Acetamide

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）的生产在癌症治疗领域需求巨大。尽管基于半胱氨酸的偶联是生产ADCs最常见且广为人知的过程，但由于ADCs的异质性，需要多种分析方法来准确确定药物-抗体比（DAR）。在这里，我们报告了用于传统基于半胱氨酸的ADCs DAR分析的不同分析方法；此外，应用良好生产规范（GMP）策略生产了用于良好实验室规范（GLP）研究的四百毫克ADC批次。本文描述的工作不仅评估了几种分析性能，还为未来阶段适当的ADC生产提供了指导，同时建立了独特的分析策略。 1.引言 近年来，抗体药物偶联物（ADCs）的临床试验迅速增加。迄今为止，已有超过八十种ADCs处于临床开发中，市场上有五种ADCs。随着ADC领域的增长，分析表征在ADCs的发现、开发和生产中继续发挥着至关重要的作用。特别是FDA要求制药行业仔细分析基于抗体的生物制药，这仍然是一个挑战，因为化合物的异质性和结构复杂性。为了解决这个问题，已经建立了几种分析方法。高效液相色谱（HPLC）分析是药物抗体比（DAR）表征最流行的分析方法，但重要的是要为不同项目阶段开发多种方法以确保DAR确定的准确性。以前，我们使用六种分析技术对位点特异性ADCs进行了分析比较，以建立项目周期每个阶段的适当分析方法。结果表明，由于其简单的组成，位点特异性ADC是展示新分析技术的优选模型。然而，在同行评审的环境中，使用单一ADC批次进行DAR确定的多种分析类型的比较研究非常有限。此外，据我们所知，没有报道比较不同TCEP当量制备的不同ADCs的HPLC结果的检查。TCEP滴定是确定获得目标DAR的基于半胱氨酸的ADCs的适当当量最关键的研究。此外，在使用位点特异性ADCs的先前研究中，我们观察到来自不同分析方法的单一批次ADCs的不同DAR结果。基于半胱氨酸的ADCs，这是临床试验中最常用的，比位点特异性ADCs具有更复杂的结构，使得通过单一分析获得实际DAR值更加困难。由于这个原因，可能需要分析指导来解释不同分析的TCEP依赖性比较。 2.材料与方法 2.1.材料 人IgG1曲妥珠单抗（赫赛汀）是从瑞士罗氏制药公司购买的。马来酰亚胺-C6-缬氨酸-瓜氨酸-单甲基奥瑞他汀E（CAS#: 646502-53-6; MC-VC-MMAE）是从美国NJ生物制药公司购买的。所有其他化学试剂都是从美国Sigma-Aldrich获得的。 基于GMP策略的半胱氨酸型ADC合成程序 市售的曲妥珠单抗（441毫克）溶解在水中，然后缓冲交换到偶联缓冲液（55毫升，pH 7.5，50毫米PBS，10毫米EDTA）中，为偶联过程做准备。还原反应以2.35当量的三（2-羧乙基）磷酸氢氧化物（TCEP-HCl）加入抗体开始，并在20℃下轻轻搅拌2.5小时。然后将二甲基乙酰胺（DMA）（6% v/v）和6当量的MC-VC-MMAE依次加入，并在20℃下轻轻搅拌1小时。未反应的药物连接体通过添加25当量的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）来猝灭，并在20℃下混合35分钟。最终混合物使用从美国emp Biotech LLC购买的Centripur P100脱盐柱进行纯化，并用pH 5.2，20毫米组氨酸，5%海藻糖洗脱。 2.2.通过Ellman's assay分析硫醇中间体的实验程序 还原步骤完成后，通过凝胶过滤对反应混合物进行纯化，以去除杂质并获得纯化的还原抗体。纯化并还原的抗体通过Ellman's assay进行分析，如前所述。 2.3.仪器/分析方法 蛋白质浓度是通过使用Solo-VPE系统的斜率光谱法确定的。疏水作用色谱（HIC）和反相（RP）-HPLC是如前所述进行的。