《Nat Chem | 陈加余团队详解三链体DNA互作蛋白的调控机制及其功能多样化》

DNA的右手双螺旋结构的提出是分子生物学的重要里程碑。然而，除了经典的双螺旋结构外，DNA还可以形成其他非典型构象，如三链体DNA。三链体DNA是指单链DNA通过胡斯坦氢键与双链DNA的大沟形成的独特三链结构，这种结构在基因组中广泛存在，具有重要的基因调控功能和潜在的基因组不稳定性风险。三链体形成寡核苷酸不仅可以作为调控基因表达、诱导突变、重组和细胞凋亡的工具，还在精准交联顺铂药物和特异性杀伤癌细胞等方面展现出巨大应用前景。因此，三链体DNA具有成为新型核酸药物的潜力。然而，目前对细胞内三链体DNA动态调控网络和分子机制的认识仍然不够深入，这极大地限制了其基础研究和转化应用。

2024年9月2日，南京大学陈加余课题组在《Nature Chemistry》杂志上发表了一篇题为《Chemoproteomic profiling unveils binding and functional diversity of endogenous proteins that interact with endogenous triplex DNA》的研究论文，首次系统性揭示了内源性三链体DNA互作蛋白及其多样化的调控模式和分子功能。

当前，研究三链体DNA调控蛋白及其分子机制主要依赖体外实验，其准确性和可推广性存在争议。为了在活细胞中系统捕获内源三链体DNA互作蛋白，研究团队开发了一种特异性识别三链体DNA的光交联化学探针photoBQQ。该探针基于Benzoquinoquinoxaline（BQQ）分子，增加了具有紫外光交联活性的双吖丙啶和能通过点击化学反应连接生物素的炔基基团。通过一系列体外和体内实验，研究团队证实了photoBQQ探针对三链体DNA的特异性识别能力及其对三链体DNA调控蛋白的临近标记活性。利用该探针，研究团队在HeLa和A549细胞系中开展了化学蛋白质组学研究，特异性捕获并通过定量质谱鉴定了78个高置信度的三链体DNA互作蛋白，为理解三链体DNA的动态调控机制奠定了基础。

进一步的多组学数据分析（如ChIP-seq，CUT&Tag，S1-END-seq）显示，这些调控蛋白具有不同的分子调控机制和潜在生物学功能。研究团队将这些蛋白的DNA结合位点与三链体DNA形成区域进行比对，识别出三种截然不同的结合模式。通过分析单链多聚胞苷酸结合蛋白HNRNPK、PCBP1和PCBP2的结合模式，研究推断内源性三链体DNA主要采用H-r3构型，这一重要发现也解开了HNRNPK、PCBP1和PCBP2蛋白的DNA结合位点与RNA结合位点偏移的谜题。此外，这些蛋白的转录调控功能可能与其结合内源性三链体DNA的活性密切相关。

研究团队还以三链体DNA调控蛋白DDX3X为例，进行了深入的分子机制研究。通过体外解旋酶实验，发现DDX3X能以不依赖ATP的方式解旋三链体DNA，尤其偏好第三链5′端存在额外单链DNA的三链体DNA。进一步的免疫荧光实验显示，DDX3X缺失会导致三链体DNA的累积和DNA损伤。通过CUT&Tag实验，研究发现DDX3X调控的三链体DNA与DNA损伤位点高度共定位。最后，通过连接介导的PCR实验（LM-PCR）证实，DDX3X缺失导致三链体DNA区域发生双链断裂。

总之，该研究首次系统揭示了内源性三链体DNA调控蛋白的全景图，为深入理解三链体DNA的动态调控奠定了基础，也为诸多蛋白的分子功能研究提供了全新视角。这一研究为探索三链体DNA的生物学功能及其在转化医学中的应用提供了宝贵资源。