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IVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛议程曝光点击图片查看，大会火热进行中，明天继续：（扫码立即领取限量免费参会入场券）疫苗的定义疫苗是将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等;当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。国内传染病发病情况2017年，甲乙类传染病发病率222.1/10万，死亡率1.4/10万。发病数前5位的病种依次为病毒性肝炎、肺结核、梅毒、淋病、细菌性和阿米巴性痢疾，占甲乙类传染病发病总数的92.8%；死亡数前5位的病种依次为艾滋病、肺结核、病毒性肝炎、狂犬病、人感染H7N9禽流感，占甲乙类传染病报告死亡总数的98.8%。2017年，丙类传染病发病率287.5/10万,死亡率0.01/10万。发病数前5位的病种依次为手足口病、其他感染性腹泻病、流行性感冒、流行性腮腺炎和急性出血性结膜炎，占丙类传染病发病总数的99.8%；死亡数较多的病种依次为手足口病、流行性感冒和其他感染性腹泻病，占丙类传染病报告死亡总数的100％。疫苗的免疫反应疫苗的分类我国疫苗主要分为一类疫苗和二类疫苗。北京市第一类疫苗（2014-2016年）15种A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗、冻干水痘减毒活疫苗（应急接种用）、脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸、脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗（老人和学生用）、麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗、麻疹风疹联合减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗、吸附白喉破伤风联合疫苗、吸附无细胞百日咳白喉破伤风联合疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、重组乙型肝炎疫苗、双价肾综合征出血热疫苗（应急接种用）北京市第二类疫苗（2016年）19种23价肺炎球菌多糖疫苗、A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、冻干人用狂犬病疫苗、冻干水痘减毒活疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、甲型乙型肝炎联合疫苗、口服轮状病毒活疫苗、狂犬免疫球蛋白、流感病毒裂解疫苗、麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗、森林脑炎灭活疫苗（专业人员用）、无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗、吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b型、流感嗜血杆菌（结合）联合疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、重组B亚单位/菌体霍乱疫苗、重组乙型肝炎疫苗国内疫苗市场仍由一类疫苗为主导，由国家财政拨款购买，集中采购，下游需求比较稳定。二类疫苗市场主要由民营企业主导，毛利高、市场化竞争程度高。民营企业占比60%左右、国企占比在30%左右、外企占比在10%左右。一类疫苗与二类疫苗的批签发量比例约为：3：2疫苗新规国家规定2019年12月1日开始施行《中华人民共和国疫苗管理法》；疫苗法的实施，会带来哪些机会呢？在《疫苗管理法》中，有几点内容值得重点关注。疫苗上市流程疫苗生产流程疫苗生产原料是生物体，类似生物药，生产过程中难以控制变异可能；质量控制严格，要求10000级洁净室，100000级洁净室；疫苗主要针对健康人群及婴幼儿，因此疫苗的安全性、有效性、可控性、一致性要求比一般药品还要高。疫苗行业产业链疫苗行业的上游一般包括临床、流行病研究机构、基础研究机构或企业，还包括参与疫苗研发、生产的设备、培养基、化学试剂和药包材等制造企业疫苗行业的下游为符合国家相关法规的合格经销商、代理商，实施疾病预防和控制工作的各级疾控中心、医院、接种点最终端为普通消费者上市前的质量控制手段——批签发制度流通制度——一票制疫苗行业上游-疫苗供应主力军我国官方的疫苗生产历史从1919年北洋政府中央防疫处的建立开始；新中国成立后，国家分别在北京、上海、武汉、长春、兰州、成都、昆明成立生物制品研究所；2017年，七大所占据了国内疫苗批签发量的52%疫苗行业中游-疫苗的流通一类疫苗属于国家强制接种，由政府在省级平台统一采购，由生产企业直接配送至终端CDC。二类疫苗的采购在疫苗新规之后，纳入省级集中招标平台，生产企业只能通过省级交易平台将疫苗销售给县疾控中心,同时需要直接或者委托配送，配送环节要求全程冷链运输，疫苗流通全部实现一票制。疫苗行业下游-疫苗接种及接种群体2017年，专业公共卫生机构中，疾病预防控制中心3457个，总的机构人员数为19.1万人，其中：省级31个、市(地)级412个、县(区、县级市)级2773个。二类疫苗不属于强免范围，可自愿选择打或不打。凡是收费的疫苗都需要签名认可，方可接种。疫苗行业发展的驱动力驱动力一：疫苗品种驱动力二：接种人数疫苗行业特点特点一：疫苗行业无论从全球市场还是公司角度都是品种驱动型，都具有上市时的起步销售额较大（起步都在2亿美金以上）、年均复合增速在7%-10%的特点。疫苗技术代际的大跨越需要多学科的发展和支持，一般需要30-40年左右的时间完成积累，同一品类疫苗的再次创新和技术升级需要10-15年的时间，因此疫苗市场的竞争格局相对稳定新的重磅炸弹都是从技术和工艺积累颇深的企业里孕育而生。因此，疫苗行业具有较高的准入门槛和技术壁垒。超级重磅品种推动或是持续不断的多品类推陈出新，造就了辉瑞或GSK的巨头地位。特点二：特点三：疫苗品种规模的大小具有DT和ET的特点，即Disease Talks & Effectiveness Talks，发病率决定了赛道的宽度，效果（技术和工艺）决定了赛道的高度。发病率越高且疾病进展危害越大的疾病其疫苗市场规模也越大；疫苗保护率不能超过现有疫苗或保护率提升不明显，都不能成为真正的重磅品种。各疾病发病特点的差异，决定了疫苗市场的结构趋于“积木式”，而工艺和技术的积累又具有连续性，因而大品种只会从积累深厚的企业中诞生。疫苗与创新药现金流模式的差异经疫苗的消费属性不同于药品，大部分疫苗完成接种后不存在再次接种的必要，而一些重磅药品需要终生服药，因此药品对价格的敏感度会更高，随着价格下降其渗透率会提升、产品生命周期会延长。重磅疫苗不仅起始销售额远高于药品，而且会在上市早期纳入部分国家的计划免疫体系内，在10-15年内迅速达到销售峰值，直至新一代的疫苗出现，其销售额会快速回落，其疫苗的产品替代性较药品更加明显。对于测算若干年后某疫苗市场规模最关键的变量为渗透率，而渗透率的决定因素为是否纳入计划免疫范围、疾病的危害性和疫苗的有效性。全球疫苗市场格局全球疫苗市场高度集中。近年来，四大疫苗巨头（葛兰素史克、赛诺菲、默沙东、辉瑞）合计销售额占比维持在全球市场总额的80%以上。全球疫苗市场规模前瞻研究院数据预测：2018年全球疫苗市场规模约494亿美元。受全球对疫苗接种日益增加的需求、政府及国际机构的支持以及研发新疫苗的驱动，预计全球疫苗市场规模将于2030年达到1000亿美元，年复合增速为6.6％。中国疫苗行业现状国内疫苗行业同样有高准入、高投入、高周期、高收益、高毛利特征，是典型的“五高”行业。高准入壁垒、高研发投入和长耗时、生产的周期性，共同导致了行业的高成本，抬高了整个行业的门槛。我国疫苗市场目前整体规模偏小，2017年，国内疫苗市场规模达到250亿，占全球438亿美元的市场总额较小（8%），远小于我国人口占世界人口的比例（18%）近几年没有重磅产品出现，行业增长较慢，急需有重磅品种冲击市场。中国疫苗市场规模2017年中国疫苗市场规模253亿元，2013-2017年CAGR为6.2%其中，一类苗市场37亿，2013-2017年CAGR为-16.3%二类苗市场217亿，2013-2017年CAGR为14.9%灼识咨询预测：2030年我国疫苗市场规模1009亿元，CAGR为11.2%其中，一类苗市场33亿，2018-2030年CAGR为-0.8%二类苗市场976亿，2018-2030年CAGR为12.3%中国疫苗行业总结中国疫苗行业发展前景一类疫苗发展前景整体上看，国内规划免疫计划下的国家采购行为决定了一类苗的市场空间弹性有限。二类疫苗发展前景二类苗为可选消费品，其属性决定了产品的升级和丰富能够刺激市场的扩大，支付能力和更多的需求反过来促进品种的升级。目前，二类苗的竞争力一方面是安全性、顺应性上对传统一类苗的升级替代；另外是满足未被一类苗覆盖的新疾病领域。联合疫苗、多价苗、新型疫苗，这将是未来疫苗行业发展的重要方向。中国疫苗行业投资趋势一类疫苗投资空间一类疫苗由国家统一控制，免费供应，国家定价、政府招标采购的模式，定价低、毛利低。所以一类疫苗基本上处于垄断竞争的微利状态。一类苗基本由国企垄断，受制政策导向严重，市场化程度极低，基本不存在可预见的投资空间。