Stickler Syndrome, Type 1

摘要：在过去的22年中，针对越来越多的肺炎链球菌类型（7价、10价、13价、15价、20价）的多价疫苗已经获得许可。尽管非疫苗血清型的出现，使用多糖-蛋白结合疫苗在减少侵袭性肺炎球菌病的发病率方面发挥了关键作用。尽管取得了成功，但仍需要对肺炎球菌疫苗进行持续改进。例如，尽管某些血清型已被纳入肺炎球菌结合疫苗，但仍存在一些挑战。特别是，肺炎链球菌3型在几个国家仍然是侵袭性肺炎球菌病的主要原因。本文报告了对已许可的肺炎球菌结合疫苗和其他目前处于临床开发阶段的疫苗候选物的优势和劣势的深入修订。 引言 肺炎链球菌（Spn）是一种重要的人类病原体，被广泛认为是社区获得性肺炎（CAP）、中耳炎、败血症和脑膜炎（统称为侵袭性肺炎球菌病[IPD]）的病原体。Spn 仍然是全球重要的疾病和死亡原因，5岁以下儿童中有5%的死亡是由肺炎球菌感染引起的。肺炎球菌是呼吸道的常见寄居者，可在5-90%的健康人（20-60%的学龄儿童和5-10%的成人）的鼻咽部定植。 Spn 产生多种参与疾病过程的毒力因子。其中，多糖荚膜是最重要的毒力因子，需要侵入宿主并引起疾病。荚膜对于肺炎球菌的生存至关重要，它通过保护细菌免受补体的攻击和随后的吞噬细胞杀死，从而保护细菌。Spn 合成了100多种荚膜多糖（CPSs），根据构成每种血清型的独特的糖苷成分和连接进行分类。其中，有23种血清型负责全球80-90%的侵袭性肺炎球菌感染。 过去几年中，已经开发出针对多种Spn血清型的肺炎球菌多糖疫苗（PPVs）和肺炎球菌结合疫苗（PCVs），并广泛用于预防肺炎球菌病。自20世纪70年代以来，已经开发出几种PPVs，包含6至23种血清型的荚膜多糖。目前，许多国家只许可使用23价PPV，推荐给65岁及以上的个体以及2至64岁有合并症的个体，如慢性心血管疾病和糖尿病。PPV23对免疫正常成人的IPD有效性通常在56-81%之间，但在免疫受损个体中较低。疫苗能够减轻CAP的严重程度，但不能预防它，并且不减少非侵袭性肺炎的发病率。此外，PPV23对2岁以下儿童无效，不产生免疫记忆，也不减少携带。为了提高疫苗在儿童中的有效性，开发了PCVs，其中荚膜多糖与载体蛋白结合，克服了PPVs的大多数限制。 截至目前，市场上已有PCV10、PCV13、PCV15和PCV20（表1）。 表1 针对多种Spn血清型的许可肺炎球菌多糖疫苗（PPVs）和肺炎球菌结合疫苗（PCVs） 根据世界卫生组织（WHO）的报告，Spn是抗菌药物耐药性（AMR）的四个优先病原体之一，已有许可的疫苗存在，建议增加许可疫苗的覆盖范围，以符合WHO的免疫目标，以最大限度地影响AMR。 许可的结合疫苗：向更高价发展 为了提高儿童疫苗的有效性，已经许可了几种PCV（表1）。2000年和2001年，美国和欧盟分别开发并许可了一种7价肺炎球菌结合疫苗（Prevnar，辉瑞）。PCV7包含来自美国最常见的七种IPD血清型的CPS，并与白喉毒素的遗传解毒突变体CRM197结合（表1）。PCV7的使用导致儿童中IPD病例迅速减少，成人中肺炎球菌感染急剧下降。在美国，2004年即疫苗引入后，1岁以下儿童的IPD发病率降低了77%，1岁儿童降低了83%，2岁儿童降低了73%。在美国人群中也发现了非侵袭性肺炎球菌感染的减少，如急性中耳炎（-20%）。由于PCV7施加的选择压力，疫苗中未包含的其他血清型变得有问题，如19A型。这一过程，称为血清型替代，推动了PCV10（Synflorix，GSK）和PCV13（Prevnar 13，辉瑞）的开发，自2009年以来已有供应。这些疫苗包含PCV7中的7种肺炎球菌荚膜多糖血清型，另外还有3种或6种额外的血清型（表1），根据全球肺炎球菌病的流行病学发展选择。另一种10价PCV疫苗（Pneumosil，印度血清研究所），与PCV10和PCV13有重叠的血清型，于2019年被WHO预认证。总的来说，PCV10和PCV13减少了疫苗类型的鼻咽部定植，并在人群中导致了群体免疫。尽管PCV10和PCV13中血清型的主要选择标准是基于疾病负担，但也包括了与抗生素耐药性相关的血清型，几项研究表明，当前的PCV在减少耐药感染的流行率方面非常有效。在美国首次使用PCV五年后，2岁以下儿童中由多重耐药（MDR）菌株引起的IPD减少了84%，65岁以上成人中由青霉素耐药IPD减少了49%。在南非，PCV的使用使儿童中青霉素耐药肺炎球菌病的发病率减少了82%，由青霉素敏感菌株引起的疾病减少了47%。为了进一步提高覆盖范围，FDA最近批准了默克和辉瑞的PCV15和PCV20，它们包含15种或20种不同的血清型，已显示出在减少非侵袭性疾病（如急性中耳炎、非菌血症性肺炎和鼻窦炎）方面的影响。然而，除非在覆盖范围上达到一个临界点，以防止血清型替代，否则这些疫苗的有效性将逐渐减弱。即使这在技术上是可行的，疫苗的制造成本将使开发在发展中国家尤其具有挑战性。一个合理的解决方案是，根据最相关的循环IPD血清型不断变化的配方。计算机模拟表明，根据最新的流行病学数据调整疫苗组成有望减少IPD负担，然而疫苗不能完全根除人群中的肺炎球菌定植。所有许可的结合物都使用CRM197作为载体蛋白，除了Synflorix使用蛋白D用于1、5、6B、7F、9V、14、23F血清型，4、TT用于18C血清型，DT用于19F血清型。最近，使用TT作为载体蛋白的PCV13已由Walvax许可（产品列表walvax.com）。不一致的疫苗效力 结合疫苗成功地保护了免受感染，但并非所有肺炎球菌血清型都具有相同的效力。对于某些血清型，通过吞噬细胞杀菌（OPK）检测的许可疫苗诱导的功能抗CPS抗体水平并不理想。其中包括1、3和5型，我们将在以下段落中进一步评论。 1型 通常认为，带负电荷和中性的多糖是2型T细胞非依赖性抗原（TI-2，或胸腺非依赖性2型抗原）。这包括大多数肺炎球菌CPS。TI-2多糖无法招募CD4+T细胞帮助，因为它们不与主要组织相容性复合体II类（MHC-II）分子相互作用。然而，某些类型的糖苷，特别是具有双重或两性离子电荷基团的糖苷，确实可以通过传统的MHCII途径激活T细胞。1型肺炎链球菌多糖胶囊（Spn-1）（图1）是这些分子中最研究的之一。已经表明，即使没有与载体蛋白结合，Spn-1也可以通过使用MHC-II途径的抗原呈递细胞处理和呈递，这导致Spn-1诱导的T细胞增殖。然而，在一项更近的研究中，表明Spn-1多糖不会在人类中诱导记忆B细胞的形成，与其他多糖类似。从参加随机临床试验以研究使用23价肺炎球菌普通多糖疫苗免疫后记忆B细胞反应的成人中获得的外周血单个核细胞。这种含有1型疫苗的使用导致与基线相比，1型抗原特异性预先存在的记忆B细胞的耗尽。这一发现表明，这种两性离子多糖不是通过MHC-II途径内的经典T依赖性机制处理的。 此外，Bjarnarson等人表明，无论是两性离子（Spn-1）还是非两性离子（Spn-19F）多糖，在新生小鼠模型中加强免疫后都会引起低反应性。与即使没有结合也能预期的免疫活性相反，含有Spn-1的市售结合疫苗对这种血清型诱导的功能抗CPS抗体水平低，这是撒哈拉以南非洲脑膜炎的主要原因。这可能是由于在化学活化和与载体蛋白结合过程中保护性表位的掩盖。Spn-1 CPS含有不寻常的单糖，2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三去氧-d-半乳糖（D-AAT），含有游离胺（图1）。