠捕获，然后与抗PD-L1连接的DNA链结合，引入超支化滚环放大（HRCA）。HRCA可以降低环境pH值，导致PVP@HRP@ZIF-8分解并释放HRP，从而产生放大的电化学响应，因此实现了癌症衍生PD-L1+外泌体的识别和检测。这种生物传感器对PD-L1+外泌体显示出宽动态范围（1×103至1×1010个粒子/mL），检测限为334个粒子/mL。Jeongmin等人报告了一种HiMEX方法，该方法集成了磁性外泌体分离和外泌体结合蛋白的电化学检测，经过酶放大。从20μL血浆样本中外泌体中肿瘤生物标志物（EGFR、EpCAM、CD24和GPA33）的联合检测有助于结直肠癌的诊断和监测。电化学方法，特别是基于核酸适配体的生物传感器在检测和分析外泌体蛋白方面显示出巨大潜力。Kashef-Kheyrabadi等人介绍了一种可分离的微流控装置，该装置实现了基于核酸适配体的电化学生物传感方法（DeMEA）。在这个系统中，针对EpCAM的核酸适配体被固定在预先电镀金纳米结构的电极表面，微流控涡旋可以增加外泌体和传感表面之间的碰撞（见图5Cb）。因此，DeMEA能够量化不同阶段乳腺癌患者血浆样本中的外泌体，为癌症特异性外泌体的高度敏感和早期检测提供了一种方法。 图5 新方法检测外泌体内容物。A 比色检测。版权所有 2018 年 Chen，2020 年 Di 。B 荧光检测。版权所有 2014 年 He，2018 年 Jin 。C 电化学检测。版权所有 2020 年 Cao 。2020 年 Kashef-Kheyrabadi L。D SPR/SERS 检测。版权所有 2014 年 Hyungsoon Im ，2020 年 Dong。E 单外泌体检测。版权所有 2019 年 Wang，2019 年 He 。F ddPCR。版权所有 2020 年 Sun ，2021 年 Liu。G 分子信标。版权所有 2016 年 Ji Hye Lee ，2015 年 Ji Hye Lee 。H LSPR 检测。版权所有 2021 年 Wu 。 8.4.表面等离子共振检测 表面等离子共振（SPR）是一种物理光学现象，由金属膜/液体界面处的全反射光引起，用于分析分子间相互作用（见图5D）。Im等人开发了一种基于透射SPR的纳米等离子体外泌体（nPLEX）检测方法，通过周期性纳米孔阵列（见图5Da）进行。每个阵列中的功能化抗体，nPLEX传感器显示出与目标外泌体蛋白水平成比例的光谱移动或强度变化。在另一项研究中，由于等离子体效应，AuNC-Exosome-AuR上观察到显著改善的散射波长移动和散射强度。通过抗LRG1抗体偶联的AuR探针评估了肺癌患者和健康个体尿液中外泌体中LRG1（富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1）的差异表达。范等人开发了一种基于SPR成像（SPRi）的生物传感检测方法。抗体（抗CD63/抗EGFR/抗EpCAM）修饰的金芯片与不同识别位点之间的生物亲和相互作用允许对NSCLC衍生的外泌体进行多重表征。这种生物传感器的检测限估计为104个粒子/μL。尽管具有多种优点，但纳米等离子体生物传感器的广泛应用受到纳米结构制造困难的限制。为了解决这一挑战，刘等人开发了一种无需纳米结构的强度调制SPR生物传感器。在这个传感器中，激光的反射强度和参考强度被两个光电探测器记录，并用于量化外泌体蛋白的表达水平，显示出比ELISA更高的检测灵敏度。 8.5.表面增强拉曼散射 表面增强拉曼散射（SERS）能够通过电磁和化学机制增强附着在粗糙金属表面的小型分子的拉曼信号（见图5D）。一种新的检测方法被报道用于外泌体的实时检测和蛋白质分析。通常，镀金的载玻片与3D打印的抗体阵列结合使用，用于捕获外泌体，QSY21包覆的金纳米棒被用作标记剂，用于定量检测目标蛋白。通过这种针对HER2和EpCAM的检测方法，定量确定了乳腺癌患者血浆衍生的外泌体水平。