二类疫苗投资空间国内二类疫苗赚钱能力极强，但由于疫苗属于国家管制商品，受限于政策，并不是完全由市场把控。二类苗行业竞争激烈，疫苗企业的销售费用均占到营收40%以上，国内疫苗企业在销售费率上有增无减。外资企业技术成熟、资金雄厚，品种多样性；国内二类疫苗竞争上优势不明显。只有自身技术过硬、销售能力强、资本雄厚的公司才会有机会成为中国的疫苗寡头。疫苗行业投资逻辑“短期看品种”，无论是整体疫苗市场还是公司的收入结构，都具有品种导向性，站在当下或面对未来，欲打造中国的“GPSM”需要有重磅品种面世或储备才具备持续成长性。监管趋严会使得市场集中度提高、“二八原则”也将在中国市场突显，强者恒强的逻辑将逐渐得到验证。“长期看工艺和技术”，具备产能和规模优势的企业，且工艺、技术持续积累的企业才有可能孕育新的品种，兼顾质控与创新。由于技术和工艺的延续性，除了看现有和即将上市的品种，从专利角度即可大致判断生产企业对于未来品种的储备和工艺积累的完成度。疫苗上市公司-智飞生物重庆智飞生物成立于1995年，2010年在深交所上市，是我国第一家在创业板上市的民营疫苗企业。主营业务为疫苗、生物制品的研发、生产、销售、推广、配送以及进口疫苗的代理销售等。智飞生物以代理疫苗起家，直销比例维持在 70%-80%。公司销售人员合计1792人，典型销售型企业。2007年开始，智飞生物自主研发的产品陆续上市，公司从疫苗代理企业逐渐转型为代理和自主研发同步发展的企业。股权结构男，1953年出生，桂林医学院大专学历，副主任医师，中国国籍；曾任广西灌阳县卫生防疫站副站长、广西计划免疫科、生物制品管理科科长、总经理等职务，现任智飞生物董事长、总经理，重庆市江北区人大代表。财务表现公司AC-Hib疫苗步入高速放量期，代理产品四价、九价HPV疫苗销售态势非常良好，五价口服轮状病毒疫苗获批，微卡报产，将与EC诊断试剂盒形成肺结核“诊断筛查+预防+治疗”全产品链布局，企业未来前景广阔。自研及代理产品核心产品——AC-Hib三联疫苗（自研）多联苗替代单苗的趋势势不可挡，替代效应逐渐显现。AC结合疫苗和Hib疫苗批签发量逐渐下降。AC-Hib三联苗于2014年上市，2015年正式销售，2018年销量约640万支，收入10亿元左右。财务预测：根据太平洋证券研究院预测，按照现有市场及替代效率，符合增长率25%计算，预计2022年AC-Hib三联苗销售将达到峰值，即1000万支，收入21亿人民币，贡献10亿净利润。需要注意！！！公司AC-Hib 疫苗于 2014 年 4 月 2 日获得原国家食品药品监督管理总局的药品注册批件（批件号：2014S00240），批准该产品注册，并颁发了药品批准文号（国药准字 S20140003），批准文号有效期5年。而2019年4月1日正是有效到期日。截止目前，公司还未拿到再注册批件，该产品从4月份开始已停产，目前无任何准确消息。核心产品——HPV疫苗（代理）人乳头状瘤病毒（HPV）是一种男女均可能感染的通过性传播、皮肤密切接触传播病毒，临床证明，99.7%的宫颈癌都是 HPV 感染所引起，不仅如此，85-90%的肛门癌、70-75%的阴道癌、30%的 外阴癌也与 HPV 感染密切相关目前，全球共有3种HPV疫苗。据智库推算，预计2020年我国HPV疫苗市场超过300亿。2017年5月，智飞获得默沙东的四价疫苗的独家代理销售权，2018年5月，获得默沙东的九价疫苗的独家代理销售权。公告显示，双方协议约定的 HPV 疫苗综合基础采购额为：2019年55.07亿元、2020年83.3亿元、2021年（6月30日前）41.65亿元。简单计算即可得出，未来3年，智飞生物从默沙东采购的HPV疫苗金额将达到180.02亿元。这也就是说，智飞生物的主营业务收入3年间，仅HPV基础采购就足以贡献180亿元营收，毛利近90亿元（50%的毛利率），净利润在50亿左右（净利润率28%），每年17亿，每股多增加1.4元的业绩，即便按照30倍的市盈率，新增股价近42元，接近翻倍。假设一：由于 GSK 批准的年龄段为 9~25 岁，且由于其产品为 2 价，我们认为其未来占比会很低，故暂不考虑2价疫苗的市场假设二：到 2023 年，5年左右时间存量，3亿左右的适龄人群累计接种率提高到10%（已知：我国HPV适龄人群免疫覆盖率约1%，远低于发达国家的60%-80%）假设三：5年时间内，国内外暂无可替代产品或者优化产品出现财务预测：默沙东HPV疫苗2019~2023 年销售量分别为 880 万支、1350 万支、1800 万支、2100 万支、2300 万支，4 价和 9 价 HPV 价格分别为 798 元/支和 1298 元/支，按照平均价1000元测算，则2019年~2023年HPV销售额分别为88亿、135亿、180亿、210亿和230亿元。其他重点产品——五价轮状疫苗人类轮状病毒(HRV)是导致全球儿童急性重症腹泻的主要原因，每年约有52.5万名五岁以下儿童死于腹泻病；全球90%的人类轮状病毒感染来源于G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8]五种病毒株，G1P[8]型最常见。市场情况：国内上市疫苗有两种，一是默沙东的五价轮状病毒疫苗RotaTeq，一是我国兰州的单价轮状病毒疫苗罗威特；智飞生物获得默沙东口服五价轮状病毒疫苗的独家代理权五价轮状疫苗作为远优于已有疫苗的品种，能迅速替代已有疫苗（已有疫苗销售近10亿）预测：未来2-3年内，疫苗每年贡献收入超20亿在研管线及进度在研重磅产品-母牛分枝杆菌疫苗结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，80%发生在肺部，是全球前10位死因之一；市场情况：对于预防结核病市场尚无有效的疫苗，已有的卡介苗只对儿童重症结核病和严重肺外结核病具有保护作用，不能预防原发性感染 (首次感染结核杆菌)，更重要的是不能预防肺部潜伏感染(隐性感染)；2018年4月，智飞的母牛分枝杆菌疫苗(结核感染人群用)申请新药生产注册获得受理，并于2018年6月正式纳入优先审评。8部门联合印发《遏制结核病行动计划(2019—2022 年)》假设一：按照1500万新生儿数量测算，则对应小学、初中、高中、大学(本科+研究生) 新生入学人数在 5300万左右；假设二：到2023年覆盖新生入学人数为20%，即1060万人，结核杆菌感染率 18%的比例，即筛查出结核杆菌携带者191万人，假设接种率60%；假设三：按照目前的6 支/人份，300元/支；预测：未来2-3年内，结核疫苗每年贡献收入超10亿，利润超4亿在研重磅产品-重组结核杆菌融合蛋白（诊断试剂）产品进度：与公司母牛分枝杆菌疫苗同步研发，该产品于2013年8月开展III期临床，并于2018年9月申请新药生产注册获得受理。诊断试剂市场情况：世界卫生组织 2014及2017版《潜伏结核感染管理指南》建议使用γ -干扰 素释放试验(IGRA)或结核菌素皮试(PPD)检测结核潜伏感染，而前者操作复杂、价格昂贵不适合大规模人群筛查和贫困地区使用，后者难以鉴别卡介苗接种与结核杆菌感染特异性差异。二级市场表现市盈率（简称P/E或PER），也称“本益比”、“股价收益比率”或“市价盈利比率（简称市盈率）”。是衡量企业估值的重要指标。三家企业对比发现，智飞生物的市盈率（动）及市盈率（TTM）均最低。自身对比，智飞生物的市盈率处于历史低点。净资产收益率是衡量一家企业是否赚钱的重要的指标。代表企业的净资产有多少是转化为了公司利润。三家企业在近三年的净资产收益率总体是一个上升的趋势。随着智飞生物这两三年自研疫苗和代销疫苗业绩的大幅增长，ROE净值和增速都是最大的。其次，对ROE进行分解，来看其盈利是靠什么因素驱动的。净资产收益率=营业净利润率*总资产周转率*权益乘数；营业净利润率=净利润/营业收入；利润空间总资产周转率=营业收入/资产总额；赚钱快慢权益乘数=1/（1-负债总额/资产总额）；杠杆高低一家企业的经营情况好不好，赚了多少钱，除了看营业收入、净利润等利润表的数据外，更重要的要看现金流量表。这是体现企业的钱流向了哪里，花在什么地方；钱回来了多少，都是什么钱。很多时候看现金流量表的重要性要超过利润表，后者只是结果，而前者是内在逻辑。经营现金流净值为正，说明公司通过开展业务能够收回现金，可以不断再投入;投资现金流净值为负，说明公司有多余现金可以进行对外投资;筹资现金流净值为负，说明公司有多余现金可以对外支付利息、现金分红;因此，公司近两年的现金流健康。智飞生物最近两年的经营现金流净额和净利润的比值均小于1，且有所下降。说明其经营现金流的增速，赶不上净利润的增速。营业成本大幅增长：其营业成本的增加主要为代理生物制品的采购成本。2016-2018年，营业成本中采购成本由2.25%增加到96.54%。营业收入大幅增长：其营业收入的增加主要为代理二类苗的收入。2016-2018年，营业收入中二类苗的代理收入由0.66%增加到74.36%。营业成本增速显著大于营业收入增速综上，2017年开始，智飞生物业务类型转变，其代理销售为主的业务模式不同于可比公司的自研销售，因此，毛利率的变化趋势也不相同。这不但不影响智飞生物的ROE和其他三家一样逐年大幅上涨。相反，其净利润的增速，远远大于净资产的增速，ROE持续稳步走高。企业运营能力主要看两个指标：应收账款周转天数、存货周转天数，这两个指标主要体现企业应收账款变现速度和存货变现速度。从上表可以看出，智飞的应收账款周转天数和存货周转天数近三年大幅缩短。相比其他三家来看，其存货变现速度和应收账款回现速度在逐渐加快，具有显著优势。说明公司的资产运转效率高。总结ENDIVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛议程曝光点击图片查看，大会火热进行中，明天精彩继续：戳这里，阅读原文立即领取免费参会入场券

