LY-294002

当归多糖水醇凝胶通过PI3K/AKT/Nrf2信号通路抑制铁死亡促进伤口愈合 汇报人：硕士研究生一年级 朱丽叶 当归多糖（ASP）具有良好的促创面愈合作用，但其水溶液易快速挥发，作用持续时间短，限制了临床应用。作者制备当归多糖凝胶剂（ASP-G），虽有望作为外用制剂，但其对创面相关铁死亡的影响及分子机制尚不明确。本研究旨在阐明ASP-G促进创面愈合的效应及机制。通过体内小鼠压疮模型及体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）或Erastin诱导的内皮细胞模型，评价ASP-G对创面愈合的作用。结果显示，ASP-G可加快小鼠创面愈合、促进血管生成并抑制创面组织铁死亡，同时上调核因子E2相关因子2（Nrf2）通路关键蛋白；蛋白质组学提示差异蛋白显著富集于磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路，免疫印迹实验证实其可提高PI3K与AKT磷酸化水平。体外实验中，ASP-G显著抑制OGD/R诱导的内皮细胞铁死亡，上调p-AKT、Nrf2及HO-1表达，改善细胞迁移、增殖与成管能力；PI3K抑制剂或Nrf2敲低可逆转上述保护效应。综上，ASP-G通过激活PI3K/AKT/Nrf2通路抑制内皮细胞铁死亡，从而促进伤口愈合，为慢性伤口的治疗提供了新的策略。 本文“Hydroalcoholic gel of Angelica sinensis polysaccharides promotes wound healing by suppressing ferroptosis through PI3K/AKT/Nrf2 signaling pathway”由兰州大学韩琳研究团队于2026年2月21日在《Phytomedicine》发表。 研究背景 慢性伤口，包括压疮、糖尿病足溃疡与下肢静脉性溃疡，因其发病机制复杂、治疗效果不佳，已成为全球性重大临床难题[1]。压疮是一类常见皮肤疾病，多因压力或压力联合剪切力、摩擦力作用，好发于骨隆突部位，在老年人及行动不便人群中尤为高发[2]。压疮临床治疗极为困难，常伴随高复发率，严重影响患者生活质量并加重社会经济负担[3,4]。目前认为，缺血再灌注损伤是压疮发生的核心诱因，其引发的血管病变、炎症反应与组织坏死，可严重阻碍创面愈合。当前压疮治疗研究主要聚焦于抗菌、创面酸化及促进血管新生与微循环改善，而修复受损血管被视为有效干预压疮的关键环节[5]。尽管血管修复机制研究已取得显著进展，但仍缺乏能高效促进创面血管再生与快速血管新生的治疗手段。 压疮局部血管损伤源于多方面细胞损害，凋亡、坏死性凋亡等多种程序性死亡方式共同参与慢性创面组织丢失，而新近研究表明，铁死亡在缺血再灌注损伤及内皮功能障碍中发挥尤为关键的作用[6]。铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡，由细胞内二价铁蓄积与脂质过氧化物堆积介导，其铁代谢紊乱、广泛脂质过氧化的特征，与压疮反复缺血再灌注所致氧化微环境及代谢紊乱高度吻合。研究证实，铁死亡与创面愈合障碍密切相关。在压疮缺氧微环境中，血管内皮细胞活性氧水平升高、脂质过氧化增强，铁死亡相关蛋白表达上调，导致细胞活力下降、血管修复能力受损[7]。因此，抑制铁死亡可减轻缺氧所致内皮损伤并促进压疮愈合，是极具潜力的治疗靶点。 Nrf2作为细胞氧化还原稳态核心调控因子，可在氧化应激状态下被激活[8]。Nrf2通路激活不仅可加速创面愈合与血管新生，还能上调铁死亡关键拮抗分子，维持GPX4活性。PI3K/AKT通路是调控细胞存活与氧化还原平衡的关键通路，亦是Nrf2重要上游激活因子。因此，靶向激活PI3K/AKT/Nrf2轴，可有效抑制内皮细胞铁死亡、促进压疮部位血管再生。 当归作为传统中药，具有补血、抗炎、镇痛等功效，是创面愈合方剂中的常用药物[9]。其主要活性成分ASP具有显著促创面愈合作用，可减轻氧化应激，并通过PI3K/AKT通路促进血管新生[10]。但当归多糖水溶液易挥发、作用持续时间短，限制了其临床应用。为提升其稳定性与疗效，本团队前期制备了ASP-G。