由于市售结合疫苗的制造使用还原胺化（Prevenar）或1-氰基-4-二甲氨基吡啶活化化学（Synflorix, Pneumosil），这些化学反应与游离胺反应，D-AAT部分的某些化学衍生化可能导致疫苗效力降低。此外，在制造过程中多糖被解聚，例如通过钠周期酸介导的二醇氧化，这也可能导致效力的额外降低。 图1 肺炎链球菌1型荚膜多糖重复单元的示意表示 →4)-α-D-GalpA2/3Ac-(1→3)-α-D-GalpA-(1→3)-D-AAT-α-Galp-(1→ 5型 肺炎链球菌5型（Spn-5）被报道为全球儿童侵袭性肺炎球菌病第五大常见血清型。此外，在加拿大温哥华，识别出与这种血清型（多位点序列类型或MLST 289）相关的IPD大簇，导致2005年至2009年在加拿大西部蔓延的大规模肺炎球菌病爆发。市售结合疫苗在预防Spn-5感染方面并不完全有效，这种行为的原因再次在于结合后的一些稳定性问题。Spn-5在与载体蛋白的化学结合过程中的不稳定性的根本原因可以通过观察多糖的重复单元（图2）轻松识别。5型重复单元由5种不同的残基组成，其中3种构成多糖的主链，其余2种是连接到中心N-乙酰-L-岩藻糖的分支的一部分。除了D-葡萄糖（主链的一部分）和D-葡萄糖醛酸（分支的一部分），还有两种罕见的去氧氨基残基完成结构：N-乙酰-L-肺炎球菌胺（L-PneuNAc）和2-乙酰氨基-2,6-二去氧-D-木糖己糖-4-酸（Sugp）。特别是，这种后一种酮胺糖的不稳定性，是主链的一部分，是结合疫苗制造问题的主要原因。事实上，在允许多糖与载体蛋白结合的还原胺化反应中，这种糖的酮基部分或全部被还原。使用还原胺化的常规条件，绝大多数Sug残基转变为三种可能的化合物：N-乙酰-D-奎诺糖胺（QuiNAc，酮官能团还原为醇官能团），N-乙酰-D-岩藻糖胺（FucNAc，N-乙酰-D-奎诺糖胺的异构体）和第三种由Sug残基更显著转化产生的副产品。发现Sug化合物向这种第三种副产品的转化对多糖的免疫原性有害，即使这种转化只是部分的，而QuiNAc或FucNAc转化没有显著影响。已经尝试通过修改结合条件来克服这个问题。一种可能的修改是将还原胺化反应的pH从8变为更酸性的pH（4至6.5之间），与常规方法相比，Sug残基的修饰程度至少降低了65%，其中大部分转化为QuiNAc，因此对结合免疫原性的影响较小。另一种可能性是将Sug完全转化为QuiNAc或FucNAc，使用强还原剂如NaBH4还原酮基团。然而，有必要将还原的多糖片段化，以重新引入末端醛基团，同时防止随后的还原胺化进行任何修饰。Seeberger和同事合成了一系列类似于Spn-5重复单元的寡糖。特别是，一个包含次级醇代替Sug残基的不稳定酮的片段，比多价Prevnar13疫苗诱导了更高的抗体滴度，具有显著更高的吞噬细胞杀菌特性和强大的免疫记忆。他们还用兔和人的参考血清证明，分支，特别是PneuNAc残基，主要参与抗体识别和亲和力，证实替换非必需的、不稳定的Sug的酮基团不影响免疫原性，从而成为一个有希望的更稳定的疫苗候选物。 图2 肺炎链球菌5型荚膜多糖重复单元的示意表示。 类型3 血清型3是一个特别的问题，值得讨论。尽管非疫苗血清型的出现，肺炎球菌结合疫苗(PCVs)在减少侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的发病率方面发挥了关键作用。然而，尽管血清型3被包含在13价肺炎球菌结合疫苗中，由Spn-3分离株引起的疾病发病率并未下降，且对该血清型的疫苗有效性报告为非显著性，导致它在一些疫苗效力研究中被记录为非疫苗类型。Spn-3产生大量的荚膜。与其他大多数血清型不同，Spn-3的荚膜不是共价连接到细菌表面，导致不断释放多糖。这可能导致远离细菌表面的荚膜结合抗体的杀菌能力降低。此外，与其他与IPD相关的血清型相比，Spn-3的病例携带者比例高，儿童已被证明携带高水平的血清型3抗体，这被认为是由于自然暴露率高，但携带持续时间较短，支持了这种血清型具有高度侵袭性的建议。此外，这种多糖的化学成分（图3）为其提供了一些特定特征，例如在琼脂平板上生长时呈现“湿润”或粘液状外观，这可能意味着其对体内调理素杀伤具有特殊的抗性。Choi等人评估了PCV13的血清型特异性保护效果。研究表明，0.2微升血清型3细菌培养上清液就足以压倒被动免疫小鼠中疫苗诱导抗体的保护效果。据估计，需要产生八倍的抗体才能诱导对血清型3侵袭性疾病的保护。值得注意的是，由Spn-3引起的疾病特别严重，包括肺炎并发症和不良心脏事件。 图3 肺炎链球菌血清型3荚膜多糖重复单元的示意图 →3)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→ 缺乏交叉保护 鉴于肺炎球菌CPSs的数量众多，理解它们的交叉保护是定义肺炎球菌疫苗配方最佳策略和评估疫苗效力的重要元素。事实上，在各种CPSs中，有些血清型的结构足够相似，可以进行抗体交叉保护，如血清型6、19、10（图4）。在血清型6A、6B、6C和6D中，它们在结构上略有不同。Spn-6A和Spn-6B是临床意义最大的。Spn-6B和Spn-6A多糖（图4）是线性共聚物，它们在单一结合位点上有所不同，并且已经表明血清型6B可以诱导与血清型6A交叉反应的抗体。两种血清型6B和6A都是感染的常见原因，但由于血清型6B的早期水解稳定性优于6A，早期商业肺炎球菌疫苗只包含血清型6B作为6群的唯一代表。然而，研究表明，尽管含有血清型6B的疫苗可以诱导与6A型交叉反应的抗体，但并非所有抗6B抗体都具有功能性交叉反应。 图4 肺炎链球菌血清型共享相似结构的示意图，预期应具有交叉保护：(A) Spn-6A 和 Spn-6B；(B) Spn-19A 和 Spn-19F；(C) Spn-10A, Spn-10B, Spn-10C 和 Spn-10F。 在过去的十年中，合成方法被用来生产几种Spn血清型共有的糖结构。与关键孔帽章鱼血蓝蛋白（KLH）蛋白结合的Spn-6B的合成糖片段，在小鼠和兔子中诱导了能够与血清型6B和6A交叉反应的抗体，并刺激了肺炎球菌血清型6A和6B的微生物细胞的吞噬作用。Spn-19A和Spn-19F多糖是另一个由非常相似的重复单元组成的血清型的例子，两者仅在糖苷键的位置上有所不同（图4）。然而，接种只含有血清型19F的肺炎球菌疫苗后，由血清型19A引起的感染数量增加，似乎表明这两种血清型之间没有抗体交叉保护，可能是由于两种多糖链之间的构象差异。几年前，合成了一个包含Spn-19A和Spn-19F重复单元的嵌合抗原，并与CRM197结合。在兔子中测试的结合物能够诱导高抗体滴度，能够识别原生血清型19A和19F。此外，抗体能够杀死两种肺炎球菌菌株。其他研究人员合成了含有不同组合的常见二糖ManNAc-β-(1→4)-Glc的化合物库，存在于Spn-19F和19A的重复单元中，通过微阵列格式表明，上游端磷酸化的二糖被免疫兔子的参考血清中的抗体强烈识别，无论是针对Spn-19F还是19A。血清型10包括五种变体：10A、10B、10C、10F和最近识别的10D。其中，Spn-10A已被包含在最新一代的PCVs中（表1），是最常见的。Spn-10A、Spn-10B、Spn-10C和Spn-10F由一个重复单元组成，其骨架由半乳糖呋喃糖、半乳糖吡喃糖、N-乙酰半乳糖胺和核糖醇磷酸组成，主要在核糖醇磷酸的糖苷键位置和侧链替代上有所不同（图4）。