Taurocholic acid

☀🚗🚛🚅例行分割线🚅🚛🚗☀     上篇讲了慢病毒种属特性及其生命周期，本篇重点讲述慢病毒的科研及临床应用，提供可选的研发方向与思路，不提供具体改造方案。 内容包括： 慢病毒载体生产系统 慢病毒假型化包膜蛋白 病毒融合蛋白分类 慢病毒假型化机制 慢病毒载体靶向重定向 结语 说明：可用于慢病毒假型化的包膜蛋白以病毒科属进行分类，并列出包膜蛋白所来源的病毒种属、嗜性、该假型化病毒特性；除弹状病毒科与逆转录病毒科内参考文献未完全确认外，其他病毒都已经完成查证，其中前30条参考文献由AI查询得来，检查的时候发现适配性存疑，又人工补了后续的文献；前几天我的小狗豆豆得了细小，每天带着去输液，实在没心情查，但这篇文章实在拖得太久就先发出来，参考文献的查证对文章影响有限，可以先参考阅读，我补全后更新在‘阅读原文’的链接里。 有什么错漏请留言并请包涵！ 壹 慢病毒载体生产 野生型慢病毒可以经过改造为在实验环境中安全使用的慢病毒载体，这些改造的慢病毒载体具有多种优点，成为现今多种细胞和模型中有力的研究工具。慢病毒载体可靶向非分裂细胞，可在宿主长期稳定表达，并且表现出低免疫原性。 图1. 野生型慢病毒基因组 慢病毒的单链RNA基因组包含包装基因、调节基因、辅助基因以及整合所需的LTRs，所有慢病毒均使用包装基因gag、pol、env来制造病毒颗粒，野生型慢病毒额外需要调节基因tat和rev，以及病毒特异的辅助基因(如HIV-1的vif、vpr、vpu和nef)。LTR包夹所有基因，其中的任何序列都会被整合进宿主基因组。 然而，并非所有组件都是慢病毒生产必需的，许多非必需组件被移除或突变，而需要的组件则被分割到不同的质粒中，以此增加系统安全性。 为制备慢病毒载体，你需要3个（或第三代的4个）质粒： 穿梭质粒：包含目的基因、sgRNA或shRNA，两侧被LTR序列包夹，包装容量8-10kb 包装质粒：包含包装基因gag和pol，以及调节基因tat和rev，在第三代系统中被分割到2个质粒中 包膜质粒：包含包装基因env（通常使用具有广谱感染性的VSV-G） 当前我们所使用的慢病毒载体递送工具，主要是由HIV-1改造而来，经过多年的改进提升了效率和安全性，这些改进将慢病毒载体划分为三个代次。 图2. HIV基因组及三代慢病毒载体示意图 1. 第一代 第一代慢病毒质粒中的病毒组件虽然被分离到不同的质粒中，但病毒基因组基本保持完整，如图2B。由于缺乏安全性，且可能产生具有复制能力的慢病毒，目前已基本弃用。 第一代质粒包括： 穿梭质粒：包含目的基因和野生型LTRs 包装质粒：包含完整的病毒基因组，含包装、调节和辅助基因，仅去除包膜基因 包膜质粒：包含包膜基因env 2. 第二代 第二代慢病毒质粒通过移除辅助基因极大地提高了慢病毒载体生产的安全性，但保留tat基因，因为穿梭质粒5' LTR的启动子活性需要Tat蛋白来激活。如图2C。 第二代质粒包括： 穿梭质粒：包含目的基因和野生型LTRs 包装质粒：包含gag、pol、tat和rev 包膜质粒：包含env 3. 第三代 第三代系统进一步提高了二代系统的安全性。首先，包装系统被拆分为2个质粒，虽然更加安全，但使用起来更加复杂，额外的质粒也造成病毒滴度更低；其次，三代系统不再需要tat，穿梭质粒包含一个与异源启动子（通常是CMV或RSV）嵌合的5' LTR，从而无需Tat蛋白的转录激活。 大多数第三代穿梭质粒的3' LTR区域存在缺失，使其具有自失活 (self-inactivating, SIN) 能力。该缺失经过逆转录后转移到5' LTR区域，从而抑制病毒整合到宿主基因组后全长病毒的转录。该设计在第二代穿梭质粒中也较为常见。见图2D。 第三代质粒包括： 穿梭质粒：包含目的基因和LTRs (嵌合 5' LTR) 包装质粒1：包含gag和pol 包装质粒2：包含rev 包膜质粒：包含env 需注意，三代穿梭质粒可以使用二代或三代包装质粒进行包装，而二代穿梭质粒只能使用二代包装质粒进行包装，二代系统与三代系统的差异汇总如下表： 特征 二代 三代 穿梭质粒 只能被含有tat基因的二代包装系统包装 二代和三代包装系统均可包装 包装质粒 一个质粒，编码gag、pol、tat和rev 二个质粒，一个编码gag/pol，另一个编码rev 包膜质粒 可互换，通常编码VSV-G 可互换，通常编码VSV-G 安全性 安全；通过三个独立质粒编码必要的病毒基因，获得复制缺陷的病毒 更安全；通过四个质粒实现复制缺陷且无需使用Tat蛋白。含3' LTR缺失实现自失活 LTR病毒启动子 野生型 杂合启动子；5' LTR 部分缺失并与异源增强子/启动子（如 CMV 或 RSV）融合 慢病毒载体制备：慢病毒生产通常使用人胚肾293T (HEK293T) 细胞作为生产细胞，将所需穿梭质粒、包装质粒与包膜质粒转入HEK293T细胞后，细胞将组装病毒颗粒并将其释放到培养基上清中。质粒转染经过首次换液后，可收集含病毒的培养上清储存或进行离心浓缩，无论是否检测病毒滴度，都可以使用粗提或浓缩病毒进行靶细胞转染。 图3. 从生产质粒开始的慢病毒载体生产示意图 由于慢病毒转染细胞后会整合进入基因组，有可能造成未知风险，且某些使用场景只需瞬时表达，这时就可以使用整合酶缺陷型的慢病毒载体(integrase-deficient lentiviruses, IDLVs)，与野生型慢病毒相比，IDLVs将基因组RNA反转录为DNA后，由于整合酶失活，而线性前病毒DNA已准备好整合，因此可以通过同源重组或非同源末端连接产生两种类型的环状附加体(episome)。 这些附加体缺乏复制起点，无法在分裂细胞中维持，但IDLV s基因组具有转录活性，可支持基因产物的瞬时表达，随着时间的推移，附加体在细胞分裂周期中丢失，基因表达逐渐减弱，但丢失速率很大程度上取决于细胞的更新速度。 图4. 非整合慢病毒的整合过程与附加体形成示意图 贰 慢病毒载体假型化 嗜性决定了慢病毒可以感染的细胞类型，如HIV-1的包膜蛋白gp120/gp41可结合T细胞表面CD4受体与辅助受体，从而感染CD4+ T细胞，但通过更改包膜基因可改变病毒嗜性，这一过程称为假型化。例如目前最常用的慢病毒假型化包膜蛋白VSV-G，其受体为多种细胞表达的LDLR，VSV-G假型化的慢病毒可实现多种类型细胞的高效转染。另外，假型化还可以更安全地研究未知的病毒病原体，例如新冠疫情期间，使用COVID-19的Spike蛋白假型化慢病毒，模拟研究新冠病毒的感染机㓡。