IL-2(Shanghai Xinshengyuan Biological Medicine Co. Ltd.)

调控性T细胞（Treg）是肿瘤微环境中最核心的免疫抑制细胞，已知可强效抑制传统αβT细胞，但其对类先天的γδT细胞是否存在调控、以何种方式调控，此前缺乏体内决定性证据。γδT细胞是一类独特的淋巴细胞亚群，不受经典抗原呈递限制，可快速识别并杀伤肿瘤细胞，以分泌IFN-γ、释放颗粒酶B等方式发挥强抗肿瘤作用。人类γδT细胞更偏向IFN-γ分泌，使其成为下一代细胞免疫治疗的理想候选。     但在临床与基础研究中，肿瘤内γδT细胞常功能低下、增殖受限、IFN-γ分泌不足，导致治疗效果打折扣。调控性T细胞（Treg）以高表达CD25构成高亲和力IL-2受体，擅长通过“细胞因子陷阱”剥夺效应T细胞的IL-2。这种机制对αβT细胞、NK细胞已被证实，但是否同样压制抗肿瘤γδT细胞，是要回答的核心科学问题。     近期，葡萄牙里斯本大学研系统究揭示：Treg通过制造IL-2匮乏环境，选择性“废掉”抗癌γδT细胞，并提出可通过IL-2Rβγ激动剂绕过抑制，重新激活γδT细胞抗肿瘤功能。 一：Treg清除特异性激活IFN-γ⁺γδT，不影响IL-17⁺亚群     研究在乳腺癌原位模型与结直肠癌模型中，利用Foxp3-DTR系统特异性清除Treg。结果显示：Treg清除后，肿瘤生长显著受控，总γδT细胞数量不变，但表型发生剧烈重塑—IFN-γ⁺γδT细胞比例、数量、平均荧光强度均大幅上升，同时颗粒酶B表达增强、增殖活性（Ki-67/BrdU）显著提高。与之相对，IL-17⁺γδT细胞几乎不受影响。     进一步分群显示，Vγ1⁺γδT是主要被激活的亚群。体内清除Vγ1⁺细胞可部分逆转Treg清除带来的肿瘤控制效果，并降低CD4⁺、CD8⁺αβT细胞的IFN-γ分泌，提示Vγ1⁺IFN-γ⁺γδT是Treg清除后抗肿瘤的关键执行者，且处于免疫调控的上游位置。     这一发现首次证明：Treg对γδT细胞的抑制具有高度选择性——只打击抗肿瘤亚群，不影响促瘤亚群。 二：Treg通过“IL-2掠夺”抑制γδT，与IL-10/IL-35/腺苷无关     为找到抑制机制，研究者逐一排除经典通路：阻断IL-10、IL-35或抑制腺苷生成，均无法逆转Treg对γδT的抑制。     真正关键在于IL-2竞争：Treg高表达三聚体高亲和力IL-2受体（CD25/CD122/CD132），而效应IFN-γ⁺γδT细胞稳态CD25低，对IL-2亲和力远弱于Treg。Treg因此成为“IL-2黑洞”，在肿瘤微环境中优先摄取有限IL-2，导致γδT细胞IL-2信号不足、STAT5磷酸化下降、增殖与效应功能被压制。     体外共培养证实：加入Treg后，γδT的IL-2诱导STAT5激活被显著抑制。而体内中和IL-2，可完全废除Treg清除带来的γδT激活与肿瘤控制效果。这从因果上锁定：IL-2剥夺是Treg抑制γδT的核心机制。 三：IL-2Rβγ激动剂（Neo2/15）可绕过Treg，直接激活γδT     既然抑制源于IL-2被抢，能否不依赖CD25、直接激活γδT？研究使用IL-2Rβγ偏好性激动剂Neo2/15，它结合IL-2Rβγ而非CD25，可绕开Treg的高亲和优势。结果显示小鼠体内给予Neo2/15，不降低Treg数量，但显著激活肿瘤内γδT，提升IFN-γ与颗粒酶B，抑制肿瘤生长。清除Vγ1⁺γδT可削弱Neo2/15的疗效，证明其直接作用于抗肿瘤γδT。     在人源体系中，Treg同样抑制人Vδ2⁺γδT及DOT治疗性γδT细胞，而Neo2/15可完全恢复其增殖、IFN-γ分泌与杀伤能力。这一结果提供了可直接转化的策略：不必清除Treg，只需用IL-2Rβγ激动剂，即可“绕开”免疫抑制，激活γδT细胞疗法。 四：人Treg对γδT的抑制保守存在，Neo2/15可增强DOT细胞治疗     研究进一步在人细胞体系中验证结论：人Treg可显著抑制外周血Vδ2⁺γδT与临床级DOT细胞（Vδ1富集型γδT）的CD25上调、增殖、IFN-γ分泌及肿瘤杀伤。加入IL-2或Neo2/15均可解除抑制。     在乳腺癌异种移植模型中，DOT细胞联合Neo2/15的抗肿瘤效果显著优于单独DOT细胞，证实该策略可直接提升γδT细胞疗法的体内疗效。这意味着Treg-IL-2-γδT调控轴在人与小鼠中高度保守，是跨物种的通用免疫抑制机制，也是通用治疗靶点。 总结与思考     本研究完整揭示一条全新肿瘤免疫调控轴：Treg→掠夺IL-2→制造IL-2匮乏微环境→选择性抑制IFN-γ⁺γδT→肿瘤免疫逃逸。它改变了以往认知：Treg不只抑制αβT，也强效、选择性抑制先天样γδT。且抑制方式不是细胞接触或分泌抑制因子，而是最简洁的细胞因子竞争。     对临床转化而言，未来γδT细胞治疗（如DOT、Vδ2、CAR-γδT）可联合IL-2Rβγ激动剂，绕过Treg抑制。不必激进清除Treg（易引发自身免疫），选择性增强效应细胞IL-2信号更安全。     Regulatory T cells sabotage anti-tumor γδ T cells by creating IL-2-deficient environments. J Exp Med. 2026 Jul 6;223(7):e20252133. doi: 10.1084/jem.20252133.

摘要 发育免疫毒理学（Developmental Immunotoxicology, DIT）正成为监管毒理学中的一个关键领域，这一领域的兴起源于人们认识到发育中的免疫系统对外源性物质的暴露尤为敏感。胎儿期或出生后早期发生的干扰可能导致免疫能力、免疫耐受性和疾病易感性的长期改变。本综述全面概述了免疫系统的发育过程，重点介绍了从胚胎发生到出生后成熟的各个关键发育阶段，并指出了免疫系统对毒物敏感度增高的时期。通过整合机制见解和方法学进展，本综述旨在支持DIT测试框架的改进和扩展，以及为监管和研究应用开发预测工具。新型方法学（New Approach Methodologies）的最新进展为模拟人类免疫发生提供了有希望的替代方案，同时也强调了确保充分覆盖与免疫毒性相关的关键发育机制和敏感期的挑战。生理图谱与多组学技术的结合增强了机制理解，而暴露与功能终点之间的流行病学关联突显了DIT在现实世界中的相关性，并有助于识别指导进一步开发相关且敏感模型的生物标志物。尽管取得了这些进展，但仍存在一些挑战，包括人类参考数据的稀缺、标准化协议的缺乏，以及需要在测试方法完善后验证涵盖多种机制的测试组合。解决这些差距对于推动DIT数据的监管采纳以及发展基于机制的、符合伦理的DIT测试策略至关重要。引言 **免疫系统发育背景** 人类免疫系统在妊娠期间于多个解剖部位逐渐发育，这一过程的时间因器官系统而异（详见第2章）。免疫细胞最初在妊娠第4周左右由胚外卵黄囊（YS）前体分化而来，随后由主动脉-性腺-中肾（AGM）来源的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）分化。由YS来源的前体和AGM来源的HSCs奠基的胎儿肝脏和骨髓（Bone Marrow, BM）成为主要的造血场所。这些主要造血部位的免疫细胞会迁移到正在发育的淋巴器官（如胸腺、脾脏和淋巴结）以及外周非淋巴器官（Park等人，2020年）。 在小鼠中，HSCs及淋巴细胞和髓系前体的出现被认为发生在三个发育窗口期： 1. **前HSCs造血期**：胚外卵黄囊是早期造血的场所。红细胞在HSCs出现之前就在卵黄囊中形成。髓系前体也在早期卵黄囊中产生，其巨噬细胞后代在成年后仍存在于大脑、肝脏、皮肤和肺部。红髓系前体还能生成肥大细胞（Macrophages, MCs），其中一些在成年后仍存活。卵黄囊中的前体可以生成αβ和γδ T细胞以及B-1细胞，但不能生成B-2细胞。 2. **妊娠中期造血期**：妊娠中期的胎儿体内存在多种造血细胞群，包括HSCs、胸腺前体、B-1和B-2前体以及先天淋巴细胞（Innate Lymphocytes, ILCs）前体。 