中文摘要近年来，过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面展现出了显著的临床效果。T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是临床常用的过继性免疫细胞，并且在淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗中已经取得了良好的效果。通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）催生了CAR-T和CAR-NK细胞疗法。CAR-T和CAR-NK细胞可高效识别肿瘤抗原且肿瘤细胞杀伤效果较好，在多种癌症研究中均有满意的结果，已经成为一个炙手可热的领域。此文对基于CAR修饰的免疫细胞疗法的发展与应用进行概述，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。正文1细胞免疫治疗肿瘤生物治疗是一种新兴肿瘤治疗模式，主要包括肿瘤免疫治疗、溶瘤病毒治疗、干扰小RNA技术疗法等。肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤，比传统的肿瘤治疗方法更加安全并且具有特异性，对晚期肿瘤具有显著的疗效。肿瘤免疫治疗包括4大类：过继性细胞免疫疗法、肿瘤疫苗、非特异性免疫刺激以及免疫检查点单克隆抗体。其中过继性细胞免疫疗法是目前研发热点，也是肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之一，其具体过程是通过对自体或异体免疫细胞进行体外激活或基因修饰，扩增出足够的具有抗肿瘤活性的免疫细胞后回输给患者。过继性免疫细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）细胞、淋巴因子激活的杀伤（lymphokine-activated killer，LAK）细胞、细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）等几大类。将免疫细胞的杀伤活性与抗体的特异性相结合，通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）使其靶向表达特定抗原的肿瘤细胞，推动了CAR-T和CAR-NK细胞疗法的发展。CAR是CAR-细胞的核心部分，它使细胞能够不依赖于HLA而通过CAR结构识别更广泛的肿瘤靶抗原。CAR基本结构包括肿瘤相关抗原结合域、通常来自单克隆抗体的抗原结合区域的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）、胞外铰链域、跨膜域和胞内信号域。scFv可以与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，这决定了 CAR结构的特异性。铰链域是细胞外区和跨膜域之间的连接序列，它给予CAR充分的定向性和灵活性来与肿瘤抗原结合，会影响CAR-细胞的活性。跨膜域位于铰链和胞内信号域之间，包括CD3 HLA-A2或CD28。胞内信号域的结构决定了CAR-细胞激活信号的强度，其中包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。目前最经典的胞内结构域是CD3 ITAM的激活区。为了提高CAR修饰的效应细胞的增殖和细胞毒作用，可在胞浆尾部加入共刺激蛋白受体，如CD28、4-1BB、CD134、ICOS等。针对CAR结构的研究除了选取合适的靶向位点scFv，很多研究专注于作为CAR-细胞功能关键区域的胞内信号域，目前已经发展了4代。第1代CAR介导的细胞激活仅通过CD3ζ链完成，抗肿瘤活性有限。第2代CAR在胞内结构域中增加了1个新的共刺激信号，包括1条CD3ζ链和1个共刺激分子对CD3ζ链的信号进行放大，并与其具有相同的抗原特异性，增加了细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡蛋白的分泌。广泛使用的共刺激分子有 CD28、4-1BB和 CD134（OX40）等。第3代CAR包括1条CD3ζ链和2个或2个以上不同的共刺激分子，使其抗肿瘤效应进一步提高。第4代CAR则通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-细胞的疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-细胞活性，必要时激活使CAR-细胞凋亡，防止对自体造成损害。CAR结构在免疫细胞中的广泛应用，引导免疫细胞特异性靶向识别肿瘤抗原并介导免疫细胞的激活，从而提高了过继性免疫疗法的适用性和有效性。CAR-细胞对血液肿瘤的治疗具有良好的效果，在实体肿瘤的治疗上也取得了一定的进展，表1中列出了近期CAR-细胞治疗的临床研究。本文对CAR-细胞疗法发展与现阶段应用进行概述，并对不同种类的CAR-细胞治疗的特点及优势进行总结，分别介绍了各自的潜力及应用，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。2CAR修饰的T细胞2.1CAR-T细胞概述T细胞在细胞介导的免疫应答中起着关键作用，参与监测和杀死肿瘤细胞或潜在的恶性细胞。基于T细胞的过继免疫疗法治疗恶性肿瘤，特别是血液病癌症效果显著。这种新出现的治疗包括3个模型：TIL、T 细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的T细胞（TCR-T）和CAR-T。与CAR-T疗法相比，前两种技术并没有对T细胞本身进行大的修饰，疗效并不显著，较低的成功率以及对疫苗的依赖也限制了它们的发展。作为一种很有前途的过继免疫治疗方案，CAR-T细胞疗法已接受了超过25年的时间考验，能够识别和消除特定的癌细胞，独立于 MHC。现阶段全球范围已开展的临床试验以第2代CAR-T为主，以CD28或CD137共刺激域构成。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持得更久。此外，由于CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部，因此主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效。第4代CAR-T细胞在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，以达到增强杀伤实体瘤的效果。2.2CAR-T细胞在抗肿瘤治疗中的应用美国FDA共批准了 5款CAR-T细胞产品上市，分别是瑞士诺华公司的Kymriah用于治疗急性B 淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）、美国吉利德公司的Yescarta用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）以及Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、美国百时美施贵宝公司的Breyanzi用于治疗复发或难治性（ralapsed/refractory，R/R）大 B 细胞淋巴瘤（R/R large B cell lymphoma，R/R LBCL）、美国百时美施贵宝公司和Bluebird Bio公司共同研发的Abecma用于治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。中国有2款CAR-T细胞产品获批上市，分别为上海复星凯特生物科技有限公司的阿基仑赛注射液用于治疗成人R/R LBCL、上海药明巨诺生物科技有限公司的瑞基仑赛注射液用于DLBCL。上述产品中除Abecma为APRIL靶点外，其余都是CD19靶点。随着大量临床研究的开展，针对不同靶点的CAR-T细胞还有望应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）、MM及实体瘤等。目前治疗ALL，特别是高病死率的R/R B-ALL最适合的方法就是CAR-T细胞治疗，其中最有效的是抗CD19抗体CAR，CD19是B细胞的重要生物标志物，在B-ALL中有较高的表达。尽管CD19是CAR-T细胞治疗ALL的理想靶点，但研究发现“抗原逃逸”是免疫疗法发展的潜在障碍，当务之急是进行优化，包括识别其他靶点。CD22是CAR-T细胞的另一个潜在靶点，2种不同的抗CD22药物已经在临床试验中用于治疗B-ALL，以弥补抗CD19治疗的不足。由于CLL发病机制导致早期免疫缺陷，因此CAR-T细胞治疗的疗效受到来自CLL患者的T细胞体外扩增困难及体内增殖反应的限制。Ibrutinib是一种不可逆的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，它不仅可以避免对T细胞的负面影响，还可以提高其抗肿瘤能力。有研究表明，5个周期的Ibrutinib治疗增强了靶向CD19的第2代CAR-T细胞（CTL019）的扩增，并降低了程序性细胞死亡蛋白1在T细胞上的表达；同时增加了 B细胞中CD200的表达，而CD200/CD200受体在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。