中文摘要
目的 建立并验证检测阿达木单抗电荷变异体的阳离子交换高效液相色谱法。
方法 采用以羧基官能团的弱阳离子为固定相的交换柱（4 mm×250 mm），以0.01 mol/L 磷酸氢二钠溶液、pH 7.5为流动相 A，以0.01 mol/L 磷酸氢二钠+0.5 mol/L 氯化钠溶液、pH 5.5为流动相 B进行梯度洗脱。按面积归一法计算赖氨酸变异体和酸性组分含量，并对该方法进行专属性、重复性、中间精密度、线性、准确度和耐用性验证。
结果 该方法检测阿达木单抗注射液可见溶剂峰和目标峰；重复检测6次各组分相对标准偏差均＜2%；不同实验员、不同实验设备检测各组分的相对标准偏差均＜2%；赖氨酸变异体之间的峰的定量限（信噪比＞10）为100 μg/mL、检测限（信噪比＞3）为30 μg/mL；在企业质量标准限度范围内检测不同浓度各组分线性良好，决定系数均＞0.99；第1酸区峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰准确度回收率均在80%～115%，第2酸区峰、主峰和赖氨酸变异体1峰准确度回收率均在85%～110%；不同流动相pH、不同流动相氯化钠浓度、不同流速与柱温、不同批次色谱柱条件下检测结果符合要求，一致性较好。
结论 建立的方法具有良好的专属性、重复性、中间精密度、线性、准确度和耐用性，适用于阿达木单抗电荷变异体的测定。
正文
全人源重组单克隆抗体（单抗）阿达木单抗具有高亲和力，是针对TNF-α靶点的生物抑制剂。阿达木单抗在哺乳动物细胞表达与纯化过程中，因N-糖基化、氨基酸翻译后修饰和空间构象的改变，会产生电荷异质性，影响单抗的有效性和稳定性。基于电荷差异的离子交换色谱、等电聚焦和毛细管电泳等是检测抗体等电点变化的常用手段。其中，阳离子交换色谱（cation exchange chromatography，CEX）可有效分离酸性变体、主峰（C末端赖氨酸被完全切除）和碱性变体。酸性物质分为第1酸区（唾液酸化修饰）和第2酸区（脱酰胺化、氧化或不同位点的唾液酸化），在主峰前洗脱分离；碱性物质分为赖氨酸变异体1（C末端保留1个赖氨酸）、赖氨酸变异体2（C末端保留2个赖氨酸）及赖氨酸变异体之间的峰，均在主峰后洗脱分离。本研究拟建立CEX法对武汉生物制品研究所有限责任公司（武汉公司）研发的阿达木单抗电荷变异体进行分析，并对该方法进行验证。
1
材料与方法
1.1
阿达木单抗参比品
阿达木单抗参比品由武汉公司抗体研究室提供，制备方法与阿达木单抗注射液制备方法一致。重复性、精密度、定量限和检测限验证使用50 ℃放置5 d的参比品，耐用性验证使用未处理参比品。
1.2
供试品
阿达木单抗注射液原液和阿达木单抗注射液由武汉公司抗体研究室提供，第1酸区峰、第2酸区峰、主峰、赖氨酸变异体1峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰由武汉公司抗体研究室将阿达木单抗参比品通过液相法和馏分收集器分离并进一步超滤纯化制备。
1.3
主要试剂及仪器
无水Na2HPO4购自美国Sigma-Aldrich公司，NaCl和水系0.45 μm滤膜购自国药集团化学试剂有限公司，ProPacTM WCX-10色谱柱（4 mm×250 mm）购自美国Thermo Fisher公司，Waters e2695高效液相色谱仪、2489 UV紫外检测器和液相进样瓶购自美国Waters公司。
1.4
试剂配制
流动相A（0.01 mol/L Na2HPO4，pH7.5）：称取无水Na2HPO4加超纯水溶解，调pH值至7.5；流动相B（0.01 mol/L Na2HPO4+0.5 mol/L NaCl，pH5.5）：称取无水Na2HPO4和NaCl加超纯水溶解，调pH值至5.5；阿达木单抗参比品、阿达木单抗注射液、阿达木单抗注射液原液、第1酸区峰、第2酸区峰、主峰、赖氨酸变异体1、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2等供试品用超纯水稀释至蛋白浓度1 mg/mL。
1.5
色谱条件
流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm，上样量100 μL。流动相为A和B组成的二元流动相体系（即以下流动相A＜100%用B补足），洗脱方式为梯度洗脱。洗脱程序为0.0~2.0 min，94%流动相A；2.0~22.0 min，94% ~76%流动相A；22.0~24.0 min，76%~0%流动相A；24.0 ~ 27.0 min，0%流动相A；27.0 ~ 27.1 min，94%流动相A；27.1 ~ 40.0 min，94%流动相A。
1.6
方法验证