此外，假型化还可以降低病毒毒性，或改善病毒对血清的敏感性。 基于已开展的研究成果，慢病毒可成功假型化的包膜蛋白按病毒科分类如下： 1. 弹状病毒科Rhabdoviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties VSV-G Vesicular stomatitis virus LDL-R (Low-density lipoprotein receptor) Broad spectrum (most mammalian cells) 金标准，高滴度、高稳定性，可被血清补体灭活，对静息免疫细胞效率低 RABV-G Rabies virus Neuronal cell surface receptors (nAchR, p75NTR, NCAM) Strong neurotropism 用于神经系统疾病基因治疗，可实现逆向轴突运输 CNV-G Chandipura virus LRP1 (presumed, neural cell receptor) Neurotropism 降低免疫原性，增强特异性 PIRYV-G Piry virus Presumed LDL receptor family member Broad tropism 对人血清补体灭活有高抗性，可耐受冻融循环 MARAV-G Maraba virus Presumed LDL receptor family member Broad tropism 肿瘤溶瘤治疗应用，可作为VSV-G替代方案 COCV-G Cocal virus Presumed LDL receptor family member Hematopoietic stem cells, T cells 某些细胞中感染效力高于VSV-G MOKV-G Mokola virus Unknown Neurotropism 增强特异性，降低脱靶，用于CNS基因递送 2. 逆转录病毒科Retroviridae Envelope   Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral   Properties gp120-gp41 Human   immunodeficiency virus CD4   + CCR5/CXCR4 CD4⁺   T cells, macrophages 用于HIV研究或靶向CD4⁺细胞 gp70-p15E Murine   leukemia virus (amphotropic 4070A) Pit2   (SLC20A2) Broad   mammalian cells 双嗜性，可感染人和小鼠细胞，广泛用于基础研究 gp70-p15E Murine   Leukemia virus (amphotropic 10A1) Pit1   + Pit2 Broad   mammalian cells 双嗜性，受体范围更广 gp70-p15E Gibbon   Ape Leukemia virus GLVR-1 Human   T cells, B cells 高效转导人淋巴细胞 RD114 Feline   endogenous retrovirus ASCT2   (SLC1A5) CD34⁺   hematopoietic stem cells, T/B cells 非细胞毒性，转导效率优于VSV-G，血清稳定性增加 BaEV-Env Baboon   endogenous retrovirus ASCT1   (SLC1A4) / ASCT2 (SLC1A5) Resting   HSPCs and T, B, NK cells 在静息造血细胞转导方面显著优于VSV-G和HERV-W，可利用双受体进入 KoRV-Env Koala   retrovirus THTR1   (Thiamine transporter 1, KoRV-J subtype) Freshly   isolated immune cells 原代免疫细胞转导优势，可稳定产毒细胞系 JSRV-Env Jaagsiekte   sheep retrovirus Hyal2 Lung   epithelial cells 肺部疾病基因治疗，可转导人气道上皮 ASLV-Env Avian   sarcoma leukosis virus TVA   (A subgroups) / TVB (B/D/E subgroups)/TVC (C subgroups) 无哺乳动物嗜性 无背景感染，可工程改造实现抗体介导再靶向，高热稳定性，低免疫原性 3. 副黏病毒科Paramyxoviridae Envelope   Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral   Properties MeV H/F Measles   virus CD46/SLAM 免疫细胞，静息态   CD34⁺ 细胞 需共表达H（血凝素）和F（融合蛋白），滴度较低但靶向精准，高既有免疫人群 SeV HN/F Sendai   virus Sialic   Acid 呼吸道上皮，HSCs 临床试验中用于呼吸道细胞递送， HPIV HN/F Human   Parainfluenza virus Sialic   Acid 呼吸道上皮 呼吸道靶向，较稳定但对冻融敏感 NiV F/G Nipah   virus EphrinB2,   EphrinB3 EphrinB2⁺ cells，包括内皮细胞、神经细胞与干细胞等 BSL-4病毒的安全替代研究工具，血清稳定性高 4. 肺病毒科Pneumoviridae Envelope   Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral   Properties HRSV SH/G/F Human   Respiratory Syncytial virus heparin,CX3CR1,nucleolin,ICAM-1 呼吸道 RSV病毒学研究工具，稳定性差 5. 