提出的3D打印阵列模板实现了廉价、便携且易于建立的检测平台，为新型癌症液体活检的发展提供了新策略。董等人表明，蛋白质磷酸化状态的分析可能为癌症诊断提供新的可能性（见图5Db）。开发了一种类似蜂巢的Au包覆的TiO2大孔反蛋白石结构，用于在无需任何标记过程的情况下捕获和分析外泌体。1087 cm-1的SERS峰的强度指的是外泌体磷酸化蛋白中的P-O键，且峰强度至少是来自癌症患者的血浆的两倍。然而，上述两种检测方法都需要预先分离外泌体，这大大阻碍了快速分析。庞等人提出了一种简单的免疫分析方法，直接从血清样本中捕获和分析外泌体PD-L1。Fe3O4@TiO2纳米颗粒被设计用于分离外泌体，抗PD-L1抗体修饰的Au@Ag@MBA SERS标签被应用于外泌体PD-L1的标记和SERS检测。这种检测方法在40分钟内成功定量了4μL血清样本中的外泌体PD-L1。 8.6.CRISPR/Cas系统辅助检测 在CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以通过识别特定的互补双链DNA（dsDNA）含有PAM（protospacer adjacent motif）序列，并通过导向RNA（gRNA）的帮助，高效地剪切dsDNA序列。通过特异性靶向外泌体蛋白的核酸适配体，蛋白质的检测可以转化为核酸的定量。最近，赵等人报告了一种结合了基于核酸适配体的外泌体膜蛋白识别和CRISPR/Cas12辅助的荧光信号放大的检测方法。在这个系统中，CD63核酸适配体特异性地靶向外泌体膜蛋白，触发核酸适配体的构象变化并释放阻断链（与核酸适配体具有互补序列）。释放的阻断链随后被CRISPR/Cas12a识别，导致对TaqMan探针的转剪切，荧光报告团和猝灭团的分离，最终产生放大的荧光信号。结果，这种方法实现了103至107个粒子/μL的线性检测范围，并成功应用于直接检测血浆外泌体，无需超速离心。邢等人开发了一种apta-HCR-CRISPR检测方法，用于从50μL鼻咽癌患者血清中检测循环的核糖体蛋白+或PD-L1+外泌体。核糖体蛋白或PD-L1靶向核酸适配体首先通过HCR（杂交链反应）放大，产生长重复的CRISPR可靶向DNA单元。通过收集CRISPR-Cas12a的旁路剪切活性诱导的荧光信号，该检测方法实现了102个粒子/μL的检测限。李等人进行了类似的检测，用于超灵敏检测CD109+和EGFR+外泌体。CRISPR/Cas系统预计将成为识别和定量外泌体蛋白的敏感工具，并可能有助于癌症的诊断和治疗监测。 8.7.单个外泌体检测 内在异质性是阻碍体液中外泌体分析的主要因素之一。单个外泌体检测可能提供更准确的肿瘤进展信息（见图5E）。郭等人提出了一个ssDNA辅助的单个外泌体检测平台。滚环放大（RCA）有助于从表面蛋白产生放大的荧光信号，使单个外泌体容易可视化，检测限为82个囊泡/μL。此外，刘等人开发了一种λ-DNA和核酸适配体介导的方法，允许通过大小和肿瘤相关标记表达对外泌体进行二维分析。 由于纳米尺寸的外泌体不能通过常规流式细胞术敏感地识别，因此醛/硫酸盐乳胶珠被用来与囊泡结合，然后被荧光抗体染色并对其蛋白标记进行表征。例如，抗GPC-1抗体和Alexa-488标记的二抗被引入到附着外泌体的珠子上，阳性珠子的百分比在此被称为GPC-1+外泌体的百分比。此外，外泌体中表达的EpCAM、HER2和EGFR的检测表明了它们在癌症诊断中的潜在作用（见图5Ea）。此外，纳米流式细胞术的发展为单颗粒的多参数分析提供了新的选择。通过纳米流式细胞术使用免疫荧光标记测量单个外泌体的CD9、CD63、CD81、CD235a、CD45、CD41a和CD144的表达，以评估通过六种不同方法分离的外泌体制备的质量。刘等人使用纳米流式细胞术分析泪液衍生外泌体中CD9、CD63、CD81、CD47、CD45、CD24和EpCAM的表达，并发现泪液中外泌体浓度大约是血浆外泌体的100倍。 