3. **成年造血期**：此时产生常规的B细胞和T细胞，而某些先天样淋巴细胞的生成量较少或完全不生成（Dorshkind & Crooks, 2023年）。 人类免疫系统的发育也是分阶段的（即构成成年免疫系统的不同类型淋巴细胞由在发育过程中不同时间出现的不同前体逐步发育而来），尽管这方面的研究不如小鼠那么深入。由于获取人类胎儿组织（尤其是特定发育阶段的组织）的难度较大（Ni等人，2025年），因此对早期人类造血的研究具有挑战性。此外，小鼠中使用的方法无法直接应用于人类。因此，从胚胎或多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）生成HSCs及其前体的体外模型至关重要（Dorshkind & Crooks, 2023年）。然而，最近的一项研究表明，在人类胚胎中，卵黄囊来源的淋巴细胞前体比HSCs更早出现（Ni等人，2025年）。 胎儿、新生儿和成人样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，人类造血干细胞前体（HSPC）在妊娠后半期的基因表达经历了渐进性变化，导致细胞群体层面的转录谱逐渐演变（Bunis等人，2021年）。因此，胎儿T细胞在发育过程中经历有节奏的基因表达变化，这些变化可能决定了其在特定发育阶段的功能。这表明，胎儿和成年造血可能不是由离散的、重叠的波次完成，而是一个单一的HSPC群体经历了渐进且连续的基因表达变化（Burt & McCune, 2023年）。 Suo等人（2022年）的一项里程碑式研究使用单细胞图谱分析了妊娠第3周至第16周期间人类免疫细胞在妊娠期造血（卵黄囊、肝脏和骨髓）、淋巴系统（胸腺、脾脏和淋巴结）以及非淋巴系统外周器官（皮肤、肾脏、肠道）中的发育过程。研究发现，淋巴细胞从先天免疫反应向适应性免疫反应发生了转变。妊娠第3至第9周，淋巴系统主要由自然杀伤细胞（NK细胞）和ILCs主导；妊娠第11周后，B细胞和T细胞开始出现。此外，该研究扩展了胎儿肝脏和骨髓作为B细胞淋巴生成的唯一场所的观点。虽然T细胞发育仅限于胸腺，但B细胞的发育没有空间限制，这突显了胸腺在T细胞选择中的重要性。He等人（2025年）的另一项里程碑式研究生成了从妊娠第11周至第24周的各种器官中分离出的CD45+细胞的单细胞图谱，并结合了scRNA-seq和单细胞T细胞受体（TCR）测序。他们的观察结果包括：（1）T细胞从前体细胞分化为成熟的naive CD4+细胞和调节性T细胞（Treg）；（2）妊娠第二孕期T细胞反应比之前认为的更为活跃和广泛；（3）记忆T细胞和活化T细胞的克隆扩增程度高于胎儿期；（4）胎儿期的抗原识别谱不同，TCR α-和β-链的比例较高，且抗原识别范围随时间缩小；（5）HSCs存在于肝脏、脾脏和骨髓以外的多种胎儿器官中。 在胚胎阶段形成的发育中的免疫系统比成年免疫系统更容易受到外源性物质的影响，许多外源性物质具有免疫毒性，这将在后续章节中详细讨论。发育免疫毒性（DIT）可能导致免疫系统在关键发育阶段的形成和功能发生改变，并可能影响终生健康。因此，需要开发工具来检测具有此类效应的化学物质，从而更有效地研究和理解DIT。毒理学目前正在经历深刻变革，这一变革受到伦理责任和需要更准确反映人类生物学模型的双重驱动。这一演变的核心是采用3R原则（替代、减少和优化动物实验），这促进了新型方法学（New Approach Methodologies, NAMs）的发展和实施。这些方法包括一系列计算机模拟、化学分析和体外工具，旨在减少对动物实验的依赖并提高预测能力（Johnson等人，2025年）。通过整合机制见解和方法学进展，本综述旨在支持DIT测试框架的改进和扩展，以及为监管和研究应用开发预测工具。 **DIT测试数据的重要性和挑战** DIT测试数据对于保护个体（尤其是在孕前和围产期）免受发育免疫毒物的影响至关重要，可以通过限制或禁止使用这些化合物来实现。然而，目前存在一些挑战，阻碍了获取足够的DIT数据以得出结论并采取适当的缓解措施。首先，与其他大多数终点指标相比，DIT数据较为稀缺，因为只有在少数化学物质注册时才会要求提供DIT数据。经济合作与发展组织（OECD）的唯一包含DIT测试的测试指南（Test Guideline, TG）是“扩展一代生殖毒性研究”（Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, EOGRTS；TG 443），该研究评估了对淋巴细胞亚群频率（T细胞、B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞）的影响，但不评估免疫功能终点。EOGRTS适用于生产或进口量≥1000吨的化学物质（如果对生育能力有疑虑，即使数量较少也可能触发EOGRTS）。在少数情况下，EOGRTS还包括所谓的第三组（Cohort 3），该组评估暴露对T细胞依赖性抗体反应（TDAR）的影响。第三组的加入基于以下触发条件：（1）生殖和发育毒性的筛选测试（TG 421/422）；（2）成年动物的28天和90天口服毒性研究（TG 407/408）；（3）公共文献。根据REACH法规，截至2022年，EOGRTS的数量约为380项，而第三组研究的数量约为60项。对于欧洲药品管理局（EMA）管理的药品，截至2023年，TDAR的数量接近36项。其中约2/3的TDAR用于检测单克隆抗体，因此使用了非人类灵长类动物。 其次，只有当对人类接触的大量化合物的潜在DIT及其与暴露的关系进行了评估时，才能全面理解DIT对人类健康的重要性和影响。欧洲化学品管理局（ECHA）在其“监管挑战关键领域”中将DIT列为关键领域（ECHA, 2024年）。第三，由于发育免疫毒物通过不同的作用机制发挥作用（Shao等人，2013年），基于有限的NAMs集合开发综合测试和评估方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA）具有挑战性。特别是当DIT数据有限时更是如此。虽然针对IL-2信号传导、DNA合成或T细胞增殖的T细胞相关NAMs在识别通过免疫抑制机制引起DIT的化合物方面具有潜力，但针对其他作用机制的NAMs仍需进一步优化和验证。有前景的方法包括用于T细胞和B细胞分化的体外模型（Li等人，2017年；Trotman-Grant等人，2021年）。这些方法是否最终能成为正式的测试指南还有待进一步研究。第四，如果能够进行计算机模拟预测，将有助于识别发育免疫毒物。这需要足够数量的阳性及阴性化合物作为参考。第五，需要人类DIT数据来验证体外和体内研究的发现。近年来，多项流行病学研究表明，接触全氟烷基物质（PFASs）与儿童疫苗接种反应减弱有关（Ehrlich等人，2023年）。这些发现提高了人们对PFASs暴露潜在健康风险的认识。重要的是，这些研究还提供了实际证据，证明发育毒性（DIT）确实在发生，这突显了改进风险评估和预防策略的必要性。更多细节请参见第3.1章“环境污染物、药物和饮食对免疫系统成熟的影响”。生理图谱在理解免疫系统成熟过程中的相关性如上所述，基于人类的NAMs（纳米毒理学方法）预计将在未来脱离动物实验的DIT危害和风险评估中发挥关键作用。然而，采用基于人类NAMs策略的一个关键前提是对人类免疫系统发育和成熟的详细机制理解。这是一个挑战，因为目前大多数知识都来源于啮齿动物模型（Nguyen等人2026年；Skaggs等人2019年；Kuper等人2016年；Vinken等人2021年）。解决这一差距的一个有前景的方法是使用生理图谱。生理图谱建立在疾病图谱的概念之上，后者以标准化和机器可读的格式可视化各种疾病的生物学机制（Ostaszewski等人2019年），它们专注于表示正常的生理过程（Mazein等人2025年；Staumont等人2025年）。它们提供了器官（Ladeira等人2025年）或细胞类型在分子和细胞层面的图形化、交互式描述，整合了信号传导、代谢和基因调控网络（Ostaszewski等人2019年）。对于免疫系统的成熟，生理图谱可以系统而全面地展示涉及的发育阶段、过程和器官。