1.6.1 专属性 分别取阿达木单抗注射液制剂缓冲液和阿达木单抗注射液按照1.5项进行检测分析。阿达木单抗注射液制剂缓冲液应仅有溶剂峰；阿达木单抗注射液除溶剂峰外应有目标峰。
1.6.2 重复性 取阿达木单抗参比品在同一时间按照1.5项重复检测6次各峰面积，计算面积百分比的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。第1酸区峰的RSD应≤6%；第2酸区峰的RSD应≤4%；赖氨酸变体总量（主峰、赖氨酸变异体1峰和赖氨酸变异体2峰之和）的RSD应≤4%；赖氨酸变异体之间的峰的RSD应≤6%。
1.6.3 中间精密度 取阿达木单抗参比品，由2名实验员按照1.5项进行测定，各重复检测6次，计算不同实验员测定结果的RSD，第1酸区峰的RSD应≤6%；第2酸区峰的RSD应≤4%；赖氨酸变体总量的RSD应≤4%；赖氨酸变异体之间的峰的RSD应≤6%。
取阿达木单抗参比品，由1名实验员在不同设备按照1.5项进行测定，重复检测6次，计算不同设备测定结果的RSD，第1酸区峰的RSD应≤6%；第2酸区峰的RSD应≤4%；赖氨酸变体总量的RSD应≤4%；赖氨酸变异体之间的峰的RSD应≤6%。
1.6.4 定量限和检测限 由于阿达木单抗注射液各组分中，赖氨酸变异体之间的峰含量最小，因此以赖氨酸变异体之间的峰信噪比不小于10和3所对应的浓度为定量限和检测限。将阿达木单抗参比品稀释至10~1 000 μg/mL，按照1.5项进行测定，确定定量限和检测限。对定量限和检测限浓度重复检测6次，计算其峰面积RSD，应分别≤10%和20%。
1.6.5 线性和范围 根据第1酸区峰、第2酸区峰、主峰、赖氨酸变异体1峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰的蛋白纯度和浓度分别配制上述各峰的供试品溶液，要求各峰峰面积百分比范围分别为2.0%~10.0%、8.0%~32.0%、52.0%~78.0%、16.0%~24.0%、1.0%~5.0%、3.0%~7.0%。按照1.5项进行测定，以供试品溶液各峰面积百分比理论值为横坐标、供试品各峰峰面积为纵坐标进行线性拟合，重复3次，得到不同线性方程和决定系数（R2），R2应不小于0.98。
1.6.6 准确度 用线性确认中配制的6个供试品溶液实测的相对百分含量结果比相对百分含量理论值，计算其回收率，第1酸区峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰回收率应在80%～115%范围内，第2酸区峰、主峰和赖氨酸变异体1峰回收率应在85%～110%范围内。
1.6.7 耐用性 （1）配制pH7.48、7.50、7.52的流动相A与pH5.48、5.50、5.52的流动相B，进行以下组合：第1组，A（pH7.50）和B（pH5.50）；第2组，A（pH7.48）和B（pH5.50）；第3组，A（pH7.52）和B（pH5.50）；第4组，A（pH7.50）和B（pH5.48）；第5组，A（pH7.50）和（pH5.52）。（2）配制NaCl浓度为0.498、0.500、0.502 mol/L的流动相B。（3）设置不同柱温为29、30、31 ℃；不同流速为0.99、1.00、1.01 mL/min。（4）使用3个不同批号的色谱柱。按照1.5项进行测定，重复检测3次，计算面积百分比RSD，酸区峰RSD应≤4%，赖氨酸变异体总量RSD应≤4%，赖氨酸变异体1和2之间的峰RSD应≤6%。
1.7
方法的应用
用该方法检测武汉公司抗体研究室生产的阿达木单抗注射液原液和阿达木单抗注射液成品。
2
结果
2.1
专属性
制剂缓冲液有溶剂峰，未出现目标峰；阿达木单抗注射液除溶剂峰外，出现目标峰，见图1。
2.2
重复性
取阿达木单抗参比品重复检测6次，第1酸区、第2酸区、赖氨酸变体总量、赖氨酸变异体之间的峰面积百分比的RSD分别为0.94%、0.19%、0.04%、0.57%，见表1。
2.3
中间精密度
不同实验员对阿达木单抗参比品重复检测6次，第1酸区、第2酸区、赖氨酸变体总量、赖氨酸变异体之间的峰面积百分比的RSD分别为1.42%、0.27%、0.12%、0.87%。结果见表2。
同一实验员在不同设备对阿达木单抗参比品重复检测6次，第1酸区、第2酸区、赖氨酸变体总量、赖氨酸变异体之间的峰面积百分比的RSD分别为0.75%、0.46%、0.17%、1.28%。结果见表3。
2.4
定量限和检测限
以赖氨酸变异体之间的峰信噪比≥10时样品浓度（100 μg/mL）为定量限，定量限检测值为0.332%，重复检测6次峰面积RSD为4.99%，对应的信噪比分别为12.8、12.3、11.5、11.6、11.3、12.3；以赖氨酸变异体之间的峰信噪比≥3时样品浓度（30 μg/mL）为检测限，检测限检测值为0.099 6%，重复检测6次峰面积RSD为3.42%，对应的信噪比分别为3.3、3.2、3.1、3.2、3.1、3.0。结果见表4。