9.传统的核酸分析 除了蛋白质载体外，外泌体中也包裹有核酸。RNA是外泌体中主要的核酸载体，已显示出作为癌症诊断和预后预测的特定生物标志物的潜力。然而，检测外泌体核酸的准确性和可行性常受到其低丰度的阻碍。为了定量外泌体核酸的表达水平，已使用了如qRT-PCR（实时定量逆转录PCR）、微阵列和下一代测序（NGS）等技术。尽管qRT-PCR具有高灵敏度，但它只能用于检测已知序列的核酸。NGS有利于高通量发现和定量未知的外泌体RNA转录本。然而，需要解决的不足之处包括高成本、大量数据和构建文库的复杂性。通过杂交探针和目标基因的互补组合，微阵列可以一次分析外泌体中的数千种核酸，但存在灵敏度低的缺点。为了克服这些限制，正在投入更多努力开发高灵敏度和便捷的外泌体核酸检测方法（见表3）。 10.新的核酸检测技术 10.1.ddPCR 液滴数字PCR（ddPCR）是一种技术，其中PCR反应混合物被分成油包水乳液中的数万个水性液滴（见图5F）。每个单独的液滴包含不超过一个目标基因的副本，并根据荧光幅度被标记为阳性或阴性。然后通过泊松分布和阳性液滴的比例估计目标核酸的浓度。ddPCR与qPCR的比较表明，ddPCR在分析尿液外泌体miRNAs方面具有更高的准确性和灵敏度。Chen等人使用ddPCR从胶质母细胞瘤（GBM）患者的血清或脑脊液（CSF）衍生的外泌体中识别IDH1（异柠檬酸脱氢酶1）转录本。在携带突变型IDH1胶质母细胞瘤患者的CSF衍生外泌体中鉴定出突变型IDH1 mRNA，并且在来自肿瘤患者的外泌体中发现IDH1 mRNA的水平高于健康对照组。Sun等人最近使用ddPCR从肝癌（HCC）患者的血浆样本中定量10种HCC特异性mRNA（见图5Fa）。通过计算数字评分评估了HCC外泌体衍生mRNA签名的诊断价值。此外，通过ddPCR检测外泌体miR-15a-5p以区分子宫内膜癌（EC）患者和健康受试者。Shen等人报告说，在与良性肺肿瘤相比，从恶性肺癌患者的EpCAM特异性外泌体中通过ddPCR定量了更多的lncRNAs RP11-77G23.5和PHEX-AS1的拷贝数。 10.2.分子信标 分子信标（MB）是一种发夹状的寡核苷酸，两端分别标记有荧光染料和猝灭剂（见图5G）。MB设计用于与目标序列自发杂交，从而破坏发夹环结构并诱导荧光出现。Lee等人观察到，分子信标与癌细胞和人血清中外泌体中的miRNA-21的杂交获得了高荧光信号（见图5Gb）。此外，通过基于MB的生物传感器从人尿液中外泌体中检测到miR-375和miR-574-3p。人血清中外泌体中miR-21、miR-375和miR-27a的表达水平被检测出来（见图5Ga）。Oliveira等人利用CPP（细胞穿透肽）将MB传递穿过血浆膜，然后检测红细胞（RBC）衍生外泌体中的miRNA-451a。Chen等人设计了一个2'-O-甲基化和硫代磷酸酯修饰的分子信标，用于定量分析人血浆中外泌体miRNA-1246。使用Triton X-100破坏外泌体膜后，探针可以特异性地靶向内部的miRNA-1246并显示定量荧光信号。Zhang等人开发了一个集成的外泌体分离和检测系统，其中外泌体可以通过微流控技术使用少量样本分离。同时，纳米孔检测技术有效地提高了无需放大和荧光标记的肿瘤相关miRNA的检测效率。基于分子信标的生物传感器具有简单程序、无需外泌体预分离和核酸提取的优势，显示出它们在癌症诊断和预后液体活检中的巨大潜力。 10.3.DNA四面体探针 DNA四面体是一种具有高可控性的DNA纳米结构，可以通过化学修饰和DNA自组装提供多样化的放大信号标签。Gao等人进行了一个基于DNA四面体纳米探针的FRET传感平台，用于灵敏地检测不同细胞系中的miR-146b-5p。Chen等人报告了一个发夹四面体纳米探针，用于人血清中外泌体miR-21的定量测量。