通过捕捉信号通路、代谢过程和基因调控之间的相互作用，它们使得健康免疫系统发育背后的关键窗口和机制得以可视化。因此，这些图谱既可以作为免疫学的参考框架，也可以作为支持从动物实验向NAMs转变的工具。它们有助于识别构建不良后果路径（AOPs）的关键事件和分子启动事件，以及测试方法的发展，并帮助将这些扩展为更综合的AOPs网络（Staumont等人2025年）。通过为相关AOPs和NAMs的发展提供信息，生理图谱有助于克服关键的转化障碍。因此，从基于动物的DIT方法向基于NAMs的方法的转变，是以建立在AOP框架之上的机制性、与人类相关和综合的方法论为特征的。这种从传统动物实验向与人类相关的NAMs的转变在图1中有所体现。图1该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像DIT的范式转变。传统的DIT评估主要依赖于基于动物的研究，包括功能性免疫检测，如TDAR。对人类免疫发育机制理解的进步，包括生理图谱、AOP框架和多组学数据，支持了基于机制的方法的发展。这些方法使得向与人类相关的NAMs的转变成为可能，包括人类体外免疫模型、干细胞衍生系统和器官芯片平台，提高了DIT危害和风险评估的相关性。这一方向上的一个重要步骤是“人类免疫系统发育图谱”（HIDmap）（Spruck等人，手稿正在修订中），由莱布尼茨环境医学研究所（IUF）开发，这是第一个由专家策划的、机器可读的、公开可访问的产前免疫系统发育的表示。该图谱托管在分子相互作用网络可视化（MINERVA）平台上（Gawron等人2016年），并使用标准化的系统生物学图形符号（Le Novère等人2009年），将已发表的数据整合到子宫内发育过程中的器官和特定过程成熟情况中。在“化学物质风险评估合作组织”（PARC）内，HIDmap目前正在扩展，以确保更广泛地覆盖免疫发育过程和化学相关性（Snapkow等人2024年）。除了风险评估之外，人类免疫系统发育的生理图谱还可以识别知识空白，促进免疫功能障碍的检测，并为整合多层次数据提供基础。它进一步支持实验数据集的可视化和分析，加强体外和计算机模拟模型，并具有教育价值（Staumont等人2025年）。最终，这样的生理图谱促进了免疫学、毒理学、监管科学和临床医学之间的知识交流——加深了对人类免疫系统成熟及其在诊断、治疗开发和安全评估中实际应用的理解。人类免疫系统的发育与完全成熟的成人免疫系统相比，发育中的免疫系统特别容易受到环境诱导的毒性影响。首先，引发效应所需的剂量要低几个数量级。此外，已经表明，与成人免疫系统相比，暴露于发育中的免疫系统会扰乱更广泛的免疫参数。发育中免疫系统的紊乱可能会持续到以后的生活中（Dietert等人，2014年）。为了更好地理解免疫系统发育过程中发生的众多过程，以下部分将描述免疫器官发生。免疫器官发生的概述人类胚胎从受精卵发育成囊胚，经过一系列有丝分裂。随后是关键的发育里程碑，包括原肠形成和器官发生，最终将胚胎塑造成可识别的胎儿。在人类中，器官发生阶段大约从妊娠的第三周到第八周。在这个阶段，器官以基本、原始的形式形成，并将在之后继续成熟。肝脏、骨髓（BM）、胸腺和脾脏等器官在胎儿免疫系统的成熟中起着关键作用（Hossain等人2022年）。已经确定了几个对DIT敏感度增加的窗口期，这意味着在这些窗口期内的暴露对健康结果有特别大的影响。图2展示了人类免疫系统的时间发展及其对发育免疫毒性（DIT）敏感的主要窗口期。图2该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像人类免疫系统的发育和对DIT敏感的窗口期。人类免疫系统在妊娠和早期生活中逐渐发育。在妊娠第3-4周，卵黄囊（YS）是主要的造血场所，随后是胎儿肝脏，而在出生前不久，骨髓成为主要的造血场所。胸腺、淋巴结和脾脏支持免疫细胞的分化和成熟。先天免疫细胞如巨噬细胞在早期发育中出现，随后是自然杀伤细胞，而在妊娠中期，适应性淋巴细胞出现。功能性适应性免疫反应在出生时建立，并在儿童时期继续成熟。这些阶段对应于对DIT敏感的关键窗口期，包括胎儿造血的紊乱、胸腺发育和T细胞选择、新生儿免疫过渡以及出生后的微生物群定植和免疫成熟。这些图谱有助于识别构建不良后果路径（AOPs）的关键事件和分子启动事件，以及测试方法的发展，并帮助将这些扩展为更综合的AOPs网络（Staumont等人2025年）。通过为相关AOPs和NAMs的发展提供信息，生理图谱有助于克服关键的转化障碍。因此，从基于动物的DIT方法向基于NAMs的方法的转变，是以向机制性、与人类相关和综合的方法论的转变为基础的。这种从传统基于动物的测试向与人类相关的NAMs的转变在图1中有所体现。图1该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像DIT的范式转变。传统的DIT评估主要依赖于基于动物的研究，包括功能性免疫检测，如TDAR。对人类免疫发育机制理解的进步，包括生理图谱、AOP框架和多组学数据，支持了基于机制的方法的发展。这些方法使得向与人类相关的NAMs的转变成为可能，包括人类体外免疫模型、干细胞衍生系统和器官芯片平台，提高了DIT危害和风险评估的相关性。使用BioRender创建。Iulini, M. (2026) https://BioRender.com/5vrup11在这个方向上的一个重要步骤是“人类免疫系统发育图谱”（HIDmap）（Spruck等人，手稿正在修订中），由莱布尼茨环境医学研究所（IUF）开发，这是第一个由专家策划的、机器可读的、公开可访问的产前免疫系统发育的表示。该图谱托管在分子相互作用网络可视化（MINERVA）平台上（Gawron等人2016年），并使用标准化的系统生物学图形符号（Le Novère等人2009年），将已发表的数据整合到子宫内发育过程中的器官和特定过程的成熟情况中。在“化学物质风险评估合作组织”（PARC）内，HIDmap目前正在扩展，以确保更广泛地覆盖免疫发育过程和化学相关性（Snapkow等人2024年）。除了风险评估之外，人类免疫系统发育的生理图谱还可以识别知识空白，促进免疫功能障碍的检测，并为整合多层次数据提供基础。它进一步支持实验数据集的可视化和分析，加强体外和计算机模拟模型，并具有教育价值（Staumont等人2025年）。最终，这样的生理图谱促进了免疫学、毒理学、监管科学和临床医学之间的知识交流——加深了对人类免疫系统成熟及其在诊断、治疗开发和安全评估中实际应用的理解。人类免疫系统的发育与完全成熟的成人免疫系统相比，发育中的免疫系统特别容易受到环境诱导的毒性影响。首先，引发效应所需的剂量要低几个数量级。还表明，与成人免疫系统相比，暴露于发育中的免疫系统会扰乱更广泛的免疫参数。发育中免疫系统的紊乱可能会持续到以后的生活中（Dietert等人，2014年）。为了更好地理解免疫系统发育过程中发生的众多过程，以下部分将描述免疫器官发生。免疫器官发生的概述人类胚胎从受精卵发育成囊胚，经过一系列有丝分裂。随后是关键的发育里程碑，包括原肠形成和器官发生，最终将胚胎塑造成可识别的胎儿。在人类中，器官发生阶段从大约妊娠的第三周到第八周。在这个阶段，器官以基本、原始的形式形成，并将在之后继续成熟。肝脏、骨髓（BM）、胸腺和脾脏等器官在胎儿免疫系统的成熟中起着关键作用（Hossain等人2022年）。已经确定了几个对DIT敏感度增加的窗口期，这意味着在这些窗口期内的暴露对健康结果有特别大的影响。图2展示了人类免疫系统的时间发展及其对发育免疫毒性（DIT）敏感的主要窗口期。图2该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像人类免疫系统的发育和对DIT敏感的窗口期。人类免疫系统在妊娠和早期生活中逐渐发育。在妊娠第3-4周，卵黄囊是主要的造血场所，随后是胎儿肝脏，而在出生前不久，骨髓成为主要的造血场所。胸腺、淋巴结和脾脏支持免疫细胞的分化和成熟。先天免疫细胞如巨噬细胞在早期发育中出现，随后是自然杀伤细胞，而在妊娠中期，适应性淋巴细胞出现。