尽管该凝胶剂具有良好外用应用前景，但其在压疮愈合中对内皮细胞铁死亡的调控作用及机制尚未明确。基于前期研究，本研究提出假说：ASP-G可通过激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路抑制内皮细胞铁死亡，进而加速压疮愈合。本研究旨在探讨ASP-G的靶向治疗潜力，为慢性创面靶向药物研发提供新思路。 图1 实验技术路线图 实验内容 Result 1 ASP-G可加速压疮小鼠模型创面愈合并促进血管新生 建立小鼠压疮模型，ASP-G给药实验流程（图2A）。在预设时间点拍摄的创面大体照片（图2B）。肉眼观察可见，ASP-G组与铁死亡抑制剂Fer-1组创面均已基本愈合，而对照组与生理盐水组创面仍未愈合；ASP-G组创面愈合进程与Fer-1组相近。对创面面积进行定量分析以评价愈合动力学（图2C）。第14天时，对照组创面面积仍为23.15 %，愈合显著受阻；而ASP-G组创面面积降至4.02 %，与Fer-1组水平相当（图2D）。上述结果表明，连续给药14天后，ASP-G可促进创面愈合，且疗效与Fer-1相当。 第14天时，ASP-G组创面可见大量新生肉芽组织、完整再上皮化、成熟胶原沉积及再生皮肤附属器（包括毛囊、皮脂腺与汗腺导管），组织学形态与Fer-1组相近（图2E、G）。与之相反，对照组与生理盐水组仍存在明显炎症浸润、创面裂隙较宽且胶原成熟延迟。组织学定量分析显示，ASP-G组创面宽度在第7天降至约3.5 mm，第14天基本完全闭合（图2F）。此外，Masson染色结果表明，与对照组相比，ASP-G组与Fer-1组胶原纤维沉积均显著增多（图2G、H）。 血管新生可为慢性创面修复提供必需营养物质并支持肉芽组织生长，在创面修复中发挥关键作用。采用血管内皮细胞标志物CD31进行免疫组化染色，结果显示，在第7天和第14天，ASP-G组与Fer-1组CD31阳性信号均较对照组与生理盐水组更强、分布更广（图2I）。定量分析证实，ASP-G组与Fer-1组创面新生血管数量显著增加（图2J）。与之相似，血管新生关键调控因子血管内皮生长因子（VEGF）在ASP-G组与Fer-1组表达亦显著升高，与CD31染色结果一致（图2I、K）。上述结果提示ASP-G可促进压疮创面血管新生。综上结果表明，ASP-G可通过多种途径加速创面愈合。 图2 ASP-G可加速小鼠压疮模型创面愈合并促进血管新生。（A）ASP-G干预压疮创面模型的实验方案。（B）创面大体观察照片及（C）创面愈合曲线。（D）对照组、生理盐水组、ASP-G组、Fer-1组不同时间点创面愈合率定量统计（n=3）。（E）各组H&E染色图片及（F）瘢痕宽度分析（n=3），标尺=500 μm或200 μm。（G）Masson三色染色图片及（H）胶原沉积定量统计（n=3），标尺=200 μm。（I）CD31与VEGF免疫组化代表性图片，标尺=50 μm。（J-K）CD31与VEGF免疫组化定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 Result 2 ASP-G在创面组织中发挥抗铁死亡作用 为探究ASP-G是否通过抑制铁死亡促进创面愈合，于第7天取四组实验动物的创面组织，检测铁死亡相关指标。与对照组和生理盐水组相比，ASP-G组与Fer-1组的Fe²⁺、ROS及丙二醛（MDA）水平显著降低（图3A-C），谷胱甘肽（GSH）含量与超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高（图3D-E）。Western blot结果进一步显示，ASP-G与Fer-1处理可显著上调创面组织中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（SLC7A11）、Nrf2及血红素氧合酶1（HO-1）的蛋白表达水平（图3F）。以上结果共同表明，ASP-G可在创面修复过程中抑制铁死亡，提示其通过该机制发挥促愈合作用。上述结果说明，ASP-G与Fer-1均能抑制创面组织铁死亡。 图3 ASP-G干预对创面组织铁死亡的抑制作用。（A）创面皮肤组织中MDA水平（n=9）。