尺寸排除色谱（SEC）分析是如前所述进行的。内毒素检测是通过美国Charles River的Endosafe-PTS系统进行的。 3.结果与讨论 通过一个非常成熟的方法合成了随机的基于半胱氨酸的ADC（图1）。这种偶联的第一步是使用TCEP部分还原抗体的分子间二硫键。基于半胱氨酸的ADCs的DAR取决于还原抗体中间体中的游离硫醇水平，TCEP当量是DAR的最关键的因素。为了确定放大样品的TCEP当量，使用五种不同的TCEP当量（2.15当量，2.35当量，2.55当量，2.75当量和2.95当量）进行了滴定检查（表1）。还原完成后，通过Ellman's assay进行了这个阶段的进程控制（IPC）分析，以确定每个抗体的游离硫醇。在Ellman's assay之前，进行了凝胶过滤，以去除可能与Ellman's试剂发生不希望的副反应的任何TCEP相关材料。基于Ellman's assay获得的每个抗体的游离硫醇百分比，计算了假定的DARs（ADC前体的每个抗体的游离硫醇量与最终ADCs的DAR值相对应）。从Elman's assay结果间接测量的DAR利用了硫醇基团与（过量）马来酰亚胺化合物（如MC-VC-MMAE）的高反应性。接下来，市售的MC-VC-MMAE与新形成的抗体上的硫醇共轭，并且测量的游离硫醇的差异导致DAR的确定。 图 1. 偶联反应概述 通过两种HPLC方法：HIC和RP-HPLC比较了五个ADCs。HIC-HPLC是一种常用于DAR确定的方法，因为它可以在非变性条件下进行。HIC-HPLC在色谱图中分离了五种DAR物种（DAR = 0，DAR = 2，DAR= 4，DAR = 6和DAR = 8）（支持信息（SI），图S1）。从这些结果中，计算了平均DARs。然而，峰分辨率相对较差，对数据准确性的怀疑仍然存在。HIC分析有时在质量控制方面存在问题，因为峰分辨率相对较低。从峰分离的角度来看，RP-HPLC可以被认为是DAR确定的理想方法，特别是对于基于半胱氨酸的ADCs。在本研究中，RP-HPLC提供了来自抗体片段的六个峰（未偶联的轻链（LC 0），由1 MMAE偶联的轻链（LC 1），未偶联的重链（HC 0），由1 MMAE偶联的重链（HC 1），由2个MMAEs偶联的重链（HC 2）和由3个MMAEs偶联的重链（HC 3））。这六个峰分离得很好，展示了可靠的DAR结果（图S2），但是本研究中同时使用了HIC-HPLC和RP-HPLC进行比较。 使用三种不同的分析方法对DAR进行确定，结果略有不同，但是TCEP当量和DAR结果之间的趋势是可比的（表1）。在这项研究中，使用有限的边际检查了TCEP当量和DAR之间的关系，但是每个批次的DAR反映了TCEP依赖性的轻微差异。结果表明TCEP对二硫键的高反应性。RP-HPLC的DAR略低于HIC结果，在所有研究中都观察到了这一点，这也在我们以前的位点特异性ADCs研究中观察到了。在许多情况下，HIC不能提供足够的峰分离，包括位置异构体，因为这种原生分析需要在移动相中使用高浓度的盐，这会影响峰分离。在某些情况下，引入像异丙醇（IPA）这样的有机溶剂有时会改善峰形，在我之前的研究中，包含IPA的流动相比不含有机溶剂的运行条件提供了更好的分辨率，然而，这在当前研究中可能还不够。另一方面，RP-HPLC由于在变性和还原条件下的样品预处理，提供了比HIC更高的分辨率。相对较高的温度和变性预处理与尿素和TCEP的结合有可能降解ADC物种的风险，这可能导致较低的DAR值。Ellman's assay仅基于还原抗体中间体分析提供假定的DAR，因为Ellman's试剂与游离巯基官能团反应。这三种分析之间的这些特征差异产生了略有不同的DAR结果。 