功能性适应性免疫反应在出生时建立，并在儿童时期继续成熟。这些阶段对应于对DIT敏感的关键窗口期，包括胎儿造血的紊乱、胸腺发育和T细胞选择、新生儿免疫过渡以及出生后的微生物群定植和免疫成熟。使用BioRender创建。Iulini, M. (2026) https://BioRender.com/er4w6cb在妊娠初期（第16至18天），卵黄囊是第一个造血产生的场所。在这里，形成造血（前体）细胞。定型的HSCs不在卵黄囊内形成，而是在AGM（胚胎肝-中胚层）内形成。妊娠4周后，可以在卵黄囊中观察到HSC样前体、NK细胞前体、红细胞前体、巨噬细胞前体和ILC前体（Popescu等人2019年）。胎儿卵黄囊还产生原始巨噬细胞，这些巨噬细胞随后在大脑、肝脏、肺和表皮中形成巨噬细胞（Gomez Perdiguero等人2015年；Hoeffel等人2015年）。大约在妊娠4周时，这些前体迁移到胎儿肝脏，使其在第五到第六周成为主要的造血场所。妊娠第5至10周之间核细胞数量的增加促进了肝脏的快速生长（Hossain等人2022年）。肝脏早期的肝脏起源于胚胎肠道底部的一个憩室，最初包含来自卵黄囊的红细胞和CD45+细胞。到妊娠第三和第四周，这个原始的肝脏还容纳单核/巨噬细胞谱系和CD34+CD45+细胞群体（Hossain等人2022年；Kuchma等人2015年）。随着胎儿发育的进展，一些主动脉内的造血簇和胎儿肝脏中的CD34+CD45+细胞被来自AGM区域的细胞所取代，这与定型的HSCs的出现相吻合，这些HSCs产生了红细胞、髓系和淋巴细胞谱系（Slayton等人1998年）。值得注意的是，在HSC衍生的群体中，开始产生单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs），最早的DCs在妊娠第6周就在胎儿肝脏中被发现（Popescu等人2019年）。从第12周开始，不同的胎儿组织中可以找到各种DCs亚群，包括常规DCs1和DCs2以及浆细胞样DCs，包括皮肤、肺、脾脏和胸腺（Fogg等人2006年）。胎儿DCs对Toll样受体（TLR）刺激具有功能性反应，在T细胞分化、增殖和激活中起关键作用。它们还通过精氨酸酶2活性增强T细胞白细胞介素4（IL-4）的产生，同时抑制T细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）的释放。这些功能强调了DCs在胎儿发育期间建立免疫耐受性的重要性（Fogg等人2006年）。此外，B细胞谱系细胞，包括前体和成熟B细胞，分别在妊娠第7周和第9周左右首次出现在胎儿肝脏中（Popescu等人2019年）。因此，肝脏在整个胎儿发育期间都是造血分化和HSCs扩增的主要场所，直到出生前。骨髓骨髓的发育与血管侵入软骨骨和骨化密切相关。形成始于妊娠第8周。骨髓成为B细胞最重要的来源（Zakir等人2022年），在妊娠中期在脾脏中丰富，而肠道B细胞的发育从妊娠第二孕期开始直到出生。出生前不久，骨髓从肝脏接管成为主要的造血场所（Kuper等人2016年）。胸腺胸腺的形成始于妊娠第6周，到第15-16周时髓质完全形成。早期淋巴前体在妊娠第8周从胎儿肝脏迁移到胸腺，在那里形成幼稚T细胞（Haynes & Heinly 1995年）。这些早期的胸腺前体分化为幼稚T细胞，然后迁移。妊娠第14周时，胸腺开始将单阳性CD4+和CD8+ T细胞输出到其他组织（Kuper等人2016年）。Treg细胞由胎儿的幼稚T细胞生成，抑制其他胎儿T细胞的增殖和细胞因子分泌（Micha?lsson等人2006年；Mold等人2010年）。一种在围产期分化的Treg亚群可以防止小鼠的自发性免疫，这种Treg细胞不能被成人生成的Treg细胞替代（Yang等人2015年），这突显了发育中的分层免疫系统。淋巴结淋巴结的形成是一个较长的过程。在妊娠第5-6周，淋巴囊/血管开始形成。早期淋巴结的形成，包括传入淋巴管，在妊娠第12-14周发生。妊娠第25-38周后，形成了具有传出淋巴管的明显包膜（Kuper等人2016年）。淋巴结从妊娠第8至11周之间的浓缩间充质细胞开始形成，包膜由边缘窦形成。到第13周时，间充质填充淋巴囊，中间窦发展，而在第8周时可以在颈部和腹膜后区域发现第一个淋巴结结构。第9-10周可以检测到支气管周围、腹腔、纵隔、腋窝、腹股沟和腘窝淋巴结，第14周可以检测到网膜和肠系膜淋巴结（Hossain等人2022年）。不同的淋巴细胞群体，包括T细胞、B细胞和一些先天淋巴细胞群体，迁移到淋巴结并参与淋巴器官的生成和塑造（Onder & Ludewig 2018）。脾脏脾脏在妊娠第6周后开始形成，并在妊娠第二孕期发育红细胞和白细胞。脾脏在DCs的帮助下参与T细胞依赖的免疫。与已经描述了胎儿肝脏中DCs发育的情况不同，胎儿脾脏中DCs的起源学仍大部分未被探索（Hossain等人2022年）。免疫系统成熟的关键阶段产前免疫胎儿免疫系统从第一孕期开始编程，先天和适应性免疫细胞出现并增殖直到出生。单核细胞/巨噬细胞是最早出现的先天细胞，随后是粒细胞、NK细胞以及B细胞和T细胞前体（Hossain等人2022年）。在人类中，由于胎盘的绒毛膜性质，母体和胎儿的免疫系统紧密接触，这有助于最大化营养和免疫因子的交换。胎盘在妊娠早期开始发育，并在妊娠第8至12周之间血管化。为了耐受半同种异体的胎儿，母体的免疫系统会经历特定的适应性变化，而子宫黏膜（蜕膜）中的免疫细胞在调节滋养层侵袭过程中起着关键作用（Svensson-Arvelund等人，2014年）。在胎儿的产前发育过程中，它们通过胎盘接收来自母亲的免疫球蛋白G（IgG），同时它们的免疫器官也开始形成（Chucri等人，2010年）。胎盘还形成了一个抵御环境污染物的保护屏障。**出生后的免疫系统** 出生时，先天免疫系统的激活标志着一个重要的转变，因为新生儿面临着外部环境中大量抗原的挑战。初乳中的母体IgG在新生儿期提供了被动保护，同时婴儿的免疫系统也在逐渐成熟（Simon等人，2015年）。出生后，新生儿必须经历一个关键的免疫发育转变（从Th2型向Th1型），以建立能够抵御儿童期及以后各种疾病的有效免疫反应。免疫系统发育过程中不断的变化和持续成熟过程使其敏感性增强（Dietert & Piepenbrink，2006年）。出生后的一段时间内，胎儿和新生儿来源的造血前体细胞存在显著的重叠。这些造血前体细胞影响着生成的免疫细胞的质量以及整个免疫系统的功能。尽管新生儿能够产生多种促炎和抗炎反应，但他们的免疫系统与成人免疫系统有所不同，这使他们更容易受到各种病原体的感染（Georgountzou等人，2017年）。因此，儿科疫苗接种计划需要包括母体接种或婴儿后期多次接种，以诱导保护性免疫反应。在婴儿期，随着B细胞和T细胞活动的增加，适应性免疫开始发挥作用，疫苗接种刺激抗体的产生以及抗原特异性T细胞和B细胞的诱导。随着儿童从婴儿期进入幼儿期，免疫系统继续成熟，抗体产生增加，接触病原体的机会增多，从而增强了他们的免疫力（Simon等人，2015年）。儿童晚期和青春期，免疫系统继续成熟，并从过去的感染和疫苗接种中形成免疫记忆，提高了儿童对已知病原体的有效反应能力。婴儿期免疫反应不足、过度或调节不当都可能带来后果，现代婴儿越来越容易患上自身免疫性疾病，如1型糖尿病、过敏和哮喘（Jain，2020年）。**先天免疫系统** 先天免疫系统在出生后迅速对抗原作出反应，对宿主的防御机制产生终生影响。微生物和共生微生物的识别依赖于宿主细胞上的模式识别受体，这些受体对于调节共生微生物群的建立以及对抗病原性病毒和细菌至关重要。这些受体的失调，尤其是在早产儿中，可能导致严重的疾病，如新生儿败血症、坏死性小肠结肠炎和病毒清除能力下降（Jain，2020年）。早产儿和极低出生体重婴儿的单核细胞中TLR4表达减少，可能导致对革兰氏阴性细菌感染的易感性增加，因为这些细胞产生的细胞因子不足（?ster-Waldl等人，2005年；Sadeghi等人，2007年）。早期生活中先天免疫反应的适当调节对长期免疫和防止感染至关重要。