PPAR α/δ Dual agonist H11 (Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University)

点击蓝字 关注我们 作者 刘畅1,2 章宝丹2 涂煜1,2 周丽伟2 刘玲1,2,* 1 山东第一医科大学临床与基础医学院，济南 250117； 2 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室，中国科学院大学，北京 100101 摘要 目的 研究高山木层孔菌Phellinus monticola 14a的次级代谢产物及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法 利用硅胶柱层析和反相高效液相色谱等方法，对该菌株的次级代谢产物进行分离纯化；结合核磁共振和质谱等波谱技术，并与相关文献比对确定化合物结构；对分离所得化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价，对于其中抑制活性良好的化合物，进一步测定其酶动力学曲线，并通过分子对接预测可能的结合位点。结果 从菌株P. monticola 14a发酵萃取物中共分离鉴定了6个已知化合物，分别鉴定为ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (1)、(17R)-4-hydroxy-17-methylincisterol (2)、1,1'-oxybis(2,4-di-tert-butylbenzene) (3)、iltremulanol A (4)、4β,6β-dihydroxy-1α,5β(H)-guai-9-ene (5)和α-cadinol (6)。其中化合物2对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制活性，IC50值为(13.13±0.78) μmol/L。酶动力学曲线表明化合物2是α-葡萄糖苷酶的混合型抑制剂，分子对接表明化合物2与α-葡萄糖苷酶具有较强的结合能力，其结合能为-8.5 kcal/mol。结论 本研究从高山木层孔菌中发现了一个具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，为新型降糖药物的研发提供了一定的理论依据。 关键词：木层孔菌；次级代谢产物；α-葡萄糖苷酶抑制活性；酶动力学；分子对接 Secondary metabolites and their α-glucosidase inhibitory activities from the alpine fungus Phellinus monticola Abstract Objective To investigate secondary metabolites from the alpine fungus Phellinus monticola (P. monticola)14a and their α-glucosidase inhibitory activities. Methods Silica gel column chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC) were used to isolate and purify the secondary metabolites of P. monticola 14a. Their structures were elucidated by comparing the nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS) spectroscopic data with those of literatures. The isolated compounds were evaluated for their α-glucosidase inhibitory activity. For those with good inhibitory activity, their enzyme kinetic profiles were further determined and possible binding sites were predicted by molecular docking. Results Six compounds were isolated from the fermented crude extract of P.monticola 14aand identified as ergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one (1), (17R)-4-hydroxy-17-methylincisterol (2), 1,1'-oxybis(2,4-di-tert-butylbenzene) (3), iltremulanolA (4), 4β,6β-dihydroxy-1α,5β(H)-guai-9-ene (5) and α-cadinol (6), respectively. Compound 2showed potential inhibitory activity against α-glucosidase, with the IC50value of (13.13±0.78) μmol/L. Enzyme kinetic analysis revealed that the inhibition of α-glucosidase by compound2 was a mixed inhibition type. And the molecular docking results indicated that compound 2 has a strong binding capacity to α-glucosidase with the binding energy of -8.5 kcal/mol. Conclusion The compound with α-glucosidase inhibitory activity isolated from P. monticola 14a was found, which provided a theoretical foundation for the development of new hypoglycemic drugs. Key words Phellinus monticola; Secondary metabolites; α-Glucosidase inhibitory activity; Enzyme kinetics; Molecular docking 糖尿病是由遗传、环境、自身免疫缺陷、不良生活习惯等多因素造成的胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗，从而引发的以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病[1-2]，继而导致糖尿病酮症酸中毒、心血管疾病、肾微血管病变等各种严重的急慢性并发症，严重危害患者的身心健康[3]。