CAR-T细胞是治疗R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）的最新免疫疗法，除抗CD19 CAR-T细胞外，4次跨膜蛋白CD20出现在90%以上的BCL中，是公认的NHL治疗靶点。目前，第1代抗CD20 CAR-T细胞治疗已经在一些研究中使用。CD30是TNF受体（TNF receptor，TNFR）超家族的成员，也可以作为淋巴瘤治疗的潜在靶点。在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）中，它是Ki-1抗体的抗原，与里德-斯德伯格细胞结合。CD30阳性淋巴细胞主要分布在淋巴组织的滤泡区周围，而在生发中心不常见。对于淋巴瘤，CD30在经典的HL、间变性大细胞淋巴瘤、DLBCL、原发性纵隔BCL和外周T细胞淋巴瘤中表达。有研究报道，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的R/R HL患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。MM是一种骨髓来源的难治性恶性肿瘤，由于骨髓瘤的异质细胞遗传学和分子异常原因，这种疾病仍然无法治愈。膜蛋白CD138属于硫酸肝素蛋白聚糖的Syndecan家族，在恶性和分化的浆细胞表达，也存在于肿瘤、成熟的上皮细胞和其他正常组织中。由于CD138在几乎所有MM患者中都有表达，因此被用作主要诊断标志物。临床试验结果显示，使用第2代抗CD138 CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者后，4例病情稳定，1例晚期浆细胞白血病患者外周血骨髓瘤细胞减少，这表明CAR-T细胞已经进入骨髓。由此可见，抗CD138 CAR-T细胞治疗MM具有良好的耐受性和潜在的抗肿瘤免疫效果。2.3CAR-T细胞面临的挑战CAR-T细胞治疗面临的主要问题是如何提高过继性细胞的有效性和持久性，以及减少治疗的不良反应。为了增强治疗效果，可以通过添加新的共刺激域或CAR部分来提高CAR-T细胞的有效性和持久性。糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR）即CD357和4-1BB都是核因子-κB诱导的TNFR超家族成员，而GITR是组成性表达于T细胞的共刺激分子，添加该结构域或结合CD28和4-1BB可以进一步增强T细胞的作用。对于淋巴瘤、MM和其他类型的恶性肿瘤中存在的抗原逃逸或多种肿瘤抗原共存现象，重建CAR部分是一种新的方法。双特异性CAR-T细胞是很有前途的治疗方法，它包括2种形式：（1）1个CAR由2个不同的scFv组成（TanCAR），或者2个不同的CAR在1个T细胞上连接不同的scFv（双信号CAR）；（2）依次或同时注入不同类型的CAR-T细胞池。此外，使用带有趋化因子基因的溶瘤病毒招募CAR-T细胞，可延长它们的持久性并直接攻击肿瘤细胞。这是一种很有前景的方法，可用于血液系统恶性肿瘤的检测。溶瘤病毒可以感染宿主，复制并破坏某些肿瘤细胞，而不伤害正常细胞。有证据表明，肿瘤细胞可以通过MHCⅠ在其细胞质中整合呈递新病毒蛋白，被CD8+ T细胞识别和摧毁。使用黏液瘤病毒、5型腺病毒和柯萨奇病毒A组21型等病毒杀灭这种类型的肿瘤细胞的应用已在MM中报道。在CAR-T细胞治疗过程中，避免失控的T细胞增殖、细胞因子风暴或靶向/非靶向肿瘤效应至关重要，可以激活自杀基因（也称为消除基因）系统来破坏注入的CAR-T细胞，调节CAR-T细胞的扩增并限制毒性。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因治疗在同种异体造血干细胞背景下已经显示了其安全性和有效性；其他非免疫原性自杀系统，如经过修饰的内在凋亡途径中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9，Cas9）也已经被开发出来。然而，这种自杀策略是通过彻底消除CAR-T细胞来缩短治疗时间。“可转换的”CAR-T细胞弥补了这个缺陷，通过在scFv和T细胞表面之间插入一个小的分子复合物来启动细胞功能并通过停止添加它来关闭细胞功能。另一种切换细胞开启和关闭的方法是设计可溶性细胞间分子，包含肿瘤抗原特异性抗体，通过改变中间分子的浓度来改变细胞功能。CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病，特别是ALL、CLL和淋巴瘤取得了很大的进展，而有效性、细胞持久性和不良反应成为广泛应用的瓶颈，需要更加创新的实验室研究来加强该疗法的有效性。3CAR修饰的NK细胞3.1CAR-NK细胞概述NK细胞是机体内天然免疫系统的核心细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的识别不依赖于MHC的表达，而是依赖于其表面杀伤细胞激活受体和杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR）间的动态平衡。当NK细胞表面的KIR识别出自身MHCⅠ的时候，NK细胞会主动失活，保护宿主细胞不受误攻击；在MHCⅠ改变、缺失或表达较低的肿瘤细胞中，KIR介导的抑制作用减弱，NK细胞以“缺失自我标记”为靶点对肿瘤细胞造成杀伤。NK细胞的杀伤作用主要体现在，NK细胞可以直接释放穿孔素和颗粒酶B，执行诱导靶细胞凋亡的作用；同时，NK细胞可以分泌大量细胞因子，如TNF-a、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN-γ、IL-3等，对靶细胞起到直接作用，或激活其他种类的免疫细胞对靶细胞进行攻击；NK细胞还能表达Fas配体和TNF相关调亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡；最后，NK细胞通过其表面CD16与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合从而发挥抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）作用。除了具有强大的杀伤功能外，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，分泌多种共刺激分子，募集和激活其他免疫细胞，如DC和巨噬细胞，间接帮助消灭靶细胞，从而调节机体的免疫状态和免疫功能。目前NK细胞所用CAR结构大多沿用自CAR-T细胞。大多数CAR-NK细胞使用CD3-ITAM作为信号转导区域进行信号转导，并利用CD3-ITAM启动NK细胞杀伤。CD3ζ二聚体可以传递来自CD16的信号，从而有助于ADCC作用。除单一的CD3型ζ链之外，胞内信号区还包括共刺激结构域，如CD28、CD137（4-1BB）或CD244（2B4）等分子，具有很好的信号转导效应，有助于CAR-NK细胞的杀伤作用。不同的共刺激分子对NK细胞的作用也不同，如在ALL异种移植小鼠模型中，CD244对CAR-NK92细胞的刺激作用强于CD137，可以募集并激活酪氨酸激酶启动激活信号，可能更适合作为CAR-NK细胞的胞内信号域。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有多种优势。首先，NK细胞易分离，寿命较短，体内转移的CAR-NK细胞不易过度增殖，导致移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）的风险低。其次，NK细胞分泌的细胞因子主要包括IFN-γ和GM-CSF，比活化CAR-T细胞释放的细胞因子如TNF-а、IL-6、IL-2、IL-8 等更加安全，这些由CAR-T细胞产生的促炎细胞因子可能导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性。除了以CAR依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还能以CAR非依赖的方式消除癌细胞，发挥自身天然的杀伤肿瘤细胞的活性，如通过激活NK细胞受体NCR、NKG2D、共刺激受体DNAM-1（CD226）和某些激活的KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4 ）等上调被激活。其次，CAR-NK细胞可以通过表面的CD16介导ADCC作用清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞拥有CAR依赖和NK细胞受体依赖的双重杀伤机制，可以有效根除一些不表达CAR所靶向抗原的异种肿瘤。最后，NK细胞可从PBMC、NK细胞系和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等中直接获取，价格更加便宜。CAR-NK细胞中的NK细胞可以从多种来源大规模生产，包括NK-92细胞系、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、CD34+ 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）和iPSC。