新生儿和成人的单核细胞中TLR的表达和分布相似，但TLR激活的功能结果不同：早产儿产生更多的IL-10，而足月儿则产生更多的IL-6和IL-23（Kollmann等人，2017年）。浆细胞样树突状细胞（pDCs）在病毒感染期间对1型干扰素（IFN）的产生起着关键作用，但在呼吸道合胞病毒感染的新生儿中其反应减弱（Marr等人，2014年）。来自脐带血的单核细胞来源的DCs和pDCs在接触某些病毒（如巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒和单纯疱疹病毒）时能够产生强效的IL-12p70和1型IFN（Renesson等人，2009年；Zhang等人，2014年，2013年）。这些发现表明，尽管TLR表达水平相当，但足月儿和早产儿在病毒刺激下pDCs的TLR激活机制存在差异。**适应性免疫系统** 最近的数据挑战了早期关于新生儿适应性免疫缺陷的假设，表明新生儿T细胞是一个适应围产期环境的独特群体（Rudd，2020年）。新生儿T细胞在起源和功能上与成人T细胞不同，表现出CD4+ T细胞向Th2辅助细胞和Treg调节细胞的偏向，以及CD8+ T细胞快速产生效应细胞的能力（Mold等人，2010年；Smith等人，2018年；Wang等人，2016年）。即使在没有刺激的情况下，新生儿T细胞也表现出与成人T细胞不同的基因表达特征，表明它们对抗原的反应性更强（Palin等人，2013年；Smith等人，2018年；Wissink等人，2015年；Yu等人，2016年；Zens等人，2017年）。这一发现突显了新生儿适应性免疫的专门化能力，新生儿T细胞表达多种TLR，如TLR2和TLR5，使它们能够有效应对微生物物质（Komai-Koma等人，2004年；McCarron等人，2009年；Sinnott等人，2016年）。新生儿T细胞对自身和非自身抗原表现出耐受性，同时在需要时能够迅速产生免疫反应。同样，新生儿B细胞的反应也与成人不同，胎儿前体细胞产生的B1 B细胞在出生后大约一个月内留在脾脏中，产生广谱反应性的低亲和力抗体（Hardy & Hayakawa，2001年）。新生儿体内的B细胞群体主要由幼稚B细胞和过渡性或发育中的B细胞组成，以及少量的记忆细胞，这反映了新生儿期与成人相比在免疫反应上的发育差异。**影响免疫系统成熟的化学物质** 关于发育免疫毒性（DIT）的研究取得了显著进展，强调了早期生活中接触各种化学物质、药物和营养压力源如何干扰免疫系统的发育。这些干扰可能导致免疫能力、耐受性和日后感染、过敏或自身免疫性疾病易感性的变化（DeWitt等人，2012年）。现在，通过研究免疫发育的脆弱窗口、干扰机制及其在人类系统中的体现，正在推动DIT危害评估和风险评价的范式转变。**环境污染物、药物和饮食对免疫系统成熟的影响** 免疫系统的成熟是通过一系列严格调控的发育阶段实现的，包括造血干细胞（HSCs）的定向和增殖、胸腺的种子细胞植入和选择，以及外周T细胞和B细胞库的建立。每个阶段都存在高度脆弱的时期，此时接触外来物质可能导致免疫能力、耐受性和调节的长期改变（Dietert，2014年）。因此，在妊娠期、出生后早期和婴儿期接触环境污染物、药物或营养失衡需要特别关注，因为这些发育窗口对干扰特别敏感。越来越多的证据表明，这些关键时期的损伤会影响免疫系统的长期轨迹，影响对感染、过敏和自身免疫及其他免疫刺激的易感性（WHO，2012年）。以下段落总结了支持这一概念的关键证据，表1概述了与发育免疫毒性相关的化学物质类别及其对免疫系统发育的影响。**环境污染物** 持久存在的环境化学物质已成为免疫发育的主要干扰因素，其中全氟烷基磺酸盐（PFASs）是一类研究最充分的发育免疫毒性物质。来自多个队列的流行病学证据表明，早期接触PFASs与儿童疫苗反应性降低之间存在一致关联。在法罗群岛的一项里程碑式前瞻性研究中，较高的孕前PFOS和全氟辛酸浓度与5岁和7岁时白喉和破伤风抗体滴度显著降低有关；PFOS浓度翻倍时，5岁时的白喉抗体水平估计下降了39%（Grandjean等人，2012年）。挪威的一项出生队列研究也独立证实了这一点，孕期母亲PFASs浓度较高与儿童3岁前的风疹和破伤风类毒素抗体水平降低相关（Granum等人，2013年）。美国青少年（12-19岁）的横断面分析显示，血清PFASs水平升高的个体风疹和腮腺炎抗体滴度较低（Stein等人，2016年）。总体而言，这些发现表明从孕前期到幼儿期是PFAS诱导的免疫脆弱性的关键时期，并强调了发育中的适应性免疫系统对低水平慢性外来物质暴露的敏感性。除了PFASs外，其他环境污染物，包括二噁英类化合物、重金属和空气中的颗粒物（PM），也被认为会影响免疫发育。妊娠期间接触二噁英类化合物TCDD（2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英）会通过激活芳烃受体途径损害胸腺发育并干扰T细胞分化，导致细胞介导的免疫长期抑制（Jin等人，2014年）。孕前和早期生活接触甲基汞和多氯联苯也与疫苗反应性降低、感染增加和细胞因子谱改变有关（Bose-O'Reilly等人，2010年；Heilmann等人，2006年；St?levik等人，2013年）。空气中的细颗粒物（PM 2.5）和超细颗粒物（PM 0.1）暴露也被认为是DIT的驱动因素。孕前或早期生活接触环境PM可引起氧化应激和关键免疫调节基因的表观遗传重塑，从而损害Treg细胞的发育（Johnson等人，2021年）。虽然PM 2.5可能从呼吸道转移到胎盘和胎儿（Bové等人，2019年），但其不良影响也可能通过母亲的炎症反应间接发生（Dugershaw等人，2020年；Hougaard等人，2015年）。提出的机制途径包括母体和胎盘的氧化应激和炎症、胎盘TLR的激活、生长和激素分泌受损以及血管功能障碍（Dugershaw等人，2020年）。关于微塑料和纳米塑料颗粒的体内和体外实验数据也表明，纳米颗粒暴露可能干扰巨噬细胞功能和抗原呈递，从而引发慢性促炎状态（Bianchi等人，2025年）。**药物** 虽然某些药物在药理上具有益处，但在妊娠期或出生后早期接触它们也可能导致DIT效应。穿过胎盘或在新生儿期给予的药物会干扰免疫系统的发生，导致免疫能力和耐受性的持久改变。合成糖皮质激素（如地塞米松）是DIT研究中研究最广泛的药物之一。这些药物被给予有早产风险的孕妇。它们容易穿过胎盘，并通过胎儿胸腺和HSCs中表达的糖皮质激素受体发挥作用（Cain & Cidlowski，2017年；Moisiadis & Matthews，2014年）。啮齿动物的实验证据表明，妊娠期间短期接触地塞米松会导致胸腺萎缩、双阳性胸腺细胞（CD4?CD8?）减少，并改变TCR库的形成（Bakker等人，1995年）。这些变化在出生后早期仍然存在，导致胸腺输出减少和T细胞亚群比例改变。最近的一项前瞻性队列研究发现，孕前使用皮质类固醇与胎儿胸腺生长减少有关（Jones等人，2020年）。这些体内观察结果得到了体外和模型生物研究的补充，进一步揭示了糖皮质激素作为药物免疫毒性物质的机制。例如，体外实验中，人类脐带血干细胞来源的DCs前体暴露于地塞米松会抑制其分化为未成熟DCs，抑制CD86/CD83表达，增加IL-10分泌，并降低T细胞的刺激能力（Mainali & Tew，2004年）。此外，斑马鱼研究显示，胚胎期暴露于类似治疗剂量的合成糖皮质激素会改变免疫细胞迁移（中性粒细胞/巨噬细胞）并导致骨骼发育异常。这表明糖皮质激素介导的DIT效应不仅限于哺乳动物（Hamilton等人，2024年）。**化疗药物和表观遗传活性药物** 化疗药物和具有表观遗传活性的药物也可能表现出DIT相关特性。例如，在妊娠期间给小鼠使用烷化化疗药物环磷酰胺会导致胎儿胸腺萎缩和皮质淋巴细胞耗竭（Prakash等人，2007年）。后代表现出胸腺细胞计数减少和T细胞反应性受损，表明其对发育中的淋巴器官有直接的致畸作用。子宫内暴露还会损害年轻成年后代的网状内皮清除功能，表明对免疫系统稳态有持久影响。