新的血清型10D则与其它血清型相比具有明显不同的骨架。血清型Spn-10A、Spn-10B、Spn-10C和Spn-10F之间的交叉反应性复杂，结构原因尚不清楚，针对一种血清型产生的血清型特异性兔子抗血清能够识别其他血清型，尽管亲和力较低。Ravenscroft和Kuttel最近发表了一项分子建模研究，与相关的血清学研究一起支持将血清型10A包含在疫苗中，以最好地保护免受10型疾病的侵害。 肺炎球菌结合疫苗对中耳炎的影响 不幸的是，基于荚膜的疫苗在对抗侵袭性疾病方面的成功被其在粘膜部位（如肺炎和中耳炎）的弱效性所抵消。像许多其他成功的细菌病原体一样，肺炎球菌会经历相位变异，在此过程中，表面成分（如荚膜）会从高水平随机变化到低水平表达。特定相位变体在不同解剖部位的频率是宿主环境中解剖部位特异性选择压力的结果。粘膜表面的细菌已被证明比血液分离的对应物的包膜化程度要低，从而暴露出表面粘附素，使针对荚膜的抗体在促进粘膜水平的调理吞噬作用上处于不利地位。除了这种对利基的遗传适应外，新近认识到的荚膜脱落现象也降低了抗荚膜抗体的效力。当进入肺部时，肺炎球菌会遭遇抗菌肽，作为一种防御，细菌在数小时内脱落大部分荚膜，这可能使基于荚膜的疫苗在这些情况下的效力降低。在急性中耳炎（AOM）感染中也观察到一些血清型特异性。AOM是儿童呼吸道感染的重要疾病，也是医生就诊和抗生素处方的主要原因。血清型19A ST320似乎是肺炎球菌乳突炎的主要病因，这是一种AOM的化脓性并发症，即使用高剂量的β-内酰胺类抗生素治疗，这种血清型也会引起持续症状。在台湾，Spn-19A ST320克隆在低PCV7疫苗接种率下非常普遍。大约50%的5岁以下儿童的IPD病例是由Spn-19A ST320引起的。在2009年至2012年间对0-18岁AOM患者进行的一项回顾性研究中，通过取样中耳液，观察到436例中有108例（24.8%）是肺炎球菌AOM。血清型19A ST320（50例，58.8%）是与AOM最频繁相关的血清型。在西班牙进行的另一项研究中，在2010年引入PCV13之前和之后分析了肺炎球菌OM的流行病学。在2008年至2016年间，收集了2653名14岁以下OM儿童的中耳渗出物，其中235例（8.9%）分离出肺炎球菌。204个可用的分离株在三个3年期间进行了血清分型：一个在PCV13引入之前，两个在引入之后。研究表明，PCV13的引入确实改变了肺炎球菌OM的流行病学，疫苗血清型的比率下降，非疫苗血清型的多样性增加，以及每个地区不同单一克隆的克隆扩散。观察到的例外情况如血清型3的持续存在和血清型19F的微弱再现。在美国进行的一项更大规模的纵向观察研究中，涉及在私人儿科诊所就诊的健康儿童，对接受了完整基础系列PCV13疫苗接种的30个月以下儿童进行了随访，直到30-36个月大，通过收集中耳液（MEF）来识别AOM发作。评估了PCV7和PCV13共有的AOM MEF血清型（4、6B、9V、14、18C、19F和23F）以及PCV13特有的六个额外血清型（1、3、5、6A、7F和19A）。对照组来自2007年至2009年进行的另一项纵向研究，新生儿接种了PCV7，AOM发作时前瞻性收集MEF，并随访至30个月大。研究表明PCV13在减少与肺炎球菌相关的AOM方面是有效的，特别是由PCV7中额外的六个血清型引起的发作。在AOM期间获得的MEF样本中，PCV13中六个额外血清型的相对减少了86%，血清型19A的相对减少了91%。在接种PCV13的儿童的MEF样本中未鉴定出血清型6A分离株。尽管两个队列中这种血清型的发病率都很低，但未发现由荚膜血清型3引起的AOM儿童数量有所减少。在PCV13中的三个额外血清型，即1、5和7F，两个队列中均未检测到。值得注意的是，尽管它存在于PCV7和PCV13中，但血清型19F的疾病发病率相当可观，尽管比PCV7引入前低得多。基于对OM处方分析的额外论文巩固了这一发现，即尽管在引入PCV7和PCV13后观察到了减少，但所有年龄段儿童的AOM疾病负担仍然很高。总体而言，这些研究支持PCV疫苗接种对OM的部分影响，并强调了根据AOM病因和循环肺炎球菌血清型的效力变化性。 制作结合疫苗的新技术 尽管肺炎球菌结合疫苗(PCVs)广泛使用并随之减少了疾病，但研究仍在积极进行，正在探索创新技术以合成更高价的多糖基疫苗，这些疫苗具有更高的效力、覆盖面，并降低成本。事实上，开发包含额外血清型的PCVs仍然是公共卫生的优先事项，因为血清型替代和向非疫苗含有血清型的转变。将额外的血清型纳入现有的PCVs导致对个别血清型的免疫反应减少，很可能是由于载体抑制。一种24价PCV（VAX-24, Vaxcyte）基于无细胞蛋白合成（CFPS）平台正在健康成人中进行1/2期试验（NCT05266456）。这种结合方法提出了使用含有多个非天然氨基酸（nnAAs）的eCRM载体蛋白，这些氨基酸位于主要T细胞表位区域之外，通过点击化学实现肺炎球菌CPSs的位点特异性共价结合。这导致了一个更一致的结合过程，并增加了多糖：蛋白比例，使得包含更多血清型的同时最小化载体介导的免疫学干扰。在兔子研究中，VAX-24显示出与Prevnar13相当的IgG反应和OPA滴度，并且高于PPV23。已经生产并证明了血清型1、2、3、5和8的完全或半合成寡糖与PCV13在小鼠和兔子模型中相当或更优。合成寡糖可以设计成携带用于位点选择性蛋白结合的连接物，同时保持保护表位完整。化学合成的结合物可以独立使用或作为当前PCV13配方的补充。此外，还开发了蛋白质荚膜基疫苗（PCMVs），避免了在碳水化合物表位中引入不需要的修饰：PCMVs是通过混合CPS、载体蛋白和化学交联剂形成的聚集体，其中未修饰的CPS与蛋白质一起被捕获。PCMVs的免疫原性取决于颗粒大小，表明较大的颗粒可能更可被抗原呈递细胞优先摄取。外膜囊泡（OMV）也被提出用于展示Spn-14糖苷。OMV结合了免疫刺激的最佳大小与多种抗原展示和自我佐剂特性。细菌被设计在OMV上展示糖链，产生了所谓的glyOMV，简化了不包括任何结合步骤的制造过程。在小鼠中，Spn-14 glyOMV诱导的IgG和调理吞噬活性与PCV13诱导的相当。PCVs无法保护非疫苗血清型和未包膜细菌，其他限制包括由于复杂配方导致的高成本、某些血清型的低免疫反应和需要多次剂量，这使得它们不太可能在需求最高的发展中国家广泛使用。因此，一种提供广泛血清型覆盖、诱导粘膜和系统免疫并阻碍初级鼻内定植以及侵袭性疾病的肺炎球菌疫苗是非常理想的。跨肺炎球菌血清型保守的蛋白质抗原可能提供一种替代血清型限制疫苗策略的方法。关于对定植的影响，蛋白质可能发挥基础作用。大多数已研究的肺炎球菌分离株表现出基于其不透明或透明菌落的两种形态之间的相位变异。在定植的初始阶段，表达较薄荚膜和其他促进与宿主组织结合的特性的透明变体优于不透明变体。事实上，一旦到达上皮表面，厚荚膜的表达似乎对肺炎球菌不利，因为它对粘附有抑制作用。此外，尽管抗荚膜抗体未能保护已经建立的鼻咽炎定植，但对肺炎球菌粘附素的抗体可以部分阻断定植的启动并减少鼻咽部的肺炎球菌负担。同样，已经发现，尽管自然获得的对IPD的免疫被认为依赖于抗荚膜抗体，但Spn的鼻咽部定植也诱导了对可能具有保护作用的蛋白质抗原的抗体。不幸的是，尽管许多这些蛋白质的临床前评估显示了被动转移免疫血清在预防小鼠的败血症和致命性肺炎中的效力，通常针对多种肺炎球菌血清型，但肺炎球菌蛋白疫苗在人类中尚未显示出很大的效力。