Corneal Dystrophy, Fleck

▎药明康德内容团队编辑（来源：上海交通大学） 癫痫是常见和重要的神经系统疾病之一，其特征是由于神经元活动异常导致的反复发作且无诱因的异常放电。癫痫的病因非常复杂，但大量证据表明，铁元素通过直接或间接方式对不同病因的癫痫发作起到重要作用。失调的铁代谢与氧化应激紧密相关，这种氧化应激加剧了中枢神经系统细胞的功能障碍和损伤，导致铁过载和铁死亡。铁过载还促进了脂质过氧化，损害蛋白质功能，这可导致皮层和皮层下结构之间的铁重新分布。 此外，通过减少铁积累、改变铁蛋白和减轻氧化损伤，可以在药理学上缓解由铁介导的癫痫。因此，精确量化铁含量是诊断、监测和个性化治疗癫痫的一个有价值的目标。鉴于铁在癫痫中的关键作用，开发一种具有特异性和非侵入性的在体铁成像技术尤为重要。然而，传统的铁成像技术如磁敏感加权成像、R2*弛豫率，以及定量磁化率成像技术等在临床铁检测方面表现出低的灵敏度和特异性。 为了解决上述技术瓶颈，上海交通大学生物医学工程学院/磁共振诊疗高端技术国家工程研究中心的魏红江团队开发了超分辨亚体素定量磁化率成像技术，可以超越磁共振成像分辨率极限精准解析体素内多成分，实现精准定量。与上海交通大学医学院附属瑞金医院脑病中心徐纪文教授团队合作，在癫痫研究中首次实现了铁病理特异的临床在体定量成像。 这项进展不仅实现了对铁特异性病灶的精准诊断，还揭示了异常的病理铁沉积与中枢神经系统细胞，特别是星形胶质细胞之间的广泛关联，为癫痫疾病的诊断、监测和个性化治疗提供了新的影像学工具。该研究成果已经发表于《科学-进展》（Science Advances）期刊上。 研究团队通过对脑组织中铁元素的信号进行建模，开发新型亚体素定量成像技术（subvoxel Quantitative Susceptibility Mapping）分离了体素内部脑组织中的顺磁性和反磁性物质效应，实现了以铁主导的顺磁性磁化率成像技术。在癫痫患者术前临床影像实验中，该技术与当前临床用于诊断癫痫病灶的金标准18F-FDG-PET低代谢指标相比，展现了良好的一致性，并提供了超分辨率的病灶定位。 此外，通过术后对离体癫痫病灶样本进行超高分辨率顺磁性磁化率影像重建、病理组织染色以及质谱分析（LA-ICP-TOF-MS），发现癫痫患者体内顺磁性磁化率值与铁含量之间存在显著相关性（R=0.6, P<0.001）。在所招募的癫痫患者队列中，35.9%（共156例中的56例）显示出铁过载现象，而5.8%（即156例中的9例）则表现出缺铁状况。这些结果表明，顺磁性磁化率成像有望成为表征与铁相关的癫痫患者的生物标志物。 ▲图1. 亚体素定量磁共振成像获得的顺磁性磁化率影像能够准确揭示和量化在体病灶区中铁沉积的异质性（图片来源：原始论文[1]） 研究团队对多种不同癫痫亚型（包括FCD I、FCD IIa、FCD IIb和神经上皮肿瘤）的离体组织进行了顺磁性磁化率影像重建及铁质谱分析，并针对每种亚型样本的病灶区及其周边组织绘制了深度曲线图。结果显示，不同亚型癫痫中铁沉积的模式存在显著差异：FCD I型癫痫中，铁沉积仅限于浅表白质区域；FCD IIa型癫痫中，铁沉积主要出现在浅表白质以及更深的白质区；FCD IIb型癫痫中铁沉积则集中在皮层到浅表白质区域；而在由神经上皮肿瘤引发的癫痫中，铁沉积广泛分布在整个病灶区。这些发现表明，不同类型的癫痫具有独特的铁分布模式，且异常的铁分布破坏了原有的皮层层状结构，暗示病灶区内细胞类型的改变。这为进一步理解癫痫的病理机制提供了新的视角。 ▲图2.顺磁性磁化率和铁元素深度曲线揭示了铁超载癫痫病灶皮质层状结构的破坏（图片来源：原始论文[1]） 在铁沉积溯源分析实验中，研究团队采用细胞-铁共染色技术来观察铁与星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元的共定位情况。实验结果显示，铁沉积确实与中枢神经系统细胞存在共定位现象，尤其是与星形胶质细胞的共定位最为显著，表明过量沉积的铁主要集中在这些中枢神经系统细胞内。 具体而言，在所研究的样本中，癫痫灶神经细胞中的铁含量显著高于周围组织，并且观察到星形胶质细胞数量增加了339%，小胶质细胞数量增加了196%。此外，还发现了星形胶质细胞形态异常（表现为较短的分支突起）和萎缩的神经元。这些发现强调了中枢神经系统细胞在癫痫中铁过量积累及其代谢过程中的关键作用，证实了它们对铁过载现象的贡献，并表明这种变化可以通过活体顺磁性磁化率影像技术捕捉到。