类似地，丙戊酸（VPA）作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，也被证明通过表观遗传机制影响免疫发育（G?ssowska-Dobrowolska等人，2020年）。在小鼠模型中，孕前VPA暴露会导致细胞因子产生改变、肠道炎症增加和微胶质细胞激活，表明发育中的神经系统和免疫系统之间存在异常相互作用（G?ssowska-Dobrowolska等人，2020年）。这些发现说明了药物诱导的表观遗传失调如何通过与免疫分化和耐受性相关的基因网络相互作用，从而影响免疫系统。单克隆抗体（mAbs）和其他针对免疫成分的生物制剂代表了一类与DIT（药物诱导的毒性）相关的新型药物。由于IgG在妊娠中期后能够有效穿过胎盘，因此很明显，在妊娠期间给予mAbs可以到达胎儿的血液循环中（Klink等人，2008年；Schwake等人，2024年）。临床案例研究表明，在妊娠晚期给予利妥昔单抗和其他抗CD20 mAbs会导致新生儿B细胞暂时减少和低丙种球蛋白血症，有时还会伴随疫苗反应延迟（Klink等人，2008年）。尽管这些效应在出生后几个月内可以逆转，但它们提供了证据，表明在发育过程中对免疫途径的药物调节可能会产生可测量且机制明确的免疫毒性后果。营养和饮食与这些药物诱导的免疫发育扰动并行，营养是一个普遍存在的环境因素，能够在整个早期生命阶段塑造免疫系统的成熟。在“最初1000天”（从受精到大约24个月大）内的营养对免疫系统的成熟起着关键作用。这是通过两种主要机制实现的：首先，直接通过营养素介导的信号传导；其次，间接通过调节肠道微生物群及其代谢产物（Fragkou等人，2021年）。充足的维生素A、D、E和锌等微量营养素对于淋巴细胞分化、抗体产生以及维持黏膜屏障功能至关重要（Gombart等人，2020年；Mora等人，2008年）。相反，母亲营养不良或缺乏这些关键营养素与后代胸腺发育受损、微生物定植模式改变以及对感染和过敏的易感性增加有关（Forgie等人，2020年）。母亲过度营养以及高脂肪、精制碳水化合物和低纤维含量的饮食与新生儿免疫编程的紊乱有关（Nelson & Friedman，2024年）。母亲的高脂肪饮食会促进微生物群失衡，减少Treg细胞的发育，并在后代中表观遗传地重新编程髓系前体细胞，使其呈现促炎表型。这种改变可能导致日后出现代谢性炎症、哮喘和自身免疫的易感性。除了宏量营养素不平衡外，食品接触材料中的化学物质也可能通过从包装材料迁移到食物中并随后被摄入来影响免疫发育。内分泌活性化合物，如双酚A（BPA）和邻苯二甲酸盐，这些化合物常见于食品包装中，已被证明会破坏Th1/Th2平衡，抑制Treg细胞的成熟，并增强过敏敏感性（EFSA，2023年）。因此，营养既是免疫发育编程的风险因素，也是保护性因素。优化母亲饮食质量并尽量减少接触免疫调节食品污染物是支持免疫韧性和降低长期疾病易感性的关键策略。表1总结了已知会干扰免疫系统成熟的主要化学物质类别，强调了它们的主要作用机制、易感的关键窗口期以及关键的功能结果。该表格旨在快速比较不同压力因素如何影响免疫发育的不同组成部分。综合这些证据表明，免疫发生过程中的化学暴露不仅可以通过明显的细胞毒性，还可以通过微妙的分子和表观遗传重编程来导致免疫失调。这些变化在以后的生活中持续存在，突显了识别免疫脆弱性的环境敏感窗口期的重要性，并将机制见解整合到未来的DIT测试框架中。实验模型和体外系统的进步发育中的免疫系统，包括子宫内、早期生命和青少年阶段，通常被认为比成年免疫系统对免疫毒性物质更敏感（Dietert & Piepenbrink，2006年）。与成人相比，较低剂量就可能引起效应，而早期生命阶段的暴露可能导致不同的、可能是持久的免疫功能改变（Luebke等人，2006年；Jusko等人，2016年）。理想情况下，每个“免疫发育窗口”都应该使用专门的方法进行评估，因为从胎儿期到青春期的不同免疫波可能对免疫毒性物质的暴露有不同的脆弱性。然而，在实践中，为每个发育阶段开发一套完整的检测方法既不可行也不总是必要的。重要的是能够准确估计整个免疫成熟过程中的免疫风险。实现这一目标需要综合方法，以捕捉最敏感和生物学上相关的发育时期，同时确保在测试策略中充分代表免疫能力和耐受性的关键途径。在进一步开发替代方法时，还需要考虑性别因素。性别特异性的免疫毒性效应在早期发育过程中并不普遍，也不限于该阶段。然而，许多案例显示，男性和女性在围产期暴露于外源性物质后会有不同的免疫结果，这可能受到免疫系统发育期间激素环境差异的影响（Hussain等人，2005年）。最后，还应考虑遗传因素。事实上，人类和动物研究中都认识到，对特定终点（如过敏或自身免疫）的遗传易感性是众所周知的，应在NAM（新方法）开发过程中加以考虑。因此，模型系统应该与人类相关，并选择或设计以确保能够检测到相关的终点。例如，促进过敏的化合物在不易产生IgE介导反应的动物模型中无法得到充分评估。我们如何在体外研究DIT？传统上用于成人免疫毒性的体外检测方法已被提议作为发育背景的初步筛选工具（OECD，2022年）。虽然这些检测可以为基本危害识别提供有价值的见解，但在将结果外推到早期生命阶段时需要谨慎。发育中的免疫系统对发育中的免疫毒性物质表现出更高的敏感性，基于成人的标准阈值可能会低估免疫成熟关键窗口期的风险。鉴于免疫发育的复杂性，单一测试不太可能全面反映所有情况。相反，NAM（新方法）越来越多地被整合到分层测试策略中，这些策略从体外和计算机模拟方法开始，逐步进行更精细的评估。生理图谱和AOP（作用途径）为选择要包含在测试组合中的NAM提供了机制基础。这些框架旨在捕捉免疫抑制效应和不适当的免疫激活，如皮肤致敏。一些方法已被纳入OECD TG（测试指南）中，包括IL-2 Luc和IL-2 Luc LTT检测（TG 444A），这些方法旨在体外检测免疫抑制活性，尽管它们在DIT中的适用性仍在讨论中（Johnson等人，2025年；OECD，2022年）。重要的是，OECD关于体外免疫毒性测试的详细审查报告（OECD，2022年）强调了需要一系列互补的检测方法，而不是依赖单一终点。这种多检测方法增强了免疫毒性评估的稳健性，并支持更符合人类实际情况的风险评估，特别是在发育暴露的背景下。图3展示了一个分层的体外DIT评估策略的示意图。图3这种图像的替代文本可能是使用AI生成的。分层的体外DIT评估策略。流程图展示了一种决策树方法，从母体-胎盘生物利用度和造血功能评估开始，根据需要进一步进行针对性的功能免疫检测（列表并不全面）。根据结果，物质可以被分类为免疫毒性或非免疫毒性。使用BioRender创建。Iulini, M. (2026) https://BioRender.com/ioo55jm在开始任何DIT体外研究之前，首先必须考虑母亲的系统暴露和胎盘转移的可能性，因为这些因素决定了发育中的胎儿是否可能接触到感兴趣的物质。对母亲毒代动力学、化学物质生物利用度和胎盘转运机制的彻底评估为确定胎儿暴露风险奠定了基础。这样的初步评估确保了后续的体外研究在生物学上是相关的，并与现实的暴露情景一致。虽然详细讨论超出了本综述的范围，但重要的是要认识到有不同复杂程度的胎盘模型可以帮助确定某种物质是否能够穿过胎盘并到达胎儿。这些模型包括基于Transwell的简单滋养层检测、体外灌注的胎盘以及更先进的微生理系统（MPS），这些系统模拟了母体-胎儿界面的关键结构和功能特征。这些模型为评估胎儿暴露潜力提供了有价值的工具，并可以补充以DIT为重点的体外研究（Cherubini等人，2021年；Martin等人，2025年）。对于免疫系统的正常发育来说，免疫细胞的分化和成熟至关重要。如前几节所述，这是一个严格调控的、逐步的过程，从HSC（造血干细胞）开始，它们迁移到不同的淋巴器官，在那里进行分化和特化。目前的模型尚未在体外再现涉及连续造血细胞区室之间的转换、细胞向初级和次级淋巴器官的迁移、在这些部位的分化以及最终成熟为完全具有免疫能力的细胞的过程。在这方面，一种可能性是在符合既定伦理指南和监管框架的最早分化阶段使用脊椎动物作为替代模型策略。例如，在受精后第5天内，斑马鱼（Danio rerio）处于胚胎或幼虫阶段，在此期间可以研究其对先天免疫的影响。