然而，蛋白质可以被认为是PCVs的附加值，以克服它们的一些限制。一种名为多重抗原呈递系统（MAPS）的新技术开发平台从Affinivax公司已经被用于开发一种结合了24种肺炎球菌CPS和两种保守肺炎球菌蛋白融合的疫苗，具有载体和抗原的双重作用。该平台利用生物素和根瘤菌素之间的高亲和力、非共价结合，并将肺炎球菌蛋白的潜力与CPSs所引起的保护结合起来。使用生物素-根瘤菌素系统，蛋白质表位保持完整，也增加了抗蛋白质T细胞反应。最近，1期试验的结果在2期试验中得到了确认，其中疫苗候选物显示出与Prevnar13共享的13种血清型的IgG和OPA免疫反应相似或更好。 这项技术还表明，CPS与载体蛋白之间的直接共价连接不是启动T依赖性反应所必需的，而是需要两个组分的共呈递。只要CPS与蛋白质之间的相互作用能在内质网环境中存活，由此产生的抗原应该能够招募T细胞帮助。与蛋白质载体非共价结合的CPS，无论是附着在细菌大小的乳胶珠上，都显示出与PCVs相似的行为。这方面的一个优势是使用肺炎球菌表面蛋白A（PspA）作为载体。为了克服在单一疫苗中包含许多CPS类型的困难和成本，也探索了全细胞疫苗作为替代品。由于安全原因和免疫接种后产生的复杂免疫反应，这类疫苗的开发并不那么直接。这些替代品要用于人类还需要一段时间。 分析挑战，因为许多结合物以多价形式组合 新疫苗中包含的多糖血清型数量不断增加，最近在Affinivax 和Vaxcyte 的1/2期测试中达到24种，这对疫苗制造商在疫苗配方以及产品释放的分析测试方面都构成了巨大挑战。对于单价工艺中间体（即，纯化的普通多糖，多糖-蛋白结合物-药物物质）和多价疫苗配方的测试，通常用Alum佐剂（药物产品），已经开发了一系列方法。在表2、3和4中，报告了用于纯化普通多糖、药物物质和药物产品的分析方法的示例列表。迄今为止使用的一些测试可能会被先进技术所取代，以增强分析控制并简化分析小组。例如，NMR也可用于纯化多糖中间体中的多糖和酒精含量测定。虽然现有的检测方法在单价工艺中间体（即，纯化的多糖，药物物质）的水平上似乎是可行的，即使需要新的试剂（抗体）进行免疫测试，但对于多价药物产品的产特性，抗原数量的增加显著增加了检测的复杂性，如干扰、交叉反应等。还需要多重方法来减少每个单独检测的时间和成本。 许可策略 通过比较每个血清型与之前许可的疫苗的免疫原性，评估了基于结合物的疫苗对不同年龄人群中IPD的有效性。例如，PCV20对IPD和肺炎的有效性是从与美国许可的肺炎球菌疫苗（PCV13和PPV23）的比较免疫原性推断出来的。通过OPA检测测量了PCV20和对照肺炎球菌疫苗所诱导的免疫反应。OPA检测用于测量对Spn的功能性抗体。在60岁及以上的成人中，PCV20诱导的所有13种匹配血清型的免疫反应在接种疫苗一个月后不逊于PVC13诱导的血清型。令人惊讶的是，在接种疫苗一个月后，PCV20诱导的7种额外血清型中的6种的免疫反应不逊于PPSV23诱导的相同血清型的免疫反应。血清型8的反应在统计上没有达到非劣性标准，差距很小。考虑到PCV20和PCV13在制造和配方方面的相似性，PCV13在预防疫苗型肺炎球菌IPD和CAP方面的有效性支持了PCV20可能的有效性，特别是对13种常见血清型。尽管如此，计划在65岁及以上的成人中进行一项研究，以确认PCV20预防由7种新血清型引起的肺炎的临床效益。 结论 尽管有100多种Spn血清型，但大多数致病株都被目前可用的PCVs所覆盖。然而，由于疫苗接种导致的血清型替代和主要血清型的区域差异，需要扩大现有疫苗以包含额外的血清型。研究仍然非常活跃，旨在降低制造成本，增加血清型覆盖范围，避免与增加价数相关的免疫干扰和载体表位抑制可能引起的问题。此外，针对Spn的疫苗的高成本是使用的一个重大障碍。结合疫苗领域的进展可以帮助简化疫苗制造和分析，尽管所需疫苗的组成复杂，通过在疫苗配方中增加保守的蛋白质抗原来增加保护，并克服与特定Spn结构和化学（例如，Spn-1和Spn-5）相关的一些限制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言 原发性卵巢功能不全（Primary Ovarian Insufficiency, POI）是一种常见的生殖系统疾病，影响着1-4%的女性，其特征是在40岁之前出现闭经和生育能力的丧失。POI不仅会严重影响女性的生育能力，还与心血管疾病、骨质疏松症和早衰等多种健康问题相关。因此，了解POI的发病机制对于早期诊断和干预至关重要。 在过去的几十年中，基于全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）的研究方法，使得研究人员能够发现多种与卵巢功能相关的遗传变异。然而，绝大多数研究采用的是加性模型（additive model），即假设每个变异等位基因独立地对表型产生影响。这种方法虽然成功鉴定了多个与绝经年龄（Age of Menopause, AOM）相关的基因位点，但由于忽略了其他可能的遗传模型，其对一些低频、高效应的变异的检测能力有限。 8月27日Nature Genetics的研究报道“Homozygosity for a stop-gain variant in CCDC201 causes primary ovarian insufficiency”，正是在这一背景下开展的。研究人员针对174,329名来自冰岛、丹麦、英国和挪威的绝经后女性，采用隐性模型（recessive model）进行了GWAS分析，旨在识别那些对AOM具有显著影响的低频遗传变异。在此过程中，研究人员发现了CCDC201基因中的一个截断突变(rs117316434)，该变异以纯合子形式存在时，会导致女性提前9年进入绝经，并且在这些纯合子中，近一半会发展为POI。 CCDC201基因直到2022年才被确定为编码蛋白质的基因，该蛋白质在卵母细胞中高度表达。然而，这一突变导致的蛋白质功能丧失对于卵巢功能产生了显著影响，促使女性的生育窗口显著缩短。这项发现不仅为POI的遗传机制提供了新的见解，也凸显了在基因筛查中考虑不同遗传模型的重要性。 基于这项研究的结果，携带CCDC201基因截断突变的女性可能需要更早进行生殖健康咨询和相关干预，以应对潜在的提前绝经及其带来的健康风险。这一发现为生殖健康领域的个性化医疗和早期干预提供了重要的科学依据。 近年来，随着社会的发展，女性推迟生育的趋势越来越明显。然而，这一趋势与女性生理上的自然衰老过程存在矛盾，特别是与卵巢功能的下降密切相关。原发性卵巢功能不全（Primary Ovarian Insufficiency, POI）是影响女性生育能力的主要因素之一，约有1-4%的女性在40岁之前因卵巢功能丧失而进入绝经。尽管通过全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）已经鉴定出多个与绝经年龄（Age of Menopause, AOM）相关的基因变异，但大多数研究都集中在加性模型（Additive Model）下，而对隐性模型（Recessive Model）的探索相对较少。 在这项研究中，研究团队通过全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）对174,329名绝经后女性样本进行了详细的分析，旨在寻找与绝经年龄（Age of Menopause, AOM）显著相关的低频遗传变异。