2.5
线性和范围
第1酸区、第2酸区、主峰、赖氨酸变异体1、赖氨酸变异体之间的峰、赖氨酸变异体2峰面积百分比分别在2.0%~10.0%、8.0%~32.0%、52.0%~78.0%、16.0%~24.0%、1.0%~5.0%、3.0%~7.0%范围内检测各组分线性良好，R2均大于0.99。结果见图2。
2.6
准确度
线性确认中配制的6个供试品溶液的第1酸区峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰准确度回收率均在80%～115%范围内，第2酸区峰、主峰和赖氨酸变异体1峰准确度回收率在均85%～110%范围内，结果见表5—10。
2.7
耐用性
在不同pH的流动相、B相NaCl浓度、流速与柱温、色谱柱批号条件下结果一致性较好，酸区面积百分比RSD均小于4.0%，赖氨酸变异体总量面积百分比RSD均小于4.0%，赖氨酸变异体1和2之间面积百分比RSD均小于6.0%，见表11—14。
2.8
方法的应用
武汉公司抗体研究室生产的阿达木单抗注射液原液和阿达木单抗注射液检测结果见表15。
3
讨论
阿达木单抗由美国艾伯维公司原研，商品名修美乐，自2002年获FDA批准、2003 年获欧洲药品管理局批准后，市场表现卓越 。阿达木单抗原研产品专利已分别于2016年和2018年在美国和欧盟到期，截至2024年11月，clinicaltrials.gov上登记的阿达木单抗生物类似药相关试验达43项，目前欧美已批准10款，国内也有8款获批。
电荷变异体的产生主要由翻译后修饰引起，这些修饰会改变抗体的电荷特性和物理化学性质。通过电荷变异体检测，可以识别潜在的质量差异并优化生产工艺，确保不同批次产品的一致性和稳定性。
在生物类似药的开发中，电荷变异体的水平是评价其与原研药一致性的关键质量属性，并有助于提升生物类似药与原研药之间的相似性评价。
本研究建立并验证了阿达木单抗电荷变异体的CEX分析方法。验证结果表明，空白溶剂色谱图中，除溶剂峰外，未见明显色谱峰；阿达木单抗注射液色谱图各组分色谱峰分离度良好，且空白溶剂峰对各组分峰均不干扰，表明该方法专属性良好。对阿达木单抗参比品重复检测6次，各组分RSD均＜2%；不同的实验员使用不同的设备对阿达木单抗参比品重复检测6次，各组分RSD均＜2%，表明该方法重复性和中间精密度良好。赖氨酸变异体之间的峰的定量限为100 μg/mL（信噪比＞10），赖氨酸变异体之间的峰的检测限为30 μg/mL（信噪比＞3），表明该方法检测限和定量限浓度较低，可满足供试品检测要求。在第1酸区峰2.0%~10.0%、第2酸区峰8.0%~32.0%、主峰52.0%~78.0%、赖氨酸变异体1峰16.0%~24.0%、赖氨酸变异体之间的峰1.0%~5.0%、赖氨酸变异体2峰3.0%~7.0%范围内检测各组分线性良好，R2均＞0.99；第1酸区峰、赖氨酸变异体之间的峰和赖氨酸变异体2峰准确度回收率均在80%～115%范围内，第2酸区峰、主峰和赖氨酸变异体1峰准确度回收率均在85%～110%范围内，符合中国药典2020年版分析方法验证指导原则（9101）的要求。耐用性试验证明，该方法对流动相pH、NaCl浓度、流速和柱温、色谱柱批次的微小变化具有较强耐受性，适用于不同实验室间的应用。方法的初步应用结果表明，该方法适用于武汉公司抗体研究室生产的阿达木单抗注射液原液和成品的检测。
本研究建立的CEX方法不仅适用于阿达木单抗，还为其他治疗性单抗的电荷变异体分析打开思路。未来可进一步探索电荷分布与药物体内药效、免疫原性的相关性，为生物类似药的临床评价提供更全面的质量依据。
作者
周蓉1 邓小杰2 何亮1 罗敏1 桂芳2 申瑷琳1 潘俊杰1 袁媛1 王嘉瑞1 孙玉珠1 李青卓2 唐杰2 潘勇兵2 施金荣1
1武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制室，武汉 430207；2武汉生物制品研究所有限责任公司抗体研究室，武汉 430207
通信作者：施金荣，
Email：shijinrong@sinopharm.com
引用本文：周蓉, 邓小杰, 何亮, 等. 阿达木单抗电荷变异体检测的阳离子交换色谱法建立及验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(6): 412-419.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250516-00034
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