杆状病毒科Baculoviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties GP64 Autographa   californica multiple nucleopolyhedrovirus Unknown 广谱，肝脏细胞、肝窦内皮细胞与呼吸道上皮细胞等 低毒性、低免疫原性，VSV-G替代方案 6. 肝病毒科Hepadnaviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties L/M/S Hepatitis B virus NTCP   (Sodium taurocholate cotransporting polypeptide) 肝细胞 肝特异性基因治疗，研究HBV入侵机制 7. 丝状病毒科Filoviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral   Properties EBOV GP Ebola virus NPC1, TIM-1 广谱，感染单核、巨噬与DCs，以及内皮细胞、肝细胞和肾上腺皮质细胞 高度糖基化形成糖链屏障，隐藏抗原表位；需要蛋白水解去除糖基帽，暴露结合位点 MARV GP Marburg virus NPC1 广谱，可感染巨噬细胞、单核细胞与DCs，内皮细胞，具有肝嗜性 丝状病毒研究工具，通过巨胞饮作用进入细胞，侵染依赖于组织蛋白酶 8. 披膜病毒科Togaviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral   Properties SINV E1/E2 Sindbis virus LAMR1, NRAMP 广谱 再靶向平台 ChIKV E1/E2 Chikungunya virus Mxra8, PHB1, GAGs and TIM-1 广谱，感染关节、皮肤、肌肉和肝脏，可感染肌肉、成纤维和滑膜细胞系等 淋系细胞感染率低，中和抗体研究平台 RRV E1/E2 Ross River virus Unknown 肝脏，神经与肌肉嗜性 高包装效率与稳定性，低毒性，可构建稳定生产细胞 SFV E1/E2 Semliki Forest virus VLDLR, DC-SIGN/L-SIGN DCs和神经元，多种非哺乳动物细胞 高稳定性，疫苗平台，体内基因递送平台 9. 正黏病毒科Orthomyxoviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties IAV HA Influenza A-D virus sialyl-galactosyl residues 呼吸道上皮与肺组织 需NA和M2蛋白辅助生产，蛋白水解激活，pH依赖性融合 FPV HA Fowl Plague virus Sialic acid 眼部，呼吸道 可与M2共表达增强假型化效率 10. 呼肠孤病毒科Sedoreoviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties GP Rotavirus A sialic   acids/ HBGA+Integrins/Hsc70/JAM-A &Occludin 肠靶向 双重疫苗接种平台 11. 沙粒病毒科Arenaviridae Envelope Protein Virus Receptor Tropism Lentiviral Properties LCMV GP Lymphocytic Choriomeningitis virus α-dystroglycan 神经细胞与胶质瘤细胞,   心脏与肝脏, DCs 高稳定性，低炎症性，低毒性，低暴露人群 PICV GP Pichinde virus Unknown 广谱嗜性，可高效转染内皮细胞、成纤维细胞与上皮细胞细胞系，可感染APC 沙粒病毒研究工具，疫苗载体开发，人群免疫率低 对慢病毒进行假型化使用的包膜蛋白具有两个核心功能：提供特异性靶向结合能力，从而改变慢病毒嗜性；提供膜融合能力，实现病毒载体的细胞内递送。对于不同的病毒来说，这两个功能可由单一蛋白完成如VSV-G，也可由两个或多个不同的蛋白分别执行不同的功能如Measles H/F。 叁 病毒融合蛋白分类 根据结构特征，病毒膜融合蛋白(membrane fusion proteins)可分为三类，不同融合蛋白还包含不同类型的融合肽，并且对辅助蛋白的依赖程度也各不相同。尽管如此，所有已鉴定的病毒融合蛋白都会经历一个过程：首先从具有融合能力的状态（二聚体或三聚体）转变为嵌入膜内的同源三聚体前发夹结构，然后转变为发夹三聚体，该发夹三聚体使附着于靶膜的融合肽和附着于病毒膜的跨膜结构哉紧密靠近，从而促进病毒膜和靶膜的融合。在这些构象转变过程中，融合蛋白诱导膜结构经历紧密贴合、半融合、形成小融合孔以及最终形成大融合孔等阶段。大量研究表明，不同病毒融合蛋白都趋向于采用相同的总体策略来介导融合，然而这些融合蛋白在序列和结构上却差异很大，并且由不同的触发机制激活。 图5. 常见三聚体发夹结构的膜融合途径 I类融合蛋白 I类融合蛋白在融合前和融合后均为三聚体，其最终状态的典型特征是具有一个中央N端三聚体α螺旋卷曲螺旋，并由三个‘C端’螺旋修饰，从而形成一个六氢化物链（6HB）。I类蛋白的6HB大小和位置差异显著，它们的融合肽位于融合亚基的N端或附近。 II类融合蛋白 II类融合蛋白主要由β折叠结构构成，并排列成3个相连的结构域，其排列方向与膜平行，这与I类病毒膜融合蛋白有显著差异，其内部融合肽以环状结构位于β链末端。它们与伴侣蛋白结合，该伴侣蛋白在病毒组装过程中或组装后不久被切割。成熟后，融合蛋白的胞外结构域以反平行二聚体的形式存在于病毒体表面下方，每个茎部位于病毒体的三重对称轴上，一旦被激活，II类融合蛋白会重新排列成三聚体，并从病毒膜的三重对称轴上突出。 III类融合蛋白 III类融合蛋白兼具I类和II类融合蛋白的特征，与I类融合蛋白类似，它们在融合前均为三聚体，并包含一个中央α螺旋卷曲螺旋结构，但是它们的融合结构域更类似于II类融合蛋白，其融合环位于延伸的β折叠链的末端。以HSV-1 gB和VSV G为代表，该类蛋白的外结构域可分为5个亚结构域，其中结构域I被称为融合结构域，主要由β折叠构成，顶端包含融合环，与第二类膜融合蛋白相同 肆 异源病毒包膜蛋白假型化机制及限制条件 一、异源包膜蛋白能嵌入的核心机制 慢病毒包膜的假型化本质上是脂质膜蛋白的物理整合过程，而非严格的生物识别机制。