Wuhan Institute of Biological Products Co., Ltd.

停牌两天后，派林生物的新主揭晓。6月9日晚，派林生物发布公告，中国生物拟协议收购胜帮英豪持有的派林21.03%股份，交易完成后，公司控股股东将由胜帮英豪变更为中国生物，实控人将由陕西国资委变更为中国医药集团。中国生物旗下已有一家血制品上市公司天坛生物，派林生物和天坛生物存在同业竞争关系，是否会合并？这引发了外界猜测。A股有8家血制品上市公司，其中2024年采浆量超过千吨的有4家，天坛生物、派林生物分别排在第一、第四。如果派林生物重组成功，中国生物旗下两家血制品上市公司采浆总量将超过4000吨，占据全国采浆总量的三成以上。陕煤集团套现退出派林生物由一南一北两家血制品公司组成：广东双林生物和哈尔滨派斯菲科，是国内血制品行业领头企业。血制品行业监管严格，2021年起，国家再未批准设立新的血制品企业，同时对新建单采血浆站实行严格管制。国内血制品牌照稀缺，激发了血制品企业并购整合的积极性。近几年，行业内不断上演大鱼吃小鱼的故事，国资成为其中的活跃角色。去年7月，华润旗下博雅生物以18.2亿元拿下外资独资企业绿十字香港。今年4月，有行业媒体以“国内血制品TOP5中，谁会在今年持续并购扩张”为题，组织了一场网络投票，最终天坛生物以276票高票当选第一，拿下超过36%的票数。业内认为，派林生物重组如果成功，将补足天坛生物在东北、华南地区的短板，进一步丰富其全国性采浆网络。派林生物之所以被收购，与公司内部治理有关。2018年，浙民投掌舵时期，曾对派林生物进行资产重组，推动当时的双林生物收购派斯菲科。派斯菲科创始人付绍兰由此进入派林生物，并被推举为董事长。此后，派林生物进入业绩高速发展期。但大股东浙民投与二股东实控人付绍兰不时传出内讧风波，最终双方因战略分歧问题分道扬镳，浙民投选择让位。2023年5月，陕西国资委旗下陕煤集团从浙民投手中接过大股东之位。陕煤集团入主后，派林生物也没稳定。2023年9月，陕煤集团旗下的持股主体胜帮英豪强行召开股东大会，改组董事会。此举招致二股东强烈反弹。10月，派斯菲科官网发布一则“派林生物董事长声明”，文中，付绍兰严辞指责大股东胜帮基金一股独大、包揽三会。胜帮英豪不得不重新调整董事会人员组成，付绍兰以联席董事长的身份留守董事会。双方的矛盾就此结下。国药再拓版图今年5月，派林生物因内控缺陷遭监管处罚，陕煤集团最后一点经营信念也被压垮了。中国生物提出的条件令陕煤集团难以拒绝：纯现金收购，通过非公开协议受让，价格是胜帮英豪此前的收购价38.44亿元本金，加上年化9%的利息，交易对价约46亿元。加上分红款，陕煤集团将赚得20%的投资收益，已经实现国资保值增值的要求。中国生物是血制品和疫苗行业的国家队，多年来一直在持续扩张。2009 年，中国生物旗下天坛生物收购成都蓉生90%股份，一举成为国内最大的血液制品企业之一。2017年，成都蓉生陆续向中国生物下属的贵州中泰及各地方血制购买股权，天坛生物自此成为中生旗下唯一的血制品业务平台，浆站数在行业内稳居第一。天坛生物并没就此满足，这几年还在四处收购。2023年6月，天坛生物与深圳国资达成协议，筹划通过武汉生物制品研究所控股卫光生物，不过目前还未有实质性进展；2024年，子公司成都蓉生又斥资1.85亿美元，拿下武汉中原瑞德100%股权。目前，天坛生物在营浆站85家，采浆量2781吨，比第二名上海莱士整整多出1000吨，占到国内血制品行业总浆量的20%。中国生物收购派林生物后，同一集团下将有两家同业公司，因此相互整合在所难免。业内猜测，如果将派林生物装入天坛生物体内，天坛生物将有实力冲击国际一线血制品巨头。不过，目前考虑这些问题为时尚早。公告指出，中国生物将在尽职调查完成后决定是否签署协议。派林生物能否成为国药系一员，还要看其质地如何。撰稿丨李傲编辑丨江芸 贾亭运营丨晨曦插图丨视觉中国声明：健识局原创内容，未经许可请勿转载多家上市药企回应“股价为何暴涨”新事丨中外合资药企，彻底“分手”热芙美“射频皮肤治疗仪”获批上市

中文摘要目的   建立3种破伤风抗体体外检测方法并比较。方法   分别构建间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验体外测定破伤风抗体，对方法进行线性与范围、中间精密度、准确度、检测限的初步验证。结果   间接法在浓度范围0.007 8~1.000 0毫国际单位（mili-international unit，mIU）/mL之间呈现良好的线性关系（决定系数=0.998 6）；双抗原法在浓度范围0.078~10.000 mIU/mL之间呈现良好的线性关系（决定系数=0.998 7）；毒素结合抑制试验在浓度范围1.95~31.25 mIU/mL之间呈现良好的线性关系（相关系数＞0.98）。方法学验证结果表明3种方法在精密度、准确度、特异性等方面均符合分析方法验证的指导原则。