现在谈及CGT治疗，特别是AAV基因治疗，常常谈及Zolgensma，Glybera，Luxturna的获批。可在这些基因治疗获批前，又有多少AAV基因治疗因为毒性，因为有效性不足而临床停止呢？尽管如此，到现在为止也逐步形成了AAV相对安全的通识，不过在那通识之前呢？1999年Jesse Gelsinger个案可能就是其中后果最为严重的一例。因此，在了解风险之前，对于临床中可能带来的许多后果，最开始那批尝试该药物的人最具有风险。在AAV基因治疗刚刚萌芽的90年代，Gelsinger案件反映了当时临床试验管理的混乱和指南章程缺失并存。然而即使如此，仍有一些无药可救的罕见病患者不得不抱着一丝希望去接受当时作为新概念的基因治疗的临床。人们总是钦佩尝百草的神农，因为第一个尝试去吃的有可能食物中毒，那么第一批去尝试AAV的人们，即使他们已经拥有了动物模型中的临床数据，在人体内依旧会有不可知的变化，他们那又何尝不是如此呢？追根溯源，那么在这一切的开端，AAV基因治疗最初在人体上应用在了什么地方是个值得关注的问题，因为这也同时反映了AAV至今的改造历程。CFTR史上第一个AAV载体上的动物临床，同时也是史上第一个AAV载体上的人体临床，其目的是治疗一项罕见病中出问题的CFTR基因。CFTR基因的对应疾病为囊性纤维化，这是一种在美国和欧洲的德系犹太人（也称为阿什肯纳兹犹太人）中较为多发的罕见病，每25个人就有一个携带者。囊性纤维化由编码CF跨膜传导调节蛋白(CFTR)的基因突变引起的常染色体隐性疾病。CFTR是一种环磷酸腺苷（cAMP）依赖的氯离子通道蛋白，控制氯离子和碳酸氢盐离子进出细胞。CFTR缺失或功能障碍可导致氯离子转运功能异常、钠离子通道调节受损，使得阴离子分泌减少，钠离子和水重吸收增加，导致汗液和黏性分泌物中盐离子浓度增加，分泌物黏稠，从而堵塞不同的器官系统继而造成严重损伤，甚至死亡。CF的临床特征是慢性气道阻塞和感染、胰腺外分泌功能不全和异常高的汗液电解质浓度。其中约半数儿童因感染或心肺功能衰竭等严重并发症于10岁前死亡，活至成年者较少。简单地说，AAV-CFTR需要靶向给药的主要是呼吸道系统，这是与现在的AAV基因治疗的给药靶向组织不同的。有趣的是，从现在囊性纤维化药物Trikafta高达56.97亿美元的销售额和全球仅仅9万的患者上限和接近50%的市场渗透率来看，这一患者群体的特征可能就是相当有钱，这大概也是基因治疗选择这一领域作为市场的原因。那么现在来看Trikafta的56.97亿美元这是什么概念呢？默沙东的HPV疫苗在2021年销售额为56.73亿美元，排行全球生物药品第19，而Trikafta竟然靠着罕见病比目前供不应求的HPV疫苗高一位，而能靠罕见病达到TOP20这个位置的销售额，只此一家。扩展阅读：这些罕见病药物为何能够大卖？基因治疗载体的确定自80年代末CFTR这一基因被华裔科学家徐立之（曾任港大校长，因此多次获得诺奖提名）发现后，人们对于使用基因治疗治愈这种疾病寄予厚望。最初的人类细胞培养研究支持了通过表达正常拷贝的CFTR基因来纠正疾病病理的潜力，那么接下来的问题就是选择一个合适的载体将其运送到体内。然而，采用的莫洛尼氏鼠白血病病毒载体、痘苗病毒载体和杆状病毒载体在此前已经用于CFTR在细胞培养中的基因表达，可结果都不理想，不适合进行体内基因治疗。而这个时间点是1990年，仅在CFTR基因发现的一年后，已经有人开始尝试用体内基因治疗治愈CFTR了。随后研究人员又将注意力转移到了逆转录病毒上。这个时间点HIV-1刚刚提取不过7年，但改造却已经如火如荼地进行。只是，将逆转录病毒引入气道上皮也不理想，因为逆转录病毒还需要体外操纵和主动分裂细胞进行转导。在这一情况下，理想的基因治疗载体需要允许CFTR在不活跃分裂的细胞内没有宿主炎症反应的情况下长期持续存在。随后研究人员将目光放在了AAV上，AAV虽然没有像牛痘之类的病毒载体历史悠久，但也逐步经历了从60年代发现，认知到一步步改造的过程。而虽然在80年代时候已经有构建rAAV，但并没有在体内得到应用，直到1993-1995年关于体内AAV基因治疗才正式展开，首先得到应用的就是AAV2。AAV血清型2 (AAV2)是细小病毒家族是一种小的单链DNA病毒，由于其对呼吸上皮细胞的嗜性而没有相关的病理学，所以被探索作为潜在的真核基因转移载体。尽管现在已知有100多种AAV的自然变体，但大多数是在2002年之后发现的。因此，血清型2的“模式菌株”是CF基因治疗中研究得最彻底的。虽然逆转录病毒需要活跃的细胞分裂来整合和表达，但AAV2没有这种限制。在没有腺病毒、疱疹病毒或牛痘的情况下，AAV能够进入稳定形式的潜伏期。