在没有miR-21的情况下，荧光供体-猝灭剂对的结构导致了低FRET效应，而目标miRNA的存在诱导了干环结构的破坏和强FRET的发生。因此，该检测方法在1×10-12至10×10-9M（摩尔/升）的范围内获得了良好的线性，并检测限为45.4×10-15M。Zhang等人提出了一个类似的基于两个多功能DNA四面体辅助催化发夹组装的电化学生物传感器。通过利用局部反应和级联放大，该传感器能够在30分钟内灵敏地检测肿瘤相关外泌体miRNA，低至7.2 aM。 10.4.局域表面等离子共振 局域表面等离子共振（LSPR）发生在入射光频率与贵金属纳米颗粒或金属导电电子的整体振动频率相匹配时（见图5H）。Joshi等人开发了一种基于LSPR的生物传感器，用于无标记和非破坏性测量外泌体miR-10b。金纳米棱柱通过化学合成到硅烷化的玻璃基底上，然后功能化HS-C6-ssDNA和PEG6-SH。目标miR-10b和HS-C6-ssDNA的直接杂交诱导双链DNA的形成，这可以增加纳米棱柱的折射率并改变LSPR偶极峰的波长（λLSPR）。miR-10b的浓度可以通过ΔλLSPR来评估。该平台足够灵敏，即使在亚阿摩尔浓度范围内，也能区分miR-10b和miR-10a（仅一个核苷酸差异）。Wu等人开发了一种基于SPRi的生物传感器，用于准确诊断NSCLC的多种外泌体miRNAs，其中Au-Ag异质结构和DNA四面体框架被用来增强SPR信号，每种外泌体miRNA都可以被不同SPR信号超灵敏地识别（见图5Ha）。 10.5.基于TIRF的单囊泡成像 作为单外泌体分析方法，全内反射荧光（TIRF）已经出现，为提供有关外泌体异质性的额外信息（见图5E）。He等人提出了一个基于TIRF的单囊泡成像检测方法，该方法将分子信标探针送入外泌体，从而诱导目标miRNA的放大荧光（见图5Eb）。他们对单个囊泡进行了直接可视化和人血清样本中miR-21的原位定量分析，发现这种检测方法在区分癌症患者和健康受试者方面比传统PCR检测方法表现更好。 10.6.热泳辅助检测 Zhao等人开发了一种热泳传感器，用于无需RNA提取或目标放大即可原位检测外泌体miRNA（见图5F）。修饰在纳米孔中的核酸适配体能结合目标外泌体miRNA，诱导荧光的出现。经过热电泳积累后，荧光信号被放大，允许在少量血清样本中灵敏地检测0.36 fM外泌体miRNA。此外，Han等人提出了一种基于DNA四面体的热泳检测（DTTA），实现了血清外泌体中14 aM mRNA的检测限。DNA四面体的两个荧光标记的识别序列被外泌体内化后，可以结合目标mRNA，导致FRET信号增加。热泳效应被应用于进一步放大FRET信号，实现了对外泌体中PSA mRNA的高灵敏度检测。DTTA检测显示，外泌体PSA mRNA在区分前列腺癌和良性前列腺增生方面比血清PSA蛋白表现更好（AUC：0.93对比0.74），为精确检测前列腺癌提供了一种新方法。 10.7.CRISPR/Cas系统辅助检测 最近，CRISPR/Cas系统为开发用于检测和定量外泌体中核酸的分析方法提供了新机会。已经提出了将核酸放大与CRISPR/Cas整合的策略，以提高分析特异性和灵敏度。例如，Wang等人进行了一种名为滚动循环放大辅助CRISPR/Cas9切割（RACE）的平台，用于检测多种外泌体miRNA。在RCA过程中，Padlock探针在HiFi Taq DNA连接酶的存在下识别单碱基差异。由大量重复目标序列和PAM结构组成的长ssDNA的放大产物被Cas9核酸酶特异性识别。因此，与ssDNA杂交的TaqMan探针被Cas9蛋白完全切割，允许“开启”荧光变化，可以方便地通过光谱测量。结果，这种RACE平台可以用于高度特异性地检测人血浆中的单一或多种外泌体miRNA。然而，基因组中大量的天然PAM结构可能增加非目标效应的风险，极大地损害分析的特异性。 11.