东京大学利用干细胞和类器官技术再现胆管发育，为胆汁淤积性疾病治疗带来新希望

东京大学的Hideki Taniguchi研究团队最近在《自然通讯》期刊上发表了一项研究，成功模拟了肝脏上皮组织和血管之间的交互作用，构建了人工血管的肝类器官（BVLO）。这一成果重建了人类胆管的结构，为先天性胆道疾病的研究提供了有价值的体外模型。

胆管（bile ducts，BD）在肝脏门静脉周围专门发育，主要任务是将肝细胞分泌的胆汁输送到肠道。胆管细胞是肝内胆管（IHBD）的上皮成分，由肝母细胞分化而来。当IHBD的结构功能出现障碍时，胆汁排泄受到阻碍，导致胆汁淤积，进一步引起严重的肝损伤。肝内胆管的正常发育离不开血管与胆管（BV-BD）之间的相互作用。

在这项研究中，研究团队通过共培养人类诱导多能干细胞（hiPSC）生成的肝祖细胞和人工血管，成功模拟了肝上皮组织与血管之间的交互作用，形成了含有人工血管的肝类器官（BVLO），从而重建了人类胆管结构。这个模型为研究先天性胆道疾病提供了一个有效的体外工具。

研究表明，门静脉的血管平滑肌细胞（PV-SMCs）与胆管细胞的早期分化有着紧密联系。胆管细胞的分化高度依赖于门静脉，PV-SMCs在胆管发育过程中发挥着关键作用。如果敲除Notch配体Jagged1（JAG1），会导致胆管发育异常。

通过对小鼠和人类胎肝进行免疫染色分析，研究发现PV-SMCs在肝门区表达高水平的αSMA，而外围区域则主要表达SM22和低水平的αSMA。外围区域的未成熟平滑肌细胞（imSMCs）与胆管细胞的早期分化相关，且JAG1在这些未成熟细胞中表达较高。结果表明，PV-SMCs在未成熟状态下与胆管发育的早期阶段有密切关联。

研究人员从人类诱导多能干细胞（hiPSC）中诱导出血管平滑肌细胞（SMCs），并通过免疫荧光和定量PCR（qPCR）分析了这些细胞在分化过程中的表现。在第6天出现的SM22+αSMAlow细胞和第10天出现的SM22+αSMAhigh细胞分别被称为hiPSC-imSMCs和hiPSC-SMCs。分析显示，JAG1在hiPSC-imSMCs中表达较高，这提示未成熟的SMCs（imSMCs）可能具有更高的诱导胆管细胞分化的潜力。

研究人员通过建立3D共培养系统，将含有JAG1、TGFβ1和Laminin 511的hiPSC血管与肝类器官结合，成功诱导出胆管样结构。在三周的培养期内，胆管细胞逐步分化，形成了具有典型胆管标志物和结构特征的胆管样结构。该系统有效地模拟了胆管细胞的分化过程，验证其作为胆管发育研究模型的潜力。

研究进一步对含有血管的肝类器官（BVLO）中生成的hiPSC-胆管进行结构和功能分析。发现这些胆管形成了管状结构，并具备典型的胆管上皮细胞特征，如紧密连接和微绒毛。此外，这些胆管还表现出了多药耐药蛋白1（MDR1）依赖的排泄和分泌功能，并检测到了γ-谷氨酰转移酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）的活性，这进一步证明了hiPSC-胆管的功能性。

当将hiPSC来源的肝祖细胞移植到免疫缺陷小鼠的肝脏表面时，研究人员观察到移植后的胆管细胞在其顶端表面表达了OPN和乙酰化微管蛋白，这些标志物在体外培养环境中并未出现，表明细胞在体内环境中进一步成熟。

为了验证移植的胆管细胞是否与宿主胆管系统相连，研究人员向移植了胆管的小鼠肝组织中注射碳墨水并进行免疫荧光分析，结果显示，移植的胆管细胞与宿主的肝内胆管建立了连接。这说明体内环境不仅促进了胆管细胞的高度成熟，还帮助它们与宿主的胆管系统形成了功能性连接。

研究人员进一步在免疫缺陷小鼠中通过胆管结扎（BDL）诱导胆汁淤积性肝损伤，并在小鼠肝脏表面移植BVLO。结果显示，移植后的小鼠存活时间显著延长，胆红素水平降低，体重减轻程度减轻。分析显示，移植的胆管结构腔体变大，推测BVLO与宿主胆管的连接可能为受体肝脏提供了一个辅助的胆汁储存空间，从而暂时缓解了胆汁淤积的症状。

最后，通过单细胞RNA测序，研究人员发现TGFβ和Notch信号通路在胆管和血管的相互作用中发挥了关键作用。这些结果表明，BVLO中的细胞与人类成人肝脏细胞相似，特别是在肝细胞和胆管细胞的亚群划分上，说明TGFβ信号在内皮细胞-胆管细胞和间充质细胞-胆管细胞的相互作用中最为显著，JAG1-NOTCH信号则主要在间充质细胞-胆管细胞的相互作用中激活。

总体而言，该研究通过模拟胎儿肝脏发育中的门静脉-胆管相互作用，在hiPSC肝脏类器官中成功生成了胆管结构。未成熟的平滑肌细胞在胆管发育的初期发挥关键作用，而人工血管的引入有助于胆管腔的形成。移植后的胆管结构虽然显示出成熟的表型标志，但仍需进一步优化以实现完全成熟。这一方法有效模拟了胆管发育异常，为先天性胆道疾病的研究提供了一个有效的体外模型。