其可靠性基于以下原理： 1. 病毒出芽的膜来源特性    慢病毒颗粒的包膜直接来源于宿主细胞质膜的脂筏区域，这些区域富含胆固醇和免疫受体。任何嵌入细胞膜的异源糖蛋白，只要位于脂筏附近，就有概率被出芽的病毒颗粒捕获并包裹进去，这一过程不需要慢病毒与异源包膜蛋白之间的特异性识别。许多异源病毒（如丝状病毒或弹状病毒）具有与慢病毒类似的组装机制，使其同源三聚体结构包膜糖蛋白能够有效地与慢病毒核心结合。 2. Gag蛋白的招募作用    病毒结构蛋白Gag在质膜组装时，其基质蛋白(MA)结构域会与膜脂质及嵌入的跨膜蛋白胞质尾部相互作用。这种招募机制不依赖包膜蛋白的序列特异性，而是依赖其跨膜区和胞内区的拓扑结构。只要异源蛋白具有合适的跨膜锚定结构，就能被Gag招募进病毒颗粒。 3. 翻译后修饰的兼容性    酰化等脂质修饰可增强包膜蛋白对脂筏的亲和力，显著提升假型化效率。多数病毒的包膜蛋白本身就具有这类修饰信号，使其能自然定位到病毒出芽位点。 二、无法进行慢病毒假型化的包膜蛋白类型 尽管慢病毒假型化具有广泛兼容性，但以下类型的包膜蛋白存在根本性限制： 1. 结构缺陷型蛋白 无跨膜结构域的可溶性蛋白：如分泌型糖蛋白，无法锚定在细胞膜上，必然不能被病毒颗粒包裹 仅含胞内区的蛋白：如某些细胞因子受体，缺乏胞外识别结构，无法介导病毒感染 2. 需要病毒特异性辅助因子的蛋白    某些病毒的包膜蛋白需要其同源病毒特有的辅助蛋白才能完成正确折叠或运输。例如： 需要特定伴侣蛋白进行构象成熟的包膜蛋白 依赖病毒编码的蛋白酶进行剪切激活的融合蛋白 在缺乏辅助因子的异源系统中无法形成功能性构象 3. 结构过度复杂或不兼容的蛋白 多层膜结构病毒蛋白：如痘病毒、疱疹病毒等具有复杂包膜结构的蛋白，与慢病毒的单层脂质膜出芽机制不兼容 尺寸/拓扑结构极端的蛋白：分子量过大 (>500 kDa) 或具有异常长的胞内尾区 (>200aa) 可能影响病毒颗粒的组装效率 4. 诱导强烈细胞毒性或干扰机制的蛋白 强促凋亡蛋白：如某些融合蛋白可诱导合胞体形成，导致生产细胞快速死亡 干扰宿主分泌途径的蛋白：过度滞留在内质网或高尔基体的蛋白，会阻断病毒颗粒的组装和释放 5. 缺乏广谱受体识别能力的蛋白 高度种属限制性蛋白：如仅识别小鼠受体的嗜亲性MLV包膜蛋白，虽然可成功假型化，但无法感染人源细胞，因此在人用基因治疗中视为功能上不可行 三、影响假型化效率的关键因素 1. 胞内尾区的兼容性    包膜蛋白的胞质尾区长度和序列显著影响其被Gag招募的效率。过长的尾区可能空间位阻Gag互作，而某些病毒的尾区含有特殊的晚期结构域 (late domain)， 可促进出芽。 2. 脂筏定位信号    包膜蛋白是否富含胆固醇结合基序或棕榈酰化位点，决定其能否有效富集于病毒出芽位点。 3. 生产系统的适配性 瞬时转染 VS 稳定细胞系：VSV-G因细胞毒性难以建立稳定包装细胞，而RD114等低毒包膜更适合构建稳定产毒株 多质粒比例优化：包膜质粒与包装质粒的摩尔比需精确调控，以避免过度表达导致内质网应激 无法进行慢病毒假型化的包膜蛋白类型，需要进行适当调整或修饰以满足膜嵌入机制。在慢病毒的假型化过程中，如果外源蛋白的膜内结构过于庞大或形状怪异，会与正在形成的Gag蛋白晶格发生碰撞，将导致病毒在没有“外皮”的情况下出芽，产生一种“光秃秃的”、不具感染性的病毒颗粒。 对于无法整合的外源蛋白，我们通常进行尾部替换，即将目标病毒的“头部”（胞外结构域）与VSV-G或HIV-1 gp41的“尾部”（跨膜区和胞质区）融合。这样就形成了一种嵌合蛋白，其外部结构与目标病毒相似，但内部功能却与慢病毒相容。 伍 病毒载体靶向重定向 在in vivo细胞疗法场景中，需要在保留包膜蛋白融合能力的同时对其原有嗜性进行工程改造，使慢病毒载体特异性地靶向目的细胞，以避免体内应用时病毒载体脱靶感染非目的细胞造成未知风险。 为此，通常采用‘blind and bind'的策略对包膜蛋白进行工程化，以VSV-G为例： 1. ‘致盲’VSV-G：引入突变使VSV-G无法结合其天然LDLR受体，失去原有的组织或细胞嗜性但保留膜融合能力，通过结构工程已证实关键突变如K47Q和R354Q可有效致盲VSV-G。 2. 重定向靶向：盲化后，需将新的靶向机制添加到病毒包膜，其中主要有两种主要方法 直接嵌合融合：将靶向配体（例如scFv 或肽）通过基因工程直接融合到 VSV-G 蛋白的 N 端。 双组分/模块化策略：这种策略使用同一病毒上的两种独立蛋白质，一种是“盲化”的VSV-G（用于融合），另一种是独立的“结合”蛋白（类似于膜锚定抗体），用于识别靶细胞。    在体内CAR-T生产中，可以使用anti-CD3或anti-CD7序列对载体进行改造，从而直接在患者体内制造CAR-T细胞，无需昂贵的以及长周期的生产过程。 而以麻疹病毒双包膜蛋白H与F蛋白为例，其与单一的 VSV-G 蛋白不同，麻疹病毒包膜采用双蛋白系统：H（血凝素）用于结合，F（融合蛋白）用于进入细胞膜。为了实现体内细胞治疗，需要多步骤的过程来保证载体只感染目的细胞且耐受患者免疫系统： 1. ‘致盲’H蛋白：H蛋白天然结合CD46、SLAM与Nectin-4，为防止载体进入非目标细胞，必须对H蛋白的胞外域进行点突变，常用的突变包括Y481A和R533A，以及S548L和F549S，使其失去与天然受体结合的能力，确保其在生物学上处于惰性状态。 2. 重定向靶向：H蛋白被‘致盲’后，在其C末端融合一个特定的靶向配体，使其能够特异性地识别T细胞表面标记物，如CD3、CD4、CD8或CD7等。    这种方式将结合与融合功能解耦，使靶向配体只负责结合，而不会干扰F蛋白倡导的融合过程。另外，需要注意的是，麻疹病毒属于副黏病毒，其糖蛋白与慢病毒核心在生物物理上并不完全兼容，为使H和F蛋白能高效组装到慢病毒颗粒表面，必须对其N端胞质尾部进行截短，H蛋白通常截短18至24个氨基酸（如CTΔ18或Δ24），F蛋白通常截短30个氨基酸（CTΔ30）。 虽然上述改造可以使VSV-G或H/F蛋白假型化的慢病毒载体重定向靶向T细胞，从而实现in vivo细胞疗法的体内应用，但由于天然VSV-G极易被人类血清中的实体系统灭活，因此还需要进行增强血清抗性的定向进化，或使用与VSV-G高度同源但抗性更强的Cocal-G蛋白 (Umoja Biopharma)，以满足全身性给药需求；而麻疹病毒H/F包膜蛋白由于人类普遍接种麻疹疫苗或有感染史，体内存在预存中和抗体限制了其临床应用，因此在实际药物开发时，可使用其他副黏病毒如Nipah病毒糖蛋白G/F (Sana Biotechnology) 进行慢病毒假型化改造。 