机器学习 机器学习指的是一种技术，它通过构建已知数据的模型来预测和分析未知数据。作为人工智能的关键分支，机器学习已被广泛用于外泌体生物标志物的多重分析。已经开发了诸如线性判别分析（LDA）、主成分分析（PCA）、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）等算法，将多变量数据分类为典型的分类模型，然后应用于未知生物数据的预测和分组。Kawakami等人证明，机器学习算法在预测和诊断上皮性卵巢癌方面比传统的逻辑回归分析表现更好。Wu等人使用尿液衍生外泌体的荧光信号作为输入数据，应用KNN（K-最近邻）和SVM作为机器学习模型，进行外泌体生物标志物分析。通过引入机器学习算法，诊断模型能够对多种疾病进行准确诊断和分类。刘等人使用LDA确定了七个外泌体生物标志物的总签名，这在区分前列腺癌和良性疾病方面取得了高准确性。田等人通过LDA分析了1μL血浆中外泌体的八个与癌症相关的蛋白质的加权和。PCA是一种算法，它通过正交变换将一组可能相关的变量转换为一系列线性无关变量。Shin等人使用PCA探索了细胞外泌体和人血浆外泌体的特征。结果表明，机器学习模型能够以95%的准确率对正常和肺癌细胞系衍生的外泌体进行分类，并在预测整个队列的肺癌方面获得了0.912的AUC。刘等人采用RF、NN和SVM分析了乳腺癌患者的多种外泌体衍生mRNAs，与单一标志物相比，表现出改善的诊断性能。这些研究表明，将外泌体分析与机器学习相结合在癌症液体活检中具有巨大潜力。值得注意的是，典型的机器学习方法需要大型数据集，而临床样本数量有限和数据不足可能导致准确性和可靠性差。更强大机器学习算法的出现将有利于液体活检中外泌体的分析。 12.外泌体在癌症液体活检中的意义 近期研究表明，外泌体在早期诊断、疾病监测和预后预测方面优于CTCs和ctDNA。在此，我们总结了外泌体在多种癌症液体活检中的应用（见图6，表4）。 图6 外泌体在癌症液体活检中的应用。癌症衍生的外泌体富集了差异表达的蛋白质和核酸，并且已被测试作为不同癌症早期诊断、分期分类和预后预测的新生物标志物，突显了它们在癌症液体活检和精准医疗中的重要价值。 12.1.HCC 肝细胞癌是癌症相关死亡的第四大原因。装载在HCC衍生外泌体中的分子签名可用于诊断。发现外泌体miR-21能够抑制HCC细胞的凋亡，并在HCC患者中上调。诸如CEA和GPC-3等外泌体蛋白能够区分HCC患者和健康受试者，可能作为无创癌症诊断的有希望的生物标志物。在包含158个样本的研究中，收集血浆用于检测10个HCC特异性基因，包括甲胎蛋白（AFP）、GPC3、白蛋白、载脂蛋白H等。观察到与非癌症队列相比，通过ddPCR在HCC队列中获得了更高的荧光信号。这10个基因签名通过机器学习进一步计算，显示出在区分早期HCC和有风险的肝硬化方面具有巨大潜力，AUC为0.93。Nakano等人比较了接受肝移植的HCC患者中外泌体miR-92b和循环AFP的表达水平。揭示了外泌体miR-92b能够预测HCC的早期复发，AUC为0.925，而AFP的AUC为0.651。Zhu等人整合了血浆外泌体RNA序列、无细胞RNA序列和TCGA组织RNA序列数据集，以识别5个非编码RNA（circ-0073052、circ-0080695、SNORD3B-1、LINC01226和HULC）作为肝癌的潜在生物标志物。此外，SNORD3B-1、circ-0080695和miR-122的组合面板在将肝癌患者与健康捐赠者分类方面显示出最高的AUC（89.4%），与其他标志物面板相比。通过所选的面板，在测试和验证集中，79.2%的AFP阴性样本和77.1%的早期肝癌样本被成功检测，这表明外泌体RNAs小组在早期诊断肝癌方面的潜力。 12.2.PDAC 作为与胰腺癌进展相关最公认的指标之一，miRNA-10b目前正在被广泛研究用于胰腺导管腺癌（PDAC）的早期诊断。