这种方法符合3R（替代、减少痛苦和优化）原则，并提供了传统体外和哺乳动物系统的替代方案（Bailone等人，2020年）。斑马鱼胚胎和幼虫检测的最新进展为研究免疫毒性提供了强大的工具，特别是对先天免疫的影响，包括整个有机体的生理学（Franza等人，2024年）。在胚胎阶段，斑马鱼的先天免疫系统是功能性的，而适应性免疫系统仍在成熟，大约在受精后4-6周开始发挥作用（Novoa & Figueras，2012年）。虽然哺乳动物、一些脊椎动物和一些鱼类具有组织化的淋巴组织，但斑马鱼并不具备这些结构。斑马鱼具有适应性免疫系统的细胞成分，但缺乏促进抗原呈递和免疫细胞之间相互作用的结构。斑马鱼的造血过程分为两个连续阶段：（i）原始造血，从受精后11小时开始，在早期胚胎发育期间发生，产生红细胞和髓系前体；（ii）确定性造血，从受精后30小时开始，产生负责生成所有成人血细胞谱系的HSPC（造血干细胞）（Franza等人，2024年）。在受精后第5天之前，斑马鱼模型完全依赖于先天免疫反应。在鱼类中，medaka扩展一代繁殖测试（MEOGRT；OECD TG 240）已经作为水生生物的对应物，类似于哺乳动物的EOGRTS（OECD，2023年）。在此基础上，斑马鱼扩展一代繁殖测试（ZEOGRT）正在验证中，其目标是利用斑马鱼丰富的遗传资源和成像能力提供互补模型（Cahill等人，2024年）。由于缺乏定义遗传性别的基因位点，ZEOGRT程序中排除了遗传性别鉴定。虽然ZEOGRT有效地捕捉了早期生命、生殖和先天免疫的终点，但由于适应性免疫反应在斑马鱼中发展较晚，因此对其评估较为有限。应使用一组互补的NAM来测试对适应性免疫系统的影响。用于研究适应性免疫系统的体外模型适应性免疫系统，包括T细胞和B细胞，在受精后大约4-6周成熟。目前，从人类脐带血CD34+细胞开始研究不同免疫细胞谱系的成熟更为可行。在这方面，已经提出了许多有前景的方案。然而，还没有一个方案得到监管使用的验证：- 从iPSC（诱导多能干细胞）分化DC（树突状细胞）和单核细胞（Park等人，2024年；Senju等人，2011年）- 从人类脐带血CD34+细胞分化B细胞（Rawlings等人，1997年）- 从人类脐带血CD34+细胞分化T细胞（Trotman-Grant等人，2021年）基于这些知识，Khan等人（2023年）开发了一种无基质细胞的体外模型，可以同时研究多种人类造血谱系（单核细胞、中性粒细胞和B细胞）。作者证明TCDD暴露会驱动HSPC向粒细胞和单核细胞分化，并抑制淋巴细胞和巨核细胞谱系。微生理系统除了这些用于免疫细胞分化的协议外，还开发了几种先进的系统，以更好地捕捉免疫发生的复杂性和外源性物质的干扰。MPS（微生理系统）是先进的体外平台，旨在在受控、动态的环境中再现人体器官的生理和功能特征。与传统检测方法不同，MPS旨在整合结构、生化和机械信号，从而更真实地模拟复杂的生理过程，如免疫细胞的分化、迁移和通信（Kwee等人，2023年；Staumont等人，2025年）。在这里，我们使用“微生理系统”这一术语时，其含义较为广泛，包括三维（3D）类器官、动态培养平台以及多器官设置等多种方法。其中，“器官芯片”更具体地指的是在受控微流控条件下复制特定免疫组织结构和功能的微工程装置，而类器官则是从干细胞衍生出的自组织3D结构，能够再现组织发育和功能的某些方面。在药物免疫毒性（DIT）研究的背景下，MPS特别具有前景，因为它们可以模拟体内（在人类体内）无法实现的关键免疫成熟窗口，而这些窗口在动物研究中也难以被准确再现。通过引入原代细胞或干细胞衍生的前体细胞，这些系统提供了研究外源性物质暴露如何干扰免疫细胞谱系定向、耐受性诱导或免疫-组织相互作用的机会（Johnson等人，2025年）。虽然接下来的章节将详细讨论以免疫系统为重点的器官芯片设备和3D类器官模型，但重要的是要认识到它们都属于MPS这一更广泛的范畴。这些技术共同代表了向与人类相关、基于机制且伦理可持续的药物免疫毒性测试策略转变的基石（Nandre & Terse，2025年；Rupar等人，2024年）。**免疫器官芯片系统** 免疫器官芯片平台已成为在受控、生理相关条件下研究人类免疫学的重要工具，尤其是在药物发现和开发领域。这些微工程系统通常能够复制单个免疫器官的环境，例如淋巴结（LN-）、骨髓（BM-）、皮肤（skin-）、胸腺（thymus-）、脾脏（spleen-）或扁桃体（tonsil-）芯片模型。尽管在开发单一免疫器官芯片方面已经取得了显著进展，但复制不同免疫器官之间的复杂相互作用仍是一个主要的技术难题（Li等人，2023年；Ramadan等人，2023年）。人们越来越关注使用这些平台来模拟免疫过敏和炎症。在这一背景下，癌症免疫疗法是一个相关的应用领域，因为这些免疫过程在治疗效果和免疫相关不良反应中起着核心作用。特别是将次级淋巴器官纳入MPS中，使得能够研究免疫细胞对肿瘤抗原的协调激活、扩增和效应功能。这样的模型可以显著提升有效免疫疗法的设计。免疫器官芯片系统利用与人类相关的数据预测治疗候选物的免疫毒性，这是实现临床转化和获得监管批准的关键步骤。然而，仍存在一些技术和生物学挑战（Nandre & Terse，2025年；Rupar等人，2024年；Shanti等人，2021年；Wang等人，2023年），包括：适当调整器官大小；选择最佳的细胞数量和类型；管理共培养的复杂性；以及设计合适的灌注系统。克服这些挑战将是充分发挥免疫器官芯片技术在生物医学研究、治疗开发和免疫毒性评估中潜力的关键。研究药物免疫毒性时，还需要考虑免疫系统在多个发育阶段的广泛变化，这增加了模型的复杂性。器官芯片模型提供了新的机会来研究不同器官之间的相互作用，但这些模型在模拟药物免疫毒性中涉及的复杂动态相互作用方面的适用性仍有待探索。**3D模型和类器官** 由于胸腺在T细胞成熟和免疫耐受中的关键作用，体外胸腺模型对于药物免疫毒性研究至关重要。二维胸腺培养对胸腺发生的支持有限，而三维基质培养则能更好地促进未成熟T细胞的发育，因为它们更接近地再现了胸腺细胞选择和成熟所需的空间组织、细胞-细胞接触和微环境信号。3D模型保持了细胞的自然形态，并促进了细胞表面与周围介质之间的异质性相互作用，从而提高了细胞的存活率和增殖能力。胸腺类器官已成为再现胸腺生理和功能关键方面的强大工具（Hübscher等人，2024年）。为了更准确地研究胸腺T细胞的成熟，已经开发了几种先进的体外系统。其中，胎儿胸腺器官培养是成熟的模型，能够再现胸腺T细胞发育的关键方面，包括正选择和负选择过程，以及通过与自身主要组织相容性复合分子和内源性抗原的相互作用建立T细胞耐受性。这些模型已在多种平台上成功建立，包括OP9-DL1/DL4和MS5-DL1/DL4饲养细胞系统，它们支持从干细胞开始的新T细胞发育。此外，重新聚集的胸腺器官培养和胎儿胸腺器官培养在模拟早期胸腺器官发生方面发挥了重要作用。使用水凝胶或天然支架的组织工程技术进一步推动了该领域的发展，使得能够在体内再现胸腺功能，为再生医学提供了有希望的应用（Pala等人，2024年）。这些系统为早期免疫发育提供了宝贵的见解，并有助于减少对动物模型的依赖（Anderson等人，2007年）。最近，从小鼠胎儿胸腺细胞开发出了一种微型化的胸腺类器官生产方法，该方法促进了T细胞的定向和发育，再现了天然胸腺的关键结构和功能特征，适用于活体成像以及中等到高通量应用（Major等人，2025年）。尽管这些模型对于阐明T细胞发育的信号通路和细胞机制至关重要，但准确再现胸腺内多样功能生态位中的复杂淋巴基质相互作用仍然是一个重大挑战。目前还没有模型被用于评估体外药物免疫毒性。一个有前景的改进方法是引入人类胸腺上皮细胞和基质细胞，无论是原代细胞还是来自iPSCs的细胞。这样的模型将能够模拟人类胸腺内的不同功能生态位。这些先进模型可以用于筛选胸腺毒性物质，为体外药物免疫毒性评估开辟新的途径。与此同时，先进的人类体外免疫模型也作为功能性免疫毒性评估的宝贵工具而出现。扁桃体来源的模型包含多种免疫细胞群体，包括B细胞（幼稚型、记忆型、生发中心前体、生发中心细胞和浆母细胞）、T细胞（幼稚型、中枢记忆型和效应记忆型CD4?和CD8?