这一成果为理解癫痫的病理机制提供了新的思路，并为癫痫的精准诊策略提供了新希望。 ▲图3. 癫痫病灶组织中的铁沉积被隔离在收缩的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元中。星形胶质细胞和小胶质细胞在铁沉积组织大量增生（图片来源：原始论文[1]） 该研究证实了基于亚体素定量成像（subvoxel QSM）中顺磁性磁化率作为一种脑铁影像标志物，能够实现对癫痫中铁病理学的在体定量成像。对于癫痫患者来说，顺磁性磁化率成像的临床应用基于常规的梯度回波序列，无需额外的成本或时间投入。这种成像技术不仅能够补充传统的结构MRI，用于检测疑似癫痫区域的形态学变化和铁相关的异常，还具有广泛的适用性，可以在各种磁共振扫描仪上实施。 此外，用于铁定量的相同原理可能潜在地应用于其他与铁代谢异常相关的神经退行性疾病，如多系统萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症等。这为扩展该技术在神经科学领域的应用提供了可能性，并为这些疾病的诊断和治疗开辟了新的途径。 论文的第一作者是博士研究生李政皓和主治医师刘强强，通讯作者为魏红江教授和徐纪文教授。此外，本研究还得到了来自上海交通大学生物医学工程学院的李力团队和汤耀辉团队、上海交通大学医学院松江研究院陈张朋团队以及上海交通大学分析测试中心的协作支持。 上海交通大学生物医学工程学院/磁共振国家工程中心魏红江团队长期致力于定量磁共振成像技术。提出了3D亚体素定量成像技术，突破了磁共振成像的物理分辨率限制，实现了体素内多成分的精准同步定量成像和解析，以此扫描完成T1mapping、T2mapping、T1w、T2w、T2*、QSM、QSM+、QSM-等多模态同步成像，在脑科学和脑疾病研究中极具应用价值，有助于实现脑疾病的精准诊疗。 原始论文： [1] Paramagnetic susceptibility measured by magnetic resonance imaging as an in vivo biomarker for iron pathology in epilepsy.  Science Advance (2025). DOI: 10.1126/sciadv.ads8149 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 更多推荐 点个“在看”再走吧~

WEDNESDAY, March 19, 2025 -- A graph neural network using data from the Multicenter Epilepsy Lesion Detection (MELD) Project (MELD Graph) can detect epileptogenic focal cortical dysplasia (FCD) on magnetic resonance imaging (MRI) scans, with improved positive predictive value (PPV) compared with an existing algorithm, according to a study published online Feb. 24 in JAMA Neurology . Mathilde Ripart, Ph.D., from the UCL Great Ormond Street Institute of Child Health in London, and colleagues examined the efficacy and interpretability of graph neural networks in automatically detecting FCD lesions on MRI scans in a multicenter diagnostic study. Retrospective MRI data were obtained from 23 epilepsy centers worldwide between 2018 and 2022. Data from 20 centers were split into training and testing cohorts, and data from three