Joshi等人指出，胰腺癌患者、患有慢性胰腺炎（CP）的高危患者和健康个体之间外泌体miR-10b的水平显著不同，这表明miR-10b在诊断胰腺癌和预测可能发展为PDAC的CP患者方面的潜力。Pang小组使用双SERS生物传感器进行一步检测外泌体中的mRNAs，也得出了相同的结论。Melo等人发现，GPC-1+循环外泌体（GPC-1+crExos）在识别PDAC患者与健康个体和慢性胰腺炎方面表现出高特异性和敏感性（AUC=1.0），优于CA199（AUC=0.739）。此外，GPC-1+crExos的水平与手术前后患者的肿瘤负担和生存相关，表明GPC-1作为治疗反应和预后监测的可靠生物标志物的潜力。此外，GPC-1和CD63的组合被证明在将PDAC患者与健康受试者区分开来方面显示出99%的敏感性和82%的特异性。此外，迁移抑制因子（MIF）被报道在区分胰腺癌的不同阶段方面比GPC-1和EGFR表现更好。 12.3.CRC 结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高。外泌体中的环状RNA与癌症的发生和发展有关。由于其环状结构，它提供了一个稳定的癌症诊断生物标志物。发现环状RNA-0004771在CRC患者血清外泌体中上调。外泌体circ-0004771的AUC用于从健康对照中识别CRC为0.88，用于区分I和II期患者与其他良性肠道疾病为0.816，这表明circ0004771可以作为结直肠癌的潜在诊断标志物。Wei等人探索了新的外泌体生物标志物，用于结直肠癌的早期诊断和预后。对血浆样本的检测显示，与健康和良性对照相比，CRC患者中CD9、CD63和EpCAM的表达显著更高（分别为0.90和0.96的AUC）。此外，miR-15b、miR-21和miR-31被报道在CRC患者血清外泌体中高度表达。ROC曲线显示miR-15b的AUC为0.86，组合的miR-15b、miR-21和miR-31小组展现出81.21%的敏感性和81.03%的特异性。 12.4.NSCLC 非小细胞肺癌占肺癌引起的死亡的80%以上。与正常人相比，NSCLC患者血清外泌体中PD-L1的水平较高。Pang等人在一个更大的患者队列中进一步证实了外泌体PD-L1的诊断价值，AUC为0.97。Ma等人发现，与健康个体相比，复发性NSCLC患者中外泌体miR-21的表达更高。然而，在外泌体中也发现了高水平的miR-21在其他癌症中，如结直肠癌、乳腺癌和肝癌。因此，检测多种miRNAs可能对NSCLC诊断更有价值。Wu等人证明miR-21、miR-378、miR-139和miR-200在NSCLC患者和健康捐赠者之间差异表达，为NSCLC早期诊断提供了更多可选的生物标志物。值得注意的是，实验结果表明，与血浆和支气管肺泡灌洗液相比，NSCLC患者尿液衍生外泌体中外泌体RNAs的数量更多，这可能为选择样本分析外泌体提供了新的方向。 12.5.乳腺癌 乳腺癌（BC）是女性癌症相关死亡的最常见原因。早期诊断可以有效降低死亡率并取得更好的治疗效果。尽管作为广泛使用的生物标志物，CA15-3（碳水化合物抗原15-3）对于诊断原发性和转移性乳腺癌（MBC）的敏感性还不够。Lee等人证明，癌细胞衍生的外泌体miR-21、miR-222和miR-200c可在体液中量化，并用于乳腺癌诊断。Lu等人报道，RDW（红细胞分布宽度）、MPV（平均血小板体积）和CA15-3的组合显示出比单一生物标志物更好的特异性和敏感性，用于识别乳腺癌。此外，通过机器学习计算八个生物标志物（CA15-3、CA125、CEA、HER2、EGFR、PSMA、EpCAM和VEGF）的加权和，鉴定出一种外泌体签名。结果，该签名显示出高度的区分准确性，用于区分MBC与非转移性肿瘤和年龄匹配的健康捐赠者（91.1%）。