亚群）以及单核细胞。这些模型能够在暴露于疫苗后引发适应性免疫反应（Bonaiti等人，2024年；Kastenschmidt等人，2023年）。虽然扁桃体来源的模型并非专为评估药物免疫毒性而设计，但它们在评估儿童和成人的免疫毒性效应方面非常有效，因为它们提供了准确且与人类相关的免疫反应。**总结** 基于CD34?细胞的检测方法、MPS模型和类器官代表了评估药物免疫毒性的有前景的工具。然而，要充分发挥它们的潜力，还需要进一步的优化和标准化。目前，这些模型的性能存在差异，实验室之间尚未建立一致的实验方案。此外，迄今为止测试的化学物质数量有限，这突显了需要扩大数据集的必要性，特别是通过识别和使用可作为验证基准的经过充分表征的参考化合物。此外，还需要扩大评估的功能性免疫终点范围。未来的研究应探索免疫激活标志物、细胞因子释放谱和免疫球蛋白的产生，以更好地捕捉免疫反应的复杂性。整合这些功能性指标将提高这些模型的生物学相关性，并增强它们在评估外源性物质的免疫抑制和免疫刺激效应方面的实用性。组织工程和生物工程的进一步进展将使3D细胞培养技术更加完善，从而能够更有效地预测免疫毒性，可能包括药物免疫毒性。**从暴露到结果：流行病学和高维免疫分析** 人类流行病学研究在免疫毒理学中发挥着关键作用，它们提供了在相关暴露水平以及最相关的物种（人类）中的证据。化学物质暴露与功能性免疫终点（如PFASs暴露后疫苗反应减弱）之间的关联，在证明实际相关性以及为监管风险评估提供信息方面发挥了重要作用，例如在欧洲食品安全局（EFSA）的评估中就体现了这一点。同时，流行病学数据由于其观察性质、潜在的混杂因素以及确定因果关系的难度而受到限制，这突显了需要补充的机制学方法。在这种情况下，区分观察性免疫指标（如免疫细胞频率或基础生物标志物水平）和直接评估免疫能力的功能性免疫终点（如对疫苗或感染的特异性免疫反应）非常重要。功能性免疫测试被广泛认为是更敏感和生物学上更相关的免疫毒性效应指标，因为它们涵盖了免疫系统的整体表现，并与不良健康结果更为相关。鉴于此，深度免疫分析和系统免疫学方法最近已成为人类免疫毒理学中的强大工具（Nygaard等人，2021年；Ronsmans等人，2022年；Tursi等人，2024年）。高维免疫分析通过同时评估多种细胞群体、激活状态和功能标志物，捕捉了免疫系统的复杂性，从而能够识别出以免疫细胞特征或改变的亚群形式存在的效应生物标志物。除了描述性关联之外，这些方法还提供了对免疫途径和受免疫毒性化合物影响的机制学见解。将高维免疫分析与流行病学数据和针对性的体外实验研究相结合，有可能在相关暴露水平上建立暴露-结果关联与潜在的细胞和分子机制之间的联系。通过研究与发育暴露相关的免疫谱型与不良健康结果（如与产前PFASs暴露相关的脐带血转录组特征和儿童早期免疫功能受损）之间的重叠，可以加强因果关系的证据。重要的是，识别出反映免疫调节效应的敏感和稳健的免疫细胞特征，可以为未来体外药物免疫毒性筛查测试的开发提供信息，并支持识别关键事件。**推进药物免疫毒性测试的挑战** 免疫系统在塑造整个生命周期中的多种健康结果方面起着核心作用。尽管在理解免疫系统发生和发展与人类相关的NAMs（纳米添加剂）方面取得了重大进展，但仍有一些挑战限制了药物免疫毒性测试在监管框架中的实施。这些挑战主要分为两类：知识空白和方法学空白，它们共同阻碍了预测性测试策略的开发、标准化和验证。**限制药物免疫毒性评估的知识空白** 我们目前对药物免疫毒性的理解存在一个主要空白，即不清楚哪些特定的免疫发育过程和易感窗口最容易受到发育免疫毒性物质的影响，以及通过哪些机制受到影响。这种不确定性与描述产前和产后早期正常免疫发育的人类参考数据有限密切相关。与啮齿动物模型相比，人类数据集仍然稀少、分散，且往往来自小规模队列或机会性采样。因此，很难（i）定义免疫成熟的基线轨迹，（ii）识别关键的易感窗口，（iii）绘制对免疫能力至关重要的细胞和分子事件，（iv）区分正常的发育变异和毒性物质引起的改变。最近的单细胞图谱开始填补了一些这些空白，但它们仍然只覆盖了选定的组织和发育窗口。此外，将多组学数据整合到连贯的机制学框架中尚未完成。因此，许多NAMs缺乏确保捕捉生物学相关过程所需的发育背景。这种不确定性直接影响了体外药物免疫毒性检测方法的选择和开发，因为尚不清楚应优先考虑哪些关键事件。解决这些知识空白需要更全面和与人类相关的免疫系统发育理解，随后可以将其转化为可行的、基于机制的、可靠的药物免疫毒性测试策略。**用于免疫系统映射的新兴技术** 为了解决这些知识空白，几种新兴技术现在提供了前所未有的分辨率，用于映射免疫系统的发育和功能。新兴的单细胞技术能够以前所未有的精度映射人类免疫系统在不同发育阶段和功能状态下的情况。对发育中的人类免疫系统的多个器官进行scRNA-seq分析（He等人，2025年；Suo等人，2022年）提供了一个系统和全面的框架，用于描述免疫细胞的分化和成熟。为了专门研究淋巴细胞的发育和克隆动态，scRNA-seq可以与单细胞TCR或抗体测序结合使用。这些高分辨率的发育图谱为设计能够检测针对特定关键事件或敏感发育窗口的不良影响的NAMs（纳米分析方法）提供了关键基础。除了发育图谱之外，单细胞高维功能免疫分析和系统免疫学方法在人类研究中也提供了强大的工具，用于识别效应生物标志物（Nygaard等人，2021年；Ronsmans等人，2022年；Tursi等人，2024年）。这些方法在人类暴露与免疫结果之间建立了重要联系，使得在现实暴露条件下检测DIT效应成为可能，并支持基于NAM的测试策略中观察到的效应的生物学验证。展望未来，（发育）免疫毒理学的进展将依赖于生成和整合更大规模、高质量的数据集，这些数据集能够区分广泛的免疫抑制生物标志物和特定化学类别的生物标志物。这种区分对于提高危害识别的准确性以及建立暴露与免疫功能障碍之间的机制联系至关重要。扩大免疫细胞靶标的范围，包括循环中的细胞和组织驻留细胞，将进一步提高（发育）免疫毒性评估的敏感性和特异性。体外模型的进步将在这一发展中发挥核心作用。新兴的系统（包括2D和3D培养、MPS以及共培养平台）提供了更好的机会来研究免疫细胞、基质细胞和屏障组织之间的动态相互作用，从而更好地理解化学物质引起的免疫改变，并支持识别更可靠且与人类相关的毒理学终点。然而，用于成人免疫毒性的体外模型并不总能捕捉到发育中的免疫系统在不同易感窗口期的变化，这对于DIT测试来说是必要的。尽管已经发表了几种用于DIT的NAMs，但只有少数几种进入了验证和监管认可的阶段。监管实施的一个重要障碍是缺乏可用于定义不同免疫系统发育阶段不良影响和基准的人类相关参考数据。此外，由于免疫发生的复杂性、免疫过程的生命周期特异性以及许多发育免疫终点的缺乏公认的金标准检测方法，NAMs的验证仍然具有挑战性。这些限制使得建立性能标准和证明监管认可所需的预测能力变得复杂。因此，需要付出巨大努力将机制见解和NAM衍生的终点转化为适合监管决策的格式。新兴体外模型的监管使用将需要明确的使用场景和适当的性能标准。协调和标准化对于确保可重复性和稳健性至关重要。协议、培养条件和报告实践的标准化将提高实验室间的可重复性，并促进实验室间的数据共享。这些改进还将提高大规模倡议的可行性，以便在化学评估的早期阶段识别免疫毒性危害。这些努力需要国际间的协调和轮换研究。IATAs（国际测试协会）和明确的方法将在推动NAMs的监管实施中发挥关键作用。由于DIT涉及多个发育过程和免疫系统组成部分，单一检测方法可能不足以预测不良后果，因此可能需要结合多种互补的NAMs来捕捉免疫发育过程中的不同关键事件。因此，建立国际公认的测试组合，以及透明的数据解释程序和性能标准，对于支持监管认可至关重要。最后，持续的国际协调对于将科学进展转化为监管实践是必不可少的。学术界、监管机构和国际组织（如经合组织）之间的合作对于实现这一目标至关重要。在全球范围内就测试策略、性能标准和数据解释框架达成共识将有助于开发经过验证的测试组合，并促进其在风险评估框架中的接受。总体而言，这些努力将有助于建立一个更具预测性且基于机制的人类相关DIT评估框架，从而保护后代免受（发育）免疫毒性物质暴露带来的健康影响。