陆 in vivo细胞疗法——不止慢病毒 无论使用哪种病毒包膜，对包膜蛋白的改造策略基本一致，即”blind and bind“致盲与重定向靶向；此外需要注意的是，由于我们使用的生产细胞株293T自身携带MHC分子，可能会展示于病毒包膜造成免疫清除，因此需要对生产细胞株进行基因编辑敲除MHC分子；而不同生产细胞糖基化的差异，也会造成病毒载体特性的改变；另外，为了避免病毒在体内被吞噬细胞非特异性吞噬，也有必要在病毒包膜表面展示“don't eat me”信号；为了增强体内感染效率，还可以在包膜表面增加相应的活化抗体如anti-CD3/anti-CD28，提高效率降低用量避免高剂量风险。 对于现在的细胞治疗或CGT，甚至整个生物医药行业来说，除慢病毒之外还有更多的病毒有待工程化，使用何种病毒，实现何种目的，满足何种需求，需要我们一起向自然界汲取经验。病毒经历亿万年的演化，是天然进化出的巨大宝库，每个基因或组件都是一个插件，每个病毒基因组都是完整的skill，在工程化过程中需要使用工具时，不妨先向大自然取经。 ps: 由于参考文献比较多，目前是79条，文章中假型化糖蛋白的种类及参考文献单独放在阅读原文链接中，方便补充更新；另外，我使用的是obsidian写的markdown文件，用其他软件打开时可能会造成引文序号错乱，需要注意。 参考资料： https://www.addgene.org/guides/lentivirus/https://blog.addgene.org/viral-vectors-101-pseudotypingThe Era of Gene Therapy: The Advancement of Lentiviral Vectors and Their Pseudotyping; doi: https://doi.org/10.3390/v17081036https://notebooklm.google.comhttps://www.kimi.comhttps://ictv.global/reportCell type-specific delivery by modular envelope design; doi: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40788-8Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins; doi: https://doi.org/10.1080/10409230802058320Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors; doi: https://doi.org/10.1038/nm1365Exploring the Use of Viral Vectors Pseudotyped with Viral Glycoproteins as Tools to Study Antibody-Mediated Neutralizing Activity; doi: https://doi.org/10.3390/microorganisms13081785

引用本文 李欢, 向宽辉. 乙型肝炎病毒新感染模型——肝脏类器官的构建和应用进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2026, 34(3):292-298. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20250407-00125. 通信作者：向宽辉，北京大学医学部基础医学院病原生物学系和感染病研究中心 专 家 简 介 向宽辉 教授 北京大学医学部副研究员、助理教授/博士生导师，中国疫苗行业协会疫苗基础研究专业委员会第一届委员会委员、中华预防医学会感染病分会青年委员，Scientific Reports 编委、中国病毒病杂志和JCTH杂志青年编委。于2017年获得博士学位并留校任教，期间在美国洛克菲勒大学Charles M. Rice教授实验室联合培养，致力于乙肝病毒感染致病模型建立与优化，病毒与宿主的相互作用及抗病毒药物筛选等工作。先后主持国自然基金及横向课题多项，参与多项国家重大专项等课题，入选北京高创计划青年骨干人才，申请中国发明专利9项，获批5项。共发表SCI论文>30篇，系列文章以第一或通讯发表在J Hepatol、Nat Comm、Signal Transduct Target Ther、J Adv Res、Stem Cell Rep和Antivir Res等杂志，以共同作者发表在Science、Gastroenterology及Cell Research等杂志上，入选ESI高被引论文。获中华医学科技奖二等奖。 摘要 乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝硬化和肝细胞癌的主要原因之一，对人类健康存在威胁，而其具体的致病机理尚未研究透彻。由于 HBV 研究的细胞和动物模型存在较大局限性，近年来，类器官模型展现出了极大的应用潜力。为了更好地探索 HBV 致病机制，实现早期预防和治疗，构建体外肝脏类器官模型具有重要意义。目前，人类肝脏类器官（HLO）模型已被探索了多种不同的分化培养方案，并被证实了在组织发育和疾病模型构建以及个性化医疗、药物筛选等方面具有极大的潜力。文章简要阐述了 HBV 模型的特点及其新兴模型 HLO 的分化培养策略和应用，为更好地了解和优化 HLO 的模型提供参考价值。   正文   乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，对人类健康存在较大威胁。据世界卫生组织报道，2019 年全球约有 150 万例新发 HBV 感染者，2.96 亿例慢性感染者，82 万例死于 HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝细胞癌等相关疾病［1］。