此外，据报道，外泌体签名能够准确监测MBC治疗反应，并作为MBC患者无进展生存的独立预后因素。 12.6.前列腺癌 PSA是检测前列腺癌的广泛使用的生物标志物。然而，增加的PSA也出现在如良性前列腺增生（BPH）等炎症性疾病中。因此，迫切需要开发敏感和特异性生物标志物，以早期诊断患者并监测癌症进展。Li等人报道，外泌体ephrinA2具有比血液中循环PSA更好的能力，以区分前列腺癌患者和BPH患者，AUC为0.906。此外，发现血清外泌体中EpCAM和PSMA增加。此外，据报道，外泌体TUBB3 mRNA的表达与转移性去势抵抗性前列腺癌患者阿比特龙治疗的无进展生存期差有关。 12.7.外泌体在临床试验和癌症液体活检中的应用 由于与CTC和ctDNA相比，外泌体具有活细胞分泌、大量存在和稳定循环的优势，基于外泌体的液体活检已在临床试验中进行了测试，其中一些已经获得批准并进入市场。2016年，Exosome Diagnostics提出了世界上第一个基于外泌体的液体活检，ExoDx™ Lung (ALK)，用于从血样中分离和分析外泌体RNA。在CLIA认证实验室中，ExoDx™ Lung (ALK)被证明是一种准确、实时的工具，用于检测NSCLC患者中的EML4-ALK突变，敏感性为88%，特异性为100%，这比cfDNA提供了一种更直接和敏感的检测基因融合的方法。此外，ExoDx Prostate IntelliScore (EPI)已获得FDA认证。基于对外泌体中ERG、PCA3和SPDEF RNA的检测，EPI提供了一个风险评分，以预测PSA在2到10ng/mL之间的患者是否有可能发展为高级别前列腺癌。根据ExoDx，前瞻性研究中达到了93%的敏感性，并且当EPI阈值设定为15.6时，避免了26%的不必要的针刺活检。三个独立的、前瞻性的、多中心的临床试验宣布EPI的表现优于标准护理，并且可以用来协助早期诊断前列腺癌和消除不必要的前列腺活检。此外，MedOncAlyzer 170是一种新开发的液体活检系统，能够一次性检测外泌体RNA和ctDNA。它可以从小量（0.5ml）的患者血液或血浆中识别多种癌症类型中的显著和功能性突变。由于外泌体和ctDNA的独特形成方式，MedOncAlyzer 170在检测癌症进展和治疗的所有阶段的突变方面准确且高度敏感。尽管临床应用价值已经得到验证，但仍然需要更大的临床样本、人群和试验来确认基于外泌体的液体活检在癌症诊断和治疗中的作用。 13.结论和展望 目前，在精准医疗领域，组织活检的局限性已逐渐被认识到。相反，液体活检具有微创性、易于获取样本和动态分析的优势。外泌体已被证实在体液中稳定循环，并包含反映肿瘤进展状态的多样化信息。外泌体作为诊断和预后生物标志物的潜力已在多种癌症中进行了研究。然而，外泌体的高异质性和纳米尺寸为获取其分子信息和相互作用带来了巨大的技术挑战。在这篇综述中，我们总结了传统和新型技术隔离、表征和检测外泌体的优点和缺点。基于物理或生物学特性的技术正在被广泛开发用于外泌体分离，微流控设备的应用在超快速分离高产量的纯外泌体方面具有巨大潜力。尽管取得了革命性的进展，但目前尚无标准化方法用于从细胞培养基和人体体液中高通量、高纯度、最小损伤分离外泌体。循环外泌体中包含的多种分子突显了外泌体在液体活检中的潜力。需要更快、更便捷的方法来验证外泌体货物作为癌症诊断中的生物标志物。大多数新的检测平台虽然优于传统方法，但仍面临低灵敏度和不同外泌体亚群的高异质性挑战。单外泌体检测和分析技术可能揭示特定外泌体的独特分子轮廓，并提供一种可行的策略来获取准确的癌症相关信息。对外泌体异质性的进一步探索将解决当前外泌体研究中的许多挑战。改进开发新策略，从体液中分离外泌体并以快速和敏感的方式分析外泌体内容物，将促进基于外泌体的液体活检在癌症精准医疗中的实践应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。