该研究的特别之处在于采用了隐性模型（Recessive Model），而非通常使用的加性模型（Additive Model），从而识别出那些可能因加性效应被忽略的关键变异。 样本数据来自四个国家，分别是冰岛（27,281人）、英国（137,906人）、丹麦（5,978人）和挪威（3,161人）。这些女性的基因组数据通过高覆盖度的全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）获得，总共分析了3.93千万个序列变异。为了保证分析结果的准确性，研究团队首先排除了受外科手术（如子宫切除术或卵巢切除术）影响的样本，确保所有被纳入分析的女性均为自然绝经。接下来，通过质量控制和混合线性模型（Mixed Linear Model）校正可能的混杂因素，如种群结构和潜在的基因型偏倚。 在研究中，研究团队通过对这些绝经后女性样本进行GWAS分析，发现了一个与绝经年龄（Age of Menopause, AOM）显著相关的低频截断变异，即CCDC201基因中的p.(Arg162Ter)变异（rs117316434）。 CCDC201基因位点（7q12.3）区域的关联图（Credit: Nature Genetics） 该图显示了该区域内所有变异与绝经年龄（Age of Menopause, AOM）之间的关联强度，每个点代表一个单核苷酸多态性（SNP），Y轴表示这些变异与AOM的关联显著性（以-log10(P)表示）。图中，p.(Arg162Ter)变异被标记为一个钻石形状，突出了该突变在该区域内与AOM显著相关。图中还可能展示了邻近基因及其与p.(Arg162Ter)变异的连锁不平衡（LD）情况，这有助于了解该突变在基因组中的具体位置及其与周围变异的关系。整体结果强调了p.(Arg162Ter)变异在该区域内作为主要影响因子的突出地位。 CCDC201基因变异对绝经年龄的影响 研究中发现，在携带p.(Arg162Ter)变异的女性中，该变异的纯合子（homozygotes）与杂合子（heterozygotes）及非携带者相比，绝经年龄平均提前了9年（P=1.3×10^-15）。冰岛样本中，6名携带纯合子变异的女性的平均绝经年龄为40岁，而非携带者的平均绝经年龄为48岁（差异8年）。英国样本中，16名携带纯合子变异的女性平均绝经年龄为40.8岁，而非携带者的平均绝经年龄为50.3岁（差异9.5年）。在丹麦和挪威样本中，尽管样本量较小，但也观察到类似的趋势，分别为10年和7.6年的提前。 不同人群和基因型下的绝经年龄分布情况（Credit: Nature Genetics） 图中按基因型（即携带p.(Arg162Ter)变异的纯合子、杂合子和未携带者）分别展示了各组女性的绝经年龄分布，并将这些数据进一步细分为不同的人群（例如冰岛、英国、丹麦和挪威等）。结果显示，携带p.(Arg162Ter)变异的纯合子女性的绝经年龄明显早于杂合子和未携带者，且这一趋势在不同人群中一致。 生育能力的影响 除了绝经年龄的显著提前，p.(Arg162Ter)变异还对女性的生育能力产生了重要影响。数据显示，携带该变异的女性比未携带者平均少生一个孩子（P=0.00011）。特别是：在携带该变异的女性中，只有16%在30岁之后仍有生育，而在非携带者中，这一比例高达51%。17名携带该变异的纯合子女性的最后一次生育年龄比非携带者平均提前了5年（P=3.8×10^-5）。携带p.(Arg162Ter)变异的女性更可能没有孩子或只生一个孩子，进一步证实了该变异对生育能力的负面影响。 不同人群和基因型下的生育年龄和生育子女数量的分布情况（Credit: Nature Genetics） 图中根据基因型（即携带p.(Arg162Ter)变异的纯合子、杂合子和未携带者）分别展示了各组女性的生育年龄（即母亲生育时的年龄）和生育的子女数量。这些数据同样被细分为不同的人群（如冰岛、英国、丹麦和挪威等）进行分析。结果显示，携带p.(Arg162Ter)变异的女性通常在较早的年龄生育，而且她们的生育子女数量比未携带者明显减少。这一趋势在不同人群中均表现出一致性。 此外，图中还展示了不同基因型下的生育年龄和子女数量的重叠情况，进一步强调了p.(Arg162Ter)变异对女性生育能力的显著影响，以及这一影响在人群间的普遍性。这些结果表明，携带该变异的女性不仅绝经年龄提前，生育能力也显著下降。 不孕症的风险 研究还发现，携带p.(Arg162Ter)变异的女性患不孕症的风险显著增加。具体而言，这些女性被诊断为不孕症的几率是非携带者的7.3倍（P=0.00019）。 对其他生殖和身体特征的影响 研究团队还分析了p.(Arg162Ter)变异对34个其他生殖、人体测量和激素特征的影响。然而，除了对绝经年龄和生育能力的显著影响外，p.(Arg162Ter)变异未对性激素水平、体重指数（BMI）或男性生殖能力等其他指标表现出显著关联。这表明该变异的效应主要集中在女性的卵巢功能上。 CCDC201基因的表达特征 CCDC201基因编码的是一种富含螺旋结构域的蛋白质。根据研究数据，该基因在女性的生殖系统中，尤其是在卵母细胞（oocytes）中表现出较高的表达水平。这一发现基于对不同组织的RNA测序（RNA-seq）数据和蛋白质表达数据的分析，显示CCDC201基因在卵巢、乳腺和胎盘中的表达最为显著。此外，单细胞RNA测序数据也表明，该基因在卵母细胞中的表达高于其他组织。 在研究中，研究人员分析了不同年龄段女性卵巢组织中CCDC201基因的表达水平，发现该基因在20-49岁的女性卵巢中表达最为显著，而在50岁以上的女性中表达几乎消失。这表明，CCDC201基因的表达与女性的生殖年龄密切相关。 CCDC201基因突变的分子机制 p.(Arg162Ter)变异是一个截断突变，位于CCDC201基因的第三个也是最后一个外显子中。这一突变导致CCDC201蛋白的C端缺失了25个氨基酸。虽然这一段缺失的具体功能尚未完全明确，但研究人员推测，这一突变可能通过以下几种机制影响卵母细胞的发育和卵巢功能： 蛋白质功能丧失：由于p.(Arg162Ter)突变位于CCDC201基因的最后一个外显子，这一截断突变可能导致蛋白质在翻译后的稳定性降低，或直接导致蛋白质无法正常折叠和功能化。研究中指出，这25个丢失的氨基酸在哺乳动物中高度保守，提示它们在蛋白质的结构和功能中起到关键作用。 卵母细胞的早期耗竭：CCDC201蛋白在卵母细胞中的高表达及其与卵母细胞发育相关的推测功能表明，p.(Arg162Ter)变异可能导致卵母细胞的加速耗竭。卵母细胞数量的减少会直接影响卵巢储备，导致女性在较早的年龄进入绝经（AOM提前）。 与其他生殖调控基因的相互作用：研究中还提到，CCDC201基因是卵母细胞特异性转录因子FIGLA的下游靶基因。FIGLA已知在早期卵泡发生中发挥作用，而CCDC201作为其下游靶基因，可能在调控卵母细胞存活和发育方面起到重要作用。因而，p.(Arg162Ter)突变可能通过干扰这些关键发育过程，进一步加速卵母细胞的消耗。 基因突变的频率与人群分布 在不同的北欧人群中，p.(Arg162Ter)突变的次等位基因频率（MAF）约为0.74%到1.15%。