目前，主要的抗病毒药物是核苷（酸）类药物和干扰素［2］，均能影响病毒复制，但并不能完全根除病毒，难以实现功能性治愈。因此，迫切需要更多深入的研究来了解 HBV 感染和致病机制，为抗病毒药物研发提供更多的靶点。目前，HBV 感染模型主要包括细胞模型和动物模型。细胞模型发展较为成熟，如 HepG2.2.15［3］和 HepAD38［4］都源自 HepG2 细胞株，是实验室中最常使用的模型。此外，还有肝细胞样细胞［5］、原代肝细胞［6］、HepG2-牛磺胆酸钠共转运蛋白（牛磺胆酸钠共转运多肽，NTCP）［7］细胞等感染模型。尽管细胞培养模型较为成熟，但其缺乏肝脏微环境，并不能完全反映病毒与宿主间的互作。动物模型（如黑猩猩）的使用受到伦理限制［8］，且某些动物模型（如小鼠模型）由于存在物种差异性，难以完全复现 HBV 在人体内的长期慢性感染过程。 近年来，科学家们发现了干细胞自我更新和分化的特性，证实了在分子水平上对干细胞进行调控的可能性。与此同时，再生医学领域的研究表明，器官可以通过干细胞分化成一种或多种所需的成熟细胞类型来进行修复和再生［9］。因此，随着体外三维培养技术的逐渐成熟，研究者们开始探索使用干细胞在体外重建类器官模型，并将其应用到组织和器官生物学领域中［10-12］。类器官是源自原代组织、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）或诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）的体外三维立体细胞簇，能够自我更新和自我组织化，表现出与起源组织相似的器官结构与功能［13-14］。目前已有研究报道了多种组织类器官模型的构建及应用，例如肠道［15］、肾脏［16］、肝脏［17］、胃［18］、乳腺［19］、前列腺［20］和脑［21］等，类器官的发展逐渐引起人们的重视。因此，在体外重建人体肝脏环境用于研究肝相关的疾病机制成为了一种新的思路。本综述简要介绍了现有 HBV 感染模型的优缺点，阐述了肝脏类器官的分化培养策略以及用于 HBV 研究的潜力，为更好地了解和优化肝类器官的模型构建和应用并将其致力于 HBV 的研究中提供参考价值。 一、 HBV 现有模型 HBV 的疾病模型主要包括细胞模型和动物模型。目前实验室常见的细胞研究模型主要为肝癌细胞株，如：稳定转染 HBV 基因组的 HepG2.2.15［3］和 HepAD38［4］细胞，以及过表达 NTCP 的感染细胞模型，如：HepG2-NTCP［7］、Huh7-NTCP［22］和 HepRG-NTCP［23］等。此外，也用原代人肝细胞进行研究，但其成本较高，来源稀缺，难以大规模使用［6］。近年来，也有报道分化出肝细胞样细胞作为 HBV 感染模型［5］。尽管细胞模型较为成熟，但其属于二维模型，缺乏正常的生理环境，难以反映病毒与宿主间的互相作用，具有较大局限性。 HBV 的动物感染模型包括黑猩猩、树鼩及各种改造的小鼠模型等，如表 1 所示［24-35］。HBV 感染具有高度受限的物种趋向性，在早期研究中，除了人类研究对象，黑猩猩几乎是可使用的唯一动物模型，这是由于黑猩猩具有与人类最接近的遗传背景和免疫系统。然而，由于人们对动物伦理的日益重视，使用黑猩猩和其他灵长类动物作为实验模型受到了高度限制。长期以来，实验小鼠一直是疾病研究的首选模型对象，但它们在自然条件下不能支持 HBV 感染。因此，随着技术不断进步，研究人员也逐步对小鼠进行改造，使其能用于HBV 研究，然而，由于物种差异性的存在，其始终不能完全复现 HBV 在人体内肝脏微环境下的长期慢性感染，因此，建立体外的人肝细胞微环境模型具有重要意义。 二、 人肝类器官模型 除了细胞和动物模型外 ，目前人肝脏类器官（human liver organoid，HLO）作为一种新兴模型已被应用在 HBV感染的研究中。此外，HLO 在基础研究、肝病建模、个性化治疗、药物筛选和毒性测试等多领域中也有所应用，成为了肝脏相关研究中有力的新兴工具之一。HLO 被定义为由原代肝细胞、成体干细胞（adult stem cell，ASC）、iPSC 或多细胞共培养衍生而来的体外三维细胞簇，它们具有自我更新和组织能力，能在结构和功能上模拟人体生理环境下的肝脏，表现出与肝脏相似的器官功能。 1. 人肝类器官模型的构建 HLO 模型可有多种不同的细胞来源，如 iPSC［36-37］、ASC［38］、原代肝细胞［39］或多种细胞共培养。此外，还可以利用肝肿瘤细胞构建肝肿瘤类器官进行相关研究［40］。起始细胞的类型决定了最终形成类器官的特征，同一来源的类器官由于分化过程中采用方法的不同也会存在差异。因此，根据需求选择合适的起始细胞和分化方案对于成功构建模型具有重要意义。 （1）基于 iPSC 的分化方案：最初，Takahashi 等［41-42］在胚胎干细胞培养条件下，通过引入 4 种因子（POU 转录因子家族成员 3/4、SRY 盒转录因子 2、髓细胞瘤病毒癌基因同源物和 Kruppel 样因子 4）成功诱导小鼠胚胎或成人成纤维细胞的多能干细胞，这些细胞被命名为 iPSC，具有胚胎干细胞的形态和生长特性，并表达胚胎干细胞标记基因。iPSC 具有自我更新能力，并且可以使用特定的分化方案分化成多种细胞类型，被认为是再生医学中最有效的供体细胞来源。 目前，iPSC 生成肝脏三维模型依赖于逐步定向分化方法来重现体内发育［43-44］。在肝脏的起源和发展中，内胚层的三个相邻区域产生双能性肝祖细胞，最终分化为肝细胞和胆管细胞［37］。因此，首先可以通过将 iPSC 分化成定形内胚层（definitive endoderm，DE）来模拟肝脏发育。下一阶段是将DE 分化为前肠或肝内胚层阶段（也称肝细胞前体）。在肝内胚层的诱导分化中，通常将成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor 2，FGF）2 和骨形态发生蛋白 4 结合使用。接下来 ，诱导分化出肝细胞核因子 4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4A）、甲胎蛋白和叉头框蛋白 A2 阳性的肝母细胞阶段，肝母细胞能进一步分化为肝细胞或胆管细胞。生成肝细胞样细胞的最末阶段通常需要多个分化步骤，其中涉及的关键分化因子包括抑瘤素 M、肝细胞生长因子（human growth factor，HGF）和类固醇等。 