centers were used for site-independent testing. MELD Graph was trained to identify FCD on surface-based features; performance was compared to that of an existing algorithm. Overall, 34 surface-based MRI features and manual lesion masks were obtained from 703 patients with FCD-related epilepsy and 482 controls. The researchers found that the MELD Graph had a sensitivity of 81.6 and 63.7 percent in histopathologically confirmed patients who were seizure-free one year after surgery and in MRI-negative patients with FCD, respectively, in the test dataset. The PPV was 67 percent for 260 patients in the test dataset compared with 39 percent using an existing baseline algorithm. In the independent test cohort, the corresponding PPVs were 76 and 46 percent. "With improved performance over existing methods, interpretable predictions, model confidence scores, and individual patient reports, MELD Graph can support the integration of lesion detection tools into the radiological workflow," the authors write. Several authors disclosed ties to the biopharmaceutical industry.

离心仍然是在生产治疗性单克隆抗体（mAb）期间从哺乳动物细胞培养液中高效收获产品的最常用的单元操作之一。由于已知哺乳动物细胞对剪切敏感，离心机的最佳性能需要在生产率和剪切力之间取得平衡。在这项研究中，计算流体动力学（CFD）已被成功用作促进高效优化的工具。多相欧拉-欧拉模型与Gidaspow阻力模型以及欧拉-欧拉k-ε混合湍流模型相结合，用于量化离心机的复杂流体力学，从而评估离心力产生的湍流应力。通过对实验观察到的细胞裂解数据进行统计分析，开发了一个经验模型，该模型是湍流应力的函数。通过使用CFD建模，已经确定了一个在高生产率、高分离效率和低细胞损伤之间提供最佳平衡的操作窗口。 在过去的二十年里，来自微生物和哺乳动物细胞培养的生物治疗产品的研究和开发呈指数级增长。到2020年，单克隆抗体（mAb）的全球销售额预计将增至1250亿美元。从细胞培养液中收获和纯化这些生物治疗药物是一个复杂的过程，涉及连续使用几个正交单元操作。这是必要的，因为收获的细胞发酵液中含有无数杂质，生物治疗药物的产品和纯度是生物制药制造中最关键的目标。在下游单元操作（如色谱和膜分离）处理工艺流之前，需要进行固液分离，使工艺流无颗粒。在细胞对剪切敏感的情况下，如哺乳动物细胞，需要监测细胞培养和收获过程中经历的剪切，以确保不会发生过度的细胞裂解。在用于固液分离的各种单元操作中，离心是最常用的操作之一，主要是因为其在操作过程中的坚固性、处理工艺流中高百分比固体的能力以及处理大量固体的能力。其他研究人员已经证明了盘式堆叠离心机离心过程中的细胞损伤。收获过程中过度的细胞裂解会导致杂质负荷增加，从而使纯化过程更加繁琐，生产率降低，最终在经济上不那么有吸引力。计算流体动力学（CFD）已成功用于模拟复杂生物处理单元操作中的流体动力学。在这项研究中，对Culturefuge 100™装置进行了CFD建模，以从哺乳动物细胞培养液中收获单克隆抗体。