（B）创面皮肤组织ROS荧光染色（n=3），标尺：100 μm。（C-E）创面皮肤组织中MDA、SOD及GSH水平（n=9）。（F）GPX4、SLC7A11、Nrf2及HO-1蛋白表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 Result 3 ASP-G处理可激活小鼠创面组织中的PI3K/AKT通路 对生理盐水组与ASP-G组的创面组织进行基于质谱的蛋白质组学分析，共筛选出209个差异表达蛋白，其中上调蛋白104个、下调蛋白105个（图4A）。核心靶标KEGG通路富集分析显示，这些差异蛋白主要显著富集于PI3K/AKTsignaling、Alanine, aspartate and glutamate metabolism及ECM-receptor interaction等通路（图4B）。值得注意的是，PI3K/AKT通路包含的差异蛋白数量最多。GSEA分析进一步证实，ASP-G处理后组织中PI3K/AKT通路显著激活（图4C）。与上述结果一致，Western blot检测显示ASP-G处理可提高PI3K和AKT的磷酸化水平（图4D），以上结果共同表明，ASP-G在加速创面愈合过程中可激活PI3K/AKT信号通路。 图4 ASP-G处理可激活小鼠创面组织中的PI3K/AKT通路。（A）差异表达蛋白热图。（B）KEGG通路富集分析。（C）GSEA富集评分显示ASP-G组中PI3K/AKT通路显著富集并激活。（D）PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表达的Western blot及灰度定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；**p<0.01，****p<0.0001。 Result 4 ASP-G可减轻内皮细胞铁死亡 为探究ASP-G促创面愈合作用是否依赖铁死亡通路，本研究采用内皮细胞进行体外实验。选用经典铁死亡诱导剂erastin抑制SLC7A11表达以诱导铁死亡。前期CCK-8剂量效应实验显示，erastin以浓度和时间依赖性方式降低HUVECs活力。基于此，后续实验选用5 µM erastin，因10 µM erastin处理24 h后细胞存活率已接近最低水平。 为评估ASP-G潜在细胞毒性，以最高160 µg/ml浓度处理HUVECs，结果显示该浓度范围内对细胞活力无明显影响。进一步检测其对erastin干预HUVECs的作用，发现10 µM ASP-G可显著提升细胞活力，浓度继续升高则活力下降，因此选用该浓度开展后续实验（图S1）。 随后检测氧化应激与脂质过氧化指标。erastin刺激后ROS与脂质ROS水平显著升高，荧光强度增强，而ASP-G共处理可逆转上述变化（图5A、C、D）。同样，erastin诱导的MDA水平显著升高可被ASP-G明显抑制（图5B）。采用JC-1染色评估线粒体膜电位，膜电位较高时JC-1以聚集体形式存在，去极化时则以单体存在。流式结果显示，erastin可导致线粒体膜电位下降，表现为JC-1单体增多，而ASP-G可有效缓解该现象（图5E、F）。Western blot结果进一步显示，ASP-G可上调被erastin抑制的关键铁死亡蛋白GPX4和SLC7A11表达（图5G）。以上结果表明，ASP-G可缓解erastin诱导的铁死亡，提示其能够减轻铁死亡介导的细胞损伤。 本研究进一步检测ASP-G对OGD/R处理内皮细胞中脂质过氧化物蓄积的影响。C11-BODIPY染色显示，OGD/R组细胞荧光信号显著增强，ASP-G处理可明显减弱该信号（图6A、E）。同时，OGD/R诱导升高的MDA水平在ASP-G处理组显著降低（图6F）。透射电镜结果显示，ASP-G可改善OGD/R所致线粒体损伤，表现为线粒体萎缩、嵴消失及膜密度增加等现象得到缓解（图6D）。JC-1染色流式结果显示，与OGD/R组相比，ASP-G组JC-1单体比例显著降低，提示线粒体膜电位得到改善（图6C）。Western blot结果进一步显示，OGD/R可下调GPX4和SLC7A11表达，而ASP-G处理可恢复其表达（图6B）。