目前已有非常多利用 iPSC 成功分化为肝类器官的方案。Mun 等［45］提供了一种可扩增且功能成熟的分化方法，即用 iPSC 分化为成熟肝细胞，再将其转移至基质胶中形成三维肝细胞样肝类器官，其保存了包括血清蛋白生成、药物代谢和解毒功能等成熟肝脏的特性，对一定浓度的药物表现出显著的毒性反应，可用于药物毒性测试和疾病模型。由于上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是人类肝脏干细胞的标志物［46］，于是 Akbari 等［47］利用 iPSC 衍生的 EpCAM+内胚层细胞作为中间体，生成了内胚层衍生的功能性肝类器官（endoderm-derived hepatic organoids，eHEPOs）。eHEPOs 可在 2 周内产生，并可长期扩增（>16 个月），不丧失向成熟肝细胞分化的能力，且可作为瓜氨酸血症的疾病模型模拟尿素循环紊乱的状态。Nie等［48］将 iPSC 来源的内胚层细胞、间充质细胞和内皮细胞在体外进行三维培养，通过细胞间的自我组织作用进一步分化为功能性的肝类器官，对其进行 HBV 感染，揭示了病毒感染可导致其出现肝功能障碍，肝脏基因表达下调，释放诱导早期急性肝衰竭的标志物，并改变肝脏超微结构，这表明其可能为肝炎个体化治疗提供一个有前途的个体化感染模型。 在肝脏器官早期形成过程中，新生成的肝细胞从前肠内胚层分离出来，形成浓缩的组织团块——肝芽［49］，并迅速发生血管化。这种大规模的形态变化依赖于前内胚层上皮细胞、间充质细胞和内皮祖细胞之间信号的精确协调［50］。因此，Takebe 等［36］提出可以通过共培养内皮细胞、间充质细胞和肝内胚层细胞，从而在体外重现了三维肝芽的形成。他们首先将人 iPSC 定向分化为能成功表达肝脏标志物 HNF4A 的肝内胚层细胞，再将其与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）和人间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，MSC）以 10∶7∶2 的比例进行共培养。培养 4～6 d 后，细胞能够自组织形成三维的肝芽结构。此外，他们将肝芽转移至小鼠血液中，发现其48 h 内就能与血管发生连接，形成功能性血管网络，从而促进肝芽的成熟。而后，他们还据此搭建了多孔阵列培养平台来实现肝类器官大量扩增，该平台可大规模生产均质和小型化的肝芽（>108细胞）［51］。Zhang 等［52］通过调控 FGF、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）和 Wnt 信号，从5 种 iPSC 中可再生地产生表达人尾型同源框转录因子 2+的后肠内胚层细胞（posterior gut endoderm cell，PGEC），而后将其与 HUVEC 和 MSC 共培养获得 PGEC 肝芽，移植到小鼠体内后成功挽救了小鼠的肝衰竭。此外，Asai 等［53］用iPSC 诱导肝特异性内胚层细胞、将其与 MSCs 和 HUVEC 建立了一种肝类器官，将其用于分析旁分泌效应，展示了一种识别调节人肝细胞分化的发育旁分泌信号的新方法。 （2）基于 ASCs 的分化方案：富含亮氨酸重复 G 蛋白偶联受体 5（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor5，LGR5）是肠道、胃、毛囊和乳腺中的干细胞标志物［54］，在稳定状态下的成人肝脏中不表达［38］。然而，有研究证明在四氯化碳诱导的急性损伤和肝毒素引发的“卵形细胞反应”［55］损伤之后，LGR5+干细胞群体具有双向分化的潜力，通过新生肝细胞和胆管细胞来促进肝脏再生［38］。这些损伤诱导 的 LGR5+ 干细胞的潜在来源包括未损伤肝脏的 LGR5－祖细胞［56］、其他细胞（如间充质细胞）的募集［55］以及某些疾病状态（如肝内胆管癌）下肝细胞向胆管细胞的转分化［57］。基于肝脏 LGR5+干细胞的这种特性，它们在肝脏类器官的研究中发挥着重要作用。Huch 等［38］将 LGR5+肝干细胞用基质胶包埋构建体外三维模型，加入表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、Rspo1（ 一种 Wnt 激动剂）、FGF10、HGF 和烟酰胺等因子，形成和获得肝类器官。通过抑制 Notch 和 TGF-β 信号，成功获得了具有成熟肝细胞标志物（ 细胞色素和白蛋白等）的分化肝类器官。Schneeberger 等［58］通过将 LGR5+干细胞与 Rspo1 和 10% 基质胶在旋转瓶中共同培养分化，建立了一种高效培养大量LGR5+干细胞类器官的方法，6 周后细胞数量能增加近 10 倍。 （3）基于原代肝细胞的分化方案：肝细胞约占肝实质细胞的 80%，可通过手术或活组织检查标本中的成熟肝脏中分离获得。其可进行增殖和分化，从而获得可以保留部分肝细胞功能、形态和基因表达，并能在培养数周后保持代谢稳定的肝类器官［59-60］。近年来，使用原代肝细胞构建的三维模型中，主要注重于修改培养基成分，从而达到最大限度地提高肝细胞的活力和维持长期生长和增殖［61］。 Hu 等［39］将小鼠和人成熟的原代肝细胞分离并包埋在基质胶中，通过添加Rspo1、EGF、FGF7、FGF10、HGF 和TGF-b 抑制剂等一系列细胞因子来促使其形成肝类器官并维持长期扩增。其中，Wnt/Rspo1 和 HGF 对于维持肝类器官的长期扩增具有重要作用，而 CHIR-99021（糖原合成酶激酶-3β 抑制剂，是 β-连环蛋白破坏复合物的一部分）被证明是肝细胞扩增所必需的因子。同时，通过对形成的类器官进行分析，证实了其存在成熟的白蛋白分泌功能，保留了肝细胞的基因表达谱。 Peng 等［62］揭示诱导损伤的炎症细胞因子TNF-α 在三维培养中具有促进肝细胞扩增的作用，使其实现了连续传代和超过 6 个月的长期培养，并用单细胞 RNA 测序证实了类器官中存在肝细胞标志物的广泛表达。Hendriks等［17］通过 IV 型胶原酶消化人胎肝组织后低速离心富集人胎肝细胞，在体外培养形成人胎儿肝类器官，并通过电穿孔方法实现基因敲除或基因敲入，将类器官模型与基因工程结合，扩展了类器官的应用。