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是机体内碳水化合物分解代谢的一种关键酶，是糖尿病药物的重要靶点，抑制其活性可有效降低餐后血糖水平。目前临床常用来治疗2型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(acarbose)和伏格列波糖(voglibose)等已成为治疗糖尿病的一线药物，但因其副作用限制了临床应用的广泛性[4]。因此，当下迫切需要聚焦于以α-葡萄糖苷酶为靶点的新型抑制剂的研发，以期为糖尿病患者提供更加安全有效的治疗选择。 天然产物凭借复杂多样的结构和良好的生物安全性，成为药物研发的重要来源。近年来，天然产物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂因高效低毒的优势逐渐受到关注。例如，Ning等[5]从Cyclocarya paliurus的叶片提取物中分离鉴定出11个潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂，包括槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，其IC50值分别为(9.66±3.57)和(23.12±1.71) μmol/L，具有降低小鼠餐后高血糖的潜力；Zhao等[6]从南海沉积物来源真菌Aspergillus insulicola的发酵培养物中分离鉴定出一系列酚类化合物，其中epicoccolide B具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值为(17.04 ± 0.28) μmol/L，表明这些酚类化合物具有开发成新型降糖药物的巨大潜力。 木层孔菌属(Phellinus)具有丰富的化学多样性和生物活性，其能产生多糖、黄酮、萜类和生物碱等丰富的次级代谢产物，发挥抗肿瘤、抗氧化和降血糖等多种生物学活性，具有重要的药用价值和开发潜力[7–9]。本研究进一步丰富木层孔菌属次级代谢产物库，并挖掘潜在的活性化合物，以1株高山木层孔菌P. monticola 14a为研究对象，对其进行放大发酵、萃取、分离和鉴定后得到6个化合物，分别为ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (1)、(17R)4-hydroxy-17-methylincisterol (2)、1,1'-oxybis(2,4di-tert-butylbenzene) (3)、iltremulanol A (4)、4β,6βdihydroxy-1α,5β(H)-guai-9-ene (5)和α-cadinol (6)。此外，对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价、酶动力学曲线和分子对接。化合物1~6的结构式如图1所示。 1  材料与方法1.1  材料1.1.1  菌株来源与鉴定 实验菌株P. monticola 14a采自四川省九龙县贡嘎山国家级自然保护区，并由中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室进行表型和分子鉴定。通过提取该菌株的基因组DNA，采用ITS5和ITS4作为引物进行ITS序列扩增[10]，扩增产物随后送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。测序结果通过BLAST与NCBI数据库中的已知序列进行比对，并结合系统发育树的构建及形态学特征分析，最终确定该菌株为高山木层孔菌[11]。1.1.2  主要仪器和试剂 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent 6520液相质谱仪(美国Agilent公司)，Xbridge C18分析色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Fisher Wharton公司)，Xbridge C18半制备色谱柱(10 mm × 250 mm，5 μm，美国Fisher Wharton 公司)，Bruker Avance III 500核磁共振仪(德国Bruker公司)和FlexStation 3酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司)等；石油醚、乙酸乙酯和无水甲醇(分析纯，北京市通广精细化工公司)，甲醇(色谱纯，北京艾萌宏升石油化工有限公司)，柱层析硅胶(10~40 μm，200~300 目，青岛海洋化工有限公司)，ODS反相硅胶(日本YMC公司)，氘代氯仿(剑桥同位素实验室公司)，二甲基亚砜(DMSO，上海麦克林生化科技股份有限公司)，α-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司)，对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，上海源叶生物科技有限公司)，阿卡波糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。 1.2  方法1.2.1  菌株发酵 将保藏于-80 ℃超低温冰箱甘油管内的菌株接种至PDA平板(新鲜去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L)进行活化，28 ℃倒置培养3 d后，切取平板外缘3~4块约0.5 cm2菌块接种至YMG培养基(葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麦芽糖提取物10 g，蒸馏水1 L)中28 ℃恒温振荡培养箱中200 r/min培养 3~4 d获得种子液，镜检无染菌后以5%的量接种至大米固体培养基(大米100 g，蒸馏水110 mL)中，28 ℃恒温静置发酵30 d，总发酵量为10 kg。