离心机内部的应力环境已被建模为转速（RPM）和入口体积流量（LPH）变化操作条件的函数。我们已经证明，产生的应力会影响细胞存活率，从而直接影响产品回收率和产品质量。CFD和经验建模在实现最佳平衡方面可以发挥的作用已得到明确阐明。 实验装置：碟片离心机culturefuge 100™ Culturefuge 100™是阿法拉伐公司（瑞典隆德）制造的商用盘式堆叠离心机，用于细胞收获以生产生物治疗药物。它由一个浅圆柱形碗组成，碗里有一个紧密放置的锥形盘，一个在另一个之上，形成一个盘堆（图1A）。每个锥形盘在其表面上具有等距的4-8个开口（填缝）。圆柱形碗和圆盘堆叠安装在空心轴上，空心轴沿旋转轴轻轻旋转（图1A）。进料由含有少量固体细胞的液体组成，通过入口管进入离心机。轴向流被偏转板转向，偏转板帮助进料移动到离心机的圆盘堆叠部分，在那里，由于离心力，进料被迫向圆盘边缘移动。这导致固体细胞由于密度较高而向外移动（朝向碗的边缘），而澄清的液体则朝向旋转轴移动。 圆盘之间的间隙形成连续的分离通道，在那里发生分离，填缝物形成进入上方分离通道的流动路径。澄清的液体从顶部的出口流出。这就是细胞与无细胞发酵液的分离过程。Culturefuge 100™中紧密放置的锥形盘之间的距离为3-4mm。碗内壁上积聚的固体通过排放口从液压操作的滑动碗底部定期喷射。在盘式堆叠离心机中，由于流体从一个圆盘流向另一个圆盘，以及流向偏转板，流动主要是双向的，切线方向上的高速主流和轴向方向上的低速二次流。切向速度是细胞所受离心力的结果。轴向流动决定了细胞在离心机中的停留时间。Culturefuge 100™的设计和操作规格如表1所示。图1B进一步说明了设计规范。 离心分离 实验在不同的转速（RPM）和入口体积流量（LPH）下进行。入口进料由两个阶段组成，即初级连续阶段（发酵液）和次级阶段（细胞）。细胞培养物的特性如下：细胞培养密度约为1040 kg/m3，乳酸脱氢酶（LDH）含量约为2534 ppm，发酵液产品浓度约为2 g/L，平均颗粒（细胞）大小dF约为16.5μm，细胞体积（固含量）约为8%，细胞密度ρS约为1521 kg/m3，发酵液粘度μ约为0.004 kg/m/s。对于8种不同的操作条件，测量了各种输出参数，如浊度（NTU）和乳酸脱氢酶（LDH）含量（ppm），这些参数列于表2中。通过使用购自Sigma-Aldrich的市售细胞毒性检测试剂盒评估释放到培养基中的LDH作为死细胞的标志物来进行LDH测定。 理论思考 在商业应用中，离心比重力沉降更受欢迎，因为它为细胞和细胞碎片的收获提供了显著更短的沉降时间。固液分离理论通常用于模拟连续圆盘堆叠离心的澄清性能。在离心机中，影响固液分离的各种因素包括面积、固液密度差、角速度、进料粘度和流速。固液分离可以使用沉降室类比进行分析。在平衡（稳态）时，作用在颗粒上的阻力可以等于有效向下力，等于颗粒重量减去浮力，以获得沉降室可以根据以下表达式从固液混合物中分离出的最小粒径dmin： 其中，Q是通过腔室的流速，A是横截面积，ρL是液体密度，μL是液体粘度，ρS是颗粒密度，g是重力加速度。液体密度和粘度的值使用水的值（ρL=998.2 kg/m3和μL=0.001 kg/m/ s）。由于盘式堆叠离心机（DSC）在外观和操作上都不同于沉降罐，因此等效面积Ae不同于传统的横截面积，由Ae=2πn r dr tanθ给出。这里，n是圆盘数量，θ是半圆盘角度，r是圆盘半径，其值可以从入口的ri变化到出口的ro（图1B）。 离心数Z是一个无量纲数，是DSC中与沉降室相比分离力的相对度量。它由Z=ω2r g给出，其中ω是离心机的转速。离心机与沉降罐的总体偏差可归因于一个称为西格玛因子（ξ）的因子，该因子是有效面积和离心数的乘积。其在离心机整个盘堆上的值可以通过以下公式计算： 因此，对于离心机，可以分离的颗粒的最小直径由下式给出： 转速和入口体积流量的范围必须根据Culturefuge 100™的规格确定（参见表1），分别为1000-9000RPM和300-1200LPH。离心机在这些操作条件下的dmin计算值在4.06-18.3μm范围内变化。只有粒径dp大于或等于最小粒径dmin的固体颗粒才会被圆盘堆叠分离。不同入口流速下，进料平均粒径dF与最小粒径dmin与转速的比值如等值线图所示（图2）。 可以看出，对于较低的转速，随着可分离的最小粒径高于进料粒径，分离效率显著降低。此外，考虑到流动处于斯托克斯状态，从方程（3）计算出的最小粒径是获得的。