目前大多数CAR-NK细胞的临床试验使用的NK92细胞系在体外具有无限的增殖能力，对反复冻存、解冻的敏感性降低，使生产时间更短，成本更低。然而，NK92细胞系为肿瘤细胞系，具有潜在致瘤风险，缺乏CD16和NKp44的表达，且在输注前需要辐照而失去体内扩增潜力。PBMC是NK细胞的重要来源，GVHD风险低，可以从健康捐赠者PBMC中分离出足够数量的NK细胞，其中90%是成熟表型的CD56dimCD16+ NK细胞，细胞毒作用更强但增殖能力下降，且这种来源的CAR-NK细胞无需辐照处理。同样的方法也适用于从UCB分离NK细胞。UCB的优势是可以选择具有特定HLA类型和特定NK细胞受体特征的供者。然而，UCB单位体积有限，NK细胞数量较少、表型不成熟，黏附分子CD16、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，NKG2A等抑制受体表达增加，使获取足够数量的临床级NK细胞成为挑战。同时，PBMC和UCB来源的CAR-NK细胞由不同供者提供，使产品很难标准化。从CD34+ HPC中分化NK细胞是获得大量临床级成熟NK细胞的另一种途径。CD34+HPC可以从骨髓、胚胎干细胞或UCB中分离，在培养系统中扩增和分化为成熟的NK细胞。除上述来源外，iPSC由于可以更有效地设计以稳定表达CAR而成为新兴的CAR-NK细胞来源，从单个CAR-iPSC细胞出发就足以分化为大量高度同源的CAR-NK细胞产品用于临床，为CAR-NK细胞提供了一种可再生的来源。然而，与UCB NK细胞类似，iPSC来源的NK细胞通常表型不成熟。3.2CAR-NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用使用非CAR工程化的NK细胞进行免疫治疗已显示出良好的效果，而用基因工程化的CAR-NK细胞可以提高临床疗效。在恶性淋巴肿瘤的临床研究中，CD33和CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的靶点。Tang等首次将CAR-NK-92细胞应用于临床试验。他们构建了包含CD28和4-1BB共刺激分子在内的第3代慢病毒载体，并在CD33的scFv和CD28之间插入Fc片段来检测转导的CAR-NK细胞。用上述构建的CD33-CAR载体转导经改造的能够表达IL-2的NK-92-MI细胞，并确认转导效率达90%以上。经过符合GMP级生产要求的细胞转导与培养后，CD33-CAR-NK-92细胞在体外对人早幼粒白血病细胞系HL-60展现了良好的杀伤作用。接着，他们对3例R/R急性髓系白血病（acute myloid lymphoma，AML）患者进行挽救化疗，没有观察到明显的不良反应，证明以5×109个CD33-CAR-NK-92细胞剂量进行输注并辐照是安全的。输注后，患者的血液中能够检测到CAR-NK-92细胞。Liu等对11例R/R NHL或CLL患者进行了UCB来源的HLA不相合的抗CD19-CAR-NK细胞治疗。将携带抗CD19、CD28跨膜区和CD28ζ信号内域的scFv的逆转录病毒载体与人IL-15基因和可诱导的Cas9自杀基因结合，导入UCB来源的NK细胞。体外扩增CAR-NK细胞，并在淋巴清除化疗后对患者进行一次性输注，未观察到明显的GVHD和CSF。在接受治疗的11例患者中，8例恶性肿瘤有一定程度的缓解，其中7例得到完全缓解。输注后的CAR-NK细胞可以扩增并维持一定水平至少12个月。这些已应用于临床的CAR-NK细胞治疗方案展现了 CAR-NK细胞对B细胞系恶性肿瘤的抗癌作用是有效且安全的，且疗效均强于非CAR-NK细胞治疗。临床前研究表明CAR-NK细胞具有很强的抗肿瘤功能，但在实体瘤中的临床应用尚处于起步阶段。目前有多项临床前试验研究CAR-NK细胞疗法治疗多发性实体瘤的疗效，如神经母细胞瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等。Liu等用表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为治疗三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的靶点，研究了EGFR-CAR-NK细胞在体内外对TNBC细胞的杀伤作用。将抗EGFR scFv的DNA片段克隆至带有CD8较链、CD28跨膜区域、4-1BB和CD3ζ胞内信号域的第3代CAR慢病毒载体中，并转导NK细胞。结果表明，EGFR-CAR-NK细胞可以被表达上调的TNBC细胞激活，并在体外特异性地触发TNBC细胞的裂解，并对小鼠体内乳腺癌细胞来源的异种移植和患者来源的异种移植肿瘤均有抑制作用。除此之外，EGFR-CAR-NK细胞可通过同时触发TNBC细胞凋亡来提高疗效，表明EGFR-CAR-NK细胞对治疗TNBC是有潜力的治疗策略。Cao等也以间皮素（mesothelin，MSLN）作为治疗胃癌的靶点，将抗MSLN 的 scFv （NKG2D跨膜区，结合 2B4-CD3 胞内信号结构域）克隆到慢病毒载体中，并转导NK-92细胞得到MSLN-CAR-NK细胞。结果表明，MSLN-CAR-NK细胞在体外对MSLN阳性的胃癌细胞具有特异性杀伤作用。此外，与非CAR工程化的NK-92细胞和CD19-CAR-NK细胞相比，MSLN-CAR-NK细胞可分泌更强的细胞因子，并可以有效清除小鼠体内皮下和腹膜肿瘤模型的胃癌细胞，对异种移植的胃癌具有较强的抗肿瘤和NK细胞浸润能力，显著延长了小鼠的存活时间，证明针对胃癌的MSLN靶点是非常具有潜力的。CAR-NK细胞具有很大的临床应用潜力，进一步的研究正在将CAR-NK细胞治疗的临床前结果转化至临床。3.3CAR-NK细胞面临的挑战CAR-NK细胞疗法是近年来发展起来的一种治疗肿瘤的免疫治疗方法，尽管在临床前研究中取得了不错的进展，但CAR-NK疗法的临床应用仍处于起步阶段，并面临着一些挑战。我们希望通过对当前挑战进行阐述，并讨论未来的改进方法，以改善临床环境下的CAR-NK的治疗结果。NK细胞的扩增是CAR-NK细胞生产的重要步骤之一，需要大量的CAR-NK细胞才能达到最佳的临床疗效，因此产生足够数量的NK细胞仍然是CAR-NK疗法的主要挑战。多种细胞因子，如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18等已被用于体外扩增原代NK细胞，但效果有限，而在开发出合适的人造APC（artificial APC，aAPC）后可以特异性并大量扩增NK细胞。Shah等使用以K562为基质表达膜结合型IL-21的aAPC在14 d的NK细胞共培养中，使UCB NK细胞的平均扩增倍数达到了2 389倍，而仅添加IL-2的NK细胞在14 d的培养中平均扩增倍数只有20倍，表明aAPC在NK细胞扩增中具有显著的促进作用。而在Denman等的研究中，膜结合型IL-21的K562还可以延缓NK细胞的端粒缩短，而端粒缩短情况也被认为是限制NK细胞分裂能力的重要因素之一。为获得足够数量的NK细胞用于CAR转导，需要开发更多、更有效的临床级别体外扩增方法。除了扩增的挑战外，CAR-NK细胞的CAR结构以及转导过程仍面临诸多问题，同时也有很多研究正在努力解决这些挑战。由于CAR结构最先用于T细胞，而针对NK细胞的CAR最优结构的设计尚未被系统地研究。CAR结合表位的位置及其与NK细胞表面的距离可能影响与抗原的结合、免疫突触的最佳形成和CAR-NK细胞的激活，同时不同来源的NK细胞对共刺激信号要求也不尽相同。Li等通过表达特制的CAR结构，能促进由iPSC分化的NK细胞的激活，这种含跨膜NKG2D和胞内2B4结构域的构建体比CAR-T构建体性能更好。因此，针对NK细胞独特的激活受体和信号激活蛋白而定制的基于NK细胞的CAR结构潜力巨大。除此之外，目前所开发的CAR大多针对癌细胞上差异表达的非突变自身抗原，导致CAR可能与正常组织上表达的抗原非特异性结合，对健康组织也造成损害。针对这一问题，可以导入自杀基因，如诱导型Cаs9，控制CAR活性剂量；也有研究指出，如果2个单独的结构或2个胞外结构域以串联形式结合，产生双特异性CAR，细胞毒性会有效降低；split CAR构造，使用小分子的二聚化以形成功能单元。而在转导过程中，目前主流的导入CAR的方式为逆转录病毒转染。但这种方法依赖宿主细胞的分裂，NK细胞在未激活时转导效率会下降。同时，逆转录病毒转染后可能存在遗传毒性，并可能触发相关机制使NK细胞凋亡。针对这一问题，有研究指出可以使用RNA工程，NK细胞的存活率和转染效率会更高。CAR-NK细胞治疗作为一种新的过继免疫治疗手段具有巨大的潜力和可行性，但仍存在许多问题需要解决。如果这些问题得到解决，CAR-NK细胞疗法将成为对抗肿瘤的强大手段。4以iPSC为平台生产CAR-T/NK细胞4.1iPSC概述2006年，山中伸弥团队在小鼠胚胎和成人成纤维细胞中诱导多能性的4个转录因子一Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc，实现了体细胞向多能干细胞的重编程。iPSC可在体外无限扩增，并且理论上可分化成任何细胞类型，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，同时避开了伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，是细胞疗法的理想细胞来源。iPSC体外培养时如果通过构建合适的环境，模拟体内发育过程，理论上可分化成任何细胞类型，包括T细胞和NK细胞。