不过相对应的，AAV也有一定限制，如包装量太小，AAV的持久性是基于细胞内游离性，这导致整合效率较低，重复给药会产生中和抗体，内源启动子活性低，最佳血清型不适用，CF副产物会导致转导失活等等。图：AAV2的优势和劣势AAV的临床前开发及概念验证随后，如何实际应用在CFTR基因就有一个巨大的障碍，要将＞4.4kb的转基因阅读框与启动子、PolyA信号和强制性145 bp反向末端重复序列(ITRs)一起包装到天然长度仅为4.7 kb的病毒中具有一定困难。为了确保这一点，研究人员删除了病毒内除了ITRs以外所有的结构，衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，以最大化装载容量，另外一方面减少了免疫毒性和细胞毒性，最终CFTR基因被包装在rAAV载体中，取代了两个ITR之间的病毒基因。而这一研究发现了该AAV载体的如下属性：①氨基末端缺失的CFTR蛋白的截短形式也能够纠正CF缺陷。②当与内源性启动子p5包装时，载体比野生型病毒略大，但仍然能够纠正cAMP调节的氯离子外流。③ITR具有内在的启动子活性，允许CFTR具有非常紧凑的启动子元件。随后多项试验的Southern印迹，蛋白质印迹分析，免疫荧光试验表明rAAV2成功介导了CFTR在细胞系中的基因表达。图. AAV的结构和基因组（图片来源：Semantic Scholar）在体外细胞的成功转录紧接着引导向了动物模型的试验，1993-1994年的里程碑式研究中，就已经有了大鼠、新西兰白兔等动物模型中的AAV2-CFTR相关基因治疗结果发布，结果表明转基因递送至兔肺的右下叶导致CFTR蛋白和mRNA以持续6个月的方式表达，验证了在人体上进行的可行性。关键的临床前非人类灵长类动物数据随后产生，安全性方面来看，在支气管内对恒河猴给药AAV-CFTR使得载体成功表达CFTR基因后6个月没有炎症或其他不良后果。基于这项临床结果的安全性和有效性数据，美国国立卫生研究院重组DNA咨询委员会(RAC)最终批准了在人体内展开的新药临床试验（IND）。总计100多名CF患者参加了5项rAAV2-CFTR经鼻、支气管内、上颌窦和气雾剂给药的独立试验。重组AAV载体被设计用于递送CFTR基因，然而由于整合的低发生率和自然气道上皮更新，载体DNA表达的持续时间有限。此外，重复施用AAV-CFTR载体导致体液免疫反应，该反应阻止了后续剂量载体的有效基因转移。小编总结总的来说，AAV2-CFTR输在了囊性纤维化这个疾病本身上，由于其给药位置的特殊，CFTR基因组较大，囊性纤维化本身的附带炎症效应，这些疾病本身相关的原因导致了AAV在这一领域的失败，但失败也是成功之母。虽说囊性纤维化的患者群体现在似乎已经逐步放弃了将AAV作为治疗手段，而更将目光放在小分子抑制剂和CRISPR/Cas9、TALENs或Zn-finger等基因编辑上，但这份对于所有AAV基因治疗的地位和贡献却着实确立了。有了在CFTR基因不同病毒载体中的尝试，AAV才能在和其他病毒载体的竞争中脱颖而出。有了CFTR-AAV2的前期研究，人们才知道AAV在人体内的持久性方式是游离性式的。而对于AAV本身的改造，其中启动子，PolyA尾和内部转录基因的装载量都有了一定尝试。那么，现在来看已经得到商业化的Zolgensma，Zolgensma的SMN1基因组，还有Luxturna的REP65的其基因组长度都小于CFTR，他们的成功上市，必然是站在巨人的肩膀上。参考来源：Zvereff VV, Faruki H, Edwards M, Friedman KJ. Cystic fibrosis carrier screening in a North American population. Genet Med. 2014 Jul;16(7):539-46. doi: 10.1038/gim.2013.188. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24357848.Loring HS, ElMallah MK, Flotte TR. Development of rAAV2-CFTR: History of the First rAAV Vector Product to be Used in Humans. Hum Gene Ther Methods. 2016 Apr;27(2):49-58. doi: 10.1089/hgtb.2015.150. Epub 2016 Feb 19. PMID: 26895204; PMCID: PMC4834522.