比较3种方法的阳性检出率，差异无统计学意义（χ2=1.34，P=0.513）。结论   成功建立间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验3种体外破伤风抗体检测法，为体外法替代体内毒素中和试验奠定研究基础。正文破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌引起的高致死性疾病，大多数破伤风病例与婴幼儿出生有关，多发生在接种疫苗不足的母亲及其新生儿中，在不卫生的分娩、流产以及不良的产后卫生和脐带护理中也较为高发。破伤风在低收入国家或卫生条件较差的地区仍然是棘手的公共卫生问题。破伤风的预防主要依靠接种破伤风疫苗，在人体内诱导一定浓度的破伤风抗体，以达到预防的作用。有研究证实在妊娠期接种3剂破伤风疫苗的有效性可达94%。婴儿时期完成3剂破伤风疫苗接种后，抗体水平虽然很高，但随着时间的推移会显著下降。根据多项血清学研究结果，WHO建议在完成婴幼儿时期的3剂疫苗接种后，在青少年阶段的合适时间再完成3剂加强接种，对破伤风的保护性免疫可持续20~30年。由于接种疫苗后对破伤风的免疫力主要由抗体介导，并且取决于特异性抗体中和破伤风痉挛毒素的能力，因此需要可靠的检测手段来评估接种疫苗后的人群是否具备对破伤风的免疫力。本研究拟通过建立并比较研究3种破伤风抗体的体外检测方法，为接种疫苗后的抗体评价手段提供选择依据。1材料与方法1.1检测标本采集遵循知情同意、自愿的原则，选择兰州大学第二医院20~59岁健康人群采集血标本；血标本经2 000×g离心5 min后分离血清，56 ℃灭活30 min后于-20 ℃保存待检。1.2主要试剂破伤风类毒素（tetanus toxin，TT），浓度为670絮状单位（limit of flocculation，Lf）/ml，由武汉生物制品研究所有限责任公司生产，批号202304002C；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗人IgG（H+L）抗体购自美国Jackson公司；标准抗血清为抗破伤风免疫球蛋白（人）第1代国际标准品〔批号TE-3、效价120国际单位（international unit，IU）/支〕，TT标准物质为破伤风类毒素第2代国际标准品（批号04/150、浓度690 Lf/支），均购自英国国家生物制品检定所；抗破伤风单克隆抗体5E5和1B2由武汉迈思生物科技有限公司制备，并进行HRP标记。1.3方法1.3.1　间接法　参照WHO的相关指导文件，采用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，用过碘酸钠法标记后的山羊抗人HRP结合物检测其中的破伤风抗体含量，选择适宜包被浓度及酶标记抗体工作稀释倍数，建立间接ELISA。参照中国药典2020年版四部“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。1.3.2　双抗原法　参照WHO的相关指导文件，用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，加入HRP标记的TT作为检测抗原，建立双抗原夹心ELISA。参照“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。1.3.3　毒素结合抑制（toxin binding inhibition，ToBI）试验　参照WHO的指导文件和相关文献，将稀释后的待测血清及标准抗血清与稀释至0.1 Lf/mL的TT标准品在体外孵育2 h，然后将孵育混合物转移至包被抗体5E5的酶标板中，再加入HRP标记的抗体1B2，通过体外检测未结合的TT含量来评估待测血清中抗体水平的高低。通过计算阳性对照的均值x̅及标准差s，得出x̅-2s所对应的吸光度值，根据标准曲线求出对应的浓度值，即为该方法的检测限。1.4新建方法的验证与应用1.4.1　线性与范围　将标准品稀释至已确定的线性范围内的各浓度，每个浓度水平重复测定6次。接受标准：每个浓度水平的检测差异变异系数（coefficient of variation，CV）≤20%，拟合直线的相关系数（r）≥0.98，决定系数（R2）≥0.99。1.4.2　精密度　按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高（0.80 mIU/mL）、中（0.50 mIU/mL）、低（0.05 mIU/mL）3种浓度水平；每种浓度水平重复测定6次进行重复性验证；由1位操作员在不同时间测定上述3种浓度水平，进行中间精密度验证。接受标准：每种浓度水平重复测定的检测CV≤15%，不同时间检测每种浓度水平之间的CV≤15%。1.4.3　准确度　按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高、中、低3种浓度水平，每种浓度的样品平行稀释6份，检测其抗原含量。