上述结果提示，ASP-G可能通过抑制HUVECs铁死亡进而促进创面愈合。 图5 ASP-G可抑制erastin诱导的细胞铁死亡（A）流式细胞术检测ROS水平及平均荧光强度（n=3）。（B）HUVECs内MDA含量测定（n=3）。（C）C11-BODIPY染色共聚焦代表性图片及（D）定量分析（n=3），标尺：20 μm。（E-F）流式细胞术观察并分析JC-1染色结果（n=3）。（G）HUVECs中GPX4与SLC7A11表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 图6 ASP-G通过抑制HUVECs铁死亡减轻OGD/R诱导的细胞损伤（A）C11-BODIPY染色共聚焦代表性图片及（E）定量分析（n=3），标尺：20 μm。（B）HUVECs中GPX4与SLC7A11表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。（C）流式细胞术观察并分析JC-1染色结果（n=3）。（D）不同干预后线粒体形态的透射电镜图片（n=3），标尺：2 μm或500 nm。（F）HUVECs内MDA含量测定（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 Result 5 ASP-G可激活OGD/R诱导内皮细胞中的PI3K/AKT/Nrf2通路 为进一步阐明ASP-G的作用机制，本研究在体外水平检测其对PI3K/AKT/Nrf2通路的影响。免疫荧光结果显示，ASP-G处理可促进OGD/R诱导HUVECs中Nrf2的核转位，提示Nrf2信号通路被激活（图7A）。与此一致，Western blot结果表明，在OGD/R条件下，ASP-G可提高PI3K与AKT的磷酸化水平，并上调Nrf2及其下游靶分子HO-1的表达（图7B）。上述结果提示，ASP-G可激活PI3K/AKT/Nrf2通路，这可能是其发挥抗OGD/R损伤保护作用的重要机制。 图7 ASP-G可激活OGD/R诱导HUVECs中的PI3K/AKT/Nrf2通路。（A）ASP-G对HUVECs中Nrf2表达影响的代表性图片（n=3）。标尺：50 μm或10 μm。（B）HUVECs中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Nrf2及HO-1表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 Result 6 ASP-G可缓解OGD/R诱导的内皮细胞功能损伤 根据CCK-8检测结果，10 μM Fer-1可显著恢复OGD/R损伤HUVECs的活力，因此选用该浓度开展后续实验（图S2）。本研究设置四组：对照组、OGD/R组、OGD/R+ASP-G组及OGD/R+Fer-1组。EdU染色结果显示，OGD/R处理后EdU阳性细胞数与S期比例显著降低，而ASP-G或Fer-1处理可有效逆转该现象（图8A-B、J），提示ASP-G可缓解OGD/R对DNA合成与细胞增殖的抑制作用。与此一致，Western blot结果显示，OGD/R可下调CyclinD1、CyclinD3及VEGF表达，而ASP-G与Fer-1均可逆转上述变化（图8E、图S3）。创面愈合实验与Transwell迁移实验结果显示，ASP-G与Fer-1可改善OGD/R所致细胞迁移能力下降（图8C-D、F-G）。此外，成管实验表明，与OGD/R组相比，ASP-G与Fer-1可促进OGD/R应激状态下的血管生成，表现为分支点数与总管长显著增加（图8H-I）。综上结果表明，ASP-G可改善OGD/R诱导的HUVECs功能损伤。 图8 ASP-G可缓解OGD/R诱导的内皮细胞功能障碍。（A）HUVECs中EdU荧光代表性图片及（B）定量统计（n=3），标尺：50 μm。（C）创面愈合实验图片及（D）各组划痕愈合率统计分析（n=3），标尺：100 μm。（E）CyclinD1、CyclinD3及VEGF蛋白Western blot图片（n=3）。（F）Transwell实验细胞迁移代表性图片及（G）定量分析（n=3），标尺：100 μm。