1.2.2  化合物分离纯化 发酵产物经乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩获得乙酸乙酯粗提物60.5 g。利用减压正相硅胶柱进行分离，经石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱(15:1~0:1, V/V)，最后用100%甲醇洗脱，经薄层色谱分析合并相似组分后，共得到6个馏分(Fr.1~Fr.6)。Fr.2(15.5 g，PE:EA=10:1)以石油醚/乙酸乙酯(20:1~0:1, V/V)梯度洗脱进行正相硅胶柱分离，得到5个亚馏分(Fr.2.1~Fr.2.5)，其中Fr.2.2(530.5 mg)经反相高效液相色谱(81%甲醇等度洗脱，2.0 mL/min)分离得到化合物4(1.5 mg，tR= 38.0 min)和化合物6(1.5 mg，t R=36.2 min)。Fr.4(12.5 g，PE:EA=8:1)以甲醇/水(3:7~1:0, V/V)梯度洗脱进行ODS反相硅胶柱分离，得到12个亚馏分(Fr.4.1~Fr.4.12)，其中Fr.4.12(52.5 mg)经反相高效液相色谱(98.5%甲醇等度洗脱，2.0 mL/min)分离得到化合物1(2.8 mg，tR=31.1 min)和化合物3(3.2 mg，tR=33.0 min)。Fr.5(2.5 g，PE:EA=6:1)以甲醇/水(4:6~1:0, V/V)梯度洗脱进行ODS反相硅胶柱分离，得到5个亚馏分(Fr.5.1~Fr.5.5)，其中Fr.5.3(55.6 mg)经反相高效液相色谱(84%甲醇等度洗脱，2.0 mL/min)分离得到化合物5(4.4 mg，tR=16.5 min)，Fr.5.4(45.3 mg)经反相高效液相色谱(100%甲醇等度洗脱，2.0 mL/min)分离得到化合物2(4.8 mg，tR=12.8 min)。1.2.3  α-葡萄糖苷酶抑制活性评价及IC50测定 参考Zhu等[12]文献方法并稍作调整，以PNPG为底物对化合物1~6(终浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125 μmol/L)进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价。将DMSO溶解的化合物用PBS缓冲液(100 mmol/L，pH 6.8)配制25 μL的化合物溶液，加入50 μL的0.5 U/mL的 α-葡萄糖苷酶，在37 ℃下孵育10 min后，加入25 μL的2.5 mmol/L PNPG混合反应10 min，反应结束后加入100 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，并立即用酶标仪检测405 nm下的吸光度，计算抑制率。使用阿卡波糖作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，PBS缓冲液作为空白对照。实验平行3次。 抑制率计算公式： 抑制率(%)=[1‒(A样品组‒A样品对照组)/(A阴性对照组‒A空白对照组)]×100% 根据不同浓度下的抑制率用Graphpad Prism9.5软件计算化合物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值。1.2.4  α-葡萄糖苷酶抑制活性动力学分析 参考Zhang等[13]文献方法并稍作调整，保持酶浓度(0.5 U/mL)不变，分别改变化合物浓度(12.5、25和50 μmol/L)和底物浓度(1.5625、3.125、6.25、12.5和25 mmol/L)，参考“1.2.3”所述方法在405 nm下测定A值。使用双倒数作图法(Lineweaver-Burk)，以1/[S](PNPG浓度的倒数)为横坐标，1/V(酶促分解速率的倒数)为纵坐标绘制相关曲线，同时确定酶的Michaelis-Menten常数(Km，直线与X轴交点的倒数)和最大速率(Vmax，直线与Y轴交点的倒数)参数。然后通过比较化合物加入与否Km及Vmax的变化来判断其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。同时通过二次作图计算化合物的游离酶抑制常数(Ki)值和酶-底物复合物抑制常数(Kis)值，判断化合物与游离酶/酶-底物复合物结合的优先程度。1.2.5  分子对接预测α-葡萄糖苷酶结合位点 参考Zhang[14]等文献方法，从Pubchem数据库下载化合物的SDF格式，随后导入到Chemdraw 3D中，利用MM2模块进行能量最小化，获得能量最低的优势构象并保存为Mol2文件。从PDB(Protein Data Bank)数据库中下载α-葡萄糖苷酶受体蛋白的晶体结构文件(PDBID：3A4A)，随后利用Pymol进行可视化，然后用Mgtools 1.5.6通过去水、加氢，计算电荷和合并非极性氢等处理后，将配体与受体分别保存为PDBQT格式。使用Autodock Vina 1.1.2软件将配体与受体进行对接，取打分较高的构象并用Pymol和Discovery Studio软件作图。 2  结果与分析2.1  结构解析 化合物1：淡黄色油状。[α]25D+40.0 (c 0.1, MeOH)，ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 393.32 [M+ H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C28H40O，不饱和度为9。