实际上，在离心机中，流动可能是湍流，在这种情况下，需要计算湍流的阻力。然而，在湍流状态下操作会产生高剪切力，可以分离的最小粒径实际上会显著减小。因此，方程式（3）仍然是确定可分离的最小粒径的上限，应用于确定操作范围。根据图2，工作转速范围可以从1000-9000RPM缩小到dF/dmin≥1的范围。在目前的情况下，为了安全操作，必须保持2的最小比率。因此，转速保持在3000-9000RPM之间，流速保持在300-1200LPH之间。 为了了解盘式堆叠离心机在狭窄操作条件下的流动条件，可以使用表达式计算颗粒雷诺数ReP： 式中，φL为液体分数，uS为粒子速度。同样，液体雷诺数ReL可以计算为： 其中，NS是每秒的转速。图2显示了整个操作条件下ReP和ReL的计算值，范围分别为0.43-1.28×10^3和0.40-1.21×10^6。颗粒和液体雷诺数的湍流临界值分别为500和4200。根据计算值，可以得出结论，在DSC中，在转速（RPM）和入口流量（LPH）的整个操作状态下，颗粒（细胞）和液体都处于湍流状态。 计算方法 为了简化啮合的离心机模型，离心机的入口直接送入最底部的圆盘，离心机的出口直接从最顶部的圆盘中取出（图3A）。盘堆中的盘的数量取为17，使得形成流动通道的盘间分离保持在4mm的距离。 划分网格 GAMBIT 2.4.6中使用离心机转鼓和其他部件（包括锥形盘、径向条（填缝料）以及入口和出口管）的三维网格创建工具构建了涉及简化离心机模型的几何形状和网格生成的计算网格。将旋转离心碗视为轴对称模型，考虑离心机的45°扇区进行网格划分。如图3所示，使用25万个非结构化六面体单元进行网格划分，图3B和C分别显示了离心机45°扇形网格的正视图和俯视图。 在本工作中，由于离心机的整个工作体积都在旋转，因此考虑了单个旋转框架运动。根据偏斜度和纵横比标准对网格质量进行了分析。偏斜度系数是单元与等效等角几何形状偏差的度量，低于0.50的值被认为是良好的，高达0.8的值则被认为是可接受的。在目前的情况下，大约87%的细胞的偏斜系数低于0.5，只有0.77%在0.70到0.80之间。另一方面，单元的纵横比描述了其不同侧面之间的比例关系，良好的网格被认为是由纵横比接近1的单元组成的网格。通常避免大的纵横比。为研究生成的网格中99%的细胞的纵横比在1到2之间。 数学模型 多项模型：使用FLUENT 14对离心机进行了CFD建模。进行了与转速和入口进料体积流量的不同操作条件相对应的模拟。欧拉-欧拉多相模型用于流体-细胞流动，假设流体和细胞是连续介质。多相系统的控制方程采用欧拉-欧拉方法求解，由两相的连续性方程和动量方程组成（表3）。固体被概念化为通过碰撞和流动相互作用，Fluent中内置的颗粒流动力学理论（KTGF）代码用于模拟这种行为。 阻力模型：在多相流中，两相之间的相间动量传递由阻力Mm=β（uL-uS）表示，该力在分离中起着重要作用。因此，需要在CFD建模中应用精确的阻力模型来实现流体动力学的准确估计。在目前的工作中，应用了Gidaspow提出的阻力模型。在该模型中，根据液体分数φL的范围，选择了两相之间相间动量传递的拟议方程（方程9-10）（表3）。为了求解方程（7），固相的应力张量τS是必需的，如方程（12）所示。为了求解方程（12），需要描述固相流变性的固体体积粘度ξS和固体剪切粘度μS的值，这些值是从本构方程中获得的。在本研究中，固体体积粘度的本构方程ξS（Pa.S）、径向分布函数g0、固体剪切粘度μS（Pa.S）、粘度的摩擦分量μS,f和固体压力Ps（Pa）被用来将固体中的应力与固体速度联系起来（补充材料中的表4）。 湍流模型：由于发现两相的雷诺数估计值高于所用操作条件范围内的临界值，因此推测离心机内的流动相对于两相都是湍流。文献中提到了不同的湍流模型。这些模型包括混合长度模型、标准k-ε湍流模型、RSM模型和RNG k-ε湍流模式。其中，标准k-ε湍流模型：（i）是工业中使用最广泛的湍流模型，（ii）计算成本较低，（iii）在大多数情况下优于RSM模型，并产生与RNG k-ε湍流模式相当的结果。因此，在我们的情况下，为了模拟湍流，使用双方程k-ε湍流混合模型以及连续性和动量方程分别评估湍流动能和湍流能量耗散率。RNG k-ε湍流模型通常更适合模拟旋转流，但有相当多的研究表明，标准k-ε模型已被用于模拟离心流。由于相之间的密度比接近1，因此应用了混合物模型。表3列出了湍流动能k和能量耗散率ε的守恒方程，这些方程与混合物特性和混合物速度有关（方程13和14）。