计算同一浓度样品测定结果的CV，并将实测值与理论值比较，计算回收率。接受标准：同一浓度检测结果CV≤15%，各浓度水平的检测回收率在80%~120%。1.5统计学方法使用Minitab17、GraphPad Prism 8.0.2及Excel 2010软件进行数据统计和处理，描述性分析3种体外检测破伤风抗体方法的相关性，并采用卡方检验评价检测率的一致性。2结果2.1间接法2.1.1　方法建立及验证　采用棋盘滴定法，选择倒S曲线平台期的最低浓度2.5 Lf/mL作为最适包被浓度，选择阳性/阴性比（P/N）值最大的酶标记抗体稀释倍数20 000倍作为工作稀释倍数，该方法在0.007 8~1.000 0 mIU/mL范围内呈现良好的线性（表1），专属性良好。线性与范围、精密度、准确度的验证结果（表1—3）表明，在检测高浓度（0.80 mIU/mL）、中浓度（0.50 mIU/mL）、低浓度（0.05 mIU/mL）标准品时，平均批间CV分别为11.03%、8.93%、13.28%，平均检测回收率分别为87.36%、90.86%、89.84%。2.1.2　方法的应用研究　应用建立的间接法对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果显示，健康人群中有一定比例的人群破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为40.98%。2.2双抗原法2.2.1　方法建立及验证　用过碘酸钠法将TT进行HRP标记，以TT原液作为包被抗原，采用棋盘滴定法，确定包被抗原浓度为0.04 Lf/mL，HRP标记的TT工作稀释倍数为3 000，该方法在0.078~10.000 mIU/mL范围内呈现良好的线性（表4）。验证结果（表4—6）表明：在检测高浓度（8.00 mIU/mL）、中浓度（5.00 mIU/mL）、低浓度（1.00 mIU/mL）标准品时，平均批间CV分别为12.82%、10.04%、10.50%，平均检测回收率分别为88.26%、90.13%、90.17%。2.2.2　方法的应用研究　应用建立的双抗原法对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果与间接法测定结果一致：在健康人群中有一定比例的人破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为31.15%。2.3ToBI试验2.3.1　方法建立及验证　将待测血样本稀释至合适浓度，加入一定浓度的TT标准物质，同时设定空白对照孔和阳性对照孔，确定最大P/N条件下的酶标记抗体1B2稀释倍数4 000倍作为最适稀释倍数，在1.95~31.25 mIU/mL的效价范围内，吸光度值与效价呈现良好的梯度关系（表7），四参数拟合的r大于0.98；通过计算，得出该方法的最低检测效价为1.70 mIU/mL。2.3.2　方法的应用研究　应用建立的ToBI，对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果与间接法、双抗原法测定结果一致：在健康人群中有一定比例的人破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为35.00%。2.43种破伤风抗体体外检测法阳性检出率的比较间接法、双抗原法、ToBI均检测出一定比例的破伤风抗体阳性血清（表8），其中间接法阳性检出率最高，而双抗原法和ToBI的阳性检出率比较接近。对3种体外法的检测结果进行卡方检验：χ2=1.34，P=0.513，表明3种方法的检出率差异无统计学意义。3讨论本研究建立了3种破伤风抗体体外检测法，经初步验证，均具有良好的特异性、重复性和准确性。3种检测方法应用于血样品中破伤风抗体滴度检测，对阳性样本的检出率差异无统计学意义，为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定了基础。与中国药典2020年版三部中的“小鼠试验法”相比，建立的3种破伤风抗体体外法均具有操作简便、方便快捷、重复性高的优点。一方面降低了动物痛苦和实验人员接触毒素的生物安全风险，另一方面还减少了动物的大量使用及检定人员的工作量，符合实验动物的3R原则。间接法采用间接ELISA测定血清中破伤风抗体的水平。有文献曾报道破伤风抗体水平在0.16~0.20 IU/ml之间时，间接法与小鼠或豚鼠体内攻毒法的测定结果具有较高的相关性。双抗原法能够检测出同时与固相抗原和酶标记抗原结合的抗体，检测原理与体内中和试验中破伤风抗体必须同时与2个抗原分子结合的模式相类似，与体内中和试验具有更好的相关性。