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 6.61 (d, J=9.4 Hz, 1H, H-7), 6.03 (d, J=9.4 Hz, 1H, H-6), 5.73 (s, 1H, H-4), 5.26 (dd, J=7.4, 15.2 Hz, 1H, H-23), 5.20 (dd, J=8.1, 15.2 Hz, 1H, H-22), 2.53 (m, 1H, Ha-2), 2.48 (m, 1H, Ha-15), 2.44 (m, 1H, Hb-2), 2.38 (m, 1H, Hb-15), 2.15 (m, 1H, H-20), 2.13 (m, 1H, H-9), 2.08 (dt, J=3.5, 12.9 Hz, 1H, Ha-12), 2.04 (m, 1H, Ha-1), 1.87 (m, 1H, H-24), 1.83 (m, 1H, Ha-16), 1.80 (m, 1H, Hb-1), 1.70 (m, 1H, Hb-11), 1.60 (m, 1H, Ha-11), 1.50 (m, 1H, Hb-16), 1.49 (m, 1H, H-25), 1.29 (m, 1H, Hb-12), 1.25 (m, 1H, H-17), 1.06 (d, J=6.9 Hz, 3H, H3-21), 0.99 (s, 3H, H319), 0.96 (s, 3H, H3-18), 0.93 (d, J=6.9 Hz, 3H, H3-28), 0.85 (d, J=6.7 Hz, 3H, H3-27), 0.83 (d, J=6.7 Hz, 3H, H3-26); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 199.7 (C-3), 164.5 (C-5), 156.2 (C-14), 135.2 (C-22), 134.2 (C-7), 132.7 (C-23), 124.6 (C-6/8), 123.2 (C-4), 55.9 (C-17), 44.5 (C-9), 44.1 (C-13), 43.0 (C-24), 39.4 (C-20), 36.9 (C-10), 35.7 (C-12), 34.3 (C-1/2), 33.2 (C-25), 27.9 (C16), 25.2 (C-15), 21.4 (C-21), 20.1 (C-26), 19.8 (C-27), 19.1 (C-11/18), 17.8 (C-28), 16.8 (C-19)。以上波谱数据与文献数据比对一致[15]，因此鉴定该化合物为ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。 化合物2：淡黄色油状。[α]25D+74.0 (c 0.1, MeOH)，ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 333.24 [M+H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C21H32O3，不饱和度为6。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 5.63 (d, J=1.9 Hz, 1H, H-2), 5.25 (dd, J=8.4, 15.3 Hz, 1H, H-16), 5.16 (dd, J=7.7, 15.3 Hz, 1H, H-15), 2.64 (m, 1H, H-8), 2.28 (m, 1H, Hb-5), 2.06 (m, 1H, H-13), 1.95 (m, 1H, Hb-6), 1.85 (m, 1H, Hb-10), 1.84 (m, 1H, H-17), 1.82 (m, 1H, Ha-5), 1.69 (m, 1H, Hb-9), 1.61 (m, 1H, Ha-6), 1.48 (m, 1H, Ha-9), 1.47 (m, 1H, H-11), 1.46 (m, 1H, H-18), 1.45 (m, 1H, Ha-10), 1.04 (d, J=6.7 Hz, 3H, H3-14), 0.92 (d, J=6.9 Hz, 3H, H3-21), 0.84 (d, J=6.6 Hz, 3H, H3-20), 0.82 (d, J=6.9 Hz, 3H, H3-19), 0.60 (s, 3H, H3-12); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 171.1 (C-1), 170.8 (C-3), 134.8 (C-15), 133.0 (C-16), 112.4 (C-2), 105.0 (C-4), 55.5 (C-11), 50.5 (C-8), 49.0 (C-7), 43.0 (C-17), 40.3 (C-13), 35.4 (C-5), 35.2 (C-6), 33.2 (C-18), 29.0 (C-10), 21.5 (C-9), 21.2 (C-14), 20.1 (C-20), 19.8 (C-19), 17.8 (C-21), 11.9 (C-12)。以上波谱数据与文献数据比对一致[16]，因此鉴定该化合物为(17R)-4-hydroxy-17methylincisterol。 化合物3：淡黄色油状。ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 395.32 [M+ H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C28H42O，不饱和度为8。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 7.54 (d, J=8.6 Hz, 2H, H-6/6'), 7.36 (d, J=2.2 Hz, 1H, H-3), 7.35 (d, J=2.2 Hz, 1H, H-3'), 7.13 (dd, J=2.5, 8.6 Hz, 2H, H-5/5'), 1.34 (s, 18H, H38/8'/9/9'/10/10'), 1.29 (s, 18H, H3-12/12'/13/13'/14/14'); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 147.8 (C-1/1'), 147.2 (C-4/4'), 138.6 (C-2/2'), 124.6 (C-3/3'), 124.1 (C-5/5'), 119.2 (C-6/6'), 35.0 (C-7/7'), 34.6 (C-11/11'), 31.5 (C-12/12'/13/13'/14/14'), 30.3 (C-8/8'/9/9'/10/10')。以上波谱数据与文献数据比对一致[17]，因此鉴定该化合物为1,1'-oxybis(2,4-di-tert-butylbenzene)。 化合物4：无色油状。