接下来，我们尝试根据FDA GLP要求应用基于GMP策略的半胱氨酸型ADC制备。为了降低交叉污染的风险，所有的偶联和配方活动都在与其他GMP实验室隔离的过程开发实验室（PD）中进行。配方后，分析活动在受GMP监管的实验室中进行，其中包括受GMP监管的设备。GMP监管区域和设备定期维护、校准，必要时进行确认。 用于偶联和配方活动的原材料是GMP级别的，符合制造、测试和质量的指南。内部原材料被隔离、取样、测试和检查。结果输入到企业资源计划（ERP）软件中，该软件有助于材料控制和批次释放，原材料合格后由质量单位进行。所有活动，包括数据收集的适当文档，都通过预先批准的批次记录在电子实验室笔记本（ELN）上同步捕获。记录的信息和数据由证人验证，并在批次记录内的控制步骤由质量单位审查。批次记录的最终审查由PD和质量单位执行；在发布时，任何更正和/或偏差都已解决。 用于测试和分析的配方方法没有经过确认，但已建立适合其预期用途。分析方法在批准后创建、审查和程序化。根据预先批准的批次记录定义的采样。相应的数据输入到ELN中以进行可追溯性，并用于创建测试证书。这些信息由PD和质量单位审查，并指导所生产材料的释放。GMP策略的总结，解释了实验室规模、传统GMP策略和我们方法之间的区别，如表2所示。 最后，根据表1中描述的先前的TCEP研究，我们旨在制造一个目标DAR为4.4的随机ADC。为了确定TCEP当量，需要考虑规模差距。在表1的小规模研究中，我们使用了摇床进行偶联。然而，我们确定了一个带有搅拌棒的玻璃反应器容器作为适合超过一百毫克规模ADC生产的合适设备。这种搅拌系统是一种非常成熟的混合设备，可以用于后续的公斤级ADC制备。我们故意降低了TCEP当量（2.35）用于规模扩大偶联，以适应该系统的搅拌效率。 在纯化和最终无菌过滤所得ADC后，创建了一个测试证书（COT），总结了使用经过验证的设备进行的分析（表3）。 扩大批次的DAR高于小规模批次，这是预期的。由于玻璃容器反应器的高混合效率，TCEP还原有效地裂解了抗体的二硫键，没有任何副反应。使用Ellman's assay的IPC分析也支持这些DAR结果（见表S1）。因此，批次之间DAR的差异被确认是由TCEP还原步骤引起的。产品产量、浓度、聚集结果（图S3）和内毒素（图S4）对于这种适合GLP的材料也很重要。 图 2. 制备基于半胱氨酸的抗体药物偶联物（ADC）的良好实验室实践流程图 4.结论 通过半胱氨酸型偶联生产的单批次ADC的分析比较已成功进行。随着TCEP当量的增加，DAR增加的趋势已通过三种不同的方法得到验证，尽管也观察到了略有不同的DAR值（0.2-0.4）。我们目前的研究表明，这三种分析都是有用的，但建议将它们结合起来使用以获得准确的DAR值，因为在这些分析中观察到了DAR的差异。为了解决这种差异，正在进行两种方法。 化学位点特异性偶联由于其简单的组成，能够简化分析流程。最近已经报告了几种设计良好的位点特异性技术，其中一些已经应用于大规模ADC合成。另一种简化ADC分析的合理解决方案是使用通过制备性HIC色谱分离得到的均匀ADCs，这可以分离DAR物种。如我们之前的报告所示，纯化的DAR ADC分析提供了清晰的DAR结果，使用六种分析方法没有显著差异。 为了建立一种理想的ADC表征分析方法，还有许多任务和挑战。最近发表了几种针对多功能ADC表征的独特分析方法，包括敏感的免疫分析、完整MS分析的样品准备和完整RP-HPLC。然而，我们相信这份出版物可以作为抗体偶联物临床前工艺开发的有用指南。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言 狗与人之间的互动有效而亲密。然而，这种跨物种社交交流的神经基础尚不清楚。众所周知，脑间活动耦合，即个体间神经活动的同步，代表了社交互动的神经基础。 