该变异在北欧的分布呈现出由北向南逐渐减少的趋势。例如，在斯堪的纳维亚人群中，这一变异的频率最高（AF=1.25%），相当于每6,400人中有1人是纯合子，而在东南欧人群中，这一频率最低（AF=0.11%），即每826,000人中才有1人是纯合子。 研究还指出，这一变异在亚洲和非洲裔人群中的频率非常低，几乎可以忽略不计。这种显著的地理和种族差异表明，p.(Arg162Ter)突变可能是特定人群中的遗传“瓶颈”或特定区域内基因漂变的结果。 功能研究与未来方向 目前，关于CCDC201基因和p.(Arg162Ter)变异的功能研究仍处于初步阶段。虽然研究表明这一变异对女性生殖健康有重大影响，但其确切的分子机制还需要通过进一步的实验研究来揭示。未来可能的研究方向包括： 蛋白质结构功能分析：利用生物信息学工具和实验方法，解析p.(Arg162Ter)突变导致的蛋白质结构变化，探索其对蛋白质功能的影响。 动物模型研究：由于CCDC201基因在哺乳动物中高度保守，可以通过建立动物模型（如小鼠模型）进一步研究这一基因在卵母细胞发育中的作用，以及p.(Arg162Ter)突变的具体影响。 临床研究和应用：将这一发现应用于临床实践，特别是在早期筛查和生殖健康管理中，开发基于CCDC201基因的诊断和治疗方案。 该研究的结果表明，携带CCDC201基因p.(Arg162Ter)突变的女性可能需要更早进行生殖健康咨询和相关干预，以应对潜在的提前绝经及其带来的健康风险。该突变的识别为早期诊断和预防措施的制定提供了重要依据。例如，可以建议携带该突变的女性考虑早期冻卵或其他生育保留措施，以减少生育能力下降带来的负面影响。此外，这一发现也为生殖健康领域的个性化医疗和基因筛查提供了新的思路，帮助识别高风险个体，从而制定更为有效的管理方案。 参考文献 Oddsson A, Steinthorsdottir V, Oskarsson GR, Styrkarsdottir U, Moore KHS, Isberg S, Halldorsson GH, Sveinbjornsson G, Westergaard D, Nielsen HS, Fridriksdottir R, Jensson BO, Arnadottir GA, Jonsson H, Sturluson A, Snaebjarnarson AS, Andreassen OA, Walters GB, Nyegaard M, Erikstrup C, Steingrimsdottir T, Lie RT, Melsted P, Jonsdottir I, Halldorsson BV, Thorleifsson G, Saemundsdottir J, Magnusson OT; DBDS Genomic Consortium; Banasik K, Sorensen E, Masson G, Pedersen OB, Tryggvadottir L, Haavik J, Ostrowski SR, Stefansson H, Holm H, Rafnar T, Gudbjartsson DF, Sulem P, Stefansson K. Homozygosity for a stop-gain variant in CCDC201 causes primary ovarian insufficiency. Nat Genet. 2024 Aug 27. doi: 10.1038/s41588-024-01885-6. Epub ahead of print. PMID: 39192094. https://www.nature.com/articles/s41588-024-01885-6 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述

CINCINNATI, July 06, 2023 (GLOBE NEWSWIRE) -- Blue Water Biotech, Inc. (“Blue Water” or the “Company”) (Nasdaq: BWV), a biotechnology and pharmaceutical company focused on developing and commercializing transformational therapies to address significant health challenges globally, today announced the signing of a Master Services Agreement with bfw Advertising Inc. (“bfw”) to generate marketing and advertising material for Blue Water’s commercial stage drug portfolio. Based in Boca Raton, Florida, bfw has more than three decades of experience supporting clinical and commercial stage life science companies, generating effective and impactful brand campaigns, including digital, direct to consumer, and health care provider content. Bfw will work with Blue Water’s commercial team to increase awareness for its commercial products through patient-facing materials, website updates, social ads, targeted provider engagement, as well as materials to support Blue Water’s sales team, among other services. “Signing this agreement and generating an action plan with bfw is a critical step in the execution of our commercial launch strategy for our products,” said Joseph Hernandez, Chairman and Chief Executive Officer of Blue Water. “By creating targeted, effective marketing materials, we can maximize patient, healthcare provider, and payor awareness to ensure long-term success for Blue Water. With their impressive history of campaigns in the life science industry, we are confident that bfw is