[α]25D+25.3 (c 0.1, MeOH)， ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 221.19 [M+ H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C15H26O，不饱和度为3。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 3.78 (dd, J=9.4, 10.7 Hz, 1H, Ha-12), 3.69 (dd, J=6.2, 10.7 Hz, 1H, Hb-12), 2.95 (m, 1H, H-7), 2.28 (m, 1H, H-3), 2.08 (dd, J=2.4, 15.0 Hz, 1H, Ha-10), 1.89 (m, 1H, Ha-5), 1.86 (m, 1H, Hb-10), 1.75 (m, 1H, Ha-4), 1.72 (m, 1H, H-6), 1.69 (s, 3H, H3-11), 1.64 (m, 1H, Hb-4), 1.58 (m, 1H, Hb-5), 1.55 (m, 1H, Hb-8), 1.44 (m, 1H, Ha-8), 1.05 (s, 3H, H315), 0.84 (s, 3H, H3-14), 0.81 (d, J=6.9 Hz, 3H, H3-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 140.0 (C-1), 127.7 (C2), 61.5 (C-12), 49.0 (C-3), 48.8 (C-10), 46.0 (C-7), 45.9 (C-8), 37.0 (C-9), 32.0 (C-6), 31.9 (C-5), 28.8 (C-15), 27.2 (C-14), 23.8 (C-11), 20.8 (C-4), 12.2 (C-13)。以上波谱数据与文献数据比对一致[18]，因此鉴定该化合物为iltremulanol A。 化合物5：无色油状。[α]25D +12.8 (c 0.1, MeOH)， ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 239.19 [M+ H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C15H26O2，不饱和度为3。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 5.50 (brd, J=9.5 Hz, 1H, H-9), 4.14 (dd, J=4.1, 9.6 Hz, 1H, H-6), 2.30 (m, 1H, H-1), 2.27 (m, 1H, Ha-8), 2.09 (dd, J=9.5, 12.0 Hz, 1H, H-5), 1.83 (m, 1H, Ha-2), 1.80 (m, 1H, Hb8), 1.73 (m, 1H, Ha-3), 1.69 (m, 1H, Hb-2), 1.67 (brs, 3H, H3-14), 1.63 (m, 1H, H-11), 1.60 (m, 1H, Hb-3), 1.32 (s, 3H, H3-15), 1.26 (m, 1H, H-7), 1.02 (d, J=6.7 Hz, 3H, H3-12), 0.95 (d, J=6.6 Hz, 3H, H3-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 139.4 (C-10), 126.3 (C-9), 81.3 (C-4), 72.6 (C-6), 57.6 (C-5), 50.7 (C-7), 42.5 (C-1), 40.1 (C3), 28.6 (C-11), 26.8 (C-2), 24.5 (C-8), 24.3 (C-14), 23.3 (C-15), 21.6 (C-13), 21.5 (C-12)。以上波谱数据与文献数据比对一致[19]，因此鉴定该化合物为4β,6β-dihydroxy-1α,5β(H)-guai-9-ene。 化合物6：无色油状。[α]25D-5.7(c 0.1, MeOH)， ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 223.19 [M+ H]+，结合1H NMR与13C NMR数据推测其分子式为C15H26O，不饱和度为3。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 5.50 (s, 1H, H-5), 2.16 (m, 1H, H-11), 1.99 (m, 1H, Hb-3), 1.98 (m, 2H, H-2), 1.80 (m, 1H, Hb-9), 1.72 (m, 1H, H-6), 1.67 (s, 3H, H3-15), 1.60 (m, 1H, Hb-8), 1.42 (m, 1H, Ha9), 1.23 (m, 1H, Ha-3), 1.22 (m, 1H, H-1), 1.13 (m, 1H, Ha-8), 1.10 (s, 3H, H3-14), 1.04 (m, 1H, H-7), 0.92 (d, J=7.0 Hz, 3H, H3-12), 0.77 (d, J=7.0 Hz, 3H, H3-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 135.1 (C-4), 122.5 (C-5), 72.6 (C-10), 50.2 (C-1), 46.8 (C-7), 42.3 (C-9), 40.0 (C6), 31.1 (C-2), 26.1 (C-11), 24.0 (C-15), 22.8 (C-3), 22.1 (C-8), 21.7 (C-12), 20.9 (C-14), 15.3 (C-13)。以上波谱数据与文献数据比对一致[20]，因此鉴定该化合物为α-cadinol。 2.2  α-葡萄糖苷酶抑制活性实验结果 2.2.1  α-葡萄糖苷酶抑制活性评价及IC50测定 化合物1~6的α-葡萄糖苷酶抑制活性评价结果(图2A)表明，在100 μmol/L终浓度下，化合物 2对α-葡萄糖苷酶表现较强的抑制活性，抑制率为(82.32±0.18)%，阳性对照阿卡波糖的抑制率为 (90.14±0.47)%。进一步测定IC50值，结果如图2B所示，IC50值为(13.13±0.78) μmol/L，阳性对照阿卡波糖的IC50值为(1.59±0.37) μmol/L。