2024年9月11日，中国科学院遗传与发育生物学研究所张永清研究员（现任湖北大学生命科学学院教授）团队与中科院自动化所余山研究员、英国林肯大学郭昆教授以及北京师范大学卢春明教授合作在Advanced Science 在线发表题为“Disrupted Human–Dog Interbrain Neural Coupling in Autism-Associated Shank3 Mutant Dogs”的研究论文，该研究报道了以前未知的人狗互动中跨物种的脑间活动耦合。 通过分析来自狗和人的脑电图信号，发现相互注视和抚摸分别在人狗互动的额叶和顶叶区域诱发脑间同步。五天内，随着人狗互动的熟悉程度不断提高，同步强度也会增加，信息流分析表明，在人狗互动中，人是领导者，而狗是追随者。此外，具有Shank3突变的狗代表了自闭症谱系障碍(ASD)的有希望的互补动物模型，在人狗互动过程中，脑间耦合丧失，注意力下降。迷幻药麦角酸二乙酰胺(LSD)可挽救这些异常。研究结果揭示了人与狗之间相互作用的大脑间同步现象，这可能是跨物种交流的基础，并表明LSD有可能改善自闭症患者的社交障碍。 人类与狗之间的交流已经进化了 30,000 多年，狗是人类最先驯养的动物，因为它们具有狩猎技巧和保护能力。随着时间的推移，狗已成为许多家庭不可或缺的成员，为人们提供情感支持和陪伴。虽然一些跨物种关系是基于保护等互惠互利而形成的，但它们很少达到人与狗之间相同的交流水平。此外，狗已经进化到能够通过行为、面部表情甚至声调来阅读、理解和响应人类的各种情绪状态和交流信号，提供非凡的主动陪伴水平，这在其他家养动物或伴侣动物（如猫）中并不常见。然而，人类与狗之间独特而有效的交流背后的神经机制在很大程度上是未知的。 在社交互动过程中，互动的个体并不是孤立的，而是嵌入在多脑系统中。先前的研究发现，同一物种的动物在社交互动过程中会表现出脑间神经耦合。这些神经耦合最初是在人类身上观察到的，随后在老鼠、蝙蝠和非人类灵长类动物中也发现了。研究表明，大脑间神经耦合反映了社交互动的互惠性、共同注意力以及社交互动的质量和结果。 人与狗互动过程中的大脑间活动耦合（Credit: Advanced Science） 虽然之前关于脑间神经耦合的研究只关注物种内的相互作用，但目前尚不清楚不同物种的个体之间是否也会发生脑间活动耦合。人与狗之间独特的联系提出了一个重要的问题：狗和人在互动时，神经状态如何相互耦合，这如何反映他们正在进行的社交互动（如共同注意）的内部状态，以及这会如何随着狗与人互动的能力而变化。本研究旨在调查这种耦合是否存在，如果存在，狗的自闭症相关基因突变是否会损害人与狗之间的社交互动。 在这项研究中，作者利用非侵入性无线脑电图(EEG)同时测量实验室犬（比格犬）和陌生人类在进行社交互动时的大脑活动。作者首次证明定向脑间神经耦合发生在人与狗之间，特别是在额叶和顶叶区域，这两个区域都与共同注意有关。此外，作者发现，与自闭症相关的狗的Shank3突变会破坏人与狗互动过程中的脑间神经耦合和共同注意，而这些表型可以通过一剂迷幻药麦角酸二乙酰胺(LSD)来挽救，这种药物重新开启了小鼠社会奖励学习的关键时期。作者的研究结果对于理解家犬与人之间有效社交互动背后的神经机制具有重要意义，并表明LSD有可能改善ASD的社交缺陷。 参考文献 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202402493 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“iNature” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述