对于模型参数Cμ、C1ε、C2ε、σk、σε，分别考虑了0.09、1.44、1.92、1.0和1.3的标准值。 数据处理 求解了欧拉-欧拉多相方程和标准k-ε湍流混合模型。SIMPLE算法用于动量偏微分方程（PDE）中的压力-速度耦合（表3中的方程6和7）。动量方程采用二阶迎风格式进行空间离散化，体积分数采用quick格式，其余方程采用一阶迎风格式。对于梯度计算，使用了基于格林高斯节点的方法。模型中使用的求解器参数是通过将最大残差容差设置为0.0001，校正阶段的最大数量设置为10来模拟的。用于更新参数值的松弛因子符合ANSYS Co提供的标准。用于压力、动量、体积分数、颗粒温度、湍流动能和湍流能量耗散率的欠松弛因子值分别为0.3、0.3、0.5、0.2、0.8和0.8。 边界和初始条件 进料口液体初级相（相1）和固体次级相（相2）的边界条件是速度入口，出口是压力出口，在所有固体壁（锥形盘和离心机壁）上都没有施加滑动条件。计算域所需的初始条件分别为相1和相2入口速度、相2颗粒温度和相2的体积分数。这些参数的值是根据相关流量、入口横截面积和细胞培养进料特性计算得出的。 基于CFD建模的离心机优化 本研究使用基于CFD建模的优化方法来优化圆盘堆叠离心机在转速（RPM）和入口流量（LPH）方面的操作。该方法如图4所示。离心机性能根据以下因素进行测量：（i）离心机生产率（g/day/m），（ii）离心机的澄清效率（%），（iii）湍流应力（Pascal），以及（iv）LDH测定（ppm）。计算的细胞培养物的性质包括：平均粒径、dF、固体（细胞）体积分数、φS、细胞密度、ρS、液体密度、ρL、液体粘度、μS和发酵液产品浓度（g/L）。这些数据作为输入数据输入到CFD模型中。根据计算出的离心西格玛因子ξ，计算出离心生产率（g/day/m）。对于整个分析范围，41个操作数据点用于CFD模拟，如图5所示。对其中8种操作条件进行了实验并测量了LDH。 首先，从制造商处获得了可能影响离心机性能的工艺参数的操作范围，即转速（RPM）和入口流量（LPH）。离心生产率（g/day/m）数据是根据整个RPM和LPH范围内的已知流量、Q、发酵液产品浓度和ξ值计算得出的。在RPM和LPH的整个操作范围内，对8种工艺条件下的输出流进行了LDH测定（ppm）分析。其中4个数据点用于经验建模，其余4个用于验证CFD模型。其次，对RPM和LPH的整个操作窗口进行了CFD模拟。根据离心壁处发现的第二相（细胞）最大体积分数的CFD模拟值和进料中细胞的已知体积分数，计算了澄清效率（%）和湍流应力τ的模拟值。第三，根据τ模拟值对观察到的增量LDH测定进行实证建模，并预测LDH测定值。第四，为每个绩效衡量因素设定了截止标准，并确定了设计空间。第五，也是最后一点，对RPM和LPH的设计空间进行了实验验证。 CFD模拟 图5显示了在确定的操作窗口内对离心机进行模拟的入口流量和转速。所有模拟都是在离心机45°扇区的稳态条件下进行的。进行了网格独立性测试，其中考虑了高达9.8万个单元的网格。然而，根据体积平均湍动能值，最终确定25万的网格尺寸为研究的最佳网格尺寸。发现离心机内的流体动力学是决定细胞损伤的关键因素，该流体动力学是根据初级相的湍流动能和湍流耗散能的体积平均值测量的。另一方面，发现负责产生离心场的主相切向速度的体积平均值是决定离心机分离性能的关键因素，而离心机分离性能又是通过离心机壁上次级相体积分数的增加来衡量的。 图6A-C显示了7000 RPM和600 LPH代表性操作条件下主相速度、湍动能和次相（单元）体积分数的正视图等值线图。主相速度的等值线图表明，速度朝向旋转离心机壁逐渐升高（由红色表示，表示最大速度为117m/s）。这是意料之中的，因为旋转离心机给流体带来了沿径向增加的切向速度。此外，仔细观察图6A可以发现，由于流体循环，锥形盘边缘（绿色区域）附近的速度梯度很高。从底部分离通道流出的流体进入顶部分离通道，在那里离心力再次将其推向开始发生相分离的边缘。与盘堆叠区域外的流体相比，这会产生更高的速度。图6B显示了湍动能的等值线图。可以看出，在从圆盘边缘到离心机转鼓壁的区域，湍动能要高得多，最高值出现在壁附近，值为166m2/s2（由红色区域表示）。更高的动能表明更高的应力和更大的细胞裂解。当离心力将细胞推向离心碗边缘时，靠近壁的区域也会经历细胞的高度积聚（图6C）。发现细胞壁（红色区域）的最大体积分数为0.342。