the right firm for this endeavor, and we look forward to the official launches of these programs in the coming months.” “With their recent acquisitions and shift into a commercial-stage as well as clinical-stage company, this is certainly an exciting time for the team at Blue Water,” said Christian Boswell, President and Creative Director at bfw. “Through decades of working in the life science industry, we understand the intricacies of marketing and advertising in this space and how challenging it can be for pharmaceutical companies to create cohesive brands. Blue Water has built a strong portfolio of products in recent months, and we are honored to utilize our institutional knowledge to support them and to help them navigate the commercial arena.” Blue Water recently expanded its operations to become a commercial stage company with the acquisition of several FDA approved assets across multiple indications, including urology, cardiology, inner ear infections and pain management. Blue Water’s commercial team will work closely with BFW to identify key areas where targeted advertising and marketing support can enhance product uptake and utilization in each respective market. About Blue Water Biotech Blue Water Biotech, Inc. is a biotechnology and pharmaceutical company focused on developing and commercializing transformational therapies to address significant health challenges globally. Headquartered in Cincinnati, OH, the Company owns ENTADFI®, an FDA-approved, once daily pill that combines finasteride and tadalafil for the treatment of benign prostatic hyperplasia. This combination allows men to receive treatment for their symptoms of benign prostatic hyperplasia without the negative sexual side effects typically seen in patients on finasteride alone. The Company also has a robust vaccine pipeline. Blue Water holds the rights to proprietary technology developed at the University of Oxford, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, St. Jude Children’s Hospital, and The University of Texas Health Science Center at San Antonio. Blue Water is developing a Streptococcus pneumoniae vaccine candidate, designed to specifically prevent highly infectious middle ear infections, known as AOM, in children, and prevention of pneumonia in the elderly. The Company is also developing a universal flu vaccine that will provide protection from all virulent strains in addition to licensing a novel norovirus S&P nanoparticle versatile virus-like particle vaccine platform from Cincinnati Children’s to develop vaccines for multiple infectious diseases, including Marburg and monkeypox, among others. Additionally, the Company is developing a Chlamydia vaccine candidate with UT Health Science Center San Antonio to prevent infection and reduce the need for antibiotic treatment associated with contracting Chlamydia disease. For more information about Blue Water, visit www.bwbioinc.com. About BFW Advertising Bfw is a full-service integrated branding and communications agency with a strong grounding in healthcare and pharma, supporting both clinical and commercial stage companies. Bfw has worked