ToBI试验是模拟体内中和试验设计的体外血清检测方法，与体内中和试验具有较高的相关性；且该方法具有较高灵敏度，当抗体水平低于0.01 IU/mL时优于体内中和试验。本研究为破伤风疫苗效价检测新方法建立的关键，今后将开展以此为基础的效价检测新方法及与小鼠攻毒法一致性等方面的研究，从而进一步应用于接种破伤风疫苗后抗体水平的评估。作者高慧君1  张雅婷2  季雅琦31兰州大学第二医院临床输血科，兰州 730030；2湖北省疾病预防控制中心卫生检验所细菌检测部，武汉 430079；3武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部，武汉 430207高慧君和张雅婷对本文有同等贡献通信作者：季雅琦Email：jyq0718@163.com引用本文：高慧君, 张雅婷, 季雅琦. 人血清中破伤风抗体检测方法的建立和比较 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(2): 114-119.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240517-00029识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2025年5月28日，康泰生物发布公告称，今日收到国家药品监督管理局签发的受理通知书，同意受理公司和兰州百灵生物技术有限公司研发的三价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞）的临床试验申请，受理号为CXSL2500428。据公司公告称，本次申请临床试验获得受理的三价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞）适用于3周岁及以上人群，可刺激机体产生抗流感病毒的免疫力，用于预防疫苗相关型别的流感病毒引起的流行性感冒。自20世纪50年代末建立MDCK细胞系以来，流感病毒可以在MDCK细胞和Vero细胞等多种细胞中培养的事实被揭示，流感疫苗的制造基质逐渐开始从鸡胚转变为细胞。其中，MDCK细胞是由Madin和Darby于1958年从犬肾脏组织分离培育建立的贴壁培养型细胞系，相较于其他细胞系，流感病毒在MDCK细胞中复制更迅速，可以在3-10代内快速适应获得高产病毒株，从而缩短疫苗株生产的时间，同时适应性代次的减少也可以降低疫苗株在传代过程中适应性突变发生的可能性。MDCK细胞具有易培养、增殖快、流感病毒易感等特征，细胞基质流感疫苗通过在MDCK细胞中大规模培养流感病毒，可以实现生产产量更高、产品质量更稳定、生产成本更低的效果。国外已有Seqirus公司等厂家的MDCK细胞基质流感疫苗获批上市。经查询国家药品监督管理局网站，目前国内未有三价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞）获批上市。不过，国内有多家企业布局了MDCK细胞基质流感疫苗，除康泰生物外，主要还包括武汉生物制品研究所、上海生物制品研究所、长春生物制品研究所、天元生物、欧林生物、北京生物制品研究所、艾美疫苗。值得注意的是，在流感疫苗方面，康泰生物还布局了四价流感病毒裂解疫苗和四价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞）：四价流感病毒裂解疫苗。2024年11月，公司的四价流感病毒裂解疫苗上市申请获CDE受理，该款疫苗适用于3岁及以上人群；同年8月，公司的该疫苗还新增6-35月龄人群获得临床试验批准通知书，进一步扩大了适用人群范围。四价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞）。同样是公司和百灵生物共同研发，已于2024年7月获批临床，该疫苗适用于3周岁及以上人群。流感疫苗是国内竞争最充分的疫苗品种。2024年以来，流感疫苗价格一降再降，三价疫苗报价曾低至每支6.5元，四价疫苗也跌至百元以内。企业更趋向扎堆相对高值的流感四价苗，从市场签发批次来看，三价式微、四价主导的趋势越来越明显了。疫苗专家陶黎纳曾表示，面对当前的竞争格局，其表示更希望中国的流感疫苗尝试各种技术路线、开辟蓝海，在收获商业成功的同时，提升中国的流感疫苗水平与选择丰富性。而MDCK细胞基质流感疫苗，无疑就是一种新的技术探索和选择。另外，流感疫苗一般每年2月拿到世卫组织分配的毒株并组织生产，6月左右生产完成，每批疫苗有2个月的等待批签发时间。今年国家调整了流感疫苗的批签发周期，从60天降到45天，加快了产品的上市周期。这也意味着，企业能否快速出手，成为市场竞争的关键之一。参考资料：[1]康泰生物公告、国家药品监督管理局药品审评中心，药物临床试验登记与信息公示平台等.[2]卷出新高度！今年的第一批流感疫苗，4月已经上市了. 健识局. 2025年04月17日.识别微信二维码，可添加药时空小编请注明：姓名+研究方向！