考虑到进料的初始细胞浓度为8%，这表明细胞向壁的迁移导致该区域的体积分数变化>300%，而在盘堆内部附近，体积分数降至零，表明完全没有细胞。 叠片式离心机的分离效率 本研究中使用的料液由0.08体积分数的次生相组成，次生相由平均细胞直径为16.5μm的细胞组成，其余部分由液体部分（连续相）组成。为了了解转速和体积进料流量对分离效率的影响，绘制了二次相的最大体积分数（根据CFD模型计算）与转速和体积流量的关系图，如图7A所示。从第2相最大体积分数的二维等值线图（图7A）可以看出，固相的最大分离是在9000 RPM的最高转速下实现的。这一观察结果支持了这样一个事实，即澄清能力随着转速的增加而提高，因为离心机内细胞的径向位置是离心场的函数，而离心场又主要是转速的函数。当转速较高（6000RPM至9000RPM）时，离心机的分离效率较高，细胞体积分数分别为0.286至0.393。随着吞吐量的增加，颗粒停留时间减少，通常无法达到停留时间和到达离心机壁所需时间之间的平衡。因此，理论表明，分离效率应随着吞吐量的增加而降低。然而，在本研究中，随着体积流量的增加，分离效率几乎保持不变（图7A）。对这一观察结果的一个合理解释是，细胞经历了非常高的离心力，导致细胞优先沿径向移动，而不是轴向。 影响细胞裂解的因素 离心机内湍流产生的应力是细胞裂解的主要原因之一。因此，根据产生的湍流应力测量了不同转速和LPH下离心机内的流体动力学。假设在空间给定点（各向同性条件）所有方向上的动量输运均匀，则使用以下方程根据CFD模拟的湍流动能值计算湍流应力τ： 离心机内流体中产生的湍流应力的体积平均值如图7B所示。 可以理解的是，由于湍流动能产生的平均应力值随着转速的增加而线性增加，因为较高的离心力加速了细胞向离心碗壁的迁移，并增强了迁移细胞之间的碰撞（图7B）。产生的应力也随着入口流速的降低而增加，这可能是由于较低的进料流速增加了进料停留时间，这使细胞暴露在湍流应力下的时间更长，从而增加了更多的细胞损伤和细胞裂解。这些观察结果得到了LDH测定的实验观察值的支持（表2）。 因此，需要对转速和入口流速进行最佳选择，以避免过度的细胞裂解。在湍流过程中会形成不同大小的涡流，这是细胞损伤的主要原因。当涡流尺寸比细胞大时，细胞被涡流从一个地方带到另一个地方。另一方面，尺寸等于或小于细胞的微涡流对细胞壁施加机械力，当这些力超过细胞壁强度时，细胞壁破裂。用于更高雷诺数的标准k-ε湍流模型使用Kolmogorov理论估计湍流涡流长度尺度；因此，湍流期间形成的最小涡流的大小可以通过以下表达式估算： 根据湍流能量耗散率的体积平均值（从不同操作条件的CFD模拟中获得），使用方程式（16）估算微涡流的大小。湍流能量耗散率是指湍流动能被吸收以将大尺寸涡流分解为小尺寸涡流，直到被粘性力转化为热量的速率。因此，湍流能量耗散率越大，越大尺寸的涡流被分解成更小尺寸的涡流。因此，最小涡流尺寸与湍流耗散能量成反比（图7C）。本研究中检查的盘式堆叠离心机在不同操作条件下产生的微涡流尺寸的估计值表明，涡流远小于进料中存在的细胞的平均尺寸，即16.5μm（图7C）。因此，涡流可能会对细胞造成损伤，并在离心过程中导致细胞溶解。很明显，λ/dF减小，表明形成了更小的涡流尺寸，导致细胞损伤。随着转速的增加，湍流应力导致微涡流的形成，这进一步增加了细胞裂解。为了了解湍流应力对细胞裂解的影响，并找到不会导致细胞过度裂解的最佳转速，使用实验观察到的增量LDH测定（作为细胞裂解的标志）在不同转速和吞吐量的操作条件下建立了一个经验模型。 LDH测定的经验模型 当细胞裂解过度时，离心机的性能会降低，因为它会增加较小尺寸的颗粒。此外，细胞裂解导致各种宿主细胞杂质（如宿主细胞蛋白质、核酸）的释放，这增加了工艺流中的杂质水平，从而使纯化过程更长，产量更低。在湍流条件下，导致细胞过度裂解的确切应力阈值可能因细胞而异，因此是一个未知参数。鉴于此，我们采取的方法是将增量LDH测定（ppm）（细胞裂解的指示）和离心过程中产生的湍流应力（帕斯卡）与离心机的操作条件进行经验关联（图7B）。所提出的方法允许用户创建设计空间，以将细胞裂解保持在预定目标以下。 将增量LDH测定与湍流应力（TSS）（根据CFD模拟的湍流动能值估算）相关的经验模型如下： 可以看出，离心机内的细胞裂解与湍流应力呈线性关系，R2=0.878。400 LPH、7500 RPM运行条件下的四个运行数据点；350升，7000转/分；使用400 LPH、6500 RPM和400 LPH和7000 RPM进行验证。