iPSC衍生的T/NK细胞能够为临床治疗提供同质且基因明确的细胞群体，消除了使用外周血或UCB来源的T/NK细胞时供者间的差异。此外，通过使用各种基因编辑技术，如病毒载体、转座子或成簇规律间隔短回文重复序列Cas9系统，可以对未分化的iPSC进行遗传操作以产生均一的目标细胞群细胞如CAR-T/NK细胞，这些优势使iPSC衍生的细胞成为“现货型”细胞疗法的理想细胞群。4.2iPSC衍生的CAR-T/NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用2013年，Sadelaint团队用编码二代抗CD19-CAR的慢病毒载体转导外周血淋巴细胞来源的iPSC，收获的iPSC-CAR-T细胞表现出与CAR-TCR-γẟ外周血淋巴细胞类似的抗肿瘤活性。Kanfman团队用iPSC生产的NK细胞表达的激活和抑制受体与外周血NK细胞相似，并且在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤和抗病毒活性。为了提高CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，2018年，Kanfman团队构建了具有NK细胞特异性激活域（NKG2D-2B4ζ）的CAR-NK细胞并以PiggyBac转座子为载体将其编码基因整合至iPSC，所收获的NK-CAR（NKG2D-2B4ζ）-iPSC-NK 细胞显示出与外周血NK细胞和未修饰的iPSC-NK细胞相似的表型，并且比 T-CAR（CD28-41BBζ）-iPSC-NK细胞表现出更高的抗肿瘤活性。美国Fate Therapeutic公司以iPSC为平台生产的CAR-NK细胞和CAR-T细胞产品均已进入Ⅰ期临床研究。FT596是由iPSC衍生的CAR-NK细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT596还表达高亲和力且不可清除的CD16受体以增强ADCC，及IL-15受体融合蛋白以增加CAR-NK细胞的体内存活时间。目前公布的Ⅰ期临床试验结果显示，在接受FT596治疗的14例R/R BCL患者中，10例（71%）患者获得客观缓解，其中7例（50%）获得完全缓解。安全性方面，数据显示FT596疗法耐受性良好，未观察到神经毒性综合征、GVHD等。除了FT596外，该公司的FT500、FT516、FT538和FT576均为由iPSC衍生的NK细胞产品且都已进入Ⅰ期临床研究。FT819是首个由iPSC衍生的CAR-T细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT538完全消除了内源性TCR的表达以及GVHD。临床数据显示，FT819在体内对表达CD19的白血病和淋巴瘤细胞系具有抗原特异性的细胞毒性，与健康的供体来源的CAR-T细胞相当；骨髓评估显示，FT819能够在体内持续存在并继续表现出肿瘤清除能力。iPSC细胞系作为一种可再生细胞来源，能够大规模生产高质量的同种异体CAR-T/NK细胞，具有更高的产品一致性、现货供应和更广泛的患者可及性，有望成为未来细胞疗法领域的重要方向。4.3iPSC衍生的CAR-T/NK细胞面临的挑战iPSC衍生的NK细胞和T细胞在近几年发展迅速，提供了可以即取即用的产品，能够极大降低肿瘤免疫治疗的成本，形成一种可以提前生产、储备，具有可预期疗效的免疫细胞治疗产品。iPSC衍生的细胞治疗产品从科研端走向临床仍面临着诸多新的挑战。其中，能够在临床应用需要克服的重要挑战之一是确立符合临床使用要求的有效细胞分化策略。虽然在基础科学研究中，已经有多项实验报道可以将iPSC成功分化为T细胞和NK细胞，然而很多分化方案仍然使用了血清和滋养层细胞，存在外源因子污染的安全性风险，不符合各国药典规则。iPSC的分化策略直接影响到最后生成的T细胞或者NK细胞的表型是否与人体中自然产生的细胞相同，不同企业或机构最后生产出的细胞产品性状很可能大不相同。此外，iPSC具有无限增殖的潜力，如果未分化的iPSC被输入到患者体内，可能具有产生肿瘤的潜力。因此，需要设定安全检查或者基因工程改造策略，将这一风险最小化。目前，对iPSC衍生的细胞治疗的功能陈述还没有建立统一的标准，如何规范基于iPSC衍生的细胞治疗产品工艺的稳定性也是目前亟需解决的问题。5CAR修饰的其他免疫细胞由于肿瘤微环境（tumor micro-environment，TME）和缺乏特异性靶向肿瘤抗原，CAR-T细胞在实体瘤中的应用仍然受到严重限制，除了 NK细胞，目前针对许多实体瘤的新策略是将CAR应用到巨噬细胞、DC和CIK细胞中。巨噬细胞M1表型具有促炎和抗肿瘤活性，在2类实体瘤异种移植小鼠模型中，CAR-巨噬细胞靶向MSLN或人表皮生长因子受体2，在人红白血病细胞中表现出抗肿瘤吞噬活性，降低了肿瘤负荷，并延长了总生存期；TME中的另一个关键作用细胞是起APC作用的DC，它可以启动幼稚T细胞并重新激活记忆应答，并与细胞毒性CD8+细胞交叉呈递，促进更强的抗肿瘤应答，Suh等用4-1BB抗CD33的CAR转导了 DC，在AML模型中对其进行了测试，经CAR-T/CAR-DC治疗的小鼠AML的负担明显减少，存活率也随之增加；CIK细胞也是备受关注的一类效应细胞，其具有经典NK细胞以及CD4+和CD8+ T细胞的共同特征，可以通过多种受体识别病原体，人表皮生长因子2-CAR-CIK细胞可完全消除人肺泡横纹肌肉瘤，而野生型CIK细胞仅能实现部分肿瘤生长抑制，而且使用CAR-CIK细胞没有严重CRS或GVHD的迹象。癌症的免疫编辑和耐药性在抗癌免疫疗法中十分常见，许多癌症通过失去MHCⅠ抗原呈递机制来逃避免疫控制，高达50%的ALL和LBCL患者中都发现CD19丢失引发的免疫逃逸，这些患者在抗CD19 CAR-T细胞治疗后复发。与自体CAR-T细胞产品中的主要细胞类型αβ T细胞不同，γẟ T细胞具有先天和适应性免疫系统的特性，它们可以以不依赖MHC的方式发挥作用，具有多种杀伤机制，并将抗原交叉呈递给αβ T细胞，靶向二唾液酸神经节苷脂2（ disialoganglioside 2，GD2）的γẟ CAR-T细胞能够向肿瘤细胞迁移和抗原交叉呈递，并增强了GD2在癌细胞系中的特异性杀伤，在另一项研究中，Rozenbaum等证明γẟ CAR-T细胞能够靶向那些失去C19（即抗原阴性）的CD19白血病细胞。记忆性T细胞和Treg作为免疫细胞，因其不会引起GVHD，也被CAR修饰后用于免疫治疗。Fernandez等构建表达NKG2D的CAR-记忆性T细胞，可以靶向清除表达NKG2D配件的骨肉瘤细胞，也是一种很有前途的骨肉瘤免疫治疗方法；Treg是一种能抑制传统T细胞和其他免疫细胞功能的T细胞亚群，针对其免疫抑制特性，目前也已开发CAR-Treg疗法治疗移植排斥以及一系列自身免疫性疾病。6展望过继性细胞免疫治疗是近年来发展迅速的一种个性化免疫治疗方法。而通过基因工程改造的方式对过继性免疫细胞进行CAR修饰，进一步提高了其识别肿瘤抗原的能力和对肿瘤细胞的杀伤效果。其中CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病特别是ALL、CLL和淋巴瘤方面取得了很大的进展，但有效性、细胞持久性和不良反应成为这种方法广泛应用的瓶颈。因此很多研究尝试用CAR修饰其他免疫细胞来代替T细胞，从而提高对实体瘤的治疗效果，同时减轻不良反应。其中，CAR-NK细胞由于杀伤能力强，导致移植物抗宿主病的风险低，同时只会引起较轻的细胞因子风暴和神经毒性不良反应，是除CAR-T细胞外研究最多的CAR修饰的免疫细胞。其他相关技术如以iPSC为平台生产T/NK细胞，CAR修饰应用到巨噬细胞、DC细胞和CIK细胞中以治疗实体瘤等方面均取得了较大突破。CAR修饰的免疫细胞治疗研发具有广泛的应用前景，但有很多问题需要解决才能用于临床治疗，需要进行更多的创新工作研究。作者徐瑞升  陈玉莹  李奇林  谭文松  蔡海波华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237通信作者：蔡海波，Email：caihaibo@ecust.edu.cn引用本文：徐瑞升，陈玉莹，李奇林，等.  基于嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法发展与应用的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 273-282.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221125-00081识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