（H）成管实验图片及（I）分支能力统计分析（n=3），标尺：50 μm。（J）流式细胞术检测并分析细胞周期分布（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 Result 7 ASP-G通过PI3K/AKT/Nrf2通路减轻OGD/R诱导的内皮细胞铁死亡 为探究ASP-G对OGD/R损伤HUVECs的保护作用是否依赖PI3K/AKT/Nrf2通路，本研究使用PI3K抑制剂LY294002及靶向Nrf2的siRNA。LY294002是经典的PI3K/AKT信号抑制剂，经CCK-8与Western blot验证，10 μM该抑制剂可有效降低HUVECs中p-AKT水平（图S4）。实验设置四组：对照组、OGD/R组、OGD/R+ASP-G组、OGD/R+ASP-G+LY294002组。LY294002可显著逆转ASP-G在OGD/R条件下对p-AKT、Nrf2及HO-1的上调作用（图9A）。同时，ASP-G对铁死亡相关蛋白SLC7A11与GPX4的上调效应也被LY294002抵消（图9B），提示PI3K通路介导了ASP-G的保护作用。 随后实验证实，转染Nrf2-siRNA list2后，Nrf2的mRNA与蛋白表达均显著降低（图9C-D）。实验设置四组：NCsi-Ctl组、NCsi-OGD/R组、NCsi-OGD/R+ASP-G组及Nrf2si-OGD/R+ASP-G组。结果显示，敲低Nrf2可明显削弱ASP-G对HO-1的上调作用；与此一致，ASP-G对SLC7A11与GPX4的促进效应在Nrf2沉默细胞中也被消除（图9E-G），提示敲除Nrf2可减弱ASP-G对OGD/R损伤的保护作用。综上，ASP-G通过PI3K/AKT/Nrf2通路调控铁死亡相关蛋白表达，进而缓解OGD/R诱导的HUVECs损伤。 图9 ASP-G通过PI3K/AKT/Nrf2通路减轻OGD/R诱导的内皮细胞铁死亡。（A-B）HUVECs中p-AKT、Nrf2、HO-1、SLC7A11及GPX4表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。（C-D）转染Nrf2-siRNAlist2或NC-siRNA的HUVECs中Nrf2的mRNA及蛋白表达水平检测（n=3）。（E-G）HUVECs中HO-1、SLC7A11及GPX4表达的Western blot检测及灰度定量分析（n=3）。所有数据以均数±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。 总结与讨论 本研究探究了当归多糖凝胶（ASP-G）促进压疮（PU）愈合的机制，结果表明，ASP-G可通过激活PI3K/AKT/Nrf2通路抑制内皮细胞铁死亡，进而加速创面愈合、促进血管新生。压疮愈合受阻的核心诱因是缺血再灌注（I/R）损伤，其引发的活性氧（ROS）蓄积会诱发内皮细胞铁死亡，阻碍血管新生与创面修复。ASP作为传统中药当归的活性成分，虽具有促愈合作用，但水溶液稳定性差，而ASP-G可解决这一问题。本研究发现，ASP-G能降低创面组织Fe²⁺、ROS及MDA水平，升高SOD与GSH含量，上调GPX4、SLC7A11等抗铁死亡蛋白表达；同时激活PI3K/AKT通路，促进Nrf2核转位及其下游HO-1表达，而PI3K抑制剂或Nrf2沉默可逆转上述保护效应。 与合成铁死亡抑制剂相比，ASP-G兼具物理支撑与药理活性优势，可多靶点调控铁死亡、氧化应激等病理过程。但本研究存在局限，仅采用单一小鼠模型，未模拟临床复杂并发症，且给药方式为局部注射，未探究局部外用效果，也未排除与其他细胞死亡通路的交叉作用。综上，ASP-G通过PI3K/AKT/Nrf2通路抑制内皮细胞铁死亡，为慢性创面治疗提供了新候选药物，PI3K/AKT/Nrf2轴也有望成为慢性创面治疗的新靶点。 参考文献 [1] Anders, J., Heinemann, A., Leffmann, C., et al., 2010. 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