其余化合物在测试浓度范围内对α-葡萄糖苷酶均未表现出明显的抑制活性。 2.2.2  α-葡萄糖苷酶动力学曲线 运用Lineweaver-Burk图(双倒数作图)来确定化合物2对α-葡萄糖苷酶的抑制模式。在Lineweaver-Burk图中(图3A)，化合物2随着其化合物浓度的增加，Km值增加，Vmax值减小，所有直线相交于第二象限，表明化合物2既能结合游离酶又能结合酶-底物复合物，是α-葡萄糖苷酶的混合型抑制剂。进一步通过对斜率和截距进行二次作图(图3B~C)，计算其Kis值(酶-底物复合物抑制常数)为31.89 μmol/L；Ki值(游离酶抑制常数)为200.83 μmol/L，Ki值大于Kis值，表明化合物2优先与酶-底物复合物结合。 2.2.3  分子对接预测α-葡萄糖苷酶结合位点 进一步使用Autodock vina 1.1.2软件将配体与受体进行分子对接，结果如图4所示，化合物2与α-葡萄糖苷酶的结合能为-8.5 kcal/mol，小于-5 kcal/mol，表明化合物2能够有效地结合到蛋白的活性口袋。随后通过分析三维相互作用，化合物2主要通过氢键和疏水相互作用与α-葡萄糖苷酶活性位点的氨基酸残基结合从而发挥抑制活性，分别与蛋白的THR-310氨基酸残基形成氢键相互作用，与蛋白的TYR-158、PHE-159、TYR-72、VAL-216、PHE-303氨基酸残基形成疏水相互作用，这些相互作用共同促进化合物2结合到蛋白的活性口袋形成复合物。 3  讨论与结论 本研究从一株高山木层孔菌P. monticola 14a发酵产物中共分离鉴定得到6个化合物，包括2个甾体类化合物(1和2)，1个双酚类化合物(3)以及3个倍半萜类化合物(4~6)，其中化合物2~6从木层孔菌属中首次分离得到。据文献报道，化合物1对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的RAW 264.7细胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成具有一定抑制作用[21]，表现出潜在的抗炎活性，还具有一定的细胞毒[22]和除草[23]活性；化合物2对卵巢癌SK-OV-3细胞、皮肤黑色素瘤SK-MEL-2细胞和结肠癌HCT-15细胞等多株肿瘤细胞系具有显著的细胞毒活性，IC50值在(1.14~1.97) μmol/L之间[24-25]，还能通过直接抑制乙酰胆碱酯酶活性并上调α7nAchR的表达从而发挥抗炎作用[26]；化合物3显著抑制LPS诱导的BV2细胞中NO的生成，具有潜在的抗神经炎作用[27]；化合物6具有一定的钙拮抗[28]、抗真菌[29]和显著的血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性[30]，对结肠癌HCT-15细胞具有显著的细胞毒活性，IC50值为0.7 μmol/L[31]。 临床常用α-葡萄糖苷酶抑制类抗糖药物阿卡波糖主要通过其类似寡糖的结构与关键氨基酸残基(包括Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526等)形成氢键和疏水相互作用，与小肠上皮细胞的α-葡萄糖苷酶活性中心可逆性结合，结合能低至-7.6 kcal/mol，从而延缓碳水化合物的分解和葡萄糖的吸收，进而降低餐后血糖水平[32]。本研究通过PNPG法筛选出化合物2对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制活性，其IC50值为(13.13±0.78) μmol/L，并通过酶动力学曲线确定化合物2为α-葡萄糖苷酶的混合型抑制剂。进一步利用分子对接预测了其与α-葡萄糖苷酶可能的结合位点，推测化合物2的活性基团主要是羰基和烷烃侧链，通过氢键和疏水相互作用分别与THR-310、TYR-158、PHE-159、TYR-72、VAL-216和PHE-303等氨基酸残基结合，其结合能为-8.5 kcal/mol，从而稳定结合在酶的活性位点，发挥抑制活性。本研究发现了具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，为新型降糖药物的研发提供了一定的理论依据。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来源：刘畅, 章宝丹, 涂煜, 等. 高山木层孔菌Phellinus monticola次级代谢产物及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究[J]. 中国抗生素杂志, 2026, 51(4): 423-430. 本期目录：《中国抗生素杂志》第51卷第4期目次 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🏛️ 罕见肿瘤：日本患者的“药物滞后”困境 在日本，罕见肿瘤、难治性肿瘤和儿童肿瘤的患者面临一个严峻现实：治疗选择极其有限，新药开发严重滞后。 根据日本癌症基因组分析中心（C-CAT）的报告，51.3% 的儿童实体瘤患者携带可靶向的基因异常，但其中仅有5.8% 的患者能够获得推荐分子靶向治疗的机会。这一巨大差距的背后，是日本缺乏像欧美那样的儿科药物研发激励法规——没有欧洲的“儿科研究计划”（PIP），也没有美国的“RACE法案”。 在东京筑地的日本国立癌症中心中央医院，一群医生正在用行动改变这一现状。他们发起了FUTURE项目——一个旨在为罕见、难治性和儿童肿瘤患者建立快速新药研发基础设施的宏伟计划。从平台试验PARTNER到罕见癌免疫治疗ROCK试验，从儿童神经母细胞瘤延迟局部治疗到血管肉瘤硼中子俘获疗法，NCC的专家们正在用多学科协作模式，为每一位“被遗忘”的患者点亮希望之光。 🔬 FUTURE项目：为“被忽视”的患者点亮希望 FUTURE项目由NCC中央医院发起，目标是建立快速将新药带给患者的研究基础设施。那些罹患罕见、难治性和儿童肿瘤的患者，通常治疗选择极其有限，无法获得足够的医疗服务。FUTURE项目正是为了给每一位这样的患者带来希望之光而启动。 项目核心成员包括： 山本昇（Noboru Yamamoto）：副院长、实验治疗科部长 沖田南都子（Natsuko Okita）：消化道肿瘤内科专家、研究管理部长 米盛寛（Kan Yonemori）：国际医疗与先进医疗科部长 安藤弥生（Yayoi Ando）：血液内科专家、临床试验管理部长 福田治彦（Haruhiko Fukuda）：JCOG数据中心主任 FUTURE项目依赖社会各界的捐赠支持，这些善款被用于研究基础设施建设、青年研究者支持、患者与公民参与度提升。 ⚕️ PARTNER试验：日本首个儿科精准医疗平台 JCOG2220（PARTNER试验） 是日本首个针对儿童和年轻成人难治性实体瘤的多队列平台试验，由NCC中央医院儿科肿瘤科的宮崎文平（Bunpei Miyazaki）医生主导。 研究背景：日本儿科肿瘤患者获取新药的机会极为有限。即使通过癌症基因组检测发现可靶向的基因异常，也仅有不到6%的患者能获得相应治疗。 研究设计： 试验类型：开放标签、多中心、多队列平台研究 目标人群：0-29岁、无标准治疗或对标准治疗不耐受的难治性肿瘤患者 用药依据：CGP检测推荐、欧美已获批儿科适应症、或日本仅获批成人适应症 给药方式：单药治疗 入组规模：每个队列最多30例 主要终点：剂量限制性毒性发生率 当前治疗队列（截至2024年1月）： 药物 靶点/机制 适用人群 伊马替尼（imatinib） BCR-ABL、KIT、PDGFR 多种融合基因阳性肿瘤 帕唑帕尼（pazopanib） 多靶点TKI 软组织肉瘤等 鲁索替尼（ruxolitinib） JAK1/2抑制剂 JAK-STAT通路异常肿瘤 曲美替尼（trametinib） MEK抑制剂 RAS/MAPK通路异常肿瘤 阿替利珠单抗（atezolizumab） PD-L1抑制剂 免疫治疗敏感肿瘤 临床意义：PARTNER试验通过平台设计，比逐一开展早期临床试验更快速、更高效地将药物递送给患者。这是日本在儿科精准医疗领域的重大突破，为那些“有靶点无药物”的患者开辟了新通道。 🔬 神经母细胞瘤：延迟局部治疗的JN-H-11试验 高危神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤之一，生存率长期不理想。日本儿童癌症组（JCCG）神经母细胞瘤委员会开展了JN-H-11全国性II期试验，由米田明弘（Akihiro Yoneda）医生（国立癌症中心医院小儿外科肿瘤学）等多位专家共同完成。 研究设计： 入组时间：2011年5月至2015年9月 入组患者：75例高危神经母细胞瘤患者（可评估64例：8例III期，56例IV期） 治疗方案：延迟局部治疗策略——先进行全身强化治疗控制系统性疾病，再进行局部治疗 5周期诱导化疗（顺铂、吡柔比星、长春新碱、环磷酰胺） 清髓性大剂量化疗（马法兰、依托泊苷、卡铂） 序贯局部肿瘤切除术+放疗 关键结果： 指标 结果 3年无进展生存率44.4% （95% CI: 31.8%-56.3%） 3年总生存率80.7% （95% CI: 68.5%-88.5%） 治疗结束时缓解率66% （42/64例，含23例完全缓解） 治疗相关死亡0 （无患者在治疗期间或完成后30天内死亡） ≥3级非血液学不良事件 48% 主要手术并发症 25% 结论：延迟局部治疗策略可行且疗效令人鼓舞，提示这种治疗模式值得在高危神经母细胞瘤的对照研究中进一步评估。 🔬 克唑替尼：改写儿童ALCL治疗格局 间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）是儿童最常见的T细胞淋巴瘤之一，约90% 的儿童患者为ALK阳性。ALK抑制剂已成为这类患者的治疗核心。 NCC中央医院儿科肿瘤科团队参与的克唑替尼日本儿童I/II期研究由森哲也（Tetsuya Mori）医生主导，多家机构共同完成。 研究设计： 研究类型：开放标签、多中心I/II期研究 目标人群：复发/难治性ALK阳性ALCL或神经母细胞瘤儿童患者 I期部分（7例）：确定推荐II期剂量（RP2D）为165 mg/m² 每日两次 II期部分（11例）：评估该剂量下ALK阳性ALCL的抗肿瘤活性 关键结果： 指标 结果 客观缓解率72.7% （90% CI: 43.6%-92.1%） 最常见≥3级不良事件 中性粒细胞减少（71%） 剂量限制性毒性 1例（3级γ-谷氨酰转移酶升高） 因疾病进展停药 1例 临床意义：克唑替尼165 mg/m² BID剂量耐受性良好，在复发/难治性ALK阳性ALCL儿童患者中显示出显著抗肿瘤活性。这一结果与美国的COG研究结果一致，为日本患者提供了新的治疗选择。 🔬 硼中子俘获疗法：攻克罕见血管肉瘤 血管肉瘤是一种罕见的皮肤恶性肿瘤，对传统放化疗抵抗，局部控制极为困难。一旦对放化疗无效，目前尚无有效的局部控制方法。 NCC中央医院放疗科与Stella Pharma公司合作，开展了硼中子俘获疗法（BNCT）治疗不可切除皮肤血管肉瘤的II期临床试验。 研究进展： 2023年12月：SPM-011（硼药）被日本厚生劳动省指定为孤儿药 2024年9月：完成10例患者入组 2025年7月：达到主要终点（缓解率），详细结果将在ESMO 2025大会（2025年10月）公布 BNCT优势：硼中子俘获疗法是一种新型放射治疗，硼-10药物选择性聚集在肿瘤细胞中，经热中子照射后产生α粒子和锂粒子，精准杀死肿瘤细胞而对周围正常组织损伤极小。 临床意义：这一突破将为那些对放化疗无效的血管肉瘤患者提供全新的治疗选择。计划基于试验结果提交上市申请。 🔬 ROCK试验：免疫治疗在罕见癌中的突破 错配修复缺陷（dMMR）/微卫星高度不稳定（MSI-H）是免疫检查点抑制剂的强效预测标志物。NCC中央医院大熊瞳（Hitomi Okuma）医生团队开展的ROCK试验评估了纳武利尤单抗在晚期dMMR/MSI-H罕见癌中的疗效。 研究设计： 研究类型：多中心、开放标签、单臂II期试验 入组时间：2018年5月至2021年3月 目标人群：晚期dMMR/MSI-H罕见实体瘤患者 入组患者：242例筛查，11例入组，10例纳入分析 中位随访：24.7个月 关键结果： 指标 结果 客观缓解率（中心评估）60% （95% CI: 26.2%-87.8%） 客观缓解率（研究者评估）70% （95% CI: 34.8%-93.3%） 中位无进展生存期 10.1个月（95% CI: 0.9-11.1） ≥3级治疗相关不良事件0 TMB≥10/Mb患者100%  缓解率（95% CI: 47.8-100） 生物标志物发现：响应者外周血单核细胞中T-bet+ PD-1+ CD4+ T细胞比例显著高于非响应者（p<0.05），可能成为新的预测性生物标志物。 结论：纳武利尤单抗在晚期dMMR/MSI-H罕见实体瘤中显示出临床获益，达到主要终点。 🔬 TOP-GEAR项目：儿童精准医学的基因组研究 NCC的TOP-GEAR项目是一项针对难治性或复发性儿童实体瘤的前瞻性分子谱研究，由NCC中央医院儿科肿瘤科主导。 