中文摘要轮状病毒是全球范围内引起婴幼儿腹泻的主要病原体，接种轮状病毒疫苗为目前最经济、有效的预防手段，很大程度上缓解了轮状病毒导致的疾病负担，但目前上市疫苗都为减毒活疫苗，存在毒力回复以及肠道不良反应等风险。因此，优化的传统活疫苗、灭活疫苗以及病毒样颗粒等亚单位疫苗成为潜在的候选疫苗，以提高轮状病毒疫苗的安全性和有效性。此文总结了市面上主要轮状病毒疫苗的应用现状以及进入临床试验新疫苗的研究情况，为后续的疫苗开发奠定基础。正文轮状病毒（rotavirus，RV）是导致婴幼儿腹泻的主要病原体，感染途径为粪-口传播，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，是引起全球5岁以下儿童严重腹泻病的最常见病原，每年导致约20万名儿童死亡[1]。RV主要侵犯的部位是小肠上皮细胞，导致细胞损伤，从而引起腹泻。在未引入RV疫苗的国家中，每年在急性胃肠炎住院患者中检测到RV的比例为38.0%，而在已开展疫苗接种的国家，在急性胃肠炎住院患者中检测到RV的比例为23.0% [2]。RV的基因组主要编码6个结构蛋白(VP1—VP4、VP6和VP7）和6个非结构蛋白（NSP1—NSP6）。VP2为内层核心蛋白，VP6为中间层蛋白，VP7和VP4为最外层衣壳蛋白，诱导机体产生主要的中和抗体。依据RV VP6可将其分为A—H 8个不同的组。其中，感染人类的主要是A组，在世界范围内最占优势的是A组G型RV。根据VP7和VP4抗原性不同，在人类和动物中共发现了36个G血清型和51个P血清型[3]。常见的G血清型有G1、G2、G3、G4，血清型G9也日渐增多；常见P血清型有P[4]和P[8]。其中G9P[8]、G1P[8]和G3P[8]在我国最为常见，分别占39.5%、16.8%和9.9%，近年来G9P[8]逐渐成为了我国最主要的流行株[4]。1RV疫苗的应用现状目前WHO对4种RV疫苗进行了预认证：Rotarix疫苗（英国葛兰素史克公司生产，2009年预认证）、RotaTeq疫苗（美国默沙东公司生产，2008年预认证）、Rotavac疫苗（印度巴拉特生物技术公司生产，2018年预认证）和Rotasiil疫苗（印度血清研究所生产，2018年预认证）[5]。单价人RV疫苗Rotarix和五价牛-人重组RV疫苗RotaTeq供全球范围内使用，而Rotavac和Rotasiil疫苗使用范围仅在印度和巴勒斯坦。在我国获批上市使用的是兰州生物制品研究所有限责任公司生产的口服RV活疫苗LLR。这些RV疫苗的推广，大大降低了RV感染的重症和死亡率。1.1Rotarix疫苗Rotarix疫苗为英国葛兰素史克公司研发的口服人RV减毒活疫苗，含有G1P[8]型毒株，来源于89-12亲本候选株，对G3、G4、G9型毒株均有交叉保护作用。Rotarix疫苗于2005年在墨西哥获得批准上市，并在2009年通过了WHO的预认证。2008年4月被许可用于美国的婴儿，在2月龄和4月龄以2个剂量口服给药，第1剂应在6~14周，两次间隔4周，所有剂量应在8月龄前完成给药[6]。Rotarix疫苗对预防RV感染具有一定的效果，但这种有效性是不均衡的，疫苗在发达国家的保护率明显高于发展中国家。Karafillakis等[7]通过分析RV有关的报道数据，得出Rotarix疫苗在欧洲的保护率为80.0%～98.3%，而在非洲的保护率为 56%～64%，这可能与发展中国家较差的生活环境有关[8-12]。此外，就成本而言，跨国疫苗制造商进行大规模试验需要巨大的资金成本支持，导致所出售的疫苗价格也不会太低，这对RV感染更加严重的发展中国家而言显然是无法负担的。因此，定价机制和分级价格水平也是至关重要的一个环节。2010年3月22日，美国FDA因发现Rotarix疫苗中存在猪圆环病毒1型DNA的污染而宣布暂停该疫苗的使用，随后在 RotaTeq疫苗中也发现了此病毒[13]。对此，葛兰素史克公司决定重建Rotarix疫苗生产所用的细胞库和毒种库，以确保后期生产的疫苗不含猪圆环病毒[14]。1.2RotaTeq疫苗RotaTeq疫苗为默沙东公司研发的五价牛-人RV重组疫苗，2009年被WHO向全世界儿童推荐使用，包含G1、G2、G3、G4、P1A［8］型5种人-牛RV重配株，可有效预防G1—G4以及G9型RV引起的RV胃肠炎（RV gastroenteritis，RVGE）。RotaTeq疫苗适用人群为1.5~8月龄的婴幼儿，接种方式为口服，分3次接种，每两剂之间的服用间隔为4~10周[15]。与Rotarix疫苗类似，RotaTeq疫苗在发达国家的有效性明显高于非洲等落后地区，据统计在欧洲和北美地区，接种RotaTeq疫苗后的第1年和第2年的保护率分别为73%和62%[16-17]；在非洲（加纳、肯尼亚、马里）及亚洲（孟加拉国、越南），接种该疫苗后对RVGE保护效力分别为33.9%、42.5%[18]。RotaTeq与Rotarix疫苗均为减毒活疫苗，其作用机制为刺激肠道产生免疫应答，这可能会给胃肠道带来不良反应。除肠套叠外，RotaTeq疫苗还伴有一些罕见的不良反应，包括腹泻、呕吐、烦躁不安、中耳炎、鼻咽炎和支气管痉挛等[19]。1.3Rotavac疫苗Rotavac疫苗是印度巴拉特生物技术公司生产的液体冷冻单价RV活疫苗，于2014年获得许可在印度上市，并在2018年通过了WHO预认证。Rotavac疫苗由天然减毒的人RV G9P[11]毒株分离而得，以冷冻形式储存，在-20 ℃最长可保存5年，在2~8 ℃之间最长保存6个月，可以反复冻融6次[20]。Bhandari等[21]通过随机、双盲、安慰剂对照试验得出，Rotavac疫苗对严重RVGE的疫苗效力为53.6%，对Ⅲ期临床试验极严重RVGE的疫苗效力为54.4%，对所有RVGE的疫苗效力为34.6%，且疫苗组和安慰剂组每年严重RVGE的发病率分别为1.5%和3.2%。此试验证明Rotavac疫苗对不同严重程度的RVGE均有保护作用。然而相关研究显示这种保护作用是不均衡的：与在中等、高等收入国家的临床试验有效性相比，在非洲、拉丁美洲和亚洲中低收入国家的有效性显著降低[22-23]。另外经济成本也是一个值得考虑的因素，尤其是对于低收入国家。虽然Rotavac冷冻疫苗可以提供较低的成本和较长的保质期，但冷链运输依然是个不容小觑的经济问题，可能会产生额外的成本。1.4Rotasiil疫苗 Rotasiil疫苗是由印度血清研究所生产的冻干五价RV疫苗，是在Vero细胞中由天然减毒的人-牛RV毒株G1、G2、G3、G4和G9分离而得。该疫苗在2017年获得许可在印度上市，并于2018年通过WHO预认证。冻干形式的Rotasiil疫苗在2~8 ℃冷藏条件下可储存30个月[20]。Kulkarni等[24]进行了1项随机、双盲、安慰剂对照Ⅲ期临床试验，其中3 749名婴儿接受疫苗为疫苗组，3 751名婴儿接受安慰剂为对照组，经过2年随访后，结果得出疫苗组的严重RVGE的发病率与安慰剂组相比显著降低。此外，Zade等[25]对60名健康婴儿进行II期临床研究，疫苗组与安慰剂组以1:1的比例分3次给药，每次给药间隔至少4周。研究发现疫苗组和安慰剂组第2次给药后血清转化率分别为36.00%和7.14%，第3次给药后血清转化率分别为48.00%和21.43%。Anil等[26]纳入20名健康成人作为受试者接受疫苗接种，随访后发现，研究期间没有出现任何非预期的不良事件。由于Rotasiil疫苗的使用范围有限，仅在印度和巴勒斯坦使用，因此对疫苗潜在的安全性问题还需进一步评估，且冷链储存和运输方面存在的问题及较高的经济成本还需进一步改善。1.5国产口服RV活疫苗在我国主要使用兰州生物所研制的国产口服RV活疫苗LLR。LLR是由1985年首次从羔羊体内分离的RV株G10P[15]制备的单价口服减毒活疫苗，于2000年获得许可上市，目前只在中国使用，适用于2个月~3岁的婴幼儿。在LLR上市后进行的几项基于人群的病例对照试验表明，LLR疫苗对RVGE的保护率为35.0%~73.3%，并且对于G3血清型引起的中度RVGE具有更高的保护作用[27-28]。张潮等[29]以随机招募100名接种LLR疫苗者为疫苗组，100名未接种疫苗者为对照组，通过比较2组间RV的感染情况、外周血中抗RV IgA抗体和IgG抗体的差异，发现疫苗组粪便RV抗原检出率明显降低，表明LLR疫苗可显著减少RVGE发生率；且疫苗组的外周血IgA与IgG水平显著高于对照组，推测外周血的抗RV IgA和抗RV IgG抗体水平对LLR疫苗接种效果有一定预测价值。此外，疫苗接种效果还与首剂接种时间、接种次数等因素有关，接种时间早，且选择母乳喂养者，并完成全部疫苗接种程序，粪便中RV抗原的检出率更低，表明疫苗接种效果更好[27]。然而该疫苗尚未纳入我国国家免疫计划，免疫覆盖率相对较低[30]。2RV疫苗的研究进展目前，获批上市的RV疫苗基本都为减毒活疫苗，作用机制是将病毒减毒后在肠道中复制，诱导肠道产生免疫应答，但有可能带来肠套叠等胃肠道不良反应。因此，继续优化RV减毒活疫苗，或者开发替代RV减毒活疫苗的其他疫苗，包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，对进一步降低RV导致的发病率和死亡率具有重要意义。2.1三价RV基因重组疫苗三价RV基因重组疫苗（LLR3）是在原已上市销售的单价羔羊P[12]G10 RV疫苗的基础上，通过基因重配技术采用G2、G3和G4型人RV分别与LLR进行基因重配，获得3个分别含有G2、G3和G4型人RV的VP7基因的人-羊RV重配株，并用该3个毒株研制了三价RV重组疫苗[31]。疫苗接种方式为口服。该疫苗覆盖了几种常见的RV血清型（G2、G3、G4型），能够更好地刺激机体产生免疫应答，有效预防RV感染[31]。Xia等[32]在中国河南的健康婴儿中进行了1项随机、双盲、安慰剂对照III期临床试验，以评估LLR3对RVGE的预防效果。试验将9 998名6~13周龄健康儿童纳入临床研究，LLR3疫苗组和安慰剂组受试者各4 999名，按照0、1、2个月的免疫程序随机服用3剂次口服LLR3或安慰剂。在接种疫苗后的2个流行季节中，分析了LLR3对RVGE的疫苗效力。