Tong 等［63］用 HYDROX（一种化学定义的 3D 纳米纤维）来培养原代肝细胞衍生的肝脏类器官，提示其导致类器官的增殖能力丧失，但药物代谢酶的基因表达水平显著提高，具有作为药物研究模型的潜力。 2. 人肝类器官模型的应用 类器官模型作为生物医学研究的替代模型，在疾病建模、肝脏再生、药物筛选和个体化治疗等基础研究和治疗应用领域具有广阔的前景（图 1），目前已有多项研究应用类器官模型解决问题。 （1）HBV 感染及其他肝病：Yan等［26］研究结果提示NTCP 是 HBV 的重要细胞进入因子，这一研究促进了新型HBV 感染三维模型的发展。目前，已有研究使用肝类器官成功地揭示了 HBV 在未过表达 NTCP 的情况下具有在体外感染和复制的可能性，通过构建病毒感染的肝类器官，可以进一步研究病毒与宿主相互作用的机制［48，64-65］，这使肝脏类器官成为 HBV 感染的新模型。Nie 等［48］构建了 hiPSC 来源的肝类器官，证明了其对 HBV 感染具有强易感性，且能维持 HBV 的复制和产生感染性病毒，同时出现了病毒感染引起的肝功能障碍，肝脏基因表达下调，肝脏超微结构改变等病理现象。除 HBV 外，类器官技术也被应用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）等肝炎病毒（表 2）［48，64-70］。 由于饮酒、代谢紊乱、病毒感染和遗传疾病等多因素原因［71］，肝病每年导致全球多人死亡。目前，类器官模型除了应用于 HBV、HCV、HEV 等病毒感染性肝病外［72］，还被应用于多种肝脏疾病，如非酒精性脂肪性肝炎［37，73］、非酒精性脂肪性肝病［74］、肝纤维化［75］以及原发性肝癌［40］等。 （2）肝脏再生：原位肝移植一直被认为是治疗晚期肝衰竭患者的最终解决方法，然而其面临供体不足、免疫排斥等诸多因素的限制，因此再生医学领域尝试寻找肝移植的优化方法。来源于患者自身的肝细胞可体外培养形成肝类器官，与患者排斥反应较弱，可能成为肝移植的潜在途径。Yang等［76］利用 HepaRG 细胞和三维生物打印技术建立了具有成熟功能的肝脏类器官，将其移植到小鼠腹腔中后发现其形成了功能齐全的血管系统，显著提高了肝移植小鼠的存活率。该研究证明体外三维打印的肝类器官可作为移植供体替代原肝脏，促进移植肝存活和生长。随着再生医学的发展，肝类器官作为肝脏再生的一种工具，或许有希望能够替代受损的脏器，提高患者的生存率，具有较为广阔的应用前景。 （3）药物筛选：药物筛选是现代药物开发过程中较为关键的一步，尽管传统的二维细胞株已经为药物筛选和反应预测提供了普遍的临床前研究，但它们与天然疾病组织的内在差异不可避免地导致了新兴药物的高失败率。目前，肝类器官已被证明能够在肝病研究中作为新药开发和临床药物疗效评估的潜在模型。例如，Li 等［77］利用肝癌类器官测试了129 种抗肿瘤药物，提示大多数抗癌药物只对少数类器官细胞系有效。此外，类器官中可维持细胞色素 P450 酶的活性，能更精确地检测药物诱导的肝毒性。Mun 等［45］的研究显示，肝类器官在长期暴露于肝毒性药物后产生明显毒性反应，为预测毒性和评估可能导致肝毒性和肝脂肪变性的药物提供了一个很好的平台。Shinozawa 等［78］创建了一种基于类器官模型的药物毒性测定方法，可以评估 238 种上市药物的活力、肝损伤和/或线粒体毒性，具有很高的预测价值。 （4）个体化治疗：目前，临床应用的抗肿瘤治疗是一种基于大量临床试验的通用治疗方案，由于肿瘤存在异质性，同一种治疗药物对不同的患者缺乏特异性，利用类器官进行个性化的实验设计有利于解决这一问题。人类来源的癌症类器官不仅可用于确定新的治疗靶点和药物筛选，还可作为个体化精准医学的体外镜像。从肿瘤中提取的单个类器官可以揭示导致药物阻抗的遗传和/或表观遗传修饰，并可针对此进行癌症患者的定制治疗［79］。例如，Steele 等［80］从 7 例癌症患者中培育了患者来源的类器官，检测了各自类器官对几种标准化疗药物的反应敏感性，为患者的个体化精准医疗提供了有利的科学参考。此外，结合成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）等基因编辑技术，可以通过对患者来源的类器官进行基因敲除或敲入来评估发病机制以及患者对治疗方案的反应性，让患者能够进行更安全、适当和有效的治疗方法。 三、 挑战与展望 类器官作为一种新的体外实验模型，与二维细胞培养和动物模型相比，具有反映人体生理结构和功能特性和复杂性的优点，可更好地模拟 HBV 感染人体的生理免疫环境。虽然类器官模型在多领域中显示出较强的优越性，然而其仍存在许多的不足。一方面，尽管肝类器官模型的结构复杂性和功能成熟度相较以前的体外模型有所提高，但它们仍然不能完全具备成熟人类肝脏的形态和功能。另一方面，肝类器官模型含有非实质细胞，但每种细胞类型是随机混合的，缺乏类似于肝脏的分区和空间等复杂结构。在模型利用上，类器官模型未实现标准化，在药物评价和毒性试验中难以产生高度可重复性的结果。此外，类器官还存在成本高、三维培养技术困难、耗时长、使用动物源性细胞外基质培养等缺点。 为了突破限制，开发更好的疾病建模和药物测试的体外模型，研究者们做出了许多努力。人类肝脏的成熟过程在出生后 2 年左右，伴随着营养变化和胃肠循环，于是有研究发现肠道微生物组或微生物组衍生的代谢物可促进 iPSC 衍生的肝细胞和肝类器官的成熟［81］。为了体现人体内多组织间的相互影响，有研究者提出了多组织类器官和多器官类器官，如肝-胆-胰类器官［82］。在结构复杂性方面，出现了类器官与三维培养技术的融合研究，如利用器官芯片［83］或三维打印技术可以提供类似于体内微环境的组织隔间和营养/氧气梯度，有利于突破与类器官功能成熟和结构成熟相关的一些限制。此外，大多数肝脏疾病和肝脏代谢与其他器官系统密切相关，因此构建类器官模型时还应考虑器官间的相互作用。未来，芯片上的多器官模型或许会成为主流，为模拟系统性疾病的发生和进行相应的药物测试、机制研究等提供平台。总之，尽管肝类器官培养体系还不完善，但许多研究表明这一培养模型对于肝脏发育及相关疾病的研究具有重要意义，是肝脏研究领域的新的有力工具，将其应用于 HBV 感染中，将会有助于进一步开发 HBV 与宿主之间的相互作用及致病机制。 参考文献 [1] 中华医学会肝病学分会, 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