将CFD模拟的LDH浓度增量值与这些条件下的实验测量值进行比较（图8A）。在这些条件下，观察到的LDH增量测定（ppm）为1393ppm、640ppm、466ppm和744ppm，而CFD模型预测值分别为1343ppm、855ppm、376ppm和854ppm。 此外，从研究中可以推测，应保持非常高的转速以提高分离效率。然而，在这些操作条件下，细胞裂解率也很高。因此，尽管建议在非常高的操作条件下操作，但有必要检查这些条件下细胞裂解的允许值。假设培养基中允许的最大增量LDH测定（ppm）为1200ppm，即几乎可以忽略细胞裂解，离心后最终输出流的LDH测定值不应超过3700ppm。根据经验模型，图8B中绘制了整个转速和入口流量范围内建模方程（17）的预测增量LDH测定。可以看出，预测的增量LDH测定值和湍流应力随着转速的增加和入口流量的减小而增加。因此，从CFD模拟和经验建模中确定的离心机操作窗口为3000-7200RPM（转速）和300-1200LPH（吞吐量），离心后增量LDH测定不超过1200ppm。 离心机设计空间 圆盘堆叠离心机的设计空间分析可以通过平衡3个性能因素来获得，即离心机生产率（g/day/m）、离心机澄清效率（%）和湍流应力（Pascal）（间接测量LDH测定），如图4所示。如图9所示，入口流量和转速对这些因素的影响各不相同。离心机生产率随着入口流量的增加而增加，随着转速的增加而降低（图9A），而澄清效率和湍流应力随着转速的升高而增加，几乎与入口流量无关（图9B-C）。选择的截止标准包括大于500克/天/平方米的离心机生产率、大于60%的离心机澄清效率和小于7000帕的湍流应力（对应于增量LDH测定<1200 ppm）。对于不同的应用，这些截止值可能会有所不同。图9D显示了图9A-C的重叠操作区，产生了灰色交叉区域作为设计空间。转速和入口流量的允许范围为3000–6000 RPM和300–1200 LPH用于生产率；5600–9000 RPM和300-1200 LPH用于澄清；3000–7200 RPM和300至1200 LPH适用于湍流应力（或增量LDH测定）。5200–7200 RPM和500–1200 LPH的最终重叠设计空间满足生产率（>500克/天/平方米）、澄清效率（>60%）和湍流应力（<7000 Pa或LDH测定<1200 ppm）的多重标准。 图9D还描述了与离心机设计空间相关的风险，在灰色交叉区域外的位置使用蓝色、红色和橙色的实心圆圈。蓝色、红色和橙色实心圆圈的位置分别表示不符合以下截止规范：（i）澄清效率，（ii）湍流应力和LDH测定，以及（iii）离心机生产率、湍流应力以及LDH测定。在本研究中，没有考虑过程经济学。 为了验证优化的灰色设计空间，使用相同的进料进行了两次试运行：（i）6000 RPM，700 LPH（试运行1）和（ii）7000 RPM，700 LPCH（试运转2）（图9D）。观察到的LDH增量测定（ppm）在6000 RPM、700 LPH下为885，在7000 RPM、700 LPH下为1072，而相应CFD模拟的预测值分别为768 ppm和1163 ppm。两次试运行都符合所有规格，低于15%实验和模拟LDH测定值的差异。然而，如果进料室尺寸分布与当前条件存在很大差异，明智的做法是根据两种情况下颗粒上产生的最大离心力（MCF）而不是图9D次级x轴中提供的转速来验证模型。 在本文中，计算流体动力学和经验建模已被成功用于促进对离心的更好理解。CFD模拟表明，更高的吞吐量会导致涡流尺寸的增加，从而降低湍流应力。值得注意的是，虽然增加流速会减少细胞裂解并提高生产率，但已发现对分离效率的影响可以忽略不计。然而，更高的转速对澄清效率有深远的影响，但也会导致更高的细胞损坏。为了在离心机生产率、澄清效率和细胞损伤之间保持平衡，有必要优化操作条件。为了实现这一目标，通过计算流体动力学（CFD）从获得的湍流动能值中评估了离心力影响下产生的湍流应力。创建了一个经验模型，将增量LDH浓度与产生的湍流压力相关联。然后，这种相关性被用来确定一个优化的操作窗口，以维持盘式堆叠离心机的最小细胞裂解、最大生产率和分离效率。CFD在过程优化和最小化大规模实验中可以发挥的重要作用得到了强调。我们相信，CFD可以在增强我们对这种复杂系统的过程理解方面发挥重要作用，从而有助于在生物工艺中实施设计质量。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。