结果发现LLR3疫苗对于所有RVGE和严重RVGE的疫苗效力分别为56.6%和70.3%，其中第1个流行季节疫苗效力分别为75.2%和59.3%，第2个流行季节疫苗效力分别为68.8%和55.1%，表明第2个流行季节的疫苗效力呈现些许下降的趋势。此外，LLR3抗原是G2、G3、G4血清型，缺乏G9、G1和P[8]型，但在近万名受试者中，对G9、G1和P[8]型仍显示出良好的免疫原性、有效性和安全性。2.2口服六价重配RV活疫苗六价牛-人重组RV减毒活疫苗含有6种流行株血清G1、G2、G3、G4、G8及G9，涵盖了A群RV 99.6%的G血清型病毒，由武汉生物制品研究所有限责任公司研发，被证明在动物中安全且具有良好的免疫原性，并已被国家药品监督管理局批准进行临床试验。Wu等[33]在中国河北省正定县进行了1项随机、双盲、安慰剂对照的Ⅰ期临床试验，纳入了120名6~12周龄的健康婴儿，分为疫苗组和安慰剂对照组。受试婴儿接种了高、中、低剂量的疫苗或安慰剂，每隔4周口服接种1次，采用ELISA测定抗RV IgA抗体的几何平均浓度（geometric mean concentration，GMC）和血清转化率以评估免疫应答。研究发现疫苗组中抗每种RV血清型IgA抗体的血清转化率显著高于安慰剂组，高剂量组抗RV IgA血清转化率约为90.00%，中剂量组所有RV血清型的血清转化率为45.45%，低剂量组的血清转化率为42.11%~63.16%；高剂量组的GMC，除G3血清型外，均高于153.46 U/ml；中剂量组的GMC，最低为G3血清型的31.23 U/ml，最高为G4血清型的49.46 U/ml；低剂量组的GMC，最低为G3血清型的25.90 U/ml，最高为G9血清型的41.88 U/ml；安慰剂组的GMC约为10.00 U/ml[33]。综上表明，高剂量组的IgA抗体血清转化率高于低剂量组和中剂量组，疫苗接种者在第3次给药后GMC也普遍高于安慰剂接种者，六价重配RV活疫苗初步显示了良好的免疫原性。目前，新型六价RV疫苗的Ⅲ期临床试验正在进行中，以进一步评估其安全性、免疫原性和免疫保护效力。2.3RV亚单位疫苗2.3.1  RV病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗   VLP是具有自我组装能力的多亚单位蛋白质结构，与天然病毒相比，不含遗传物质，不具传染性，但模拟了天然病毒的整体结构，通常比单体蛋白质结构更具免疫原性[34]。VLP的颗粒大小范围为20~100 nm，这恰好是树突状细胞吸收纳米颗粒和激活T细胞产生免疫应答的最佳范围[35]。RV-VLP的生产首次报告于20世纪80年代[36]。20世纪90年代，Crawford等[35]通过昆虫杆状病毒表达系统以不同组合分别表达了RV-VP2/VP6/VP7的3层VLP和RV-VP6/7的双层VLP，并在小鼠中评估了其免疫原性：在同样使用佐剂QS-21的情况下，3层VP2/6/7-VLP产生的抗体GMC比双层VP6/7-VLP的更高。此外，Li等[38]通过大肠埃希菌表达RV衣壳蛋白VP2和VP6，纯化后组装成单层VP6-VLP或双层VP2/6-VLP，并在小鼠中进行了免疫原性的比较，发现双层VP2/6-VLP对RV诱导小鼠腹泻的保护率显著高于单层VP6-VLP。综上2个研究显示，3层RV-VLP对小鼠产生的保护率高于双层RV-VLP，双层RV-VLP对小鼠产生的保护率显著高于单层RV-VLP。并且证实了VP6在形成RV-VLP的过程中发挥着关键作用。之前关于RV-VLP的免疫原性评估尚停留在实验室阶段，而近期Kurokawa等[39]在澳大利亚婴儿中进行了1项植物源性VP2/6/7-VLP的Ⅰ期临床试验，试验分为疫苗组（按剂量递增的方式接种疫苗）和安慰剂组。结果显示，第2次和第3次注射后4周，RV-VLP疫苗诱导婴儿产生了抗G1P[8] IgG应答，第3次给药4周后，所有RV VLP婴儿组对同源G1P[8]RV的中和抗体应答均高于安慰剂组。且注射RV VLP疫苗后，没有出现安全性或耐受性问题。另外婴儿受试者的免疫反应并没有根据剂量的差异而出现明显的变化，所以有必要进一步研究剂量-反应关系，以探索植物源性RV VLP疫苗的最佳剂量。2.3.2  P2-VP8-P[8]重组亚单位疫苗   P2-VP8-P[8]重组亚单位疫苗由截短的RV-VP8（由RV衣壳蛋白VP4经胰蛋白酶裂解而来）与破伤风毒素的P2表位融合，在大肠埃希菌中表达所得[40-41]。此疫苗诱导的对P[8]毒株的中和抗体应答最为强烈，对P[4]毒株中等，对P[6]毒株却相当有限，基于此1种三价疫苗得以开发，包括来自P[4]、P[6]和P[8]毒株的抗原，该疫苗诱导的对这3种P型毒株的应答更为平衡。Groome等[40]在南非开展了1项双盲、随机、安慰剂对照、剂量递增的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，发现实验组（15、30和90 µg）在第3次注射后4周对P[4]、P[6]和P[8]抗原产生的IgG和IgA抗体滴度是注射前的5倍，产生的中和抗体滴度是注射前的3.7倍，且各剂量组诱导的对P[4]、P[6]和P[8]的IgG和IgA抗体滴度和中和抗体应答均显著高于安慰剂组。此外，30 μg组有58%~83%的婴儿出现抗P2-VP8 IgG抗体应答，而 90 μg组有高达83%~92%的婴儿出现IgG抗体应答；30 μg组只有50%~83%的婴儿出现IgA抗体应答，而90 μg组有高达67%~92%的婴儿出现抗P2-VP8 IgA抗体应答[40]。表明随着剂量的增加，出现抗体应答的效果越好。目前P2-VP8-P[8]疫苗已在Ⅲ期临床试验中对安全性、免疫原性和有效性进行了评估，但具体结果还未公布。2.4RV灭活疫苗（inactivted RV vaccine，IRV）美国CDC研发的一种可进行肠外给药的IRV CDC-9是一种单基因重配疫苗，VP3基因来自G2P4毒株，其他基因来自G1P[8]毒株[42]，在Vero细胞中培养，经热处理灭活。在临床前研究中，Resch等[43]通过肌内注射（intramuscular，IM）或使用微针贴片（microneedle，MN）进行疫苗接种，后对CDC-9 IRV的免疫应答进行评估。研究发现以MN贴片方式接种疫苗后，诱导了相当水平的体液免疫，但与MN接种方式相比，IM接种方式可诱导更高水平的体液免疫[41]。需要关注的是，IM接种时是配制Al(OH)3佐剂使用的[42]。考虑到口服病毒活疫苗所带来的不良反应以及肠道微环境对疫苗有效性的干扰，通过IM给药或MN贴片注射IRV有望成为口服RV疫苗的一种替代和改进的方法。Shahrudin等[45]在小鼠体内测试了用50 kGy辐照的γ射线灭活RV的免疫原性，发现与活RV诱导的体液免疫应答相当，特别是可诱导高水平的IgG2c。中国医学科学院医学生物所研制的IRV使用Vero细胞培养的G1P[8]人RV经热处理灭活，并与Al(OH)3佐剂配伍制成。以小鼠为动物模型，发现灭活疫苗可以诱发血清IgG和IgA、肠道IgG和IgA及中和抗体等全身和局部体液免疫应答，且中和抗体在体外可以中和同型感染性Wa株(G1型)RV和异型感染性SA11 株（G3型）RV，显示出一定的交叉保护作用[46]。已有1项针对此IRV（Vero细胞）在健康人群中接种的安全性及初步观察免疫原性的随机、双盲、安慰剂对照Ⅰ期临床试验，受试者为18~49岁的成人、6~17岁的青少年、2~6月龄和7~71月龄的婴幼儿；试验分为疫苗组和对照组，其中疫苗组分为3组，每组每人每次剂量为0.5 ml，分别含RV灭活抗原80、160、320 EU，接种3剂，每次注射间隔28 d[47]。该试验于2021年11月完成，对受试者的安全性和初步免疫原性进行了评估，目前结果尚未公布。3结论与展望减毒活疫苗的推广一定程度上缓解了由RV带来的疾病负担，但仍有一些问题亟待解决，如安全问题（肠道不良反应等）、国家间的疗效差异问题（发达国家的疗效高于发展中国家的疗效等）以及高成本问题（冷链运输问题等）。为此，在继续改进减毒活疫苗的同时还需要考虑其他疫苗研发平台来进行RV疫苗的研发。在改进减毒活疫苗方面，三价RV基因重组疫苗（LLR3）和六价牛-人重组RV减毒活疫苗实现了覆盖多种血清型，从而对RV引起的胃肠炎发挥了更好的保护作用，当前已经进入了临床试验阶段；除活疫苗外，还考虑了如灭活疫苗和亚单位疫苗等疫苗研发平台：灭活疫苗使用物理或化学方法将具有感染性的病毒杀死但同时保持其抗原颗粒的完整性，使其失去致病力而保留抗原性，保证了疫苗使用的安全性，但在有效性方面还需进一步提升；亚单位疫苗筛选具有免疫活性的病毒蛋白质结构，不含核酸，结构模拟原病毒，常配制佐剂使用，在使用安全的基础上更好地刺激了机体产生免疫应答，但如何提高蛋白的表达量、优化纯化条件是亚单位疫苗研发的重点。当前无论是RV灭活疫苗还是重组亚单位疫苗都尚处于前期研发或者临床研究阶段，对实验动物显示了一定的保护效果，但其人体的免疫保护效果还需进一步研究，应用前景值得期待。作者孙建鑫1 综述    周旭2 审校1上海生物制品研究所有限责任公司第二研究室，上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 200051通信作者：周旭，Email：kathzhou@sina.com引用本文：孙建鑫, 周旭. 轮状病毒疫苗的研究现状及进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(5)：290-296.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220107-00002