across a broad range of brands and therapeutic areas, including men’s and women’s health, CNS, pediatrics, oncology, pain management, pulmonary and HIV-associated disorders, as well as leading recruiting campaigns for clinical trial participants. Cautionary Note Regarding Forward-Looking Statements Certain statements in this press release are forward-looking within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. These statements may be identified by the use of forward-looking words such as “anticipate,” “believe,” “forecast,” “estimate,” “expect,” and “intend,” among others. These forward-looking statements (including, without limitation, the anticipated benefits of the Company’s agreement with BFW and the Company’s sales and marketing efforts as described herein) are based on Blue Water’s current expectations and actual results could differ materially. There are a number of factors that could cause actual events to differ materially from those indicated by such forward-looking statements. These factors include, but are not limited to, risks related to Blue Water’s ability to realize the benefits of its acquisitions of ENTADFI®, ZONTIVITY®, OTOVEL®, CETRAXAL®, CONJUPRI®, TREZIX™ and NALFON®; risks related to Blue Water’s ability to expand its business scope, commercialize ENTADFI® and integrate the assets and commercial operations being acquired from WraSer into Blue Water’s business; risks related to Blue Water’s ability to attract, hire and retain skilled personnel and establish an effective sales team; risks related to Blue Water’s ability to enter into a definitive agreement with IQVIA and optimize its collaboration with IQVIA; risks related to the development of Blue Water’s vaccine candidates; the failure to obtain FDA clearances or approvals and noncompliance with FDA regulations;; risks related to the timing and progress of clinical development of our product candidates; our need for additional financing; uncertainties of patent protection and litigation; uncertainties of government or third party payor reimbursement; limited research and development efforts and dependence upon third parties; and substantial competition. As with any commercial-stage pharmaceutical product or any product candidate under clinical development, there are significant risks in the development, regulatory approval and commercialization of pharmaceutical products. Blue Water does not undertake an obligation to update or revise any forward-looking statement. Investors should read the risk factors set forth in Blue Water’s Annual Report on Form 10-K, filed with the Securities and Exchange Commission (the “SEC”) on March 9, 2023 and periodic reports filed with the SEC on or after the date thereof. All of Blue Water’s forward-looking statements are expressly qualified by all such risk factors and other cautionary statements. The information set forth herein speaks only as of the date thereof. Media Contact Information:Blue Water Media RelationsTelephone: (646) 942-5591 Email: Nic.Johnson@russopartnersllc.com Investor Contact Information:Blue Water Investor RelationsEmail: investors@bwbioinc.com