研究设计： 入组时间：2016年8月至2021年12月 入组患者：142例难治性或复发性儿童肿瘤患者（年龄1-28岁） 检测方法：NCC Oncopanel（ver. 4.0）和NCC Oncopanel Ped（ver. 1.0） 可评估样本：128例（90%） 关键发现： 59%（76例）患者携带至少一个可报告的体细胞或胚系变异 31%（40例）患者发现潜在可干预的基因异常 10%（13例）患者基于基因组检测结果接受了推荐治疗 最常见突变基因：TP53、MYCN、MYC、CDKN2A、CDK4主要分子通路异常：转录调控、细胞周期调控、表观遗传修饰、RAS/MAPK信号通路 临床意义：基因组医学的实施加深了对肿瘤生物学的理解，并提供了新的治疗策略。但药物可及性仍是瓶颈——虽然31%的患者有潜在靶点，最终仅10%能获得相应治疗，这更凸显了PARTNER试验等平台的重要性。 注：本文基于NCC官方信息及公开医学资料整理，为知识性科普，仅供学习、交流，请勿用作商业用途。 参考资料 Yoneda A, Shichino H, Hishiki T, et al. A nationwide phase II study of delayed local treatment for children with high-risk neuroblastoma: The Japan Children's Cancer Group Neuroblastoma Committee Trial JN-H-11. Pediatr Blood Cancer. 2024;71(6):e30976. Miyazaki B, Shirakawa N, Sugiyama M, et al. A multicohort platform trial to improve drug access for pediatric cancer patients in Japan: The PARTNER trial (NCCH2220). J Clin Oncol. 2024;42(suppl 16; abstr TPS10079).  Stella Pharma. Achievement of Primary Endpoints in Phase II Clinical Trial Targeting Angiosarcoma in Japan —Detailed Trial Results to Be Presented at ESMO Congress 2025— (2025年7月28日).  国立癌症研究中心. The FUTURE Project.  Mori T, Kada A, Osumi T, et al. Phase 1/2 Study of Crizotinib in Children With Relapsed/Refractory ALK-Positive Anaplastic Large Cell Lymphoma or Neuroblastoma in Japan. Cancer Sci. 2026;117:777-786.  Okuma HS, Watanabe K, Tsuchihashi K, et al. Phase 2 trial of nivolumab in metastatic rare cancer with dMMR or MSI-H and relation with immune phenotypic analysis (the ROCK trial). Clin Cancer Res. 2023.  Yoneda A, Shichino H, Hishiki T, et al. A nationwide phase II study of delayed local treatment for children with high-risk neuroblastoma: The Japan Children's Cancer Group Neuroblastoma Committee Trial JN-H-11. Pediatr Blood Cancer. 2024;71(6):e30976.  Nakajima M, Arakawa A, Ogawa C. Japan's contribution to an ongoing global pediatric cancer clinical trial: The experience of the National Cancer Center Hospital (NCCH) in Tokyo. EJC Paediatric Oncology. 2024:100157.  Stella Pharma. Patient Enrollment Completed for Phase II Clinical Trial in Japan on Angiosarcoma (2024年9月10日).  Department of Pediatric Oncology, National Cancer Center Hospital, et al. Pediatric Precision Medicine at the National Cancer Center Japan: Prospective Genomic Study of Pediatric Patients with Cancer as Part of the TOP-GEAR Project. JCO Precis Oncol. 2023;7:e2200266.  🤝 通往NCC的桥梁 如果您或家人确诊罕见肿瘤、难治性肿瘤或儿童肿瘤，希望了解日本国立癌症中心的治疗方案，我们可以为您提供： ✅ 精准专家匹配：根据具体诊断和基因特征，推荐最对口的NCC专家——如宮崎文平医生（PARTNER试验）、山本昇医生（早期临床试验）、米田明弘医生（儿童神经母细胞瘤）✅ FUTURE项目评估：对于罕见、难治性或儿童肿瘤，评估是否适合FUTURE项目的新药研发通道✅ PARTNER试验筛选：根据CGP检测结果，评估是否符合PARTNER平台试验的入组条件✅ 孤儿药评估：对于血管肉瘤等罕见肿瘤，评估BNCT等孤儿药的适用性✅ 免疫治疗评估：根据dMMR/MSI-H状态、TMB水平，评估纳武利尤单抗等免疫治疗的适用性✅ 远程会诊协助：通过指定协调公司，在出发前获得专家第二诊疗意见✅ 赴日就医全流程支持：对接协调公司，完成材料准备、费用预付、签证办理等 📩 私信我们，发送【罕见肿瘤/儿童肿瘤+简要病史】，获取免费初步评估